JPH08231594A - 繊維素溶解性の血液凝固阻害性質を有するたん白質 - Google Patents
繊維素溶解性の血液凝固阻害性質を有するたん白質Info
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- JPH08231594A JPH08231594A JP7297020A JP29702095A JPH08231594A JP H08231594 A JPH08231594 A JP H08231594A JP 7297020 A JP7297020 A JP 7297020A JP 29702095 A JP29702095 A JP 29702095A JP H08231594 A JPH08231594 A JP H08231594A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 繊維素溶解性の血液凝固阻害性質を有するた
ん白質 【解決手段】 本発明はプラスミノーゲンを活性化する
アミノ酸配列のＮ- 及び（又は）Ｃ- 最終末端でトロン
ビン又は因子Ｘａを阻害するアミノ酸配列と結合する、
繊維素溶解性の血液凝固阻害性質を有するたん白質に関
し、遺伝子工学によって生成されたたん白質は血栓溶解
剤として適する。
ん白質 【解決手段】 本発明はプラスミノーゲンを活性化する
アミノ酸配列のＮ- 及び（又は）Ｃ- 最終末端でトロン
ビン又は因子Ｘａを阻害するアミノ酸配列と結合する、
繊維素溶解性の血液凝固阻害性質を有するたん白質に関
し、遺伝子工学によって生成されたたん白質は血栓溶解
剤として適する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、繊維素溶解性の血
液凝固阻害性質を有するたん白質──これは、プラスミ
ノーゲンを活性化するアミノ酸配列のＮ- 及び（又は）
Ｃ- 最終末端でトロンビン及び（又は）因子Ｘａを阻害
するアミノ酸配列と結合する──、このポリペプチドを
産生するためのプラスミド及び有効物質としてこの様な
ポリペプチドを含有する血栓溶解剤に関する。
液凝固阻害性質を有するたん白質──これは、プラスミ
ノーゲンを活性化するアミノ酸配列のＮ- 及び（又は）
Ｃ- 最終末端でトロンビン及び（又は）因子Ｘａを阻害
するアミノ酸配列と結合する──、このポリペプチドを
産生するためのプラスミド及び有効物質としてこの様な
ポリペプチドを含有する血栓溶解剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】重い疾病の多くは、動脈又は静脈血管の
閉塞が原因である。この様な血栓症疾患に、心筋梗塞、
脳梗塞、肺塞栓、深在性静脈血栓症及び末梢の動脈閉塞
疾患が属する。血管の閉塞によって対応する組織への酸
素の供給並びに栄養物質及び代謝物の交換が妨げられ
る。その結果として関係する器官及び組織の回復できな
い損傷が生じる。
閉塞が原因である。この様な血栓症疾患に、心筋梗塞、
脳梗塞、肺塞栓、深在性静脈血栓症及び末梢の動脈閉塞
疾患が属する。血管の閉塞によって対応する組織への酸
素の供給並びに栄養物質及び代謝物の交換が妨げられ
る。その結果として関係する器官及び組織の回復できな
い損傷が生じる。
【０００３】血栓によって引き起こされる血管の閉塞
は、ほとんど動脈硬化障害でフィブリン、血栓及び赤血
球から血液凝固システムの種々の酵素の作用下に生じ
る。血液凝固システムの酵素カスケードのうち、因子Ｘ
ａ及びトロンビンが重要な役割を果す。因子Ｘａは、プ
ロトロンビナーゼ- 複合体の成分としてプロトロンビン
をトロンビンに変える。トロンビンは、血液凝固システ
ムの重要な酵素すべてを活性化することができ、血小板
の凝集を誘発し、フィブリノーゲンをフィブリンに変え
ることによってフィブリンクロット(Fibringespinte)の
形成を生じる(Furie及びFurie, New Engl. J. Med,３２
６，８００（１９９２））。
は、ほとんど動脈硬化障害でフィブリン、血栓及び赤血
球から血液凝固システムの種々の酵素の作用下に生じ
る。血液凝固システムの酵素カスケードのうち、因子Ｘ
ａ及びトロンビンが重要な役割を果す。因子Ｘａは、プ
ロトロンビナーゼ- 複合体の成分としてプロトロンビン
をトロンビンに変える。トロンビンは、血液凝固システ
ムの重要な酵素すべてを活性化することができ、血小板
の凝集を誘発し、フィブリノーゲンをフィブリンに変え
ることによってフィブリンクロット(Fibringespinte)の
形成を生じる(Furie及びFurie, New Engl. J. Med,３２
６，８００（１９９２））。
【０００４】血栓の形成は、生理学的血液凝固阻止剤、
たとえばアンチトロンビンＩＩＩ、活性化されたたん白
質Ｃ及び組織因子経路阻害剤によって制御される。一度
形成された血栓を、生体に特有なプラスミンの作用によ
って再び溶解することができる。プラスミンは不活性な
プロ酵素、プラスミノーゲンから生じ、このプラスミン
はプラスミノーゲン活性化因子によってたん白質分解し
て活性化される。プラスミンによって引き起こされる血
栓溶解は、血栓症疾患の患者、特に急性心筋梗塞の患者
をプラスミノーゲン活性化因子で処置する治療に利用さ
れる。現在この治療に、ストレプトキナーゼ、ＡＰＳＡ
Ｃ(Anisolated PlasminogenStreptokinase Activator C
omplex)、二本鎖ウロキナーゼ（ＵＫ）、組換え型一本
鎖ウロキナーゼ（組換え型プロウロキナーゼ）及び組織
プラスミノーゲン活性化因子（ｔ- ＰＡ）が使用されて
いる(Collen 及び Lijnen, Blood ７８，３１１４（１
９９１））。更に、コウモリ- プラスミノーゲン活性化
因子(Gardell等、J. Biol. Chem. ２６４，１７９４７
（１９８９）；ヨーロッパ特許第３８３４１７号明細
書）、スタフィロキナーゼ(Schlott等、Bio ／Technolo
gy １２，１８５（１９９４）；Collen及びVan De Wer
f, Circulation ８７，１８５０（１９９３））、組換
え型組織プラスミノーゲン活性化因子ＢＭ ０６．０２
２(Martin 等、J. Cardiovasc. Pharm. １８，１１１
（１９９１））並びにｔ- ＰＡ- 変異体のＴＮＫ- ｔ-
ＰＡ(Keyt 等、Proc. Natl. Acad. Sci.９１，３６７０
（１９９４））が開発されている。
たとえばアンチトロンビンＩＩＩ、活性化されたたん白
質Ｃ及び組織因子経路阻害剤によって制御される。一度
形成された血栓を、生体に特有なプラスミンの作用によ
って再び溶解することができる。プラスミンは不活性な
プロ酵素、プラスミノーゲンから生じ、このプラスミン
はプラスミノーゲン活性化因子によってたん白質分解し
て活性化される。プラスミンによって引き起こされる血
栓溶解は、血栓症疾患の患者、特に急性心筋梗塞の患者
をプラスミノーゲン活性化因子で処置する治療に利用さ
れる。現在この治療に、ストレプトキナーゼ、ＡＰＳＡ
Ｃ(Anisolated PlasminogenStreptokinase Activator C
omplex)、二本鎖ウロキナーゼ（ＵＫ）、組換え型一本
鎖ウロキナーゼ（組換え型プロウロキナーゼ）及び組織
プラスミノーゲン活性化因子（ｔ- ＰＡ）が使用されて
いる(Collen 及び Lijnen, Blood ７８，３１１４（１
９９１））。更に、コウモリ- プラスミノーゲン活性化
因子(Gardell等、J. Biol. Chem. ２６４，１７９４７
（１９８９）；ヨーロッパ特許第３８３４１７号明細
書）、スタフィロキナーゼ(Schlott等、Bio ／Technolo
gy １２，１８５（１９９４）；Collen及びVan De Wer
f, Circulation ８７，１８５０（１９９３））、組換
え型組織プラスミノーゲン活性化因子ＢＭ ０６．０２
２(Martin 等、J. Cardiovasc. Pharm. １８，１１１
（１９９１））並びにｔ- ＰＡ- 変異体のＴＮＫ- ｔ-
ＰＡ(Keyt 等、Proc. Natl. Acad. Sci.９１，３６７０
（１９９４））が開発されている。
【０００５】ストレプトキナーゼ、すなわち溶血性レン
サ球菌のたん白質はヒトプラスミノーゲンを活性化す
る。というのはこのたん白質はプラスミノーゲンと複合
体を生成し、それによってプラスミノーゲンが活性な構
造に変化するからである。この複合体それ自体は遊離の
プラスミノーゲンをプラスミンに変え、このプラスミン
はその時再びストレプトキナーゼと結合するプラスミノ
ーゲンを切断する。同様にスタフィロキナーゼ、すなわ
ち黄色ブドウ球菌から得られるたん白質も作用するが、
これはストレプトキナーゼに比してより高いフィブリン
特異性を有する。ストレプトキナーゼが更に開発された
ものは、ＡＰＳＡＣ、ストレプトキナーゼとヒトプラス
ミノーゲンから試験管内で産生された化合物である。Ａ
ＰＳＡＣは、プラスミノーゲンの活性中心の化学修飾に
よってストレプトキナーゼに比して高められた生物学的
半減期を有する。
サ球菌のたん白質はヒトプラスミノーゲンを活性化す
る。というのはこのたん白質はプラスミノーゲンと複合
体を生成し、それによってプラスミノーゲンが活性な構
造に変化するからである。この複合体それ自体は遊離の
プラスミノーゲンをプラスミンに変え、このプラスミン
はその時再びストレプトキナーゼと結合するプラスミノ
ーゲンを切断する。同様にスタフィロキナーゼ、すなわ
ち黄色ブドウ球菌から得られるたん白質も作用するが、
これはストレプトキナーゼに比してより高いフィブリン
特異性を有する。ストレプトキナーゼが更に開発された
ものは、ＡＰＳＡＣ、ストレプトキナーゼとヒトプラス
ミノーゲンから試験管内で産生された化合物である。Ａ
ＰＳＡＣは、プラスミノーゲンの活性中心の化学修飾に
よってストレプトキナーゼに比して高められた生物学的
半減期を有する。
【０００６】ウロキナーゼは、ヒトのたん白質であり、
これは２つの形態でたん白質分解に活性なたん白質とし
てウリンから得ることができる：高分子ウロキナーゼ
（ＨＵＫ）及び低分子ウロキナーゼ（ＬＵＫ(Stump等、
J. Biol. Chem. ２６１，１２６７（１９８６））。Ｈ
ＵＫ及びＬＵＫは、ウロキナーゼの活性型、すなわち二
本鎖分子である。ウロキナーゼを一本鎖ウロキナーゼ
（プロウロキナーゼ）として種々の組織中に生成し、プ
ロ酵素として少量でヒト血液中で検出することができる
(Wun等、J. Biol. Chem. ２５７，３２７６（１９８
２））。プロウロキナーゼの活性型はＨＵＫとして５４
キロダルトンの分子量を有し、３個のドメインから成
る：アミノ- 末端成長因子- ドメイン、クリングル及び
セリン- プロテアーゼ- ドメイン(Guenzler 等、Hoppe-
Seyler's Z. Physiol. Chem.３６３，１１５５（１９８
２）；Steffens等、Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem.
