JPH08231595A - 繊維素溶解性のトロンビン阻害性質を有するキメラたん白質 - Google Patents
繊維素溶解性のトロンビン阻害性質を有するキメラたん白質Info
- Publication number
- JPH08231595A JPH08231595A JP7298570A JP29857095A JPH08231595A JP H08231595 A JPH08231595 A JP H08231595A JP 7298570 A JP7298570 A JP 7298570A JP 29857095 A JP29857095 A JP 29857095A JP H08231595 A JPH08231595 A JP H08231595A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- acid sequence
- protein
- formula
- gly
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8121—Serpins
- C07K14/8128—Antithrombin III
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 繊維素溶解性の血液凝固阻害性質を有するキ
メラたん白質。 【解決手段】 本発明はプラスミノーゲンを活性化する
アミノ酸配列のＣ- 最終末端でトロンビンを阻害するア
ミノ酸配列と結合する、繊維素溶解性の血液凝固阻害性
質を有するキメラたん白質に関する。
メラたん白質。 【解決手段】 本発明はプラスミノーゲンを活性化する
アミノ酸配列のＣ- 最終末端でトロンビンを阻害するア
ミノ酸配列と結合する、繊維素溶解性の血液凝固阻害性
質を有するキメラたん白質に関する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、繊維素溶解性の血
液凝固阻害性質を有するキメラたん白質──これは、プ
ラスミノーゲンを活性化するアミノ酸配列のＣ- 最終末
端でトロンビンを阻害するアミノ酸配列と結合する─
─、このポリペプチドを産生するためのプラスミド及び
有効物質としてこの様なポリペプチドを含有する血栓溶
解剤に関する。
液凝固阻害性質を有するキメラたん白質──これは、プ
ラスミノーゲンを活性化するアミノ酸配列のＣ- 最終末
端でトロンビンを阻害するアミノ酸配列と結合する─
─、このポリペプチドを産生するためのプラスミド及び
有効物質としてこの様なポリペプチドを含有する血栓溶
解剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】すべての工業国に於て、心臓- 循環器系
疾患が現在最も頻発する死因である。その際特に重要な
ことは、急性の血栓症閉塞を生じ、その発生が心筋梗塞
の場合、最も短時間以内に心筋への生命に危険な供給不
足を生じる。同様なことが脳梗塞にもいえる。この場合
脳内閉塞は、病気に見舞われた脳領域の大きい虚血性損
傷を伴う。高い死亡率と結びつく心筋梗塞に反して、脳
梗塞に於ける供給不足は一般に急性の生命に危険な状態
を導びかす、特定の脳機能の欠損によって日々の性格に
著しい悪影響を与え、したがって一部、病気に見舞われ
た人の生活習慣の極端な欠陥を生じる。上記２つの梗塞
形態は一般に、病気に見舞われた動脈によって供給され
る領域が数時間以内に──治療せずに──回復不能に傷
つけられるとされている。治療を必要とする他の血栓症
性閉塞疾患は、肺塞栓、静脈血栓症及び末梢の動物閉塞
疾患である。
疾患が現在最も頻発する死因である。その際特に重要な
ことは、急性の血栓症閉塞を生じ、その発生が心筋梗塞
の場合、最も短時間以内に心筋への生命に危険な供給不
足を生じる。同様なことが脳梗塞にもいえる。この場合
脳内閉塞は、病気に見舞われた脳領域の大きい虚血性損
傷を伴う。高い死亡率と結びつく心筋梗塞に反して、脳
梗塞に於ける供給不足は一般に急性の生命に危険な状態
を導びかす、特定の脳機能の欠損によって日々の性格に
著しい悪影響を与え、したがって一部、病気に見舞われ
た人の生活習慣の極端な欠陥を生じる。上記２つの梗塞
形態は一般に、病気に見舞われた動脈によって供給され
る領域が数時間以内に──治療せずに──回復不能に傷
つけられるとされている。治療を必要とする他の血栓症
性閉塞疾患は、肺塞栓、静脈血栓症及び末梢の動物閉塞
疾患である。
【０００３】血栓によって引き起こされる血管の閉塞