３６３，１０４３（１９８２））。プロウロキナーゼ及
びプラスミノーゲンはプロ酵素として存在するけれど
も、プロウロキナーゼは内的活性のゆえにプラスミノー
ゲンを活性プラスミンに変えることができる。しかしこ
のプラスミノーゲン活性化因子は、生成されたプラスミ
ンそれ自体がプロウロキナーゼを 158リジン及び 159イ
ソロイシンの間で切断した後に初めて十分な活性を維持
する(Lijnen 等、J. Biol.Chem. ２６１，１２５３（１
９８６））。大腸菌中でウロキナーゼを遺伝子工学で産
生する方法は、Heyneker等によって初めて記載された(P
roceedings of the IVth International Symposium on
Genetics of Industrial Microorganisms１９８２）。
非グリコシル化されたプロウロキナーゼ(Saruplase) を
合成遺伝子の使用下に生成する(Brigelius-Flohe等、Ap
pl. Microbiol. Biotech. ３６，６４０（１９９
２））。
これは２つの形態でたん白質分解に活性なたん白質とし
てウリンから得ることができる：高分子ウロキナーゼ
（ＨＵＫ）及び低分子ウロキナーゼ（ＬＵＫ(Stump等、
J. Biol. Chem. ２６１，１２６７（１９８６））。Ｈ
ＵＫ及びＬＵＫは、ウロキナーゼの活性型、すなわち二
本鎖分子である。ウロキナーゼを一本鎖ウロキナーゼ
（プロウロキナーゼ）として種々の組織中に生成し、プ
ロ酵素として少量でヒト血液中で検出することができる
(Wun等、J. Biol. Chem. ２５７，３２７６（１９８
２））。プロウロキナーゼの活性型はＨＵＫとして５４
キロダルトンの分子量を有し、３個のドメインから成
る：アミノ- 末端成長因子- ドメイン、クリングル及び
セリン- プロテアーゼ- ドメイン(Guenzler 等、Hoppe-
Seyler's Z. Physiol. Chem.３６３，１１５５（１９８
２）；Steffens等、Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem.
３６３，１０４３（１９８２））。プロウロキナーゼ及
びプラスミノーゲンはプロ酵素として存在するけれど
も、プロウロキナーゼは内的活性のゆえにプラスミノー
ゲンを活性プラスミンに変えることができる。しかしこ
のプラスミノーゲン活性化因子は、生成されたプラスミ
ンそれ自体がプロウロキナーゼを 158リジン及び 159イ
ソロイシンの間で切断した後に初めて十分な活性を維持
する(Lijnen 等、J. Biol.Chem. ２６１，１２５３（１
９８６））。大腸菌中でウロキナーゼを遺伝子工学で産
生する方法は、Heyneker等によって初めて記載された(P
roceedings of the IVth International Symposium on
Genetics of Industrial Microorganisms１９８２）。
非グリコシル化されたプロウロキナーゼ(Saruplase) を
合成遺伝子の使用下に生成する(Brigelius-Flohe等、Ap
pl. Microbiol. Biotech. ３６，６４０（１９９
２））。
【０００７】ｔ- ＰＡは、血液中及び組織中に産生す
る、分子量７２キロダルトンのたん白質である。このプ
ラスミノーゲン活性化因子は５個のドメインから成る：
アミノ- 末端フィンガードメイン、成長- 因子- ドメイ
ン、クリングル一、クリングル２及びセリン- プロテア
ーゼ- ドメイン。プロウロキナーゼの様に、ｔ- ＰＡを
クリングル２とセリン- プロテアーゼ- ドメインの間、
すなわち 275Ａｒｇと276Ｉｌｅの間でプラスミン触媒
による切断によって活性な二本鎖型に変える。試験管内
試験及び動物実験による結果によればｔ- ＰＡはフィブ
リンと結合し、そしてその酵素活性はフィブリンによっ
て刺激されることが示されている(Collen 及び Lijnen,
Blood ７８，３１１４（１９９１））。ｔ- ＰＡのフ
ィブリン特異性によって、プラスミンが血液系全体中で
生成され、後にフィブリンばかりでなく、フィブリノー
ゲンも分解するのを回避しなければならない。この様な
系統的なプラスミノーゲン活性化並びにフィブリノーゲ
ンの著しい分解は望ましいものではない。というのはこ
れが出血の危険を高めるからである。いずれにせよ治療
実務で、前臨床実験から生じる、ｔ- ＰＡのフィブリン
特異性に関する期待は、満たされないことが明らかであ
る。またｔ- ＰＡの短い生物学的半減期のために、高い
投薬量を注入しなければならない。この投薬量はフィブ
リン特異性にもかかわらず系統的プラスミノーゲンの活
性化を生じる(Keyt 等、Proc. Natl. Acad. Sci. ９
１，３６７０（１９９４））。
る、分子量７２キロダルトンのたん白質である。このプ
ラスミノーゲン活性化因子は５個のドメインから成る：
アミノ- 末端フィンガードメイン、成長- 因子- ドメイ
ン、クリングル一、クリングル２及びセリン- プロテア
ーゼ- ドメイン。プロウロキナーゼの様に、ｔ- ＰＡを
クリングル２とセリン- プロテアーゼ- ドメインの間、
すなわち 275Ａｒｇと276Ｉｌｅの間でプラスミン触媒
による切断によって活性な二本鎖型に変える。試験管内
試験及び動物実験による結果によればｔ- ＰＡはフィブ
リンと結合し、そしてその酵素活性はフィブリンによっ
て刺激されることが示されている(Collen 及び Lijnen,
Blood ７８，３１１４（１９９１））。ｔ- ＰＡのフ
ィブリン特異性によって、プラスミンが血液系全体中で
生成され、後にフィブリンばかりでなく、フィブリノー
ゲンも分解するのを回避しなければならない。この様な
系統的なプラスミノーゲン活性化並びにフィブリノーゲ
ンの著しい分解は望ましいものではない。というのはこ
れが出血の危険を高めるからである。いずれにせよ治療
実務で、前臨床実験から生じる、ｔ- ＰＡのフィブリン
特異性に関する期待は、満たされないことが明らかであ
る。またｔ- ＰＡの短い生物学的半減期のために、高い
投薬量を注入しなければならない。この投薬量はフィブ
リン特異性にもかかわらず系統的プラスミノーゲンの活
性化を生じる(Keyt 等、Proc. Natl. Acad. Sci. ９
１，３６７０（１９９４））。
【０００８】ｒ- ＰＡ及びＴＮＫ- ｔ- ＰＡは、改良さ
れた性質を有するｔ- ＰＡ- 変異体である。ｒ- ＰＡ
（ＢＭ０６．０２２）の場合、最初の３つのｔ- ＰＡ-
ドメイン、すなわちフィンガードメイン、成長因子- ド
メイン及び第一クリンゲルを欠失するので、短くなった
分子は第二クリンゲルとプロテアーゼドメインしか含有
しない。ｒ- ＰＡに比してｒ- ＰＡは遺伝子工学で大腸
菌中に産生され、グリコシル化されない。ｔ- ＰＡはよ
り長い生物学的半減期を有し、より急速な再潅流(Reper
fusion) を生じる。動物実験で、ボルスとして投与され
るｒ- ＰＡはｔ-ＰＡ- 注入と同様に有効であることが
明らかである(Martin 等、J. Cardiovasc.Pharmacol.
１８，１１１（１９９１））。
れた性質を有するｔ- ＰＡ- 変異体である。ｒ- ＰＡ
（ＢＭ０６．０２２）の場合、最初の３つのｔ- ＰＡ-
ドメイン、すなわちフィンガードメイン、成長因子- ド
メイン及び第一クリンゲルを欠失するので、短くなった
分子は第二クリンゲルとプロテアーゼドメインしか含有
しない。ｒ- ＰＡに比してｒ- ＰＡは遺伝子工学で大腸
菌中に産生され、グリコシル化されない。ｔ- ＰＡはよ
り長い生物学的半減期を有し、より急速な再潅流(Reper
fusion) を生じる。動物実験で、ボルスとして投与され
るｒ- ＰＡはｔ-ＰＡ- 注入と同様に有効であることが
明らかである(Martin 等、J. Cardiovasc.Pharmacol.
１８，１１１（１９９１））。
【０００９】ｔ- ＰＡ- 変異体ＴＮＫ- ｔ- ＰＡは、次
の３つの点で天然ｔ- ＰＡと相違する： 103テオリンを
アスパラギンと交換、それによって新しいグリコシル化
部位を生じる； 117アスパラギンをグルタミンと交換、
それによってグリコシル化部位を除き、 296リジンと
299アルギニンの間の配列を４個の連続するアラニン-
単位と交換する。これらの３つの変異の組合せは、天然
ｔ- ＰＡに比してより高いフィブリン特異性及びより長
い生物学的半減期を有するポリペプチドを生じる。更
に、ＴＮＫ- ｔ- ＰＡは、天然ｔ- ＰＡに比して著しく
急速にＰＡＩ- １によって阻害される(Keyt 等、Proc.
Natl. Acad. Sci. ９１，３６７０（１９９４））。Ｔ
ＮＫ- ｔ- ＰＡの前駆体を用いて得られる動物実験の結
果は、ＴＮＫ- ｔ- ＰＡがボルス投与に適していること
を示している(Refino 等、Thromb. Haemost. ７０、３
１３（１９９３））。
の３つの点で天然ｔ- ＰＡと相違する： 103テオリンを
アスパラギンと交換、それによって新しいグリコシル化
部位を生じる； 117アスパラギンをグルタミンと交換、
それによってグリコシル化部位を除き、 296リジンと
299アルギニンの間の配列を４個の連続するアラニン-
単位と交換する。これらの３つの変異の組合せは、天然
ｔ- ＰＡに比してより高いフィブリン特異性及びより長
い生物学的半減期を有するポリペプチドを生じる。更
に、ＴＮＫ- ｔ- ＰＡは、天然ｔ- ＰＡに比して著しく
急速にＰＡＩ- １によって阻害される(Keyt 等、Proc.
Natl. Acad. Sci. ９１，３６７０（１９９４））。Ｔ
ＮＫ- ｔ- ＰＡの前駆体を用いて得られる動物実験の結
果は、ＴＮＫ- ｔ- ＰＡがボルス投与に適していること
を示している(Refino 等、Thromb. Haemost. ７０、３
１３（１９９３））。
【００１０】コウモリプラスミノーゲン活性化因子(bat
-PA)は、吸血コウモリ(FledermausDesmodus rotundus)
のつば中に見い出される。遺伝子工学で産生されたこれ
らのプラスミノーゲン活性化因子は、ｔ- ＰＡよりも更
に優れたフィブリン特異性を有し、動物実験で、高めら
れた生物学的半減期及び減少された系統的プラスミノー
ゲン活性化と共に改良された血栓溶解を示す(Gardell
等、Circulation ８４，２４４（１９９１））。
-PA)は、吸血コウモリ(FledermausDesmodus rotundus)
のつば中に見い出される。遺伝子工学で産生されたこれ
らのプラスミノーゲン活性化因子は、ｔ- ＰＡよりも更
に優れたフィブリン特異性を有し、動物実験で、高めら
れた生物学的半減期及び減少された系統的プラスミノー
ゲン活性化と共に改良された血栓溶解を示す(Gardell
等、Circulation ８４，２４４（１９９１））。
【００１１】血栓症疾患の治療に於て、プラスミノーゲ
ン活性化因子を一般に血液凝固阻止物質、たとえばヘパ
リンと一緒に投与する。それによってプラスミノーゲン
活性化因子での単独処理に於けるよりも改良された血栓
溶解が得られる(Tebbe等、Z.Kardiol. ８０，Suppl.
３，３２（１９９１））。臨床から得られた種々の所見
は、血栓の溶解に平行して高められた血液凝固傾向を生
じることを示している(Szczeklik等、Arterioscl. Thro
mb. １２，５４８（１９９２）；Goto等、Angiology ４
５，２７３（１９９４））。このことは血栓中に包含さ
れ、血餅の溶解の際に再び遊離されるトロンビン分子が
原因になっていると考えられる。更に、プラスミノーゲ
ン活性化因子それ自体もプロトロンビンの活性化を促進
し、それ故に血栓溶解を押さえるはたらきをすることが
示されている（Brommer 及びMeijer, Thromb. Haemosta
s.７０，９９５（１９９３））。血液凝固阻止物質、た
とえばヘパリン、ヒルゲン、ヒルジン、アルガドロバ
ン、プロテインＣ及び組換え型ダニ血液凝固阻止ペプチ
ド（ＴＡＰ）は、血栓溶解の間、強められた再閉塞傾向
を阻止し、それ故に溶解治療の結果を改良する(Yao等、
Am. J. Physiol.２６２（Heart Circ. Physiol.３１）
Ｈ３４７−Ｈ３７９（１９９２）；Schneider, Theomb.
Res. ６４，６６７（１９９１）；Gruber等、Circulat
ion８４，２４５４（１９９１）；Martin等、J. Am. Co
ll. Cardiol. ２２，９１４（１９９３）；Vlasuk等、C
irculation ８４，Suppl.ＩＩ−４６７（１９９１）。
ン活性化因子を一般に血液凝固阻止物質、たとえばヘパ
リンと一緒に投与する。それによってプラスミノーゲン
活性化因子での単独処理に於けるよりも改良された血栓
溶解が得られる(Tebbe等、Z.Kardiol. ８０，Suppl.
３，３２（１９９１））。臨床から得られた種々の所見
は、血栓の溶解に平行して高められた血液凝固傾向を生
じることを示している(Szczeklik等、Arterioscl. Thro
mb. １２，５４８（１９９２）；Goto等、Angiology ４
５，２７３（１９９４））。このことは血栓中に包含さ
れ、血餅の溶解の際に再び遊離されるトロンビン分子が
原因になっていると考えられる。更に、プラスミノーゲ
ン活性化因子それ自体もプロトロンビンの活性化を促進
し、それ故に血栓溶解を押さえるはたらきをすることが
示されている（Brommer 及びMeijer, Thromb. Haemosta
s.７０，９９５（１９９３））。血液凝固阻止物質、た
とえばヘパリン、ヒルゲン、ヒルジン、アルガドロバ
ン、プロテインＣ及び組換え型ダニ血液凝固阻止ペプチ
ド（ＴＡＰ）は、血栓溶解の間、強められた再閉塞傾向
を阻止し、それ故に溶解治療の結果を改良する(Yao等、
Am. J. Physiol.２６２（Heart Circ. Physiol.３１）
Ｈ３４７−Ｈ３７９（１９９２）；Schneider, Theomb.
Res. ６４，６６７（１９９１）；Gruber等、Circulat
ion８４，２４５４（１９９１）；Martin等、J. Am. Co
ll. Cardiol. ２２，９１４（１９９３）；Vlasuk等、C
irculation ８４，Suppl.ＩＩ−４６７（１９９１）。
【００１２】強められたトロンビン阻害剤の１つは、６
５個のアミノ酸から成る、チスイビル(Hirudo medicina
les)から得られるヒルジンである。いくつかのアミノ酸
が異なる種々のヒルジン- 同型が得られる。すべてのヒ
ルジン- 同型はトロンビンと物質、たとえばフィブリノ
ーゲンとの結合及びトロンビンの活性中心を遮断する(R
ydel等、Science ２４９，２７７（１９９０）；Bode及
びHuber, MolecularAspects of Inflammation, スプリ
ンガー、ベルリン、ハイデルベルク, １０３−１１５
（１９９１）；Stone 及び Hofsteenge, Prot. Enfinee
ring ２，２９５（１９９１）；Dodt等、Biol. Chem.
Hoppe-Seyler ３６６，３７９（１９８５）．更にヒル
ジンから生じる小さい分子は公知であり、これは同様に
トロンビン阻害活性を有する(Maraganore 等、Biochemi
stry ２９，７０９５（１９９０）；Krstenansky 等、
J. Med. Chem. ３０，１６８８（１９８７）；Yue 等、
Prot. Engineering ５，７７（１９９２））。
５個のアミノ酸から成る、チスイビル(Hirudo medicina
les)から得られるヒルジンである。いくつかのアミノ酸
が異なる種々のヒルジン- 同型が得られる。すべてのヒ
ルジン- 同型はトロンビンと物質、たとえばフィブリノ
ーゲンとの結合及びトロンビンの活性中心を遮断する(R
ydel等、Science ２４９，２７７（１９９０）；Bode及
びHuber, MolecularAspects of Inflammation, スプリ
ンガー、ベルリン、ハイデルベルク, １０３−１１５
（１９９１）；Stone 及び Hofsteenge, Prot. Enfinee
ring ２，２９５（１９９１）；Dodt等、Biol. Chem.
Hoppe-Seyler ３６６，３７９（１９８５）．更にヒル
ジンから生じる小さい分子は公知であり、これは同様に
トロンビン阻害活性を有する(Maraganore 等、Biochemi
stry ２９，７０９５（１９９０）；Krstenansky 等、
J. Med. Chem. ３０，１６８８（１９８７）；Yue 等、
Prot. Engineering ５，７７（１９９２））。
【００１３】ヒルジンをプラスミノーゲン活性化因子と
組合せて、血栓症疾患に使用することは、ヨーロッパ特
許第３２８９５７号及び第３６５４６８号明細書中に記
載されている。ヒルジン誘導体を血栓溶解剤と組合せて
使用することは、国際特許出願ＷＯ９１／０１１４２か
ら公知である。ヒルリンはチスイビル(Hirudo manillen
sis)から単離された６１個のアミノ酸を有するたん白質
である。ヒルリンはその作用及び阻害強度の点でヒルジ
ンと同等であるが、アミノ酸配列の点でヒルジンと著し
く異なる。ヒルリンから、トロンビンを極めて良好に阻
害するより小さい分子を生じることもできる(Krstenans
ky等、Febs Lett. ２６９，４６５（１９９０））。
組合せて、血栓症疾患に使用することは、ヨーロッパ特
許第３２８９５７号及び第３６５４６８号明細書中に記
載されている。ヒルジン誘導体を血栓溶解剤と組合せて
使用することは、国際特許出願ＷＯ９１／０１１４２か
ら公知である。ヒルリンはチスイビル(Hirudo manillen
sis)から単離された６１個のアミノ酸を有するたん白質
である。ヒルリンはその作用及び阻害強度の点でヒルジ
ンと同等であるが、アミノ酸配列の点でヒルジンと著し
く異なる。ヒルリンから、トロンビンを極めて良好に阻
害するより小さい分子を生じることもできる(Krstenans
ky等、Febs Lett. ２６９，４６５（１９９０））。
【００１４】更に、トロンビンを、ヒトトロンビンレセ
プターのアミノ- 末端配列から生じるペプチドによって
阻害することもできる(Vu 等、Nature ２５３，６７４
（１９９１））。このトロンビンレセプターは、細胞外
のアミノ- 末端域でに隣接する切断部位を有するトロン
ビン結合配列をトロンビンに対して有する。この配列
は、切断部位を42セリンから42フエニルアラニンに交換
することによってマスクする場合、トロンビンを阻害す
ることができる。
プターのアミノ- 末端配列から生じるペプチドによって
阻害することもできる(Vu 等、Nature ２５３，６７４
（１９９１））。このトロンビンレセプターは、細胞外
のアミノ- 末端域でに隣接する切断部位を有するトロン
ビン結合配列をトロンビンに対して有する。この配列
は、切断部位を42セリンから42フエニルアラニンに交換
することによってマスクする場合、トロンビンを阻害す
ることができる。
【００１５】アンチスタシン及びＴＡＰは因子Ｘａの阻
害剤である。アンチスタシンは、１１９個のアミノ酸を
包含する、チスイビル(Haementeria ghiliani)から得ら
れるたん白質であり、これはヒルジンと相似する配列は
有しない(Tuszynski等、J.Biol. Chem. ２６２，９７１
８（１９８７）；Nutt等、J. Biol. Chem.２６３，１０
１６２（１９８８）；Condra等、Thromb. Haemostas.６
１，４３７（１９８９））。アンチスタミン組換型の産
生は、Han 等、Gene ７５，４７（１９８９）に記載さ
れている。
害剤である。アンチスタシンは、１１９個のアミノ酸を
包含する、チスイビル(Haementeria ghiliani)から得ら
れるたん白質であり、これはヒルジンと相似する配列は
有しない(Tuszynski等、J.Biol. Chem. ２６２，９７１
８（１９８７）；Nutt等、J. Biol. Chem.２６３，１０
１６２（１９８８）；Condra等、Thromb. Haemostas.６
１，４３７（１９８９））。アンチスタミン組換型の産
生は、Han 等、Gene ７５，４７（１９８９）に記載さ
れている。
【００１６】ＴＡＰは６０個のアミノ酸を包含するマダ
ニ(Onithodoros moubata) から得られるたん白質であ
り、これも遺伝子工学で産生することができる。ＴＡＰ
は因子Ｘａと可逆的に結合し、それによってトロンビン
の形成を押えるはたらきをする。種々の血栓症モデル
で、ＴＡＰはヒルジン又はヘパリンと同様に有効である
(Vlasuk, Thromb. Haemost. ７０，２１２（１９９
３）；Schaffer等、Circulation ８４，１７４１（１９
９１））。
ニ(Onithodoros moubata) から得られるたん白質であ
り、これも遺伝子工学で産生することができる。ＴＡＰ
は因子Ｘａと可逆的に結合し、それによってトロンビン
の形成を押えるはたらきをする。種々の血栓症モデル
で、ＴＡＰはヒルジン又はヘパリンと同様に有効である
(Vlasuk, Thromb. Haemost. ７０，２１２（１９９
３）；Schaffer等、Circulation ８４，１７４１（１９
９１））。
【００１７】Phaneuf 等は Thromb. Haemost. ７１，４
８１（１９９４）に、ストレプトキナーゼ及びヒルジン
の偶発性化学結合から成る複合体が記載されている。し
かしプラスミノーゲンを活性化する能力は、このストレ
プトキナーゼ- ヒルジン- 複合体の場合非修飾のストレ
プトキナーゼ下で因子８あたりにある。
８１（１９９４）に、ストレプトキナーゼ及びヒルジン
の偶発性化学結合から成る複合体が記載されている。し
かしプラスミノーゲンを活性化する能力は、このストレ
プトキナーゼ- ヒルジン- 複合体の場合非修飾のストレ
プトキナーゼ下で因子８あたりにある。
【００１８】
【発明を解決しようとする課題】本発明による課題は、
極めて短い時間内で完全な血栓溶解を生じさせ、同時に
血管の再度の閉塞を、まず第一に有効な血栓溶解後に阻
害する、血栓症が原因の血管閉塞を治療するための有効
物質を開発することである。更に、この有効物質を用い
て系統的プラスミノーゲン活性化因子を回避しなければ
ならない。
極めて短い時間内で完全な血栓溶解を生じさせ、同時に
血管の再度の閉塞を、まず第一に有効な血栓溶解後に阻
害する、血栓症が原因の血管閉塞を治療するための有効
物質を開発することである。更に、この有効物質を用い
て系統的プラスミノーゲン活性化因子を回避しなければ
ならない。
【００１９】
【問題を解決するための手段】本発明者は、プラスミノ
ーゲンを活性化するアミノ酸配列のＮ- 及び（又は）Ｃ
- 最終末端にトロンビン- 及び（又は）因子Ｘａを阻害
するアミノ酸配列を有する有効物質に対して求められる
高い要求が、繊維素溶解性質を有するたん白質によって
かなえられることを見い出した。
ーゲンを活性化するアミノ酸配列のＮ- 及び（又は）Ｃ
- 最終末端にトロンビン- 及び（又は）因子Ｘａを阻害
するアミノ酸配列を有する有効物質に対して求められる
高い要求が、繊維素溶解性質を有するたん白質によって
かなえられることを見い出した。
【００２０】したがって、本発明の対象は、プラスミノ
ーゲンを活性化するアミノ酸配列のＮ- 及び（又は）Ｃ
- 末端で、トロンビン及び（又は）因子Ｘａを阻害する
アミノ酸配列と結合する、繊維素溶解性の血液凝固阻害
性質を有するたん白質に於て、非グリコシル化されたプ
ロウロキナーゼのプラスミノーゲンを活性化するアミノ
酸配列47Ｓｅｒ〜 411ＬｅｕがＣ- 最終末端で式
ーゲンを活性化するアミノ酸配列のＮ- 及び（又は）Ｃ
- 末端で、トロンビン及び（又は）因子Ｘａを阻害する
アミノ酸配列と結合する、繊維素溶解性の血液凝固阻害
性質を有するたん白質に於て、非グリコシル化されたプ
ロウロキナーゼのプラスミノーゲンを活性化するアミノ
酸配列47Ｓｅｒ〜 411ＬｅｕがＣ- 最終末端で式
【００２１】
【化４】
【００２２】（式中Ｔ1 はＰｒｏ又はＶａｌ、Ｔ2 はＬ
ｅｕ又はＰｒｏとＧｌｙとの間の直接結合、Ｔ3 はＧｌ
ｎ又はヒドロキシル基を示す。）のヘプチド配列と結合
するたん白質は除外されることを特徴とする、上記たん
白質である。繊維素溶解性の血液凝固阻害性質を有する
好ましいたん白質は、プラスミノーゲンを活性化するア
ミノ酸配列は、プロウロキナーゼの不変化アミノ酸配
列；欠失、置換、挿入及び（又は）付加によって修飾さ
れたプロウロキナーゼのアミノ酸配列の少なくとも１
種、ウロキナーゼの不変化アミノ酸配列；欠失、置換、
挿入及び（又は）付加によって修飾されたウロキナーゼ
のアミノ酸配列少なくとも１種、組織プラスミノーゲン
活性化因子（ｔ- ＰＡ）不変化アミノ酸配列；欠失、置
換、挿入及び（又は）付加によって修飾されたｔ- ＰＡ
のアミノ酸配列、コウモリ- プラスミノーゲン活性化因
子（ｂａｔ- ＰＡ）の不変化アミノ酸配列；欠失、置
換、挿入及び（又は）付加によって修飾されたｂａｔ-
ＰＡのアミノ酸配列少なくとも１種及び（又は）ストレ
プトキナーゼ、スタフィロキナーゼ及び（又は）ＡＰＳ
ＡＣのアミノ酸配列を含有する。
ｅｕ又はＰｒｏとＧｌｙとの間の直接結合、Ｔ3 はＧｌ
ｎ又はヒドロキシル基を示す。）のヘプチド配列と結合
するたん白質は除外されることを特徴とする、上記たん
白質である。繊維素溶解性の血液凝固阻害性質を有する
好ましいたん白質は、プラスミノーゲンを活性化するア
ミノ酸配列は、プロウロキナーゼの不変化アミノ酸配
列；欠失、置換、挿入及び（又は）付加によって修飾さ
れたプロウロキナーゼのアミノ酸配列の少なくとも１
種、ウロキナーゼの不変化アミノ酸配列；欠失、置換、
挿入及び（又は）付加によって修飾されたウロキナーゼ
のアミノ酸配列少なくとも１種、組織プラスミノーゲン
活性化因子（ｔ- ＰＡ）不変化アミノ酸配列；欠失、置
換、挿入及び（又は）付加によって修飾されたｔ- ＰＡ
のアミノ酸配列、コウモリ- プラスミノーゲン活性化因
子（ｂａｔ- ＰＡ）の不変化アミノ酸配列；欠失、置
換、挿入及び（又は）付加によって修飾されたｂａｔ-
ＰＡのアミノ酸配列少なくとも１種及び（又は）ストレ
プトキナーゼ、スタフィロキナーゼ及び（又は）ＡＰＳ
ＡＣのアミノ酸配列を含有する。
【００２３】本発明によるたん白質中でプラスミノーゲ
ンを活性化するアミノ酸配列は、プロウロキナーゼの不
変化アミノ酸配列；欠失、置換、挿入及び（又は）付加
によって修飾されたプロウロキナーゼのアミノ酸配列少
なくとも１種、ｔ- ＰＡの不変化及び（又は）欠失、置
換、挿入及び（又は）付加によって修飾された、ｔ-Ｐ
Ａのアミノ酸配列少なくとも１種を含有する。特に好ま
しいたん白質は、そのプラスミノーゲンを活性化するア
ミノ酸配列が、不変化の、アミノ酸４１１個から成るプ
ロウロキナーゼの配列から、プロウロキナーゼのアミノ
酸配列47Ｓｅｒ〜 411Ｌｅｕから、プロウロキナーゼの
アミノ酸配列 138Ｓｅｒ〜 411Ｌｅｕから、不変化の、
アミノ酸５２７個から成るｔ- ＰＡの配列から、ｔ- Ｐ
Ａのアミノ酸配列Ｓｅｒ−89Ａｒｇ〜 527Ｐｒｏから及
び（又は）ｔ- ＰＡのアミノ酸配列 174Ｓｅｒ〜 527Ｐ
ｒｏから成る。
ンを活性化するアミノ酸配列は、プロウロキナーゼの不
変化アミノ酸配列；欠失、置換、挿入及び（又は）付加
によって修飾されたプロウロキナーゼのアミノ酸配列少
なくとも１種、ｔ- ＰＡの不変化及び（又は）欠失、置
換、挿入及び（又は）付加によって修飾された、ｔ-Ｐ
Ａのアミノ酸配列少なくとも１種を含有する。特に好ま
しいたん白質は、そのプラスミノーゲンを活性化するア
ミノ酸配列が、不変化の、アミノ酸４１１個から成るプ
ロウロキナーゼの配列から、プロウロキナーゼのアミノ
酸配列47Ｓｅｒ〜 411Ｌｅｕから、プロウロキナーゼの
アミノ酸配列 138Ｓｅｒ〜 411Ｌｅｕから、不変化の、
アミノ酸５２７個から成るｔ- ＰＡの配列から、ｔ- Ｐ
Ａのアミノ酸配列Ｓｅｒ−89Ａｒｇ〜 527Ｐｒｏから及
び（又は）ｔ- ＰＡのアミノ酸配列 174Ｓｅｒ〜 527Ｐ
ｒｏから成る。
【００２４】トロンビン及び（又は）因子Ｘａを阻害す
るアミノ酸配列は、ヒルジン性質を有するアミノ酸配列
少なくとも１種、ヒトのトロンビンレセプターから生じ
るアミノ酸配列少なくとも１種、ヒルリン性質を有する
アミノ酸配列少なくとも１種、アンチスタミン及び（又
は）ダニ抗凝血物質ペプチド（ＴＡＰ）を含有する。ト
ロンビン及び（又は）因子Ｘａを阻害するアミノ酸配列
は、ヒルジンヒトトロンビンレセプターから生じるアミ
ノ酸配列少なくとも１種及び（又は）ヒルリン性質を有
するアミノ酸配列少なくとも１種を含有するのが好まし
い。
るアミノ酸配列は、ヒルジン性質を有するアミノ酸配列
少なくとも１種、ヒトのトロンビンレセプターから生じ
るアミノ酸配列少なくとも１種、ヒルリン性質を有する
アミノ酸配列少なくとも１種、アンチスタミン及び（又
は）ダニ抗凝血物質ペプチド（ＴＡＰ）を含有する。ト
ロンビン及び（又は）因子Ｘａを阻害するアミノ酸配列
は、ヒルジンヒトトロンビンレセプターから生じるアミ
ノ酸配列少なくとも１種及び（又は）ヒルリン性質を有
するアミノ酸配列少なくとも１種を含有するのが好まし
い。
【００２５】特に、トロンビン及び（又は）因子Ｘａを
阻害するアミノ酸配列は、ヒルジン性質を有するアミノ
酸配列としてアミノ酸６５個から成るヒルジンの配列、
及び（又は）式
阻害するアミノ酸配列は、ヒルジン性質を有するアミノ
酸配列としてアミノ酸６５個から成るヒルジンの配列、
及び（又は）式
【００２６】
【化５】
【００２７】このアミノ酸配列中、Ｔ1 はＰｒｏ又はＶ
ａｌ、Ｔ2 はＬｅｕ又はＰｒｏとＧｌｙの間の直接結
合、Ｔ3 はＧｌｎ、ヒドロキシル基又は隣接するアミノ
酸への直接結合、Ｔ4 はＭｅｔ、Ｉｌｅ又は隣接するア
ミノ酸への直接結合、Ｔ5 はＭｅｔ又は隣接するアミノ
酸への直接結合を示す。プラスミノーゲンを活性化する
アミノ酸配列は、Ｎ- 及び（又は）Ｃ- 最終末端でイソ
ロイシンを介して又は一般式
ａｌ、Ｔ2 はＬｅｕ又はＰｒｏとＧｌｙの間の直接結
合、Ｔ3 はＧｌｎ、ヒドロキシル基又は隣接するアミノ
酸への直接結合、Ｔ4 はＭｅｔ、Ｉｌｅ又は隣接するア
ミノ酸への直接結合、Ｔ5 はＭｅｔ又は隣接するアミノ
酸への直接結合を示す。プラスミノーゲンを活性化する
アミノ酸配列は、Ｎ- 及び（又は）Ｃ- 最終末端でイソ
ロイシンを介して又は一般式
【００２８】
【化６】
【００２９】のペプチド配列を介してトロンビン及び
（又は）因子Ｘａを阻害するアミノ酸配列と直接結合す
る。架橋配列の変化可能な成分は、次の意味を有する：
Ｘ1 はＰｒｏ又はＬｅｕ、Ｘ2 はＧｌｙ、Ｖａｌ又はＰ
ｒｏ、Ｘ3 はＬｙｓ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ又はＧｌ
ｕ、Ｘ4 はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ又はＩｌ
ｅ、Ｘ5 はＧｌｙ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａ
ｌ、Ｘ6 はＧｌｙ、Ｐｒｏ又は隣接するアミノ酸への直
接結合、Ｘ7 はＩｌｅ又は隣接するアミノ酸への直接結
合を示す。
（又は）因子Ｘａを阻害するアミノ酸配列と直接結合す
る。架橋配列の変化可能な成分は、次の意味を有する：
Ｘ1 はＰｒｏ又はＬｅｕ、Ｘ2 はＧｌｙ、Ｖａｌ又はＰ
ｒｏ、Ｘ3 はＬｙｓ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ又はＧｌ
ｕ、Ｘ4 はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ又はＩｌ
ｅ、Ｘ5 はＧｌｙ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａ
ｌ、Ｘ6 はＧｌｙ、Ｐｒｏ又は隣接するアミノ酸への直
接結合、Ｘ7 はＩｌｅ又は隣接するアミノ酸への直接結
合を示す。
【００３０】公知のプラスミノーゲン活性化因子；プラ
スミノーゲン活性化因子とトロンビン阻害剤とから成る
公知の混合物並びに公知のストレプトキナーゼ- ヒルジ
ン-複合体に比して、本発明によるたん白質は良好にト
ロンビンを阻害する性質と共に、強められた繊維素溶解
作用の点で優れている。更に本発明によるポリペプチド
によってプラズマフィブリノーゲンが明らかにより僅か
な量で消費される。これから結果として生じるフィブリ
ン特異性、特にプラスミノーゲン活性化因子とトロンビ
ン阻害剤との公知の混合物と比較しても著しく高められ
たフィブリン特異性は次のことを生じさせる。それは血
液の凝固性にほんの僅かにしか影響を与えず、そして制
御されていない出血の危険を系統的フィブリノーゲン分
解の起こりうる併発症として最も少なくすることであ
る。したがって本発明によるたん白質の高いフィブリン
特異性は、公知の血栓溶解剤のボルス投与に比して明ら
かに減少された出血の危険を有するボルス投与を可能に
する。
スミノーゲン活性化因子とトロンビン阻害剤とから成る
公知の混合物並びに公知のストレプトキナーゼ- ヒルジ
ン-複合体に比して、本発明によるたん白質は良好にト
ロンビンを阻害する性質と共に、強められた繊維素溶解
作用の点で優れている。更に本発明によるポリペプチド
によってプラズマフィブリノーゲンが明らかにより僅か
な量で消費される。これから結果として生じるフィブリ
ン特異性、特にプラスミノーゲン活性化因子とトロンビ
ン阻害剤との公知の混合物と比較しても著しく高められ
たフィブリン特異性は次のことを生じさせる。それは血
液の凝固性にほんの僅かにしか影響を与えず、そして制
御されていない出血の危険を系統的フィブリノーゲン分
解の起こりうる併発症として最も少なくすることであ
る。したがって本発明によるたん白質の高いフィブリン
特異性は、公知の血栓溶解剤のボルス投与に比して明ら
かに減少された出血の危険を有するボルス投与を可能に
する。
【００３１】したがってもう１つの本発明の対象は、本
発明によるたん白質を有効物質として含有する血栓溶解
剤である。血栓症の原因となる血管閉塞、たとえば心筋
梗塞、脳梗塞、末梢の急性動脈閉塞、肺塞栓及び深在性
下肢- 及び骨盤静脈血栓症に、本発明によるポリペプチ
ド０．１〜１ｍｇ／ｋｇが必要である。本発明によるた
ん白質は静脈内にボルス注射又は注入によって投与され
る。本発明によるたん白質──その血液凝固阻害性質は
専らトロンビン阻害アミノ酸配列に又はトロンビン及び
因子Ｘａを阻害するアミノ酸配列に帰因する──は特に
慢性血栓症患者、たとえば深在性静脈血栓症又は不安定
な狭心症の治療に適する。
発明によるたん白質を有効物質として含有する血栓溶解
剤である。血栓症の原因となる血管閉塞、たとえば心筋
梗塞、脳梗塞、末梢の急性動脈閉塞、肺塞栓及び深在性
下肢- 及び骨盤静脈血栓症に、本発明によるポリペプチ
ド０．１〜１ｍｇ／ｋｇが必要である。本発明によるた
ん白質は静脈内にボルス注射又は注入によって投与され
る。本発明によるたん白質──その血液凝固阻害性質は
専らトロンビン阻害アミノ酸配列に又はトロンビン及び
因子Ｘａを阻害するアミノ酸配列に帰因する──は特に
慢性血栓症患者、たとえば深在性静脈血栓症又は不安定
な狭心症の治療に適する。
【００３２】本発明による血栓溶解剤は、少なくとも１
種の本発明によるポリペプチドの他に助剤、たとえば賦
形剤、溶剤、希釈剤、染料及び結合剤を含有する。これ
らの助剤の選択並びにその使用すべき量それ自体は、薬
剤が投与されてよいこと、及び薬剤が当業者に問題なく
調製されることに依る。本発明によるたん白質の産生
は、遺伝子工学の方法によって行われる。更に、対応す
る遺伝子を、合成オリゴヌクレオチドから適当なプラス
ミド中に定着し、これはｔｒｐ- 又はｔａｃ- プロモー
ターの制御下、特にｔｒｐ- プロモーターの制御下に大
腸菌中で発現する。
種の本発明によるポリペプチドの他に助剤、たとえば賦
形剤、溶剤、希釈剤、染料及び結合剤を含有する。これ
らの助剤の選択並びにその使用すべき量それ自体は、薬
剤が投与されてよいこと、及び薬剤が当業者に問題なく
調製されることに依る。本発明によるたん白質の産生
は、遺伝子工学の方法によって行われる。更に、対応す
る遺伝子を、合成オリゴヌクレオチドから適当なプラス
ミド中に定着し、これはｔｒｐ- 又はｔａｃ- プロモー
ターの制御下、特にｔｒｐ- プロモーターの制御下に大
腸菌中で発現する。
【００３３】したがって本発明の対象は、本発明による
たん白質を産生する際に使用するプラスミドにもあり、
そのオペロンは制御可能なプロモーター、リボソーム結
合部位として有効なシャイン・ダルガーノ配列、開始コ
ドン、本発明によるたん白質に対する合成構造遺伝子及
び構造遺伝子から上流へターミネーター１又は２個を有
する。
たん白質を産生する際に使用するプラスミドにもあり、
そのオペロンは制御可能なプロモーター、リボソーム結
合部位として有効なシャイン・ダルガーノ配列、開始コ
ドン、本発明によるたん白質に対する合成構造遺伝子及
び構造遺伝子から上流へターミネーター１又は２個を有
する。
【００３４】本発明によるプラスミドの発現を、大腸菌
株、特にグループＫ１２の大腸菌、たとえばＥ．ｃｏｌ
ｉ Ｋ１２ ＪＭ１０１（ＡＴＣＣ３３８７６）、Ｅ．
ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＭ１０３（ＡＴＣＣ３９４０
３）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ＪＭ１０５（ＤＳＭ４１６
２）及びＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３
８４９）中で行う。細菌細胞中に、本発明によるポリペ
プチドは、たん白質が変性された形で存在する封入体の
形で高収率で生じる。封入体の単離後、変性されたたん
白質をたん白質化学でレドックス系の作用下所望の三次
構造に折りたたむ。
株、特にグループＫ１２の大腸菌、たとえばＥ．ｃｏｌ
ｉ Ｋ１２ ＪＭ１０１（ＡＴＣＣ３３８７６）、Ｅ．
ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＭ１０３（ＡＴＣＣ３９４０
３）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ＪＭ１０５（ＤＳＭ４１６
２）及びＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３
８４９）中で行う。細菌細胞中に、本発明によるポリペ
プチドは、たん白質が変性された形で存在する封入体の
形で高収率で生じる。封入体の単離後、変性されたたん
白質をたん白質化学でレドックス系の作用下所望の三次
構造に折りたたむ。
【００３５】
【実施例】次に例によって本発明を説明する。 〔例１〕本発明によるたん白質の産生、単離及び精製。 ａ）定着処理 大腸菌中で本発明によるポリペプチドを遺伝子工学によ
る産生に使用される発現プラスミドを公知の方法で生成
する。各生成工程の順序を図１〜１７に示す。プラスミ
ド生成の出発物は、プラスミド pBlueskript ＫＳＩＩ
＋(Stratagene社、ハイデルベルグ）、ｐＵＣ８及びｐ
ＳＬ１１９０（Pharmacia 社、フライブルグ）並びにｐ
ＧＲ２０１である。ｐＧＲ２０１は、ヨーロッパ特許第
４０８９４５号明細書及び Appl. Microbiol. Biotech
n. ３６，６４０−６４９（１９９２）に記載されてい
るプラスミドｐＢＦ１６０と同一である。制限エンドヌ
クレアーゼBan II, BamHI, ClaI, HindIII, NcoI, Nde
I, NheI, SacI及びXbaI並びにＤＮＡ- 修飾された酵
素、たとえばアルカリ性ホスファターゼ、Ｔ４- リガー
ゼ、Ｔ４- キナーゼ及びＴ７- ポリメラーゼを Pharmac
ia社、Stratagene社、Boehringer Mannheim 及び Gibco
（エゲンシュタイン）から入手する。その生成の間のプ
ラスミドの変化を、制限分析及びＤＮＡ- 配列分析によ
って検査する。ＤＮＡ- 配列分析を製造者の説明書に従
って Pharmacia社の試薬コレクションを用いて行う。プ
ラスミドの生成にあたり、種々のオリゴデスオキシリボ
ヌクレオチド(Oligos)を使用し、その配列を、関連する
表示と共に表１中に記載する。
る産生に使用される発現プラスミドを公知の方法で生成
する。各生成工程の順序を図１〜１７に示す。プラスミ
ド生成の出発物は、プラスミド pBlueskript ＫＳＩＩ
＋(Stratagene社、ハイデルベルグ）、ｐＵＣ８及びｐ
ＳＬ１１９０（Pharmacia 社、フライブルグ）並びにｐ
ＧＲ２０１である。ｐＧＲ２０１は、ヨーロッパ特許第
４０８９４５号明細書及び Appl. Microbiol. Biotech
n. ３６，６４０−６４９（１９９２）に記載されてい
るプラスミドｐＢＦ１６０と同一である。制限エンドヌ
クレアーゼBan II, BamHI, ClaI, HindIII, NcoI, Nde
I, NheI, SacI及びXbaI並びにＤＮＡ- 修飾された酵
素、たとえばアルカリ性ホスファターゼ、Ｔ４- リガー
ゼ、Ｔ４- キナーゼ及びＴ７- ポリメラーゼを Pharmac
ia社、Stratagene社、Boehringer Mannheim 及び Gibco
（エゲンシュタイン）から入手する。その生成の間のプ
ラスミドの変化を、制限分析及びＤＮＡ- 配列分析によ
って検査する。ＤＮＡ- 配列分析を製造者の説明書に従
って Pharmacia社の試薬コレクションを用いて行う。プ
ラスミドの生成にあたり、種々のオリゴデスオキシリボ
ヌクレオチド(Oligos)を使用し、その配列を、関連する
表示と共に表１中に記載する。
【００３６】オリゴデスオキシリボヌクレオチドを、脱
トリチル化された形で０．１μＭｏｌ- スケールで、工
場で適用されるバイオシステム(Weitersadt)の合成酵素
（モデル３９１）を用いて製造者の説明書に従ってβ-
シアノエチル- 保護されたジイソプロピルアミノホスホ
アミジトの使用下に行う。夫々１００ｐｍｏｌのオリゴ
デスオキシリボヌクレオチドを、５０ｍＭトリ（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン／ＨＣｌ（トリス／ＨＣ
ｌ）、１０ｍＭ塩化マグネシウム及び５ｍＭジチオスレ
イトール中で７．５のｐＨ- 値で酵素単位Ｔ４- キナー
ゼを用いて１０ｍＭアデノシントリホスフアートの存在
下にホスホリル化し、次いで同一の緩衝液中で二本鎖Ｄ
ＮＡ- 分子に変える。得られた合成の二本鎖ＤＮＡ- 分
子をゲル電気泳動によってポリアクリルアミドゲル（５
％ポリアクリルアミド）上で精製し、次いで前もって調
製されたプラスミドとの連結反応に使用する。制限酵素
で消化、対応する制限フラグメントの単離及び５'-末端
の脱ホスホリル化、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＭ１０３
中での引き続きの連結反応及び形質転換並びにすべての
他の遺伝子工学処理によるプラスミドの前もっての調製
は、公知方法で行われ、Sambrook等、"Molecular Cloni
ng: A Laboratory Manual", 2. Auflage, ColdSpring H
arbor Laboratory Press, Cold Spring Harbour, アメ
リカ, １９８９中に記載されている。
トリチル化された形で０．１μＭｏｌ- スケールで、工
場で適用されるバイオシステム(Weitersadt)の合成酵素
（モデル３９１）を用いて製造者の説明書に従ってβ-
シアノエチル- 保護されたジイソプロピルアミノホスホ
アミジトの使用下に行う。夫々１００ｐｍｏｌのオリゴ
デスオキシリボヌクレオチドを、５０ｍＭトリ（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン／ＨＣｌ（トリス／ＨＣ
ｌ）、１０ｍＭ塩化マグネシウム及び５ｍＭジチオスレ
イトール中で７．５のｐＨ- 値で酵素単位Ｔ４- キナー
ゼを用いて１０ｍＭアデノシントリホスフアートの存在
下にホスホリル化し、次いで同一の緩衝液中で二本鎖Ｄ
ＮＡ- 分子に変える。得られた合成の二本鎖ＤＮＡ- 分
子をゲル電気泳動によってポリアクリルアミドゲル（５
％ポリアクリルアミド）上で精製し、次いで前もって調
製されたプラスミドとの連結反応に使用する。制限酵素
で消化、対応する制限フラグメントの単離及び５'-末端
の脱ホスホリル化、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＭ１０３
中での引き続きの連結反応及び形質転換並びにすべての
他の遺伝子工学処理によるプラスミドの前もっての調製
は、公知方法で行われ、Sambrook等、"Molecular Cloni
ng: A Laboratory Manual", 2. Auflage, ColdSpring H
arbor Laboratory Press, Cold Spring Harbour, アメ
リカ, １９８９中に記載されている。
【００３７】
【表１】
【００３８】ｂ）連続培養及び発酵の調製。 組換え型発現プラスミドｐＨＷ５６（Ｍ４３）、ｐＷＬ
Ｔ２７（Ｍ５１）、ｐＷＳ１（Ｍ５１１２）、ｐＳＥ８
（Ｍ３６）を大腸菌 Ｋ１２ ＪＭ１０３（ＡＴＣＣ３
９４０３）中に入れ、標準- Ｉ- 栄養寒天（MERCK 社、
アンピシリン１５０ｍｇ／ｌ）上に塗布する(Sambrook
等、"Molecular Cloning: A LaboratoryManual") 。各
形質転換の単一コロニーの夫々を、標準- Ｉ- 栄養ブイ
ヨン(Merck社、ｐＨ７．０；アンピシリン１５０ｍｇ／
ｌ）中で２０℃で５７８ｎｍで１の光学密度（ＯＤ）ま
で培養し、連続培養物として２ｍｌづつ分けてジメチル
スルホキシド（ＤＭＳＯ）（７．５％最終濃度）の添加
下に−７０℃で凍結し、保存する。本発明によるポリペ
プチドの産生のために、各連続培養物の夫々１ｍｌを標
準- Ｉ- 栄養ブイヨン２０ｍｌ（ｐＨ７．０；１５０ｍ
ｇ／ｌアンピシリン）中で懸濁し、３７℃で５７８ｎｍ
で１のＯＤまで培養する。
Ｔ２７（Ｍ５１）、ｐＷＳ１（Ｍ５１１２）、ｐＳＥ８
（Ｍ３６）を大腸菌 Ｋ１２ ＪＭ１０３（ＡＴＣＣ３
９４０３）中に入れ、標準- Ｉ- 栄養寒天（MERCK 社、
アンピシリン１５０ｍｇ／ｌ）上に塗布する(Sambrook
等、"Molecular Cloning: A LaboratoryManual") 。各
形質転換の単一コロニーの夫々を、標準- Ｉ- 栄養ブイ
ヨン(Merck社、ｐＨ７．０；アンピシリン１５０ｍｇ／
ｌ）中で２０℃で５７８ｎｍで１の光学密度（ＯＤ）ま
で培養し、連続培養物として２ｍｌづつ分けてジメチル
スルホキシド（ＤＭＳＯ）（７．５％最終濃度）の添加
下に−７０℃で凍結し、保存する。本発明によるポリペ
プチドの産生のために、各連続培養物の夫々１ｍｌを標
準- Ｉ- 栄養ブイヨン２０ｍｌ（ｐＨ７．０；１５０ｍ
ｇ／ｌアンピシリン）中で懸濁し、３７℃で５７８ｎｍ
で１のＯＤまで培養する。
【００３９】次いで得られた培養物の全量を標準- Ｉ-
栄養ブイヨン１ｌ（ｐＨ７．０；１５０ｍｇ／ｌアンピ
シリン）中に懸濁し、振盪フラスコ中で３７℃で発酵す
る。誘発はインドールアクリル酢酸溶液２ｍｌ（エタノ
ール２ｍｌ中に６０ｍｇ）の添加によって５７８ｎｍで
０．５〜１のＯＤで行われる。 ｃ）発現テスト 発現度をテストするために、誘発の直前及び誘発後の各
時間（全体で６時間）で、５７８ｎｍで１のＯＤを有す
る細胞懸濁液１ｍｌに相当する細胞を遠心分離する。沈
降された細胞を、リゾチーム（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ
- 緩衝液、ｐＨ８．０、５０ｍＭエチレンジアミンテト
ラ酢酸（ＥＤＴＡ）及び１５％サッカロース中でｍｌあ
たりリゾチーム１ｍｇ）を用いて加水分解する。溶解さ
れた細胞のホモジネートを、４〜５Ｍグアニジニウムハ
イドロクロライド溶液中に溶解し、１．２Ｍグアニジニ
ウムハイドロクロライドに希釈後、還元剤（グルタチオ
ン又はシスティン）の添加下に２〜５時間折りたたみ反
応を行う(Winkler等、Biochemistry ２５ ４０４１〜
４０４５（１９８６））。得られた一本鎖の本発明によ
るポリペプチドを、プラスミンの添加によって対応する
二本鎖分子に変え、その活性を色素産生基質ｐｙｒｏ-
Ｇｌｕ- Ａｒｇ- ｐ- ニトロアニリドを用いて測定す
る。本発明によるポリペプチドのプラスミンによる活性
化は、５０ｍＭトリス／ＨＣｌ- 緩衝液、１２ｍＭ塩化
ナトリウム、０．０２％トウィーン８０中でｐＨ７．４
及び３７℃で行われる。本発明によるポリペプチドとプ
ラスミンの割合は、酵素単位あたり約８，０００−３
６，０００である。試験培養は、５０ｍＭトリス／ＨＣ
ｌ- 緩衝液及び３８ｍＭ塩化ナトリウム中でｐＨ８．８
で０．３６μＭアプロチニン（プラスミンの阻害のため
に）及び０．２７ｍＭ基質ｐｙｒｏ- Ｇｌｕ- Ｇｌｙ-
Ａｒｇ- ｐ- ニトロアニリドの存在下に３７℃で行われ
る。本発明によるポリペプチド濃度に関係なく、反応を
５〜６０分培養後５０％酢酸の添加によって停止し、４
０５ｎｍで吸光を測定する。基質の製造者(Kadi Vitru
m, スウェーデン) の説明書によれば、この処理で４０
５ｎｍで１分あたり０．０５の吸光変化は、試験溶液１
ｍｌあたり２５プラーク- 単位のウロキナーゼ- 活性に
相当する。本発明によるポリペプチドは、たん白質１ｍ
ｇあたり１２０，０００〜１５５，０００プラーク- 単
位の比活性を有する。溶液のたん白質含有量は、Pierce
社のＢＣＡ- 検定法を用いて測定する。 ｄ）単離及び精製 ６時間後、１ｂ）に記載された条件で行われた発酵を終
了し（５７．８ｎｍで密度５〜６ＯＤ）、細胞を遠心分
離によって収得する。細胞沈降物を水２００ｍｌで再懸
濁し、高圧ホモジナイザー中で分解する。新たに遠心分
離した後、一本鎖の本発明によるポリペプチドの全量を
含有する沈澱を、５Ｍグアニジニウムハイドロクロライ
ド５００ｍｌ、４０ｍＭシステイン、１ｍＭ ＥＤＴＡ
中にｐＨ- 値８．０で溶解し、ｐＨ- 値９．０の２５ｍ
Ｍトリス／ＨＣｌ ２０００ｍｌを用いて希釈する。折
りたたみ反応を約１２時間後に完了する。
栄養ブイヨン１ｌ（ｐＨ７．０；１５０ｍｇ／ｌアンピ
シリン）中に懸濁し、振盪フラスコ中で３７℃で発酵す
る。誘発はインドールアクリル酢酸溶液２ｍｌ（エタノ
ール２ｍｌ中に６０ｍｇ）の添加によって５７８ｎｍで
０．５〜１のＯＤで行われる。 ｃ）発現テスト 発現度をテストするために、誘発の直前及び誘発後の各
時間（全体で６時間）で、５７８ｎｍで１のＯＤを有す
る細胞懸濁液１ｍｌに相当する細胞を遠心分離する。沈
降された細胞を、リゾチーム（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ
- 緩衝液、ｐＨ８．０、５０ｍＭエチレンジアミンテト
ラ酢酸（ＥＤＴＡ）及び１５％サッカロース中でｍｌあ
たりリゾチーム１ｍｇ）を用いて加水分解する。溶解さ
れた細胞のホモジネートを、４〜５Ｍグアニジニウムハ
イドロクロライド溶液中に溶解し、１．２Ｍグアニジニ
ウムハイドロクロライドに希釈後、還元剤（グルタチオ
ン又はシスティン）の添加下に２〜５時間折りたたみ反
応を行う(Winkler等、Biochemistry ２５ ４０４１〜
４０４５（１９８６））。得られた一本鎖の本発明によ
るポリペプチドを、プラスミンの添加によって対応する
二本鎖分子に変え、その活性を色素産生基質ｐｙｒｏ-
Ｇｌｕ- Ａｒｇ- ｐ- ニトロアニリドを用いて測定す
る。本発明によるポリペプチドのプラスミンによる活性
化は、５０ｍＭトリス／ＨＣｌ- 緩衝液、１２ｍＭ塩化
ナトリウム、０．０２％トウィーン８０中でｐＨ７．４
及び３７℃で行われる。本発明によるポリペプチドとプ
ラスミンの割合は、酵素単位あたり約８，０００−３
６，０００である。試験培養は、５０ｍＭトリス／ＨＣ
ｌ- 緩衝液及び３８ｍＭ塩化ナトリウム中でｐＨ８．８
で０．３６μＭアプロチニン（プラスミンの阻害のため
に）及び０．２７ｍＭ基質ｐｙｒｏ- Ｇｌｕ- Ｇｌｙ-
Ａｒｇ- ｐ- ニトロアニリドの存在下に３７℃で行われ
る。本発明によるポリペプチド濃度に関係なく、反応を
５〜６０分培養後５０％酢酸の添加によって停止し、４
０５ｎｍで吸光を測定する。基質の製造者(Kadi Vitru
m, スウェーデン) の説明書によれば、この処理で４０
５ｎｍで１分あたり０．０５の吸光変化は、試験溶液１
ｍｌあたり２５プラーク- 単位のウロキナーゼ- 活性に
相当する。本発明によるポリペプチドは、たん白質１ｍ
ｇあたり１２０，０００〜１５５，０００プラーク- 単
位の比活性を有する。溶液のたん白質含有量は、Pierce
社のＢＣＡ- 検定法を用いて測定する。 ｄ）単離及び精製 ６時間後、１ｂ）に記載された条件で行われた発酵を終
了し（５７．８ｎｍで密度５〜６ＯＤ）、細胞を遠心分
離によって収得する。細胞沈降物を水２００ｍｌで再懸
濁し、高圧ホモジナイザー中で分解する。新たに遠心分
離した後、一本鎖の本発明によるポリペプチドの全量を
含有する沈澱を、５Ｍグアニジニウムハイドロクロライ
ド５００ｍｌ、４０ｍＭシステイン、１ｍＭ ＥＤＴＡ
中にｐＨ- 値８．０で溶解し、ｐＨ- 値９．０の２５ｍ
Ｍトリス／ＨＣｌ ２０００ｍｌを用いて希釈する。折
りたたみ反応を約１２時間後に完了する。
【００４０】得られた本発明によるポリペプチドを、シ
リカゲル８ｇの添加後２時間の攪拌によって完全にシリ
カゲルと結合する。結合されたシリカゲルを分離し、酢
酸塩- 緩衝液（ｐＨ４．０）で洗滌する。ポリペプチド
を、０．５Ｍトリメチルアンモニウムクロライド（ＴＭ
ＡＣ）を用いて０．１Ｍ酢酸塩- 緩衝液（ｐＨ４）溶離
する。２つのクロマトグラフィー分離（銅- キレート-
カラムとカチオン交換体）後、ポリペプチドが純粋な形
で得られる。Ｎ- 末端配列分析によって一本鎖を確認す
る。
リカゲル８ｇの添加後２時間の攪拌によって完全にシリ
カゲルと結合する。結合されたシリカゲルを分離し、酢
酸塩- 緩衝液（ｐＨ４．０）で洗滌する。ポリペプチド
を、０．５Ｍトリメチルアンモニウムクロライド（ＴＭ
ＡＣ）を用いて０．１Ｍ酢酸塩- 緩衝液（ｐＨ４）溶離
する。２つのクロマトグラフィー分離（銅- キレート-
カラムとカチオン交換体）後、ポリペプチドが純粋な形
で得られる。Ｎ- 末端配列分析によって一本鎖を確認す
る。
【００４１】すべての単離された本発明によるポリペプ
チド──そのアミノ酸配列は図１８〜２１に記載されて
いる──は、ウロキナーゼに対する色素産生基質を用い
る直接的な活性度試験で全く又は極めて僅かしか活性度
を示さない（１％以下）。プラスミンで分解した後に初
めて（条件は１ｃの項に記載した）完全な酵素活性が得
られる。したがって本発明によるポリペプチドは、大腸
菌Ｋ１２ ＪＭ１０３中で一本鎖たん白質として発現す
る。 ２．トロンビン阻害作用の測定 本発明によるポリペプチドの阻害活性を、ヒトクエン酸
プラズマをベロナール緩衝液中でトロンビン溶液５０μ
ｌ（０．２単位）で１：１０に希釈されたプラズマ２０
０μｌと本発明によるポリペプチド０．５〜５０μｇを
含有する水性溶液５０μｌを混合することによるトロン
ビン存続期間の測定によって決定する。表２中に測定さ
れた阻害因子を記載する。これはトロンビン存続期間の
延長を本発明によるポリペプチドの存在下に示す。 表 ２： 本発明によるポリペプチドによるトロンビン存続期間の延長 本発明によるポリペプチド 阻害因子1) Ｍ５１ １．２ Ｍ５１１２ ３．０ Ｍ３６ ２．８ Ｍ４３ １．２1) ５μｇたん白質阻害因子の作用に対して＝阻害剤の存在下にトロンビン存続 期間と阻害剤の不在下にトロンビン存続期間との商
チド──そのアミノ酸配列は図１８〜２１に記載されて
いる──は、ウロキナーゼに対する色素産生基質を用い
る直接的な活性度試験で全く又は極めて僅かしか活性度
を示さない（１％以下）。プラスミンで分解した後に初
めて（条件は１ｃの項に記載した）完全な酵素活性が得
られる。したがって本発明によるポリペプチドは、大腸
菌Ｋ１２ ＪＭ１０３中で一本鎖たん白質として発現す
る。 ２．トロンビン阻害作用の測定 本発明によるポリペプチドの阻害活性を、ヒトクエン酸
プラズマをベロナール緩衝液中でトロンビン溶液５０μ
ｌ（０．２単位）で１：１０に希釈されたプラズマ２０
０μｌと本発明によるポリペプチド０．５〜５０μｇを
含有する水性溶液５０μｌを混合することによるトロン
ビン存続期間の測定によって決定する。表２中に測定さ
れた阻害因子を記載する。これはトロンビン存続期間の
延長を本発明によるポリペプチドの存在下に示す。 表 ２： 本発明によるポリペプチドによるトロンビン存続期間の延長 本発明によるポリペプチド 阻害因子1) Ｍ５１ １．２ Ｍ５１１２ ３．０ Ｍ３６ ２．８ Ｍ４３ １．２1) ５μｇたん白質阻害因子の作用に対して＝阻害剤の存在下にトロンビン存続 期間と阻害剤の不在下にトロンビン存続期間との商
【図１】繊維素溶解性質を有するたん白質を生成するた
めのプラスミドを産生する方法を示す。
めのプラスミドを産生する方法を示す。
【図２】繊維素溶解性質を有するたん白質を生成するた
めのプラスミドを産生する方法を示す。
めのプラスミドを産生する方法を示す。
【図３】繊維素溶解性質を有するたん白質を生成するた
めのプラスミドを産生する方法を示す。
めのプラスミドを産生する方法を示す。
【図４】繊維素溶解性質を有するたん白質を生成するた
めのプラスミドを産生する方法を示す。
めのプラスミドを産生する方法を示す。
【図５】繊維素溶解性質を有するたん白質を生成するた
めのプラスミドを産生する方法を示す。
めのプラスミドを産生する方法を示す。
【図６】繊維素溶解性質を有するたん白質を生成するた
めのプラスミドを産生する方法を示す。
めのプラスミドを産生する方法を示す。
【図７】繊維素溶解性質を有するたん白質を生成するた
めのプラスミドを産生する方法を示す。
めのプラスミドを産生する方法を示す。
【図８】繊維素溶解性質を有するたん白質を生成するた
めのプラスミドを産生する方法を示す。
めのプラスミドを産生する方法を示す。
【図９】繊維素溶解性質を有するたん白質を生成するた
めのプラスミドを産生する方法を示す。
めのプラスミドを産生する方法を示す。
【図１０】繊維素溶解性質を有するたん白質を生成する
ためのプラスミドを産生する方法を示す。
ためのプラスミドを産生する方法を示す。
【図１１】繊維素溶解性質を有するたん白質を生成する
ためのプラスミドを産生する方法を示す。
ためのプラスミドを産生する方法を示す。
【図１２】繊維素溶解性質を有するたん白質を生成する
ためのプラスミドを産生する方法を示す。
ためのプラスミドを産生する方法を示す。
【図１３】繊維素溶解性質を有するたん白質を生成する
ためのプラスミドを産生する方法を示す。
ためのプラスミドを産生する方法を示す。
【図１４】繊維素溶解性質を有するたん白質を生成する
ためのプラスミドを産生する方法を示す。
ためのプラスミドを産生する方法を示す。
【図１５】繊維素溶解性質を有するたん白質を生成する
ためのプラスミドを産生する方法を示す。
ためのプラスミドを産生する方法を示す。
【図１６】繊維素溶解性質を有するたん白質を生成する
ためのプラスミドを産生する方法を示す。
ためのプラスミドを産生する方法を示す。
【図１７】繊維素溶解性質を有するたん白質を生成する
ためのプラスミドを産生する方法を示す。
ためのプラスミドを産生する方法を示す。
【図１８】本発明によるポリペプチドのアミノ酸配列を
示す。
示す。
【図１９】本発明によるポリペプチドのアミノ酸配列を
示す。
示す。
【図２０】本発明によるポリペプチドのアミノ酸配列を
示す。
示す。
【図２１】本発明によるポリペプチドのアミノ酸配列を
示す。
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ゲルト・ヨーゼフ・シユテフエンス ドイツ連邦共和国、52072 アーヒエン、 ムッフエッター・ウエーク、50
Claims (14)
- 【請求項１】 プラスミノーゲンを活性化するアミノ酸
配列のＮ- 及び（又は）Ｃ- 末端で、トロンビン及び
（又は）因子Ｘａを阻害するアミノ酸配列と結合する、
繊維素溶解性の血液凝固阻害性質を有するたん白質に於
て、非グリコシル化されたプロウロキナーゼのプラスミ
ノーゲンを活性化するアミノ酸配列47Ｓｅｒ〜411 Ｌｅ
ｕがＣ- 最終末端で式 【化１】 （式中Ｔ1 はＰｒｏ又はＶａｌ、Ｔ2 はＬｅｕ又はＰｒ
ｏとＧｌｙとの間の直接結合、Ｔ3 はＧｌｎ又はヒドロ
キシル基を示す。）のペプチド配列と結合するたん白質
は除外されることを特徴とする、上記たん白質。 - 【請求項２】 プラスミノーゲンを活性化するアミノ酸
配列は、プロウロキナーゼの不変化アミノ酸配列；欠
失、置換、挿入及び（又は）付加によって修飾されたプ
ロウキナーゼのアミノ酸配列の少なくとも１種、ウロキ
ナーゼの不変化アミノ酸配列；欠失、置換、挿入及び
（又は）付加によって修飾されたウロキナーゼのアミノ
酸配列少なくとも１種、組織プラスミノーゲン活性化因
子（ｔ- ＰＡ）の不変化アミノ酸配列；欠失、置換、挿
入及び（又は）付加によって修飾されたｔ- ＰＡのアミ
ノ酸配列、コウモリ- プラスミノーゲン活性化因子（ｂ
ａｔ- ＰＡ）の不変化アミノ酸配列；欠失、置換、挿入
及び（又は）付加によって修飾されたｂａｔ- ＰＡのア
ミノ酸配列少なくとも１種及び（又は）ストレプトキナ
ーゼ、スタフィロキナーゼ及び（又は）ＡＰＳＡＣのア
ミノ酸配列を含有する、請求項１記載のたん白質。 - 【請求項３】プラスミノーゲンを活性化するアミノ酸配
列は、プロウロキナーゼの不変化アミノ酸配列；欠失、
置換、挿入及び（又は）付加によって修飾されたプロウ
ロキナーゼのアミノ酸配列少なくとも１種、ｔ- ＰＡの
不変化アミノ酸配列及び（又は）欠失、置換、挿入及び
（又は）付加によって修飾されたｔ-ＰＡのアミノ酸配
列少なくとも１種を含有する、請求項２記載のたん白
質。 - 【請求項４】 プラスミノーゲンを活性化するアミノ酸
配列は、不変化の、アミノ酸４１１個から成るプロウロ
キナーゼの配列から、プロウロキナーゼのアミノ酸配列
47Ｓｅｒ〜 411Ｌｅｕから、プロウロキナーゼのアミノ
酸配列 138Ｓｅｒ〜 411Ｌｅｕから、不変化の、アミノ
酸５２７個から成るｔ- ＰＡのアミノ酸配列Ｓｅｒ−89
Ａｒｇ〜 527Ｐｒｏから及び（又は）ｔ- ＰＡのアミノ
酸配列 174Ｓｅｒ〜 527Ｐｒｏから成る、請求項３記載
のたん白質。 - 【請求項５】 トロンビン及び（又は）因子Ｘａを阻害
するアミノ酸配列は、ヒルジン性質を有するアミノ酸配
列少なくとも１種、ヒトのトロンビンレセプターから生
じるアミノ酸配列少なくとも１種、ヒルリン性質を有す
るアミノ酸配列少なくとも１種、アンチスタシン及び
（又は）ダニ抗凝血物質ペプチド（ＴＡＰ）を含有す
る、請求項１ないし５のいずれかに記載のたん白質。 - 【請求項６】 トロンビン及び（又は）因子Ｘａを阻害
するアミノ酸配列は、ヒルジン性質を有するアミノ酸配
列少なくとも１種、ヒトトロンビンレセプターから生じ
るアミノ酸配列少なくとも１種及び（又は）ヒルリン性
質を有するアミノ酸配列少なくとも１種を含有する、請
求項５記載のたん白質。 - 【請求項７】 トロンビン及び（又は）因子Ｘａを阻害
するアミノ酸配列は、アミノ酸６５個から成るヒルジン
の配列、及び（又は）式 【化２】 （式中Ｔ1 はＰｒｏ又はＶａｌ、Ｔ2 はＬｅｕ又はＰｒ
ｏとＧｌｙの間の直接結合、Ｔ3 はＧｌｎ、ヒドロキシ
ル基又は隣接するアミノ酸への直接結合、Ｔ4はＭｅ
ｔ、Ｉｌｅ又は隣接するアミノ酸への直接結合、Ｔ5 は
Ｍｅｔ又は隣接するアミノ酸への直接結合を示す。）の
アミノ酸配列少なくとも１個を含有する、請求項５又は
６記載のたん白質。 - 【請求項８】 プラスミノーゲンを活性化するアミノ酸
配列は、Ｎ- 及び（又は）Ｃ- 最終末端でイソロイシン
を介して又は一般式 【化３】 （式中Ｘ1 はＰｒｏ又はＬｅｕ、Ｘ2 はＧｌｙ、Ｖａｌ
又はＰｒｏ、Ｘ3 はＬｙｓ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ又
はＧｌｕ、Ｘ4 はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ又は
Ｉｌｅ、Ｘ5 はＧｌｙ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶ
ａｌ、Ｘ6 はＧｌｙ、Ｐｒｏ又は隣接するアミノ酸への
直接結合、Ｘ7 はＩｌｅ又は隣接するアミノ酸への直接
結合を示す。）のペプチド配列を介してトロンビン及び
（又は）因子Ｘａを阻害するアミノ酸配列と直接結合す
る、請求項１ないし７のいずれかに記載のたん白質。 - 【請求項９】 オペロンは制御可能なプロモーター、リ
ボソーム結合部位として有効なシャイン・ダルガーノ配
列、開始コドン、請求項１ないし９による繊維素溶解性
質を有するたん白質に対する合成構造遺伝子及び構造遺
伝子から上流へターミネーター１又は２個を有し、そし
てプラスミドは、大腸菌株中で繊維素溶解性質を有する
たん白質の発現に適する、請求項１ないし８のいずれか
に記載の繊維素溶解性質を有するたん白質を産生するた
めのプラスミド。 - 【請求項１０】 ｐＷＬＴ２７、ｐＷＳ１、ｐＷＳＥ８
及びｐＨＷ５６より成る群から選ばれる、請求項９記載
のプラスミド。 - 【請求項１１】 請求項９又は１０に記載されたプラス
ミドを産生するにあたり、これを図１〜１７に記載され
たプラスミドｐＢｌｕｅ- ｓｋｒｉｐｔ ＫＳ Ｉ
Ｉ+ 、ｐＵＣ８、ｐＳＬ１１９０及びＰｇｒ２０１から
産生することを特徴とする上記プラスミドの産生方法。 - 【請求項１２】 プラスミドを用いて大腸菌- 株を公知
方法で形質転換し、構造遺伝子の発現を誘発し、生じた
たんぱく質前駆体を培地及び溶解された細菌細胞から分
離し、溶解し、次いでレドックス系の作用によって繊維
素溶解性質を有するたん白質に折りたたむことを特徴と
する、請求項１ないし８のいずれかに記載された繊維素
溶解性質を有するたん白質の産生に請求項９又は１０に
記載されたプラスミドを使用する方法。 - 【請求項１３】 有効物質として請求項１ないし８のい
ずれかに記載のたん白質を含有する血栓溶解剤。 - 【請求項１４】 ボルス投与に適する、請求項１３記載
の血栓溶解剤。
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