は、ほとんど動脈硬化障害でフィブリン、血栓及び赤血
球から血液凝固システムの種々の酵素の作用下に生じ
る。血液凝固システムの酵素カスケードのうち、トロン
ビンが重要な役割を果たす。トロンビンは血液凝固シス
テムの重要な酵素すべてを活性化することができ、血小
板の凝集を誘発し、フィブリノーゲンをフィブリンに変
えることによってフィブリンクロット(Fibringespinte)
の形成を生じる(Furie及びFurie, New Engl. J. Med,３
２６，８００（１９９２））。
は、ほとんど動脈硬化障害でフィブリン、血栓及び赤血
球から血液凝固システムの種々の酵素の作用下に生じ
る。血液凝固システムの酵素カスケードのうち、トロン
ビンが重要な役割を果たす。トロンビンは血液凝固シス
テムの重要な酵素すべてを活性化することができ、血小
板の凝集を誘発し、フィブリノーゲンをフィブリンに変
えることによってフィブリンクロット(Fibringespinte)
の形成を生じる(Furie及びFurie, New Engl. J. Med,３
２６，８００（１９９２））。
【０００４】血栓の形成は、生理学的血液凝固阻止剤、
たとえばアンチトロンビンＩＩＩ、活性化されたたん白
質Ｃ及び組織因子経路阻害剤によって制御される。一度
形成された血栓を、生体に特有なプラスミンの作用によ
って再び溶解することができる。プラスミンは不活性な
プロ酵素、プラスミノーゲンから生じ、このプラスミン
はプラスミノーゲン活性化因子によってたん白質分解し
て活性化される。プラスミンによって引き起こされる血
栓溶解は、血栓症疾患の患者、特に急性心筋梗塞の患者
をプラスミノーゲン活性化因子で処置する治療に利用さ
れる。多くの治療が病気に見舞われた梗塞領域を縮小
し、死亡を減少させる。現在この治療に、ストレプトキ
ナーゼ、ＡＰＳＡＣ (Anisolated Plasminogen Strept
okinase Activator Complex)、二本鎖ウロキナーゼ（Ｕ
Ｋ）、組換え型一本鎖ウロキナーゼ（組換え型プロウロ
キナーゼ）及び組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ-
ＰＡ）が使用されている(Collen 及び Lijnen, Blood
７８，３１１４（１９９１））。溶解治療の従来存在す
る経験から、閉塞された冠状血管の再切開は梗塞の発作
後数時間以内で、すなわち１〜４時間で最良の機能適結
果を生じることが明らかである。最適な再潅流（Reperf
usion)の目的を達成するために、多くの場合に、治療開
始は一定の吸収に先立って実際上始めねばならない。し
かしこれはこの時点でまだ安全でない診断法を顧慮すれ
ば副作用のあまりないかつ安全な繊維素溶解剤を用いて
しか行われない。しかしいわゆる第一タイプのすべての
繊維素溶解剤、たとえばストレプトキナーゼ、ＡＰＳＡ
Ｃ及びウロキナーゼは、急性梗塞の治療に於て必要な投
薬で全身性プラスミノーゲン活性化を生じる。このこと
は、高い出血危険を伴う。いわゆる第二タイプの繊維素
溶解剤、ｔ- ＰＡ及びプロウロキナーゼの使用は、多く
の梗塞患者に於て系統的プラスミノーゲン活性化を生じ
る。再潅流を成果あるものにし、かつ再閉塞を回避する
ために、ｔ- ＰＡ及びプロウロキナーゼを明らかな繊維
素溶解、すなわち系統的プラスミノーゲン活性化を生じ
る。高い投薬量で使用しなければならない。このこと
は、従来の研究に於て、出血性合併症の発生率の点でｔ
- ＰＡ又はプロウロキナーゼで治療した患者とストレプ
トキナーゼで治療した患者の間の著しい相違は検出する
ことができなかったという観察結果と一致する。 した
がってプラスミノーゲン活性化因子の薬理学的特徴を改
良するために、種々の試みが続けられた。
たとえばアンチトロンビンＩＩＩ、活性化されたたん白
質Ｃ及び組織因子経路阻害剤によって制御される。一度
形成された血栓を、生体に特有なプラスミンの作用によ
って再び溶解することができる。プラスミンは不活性な
プロ酵素、プラスミノーゲンから生じ、このプラスミン
はプラスミノーゲン活性化因子によってたん白質分解し
て活性化される。プラスミンによって引き起こされる血
栓溶解は、血栓症疾患の患者、特に急性心筋梗塞の患者
をプラスミノーゲン活性化因子で処置する治療に利用さ
れる。多くの治療が病気に見舞われた梗塞領域を縮小
し、死亡を減少させる。現在この治療に、ストレプトキ
ナーゼ、ＡＰＳＡＣ (Anisolated Plasminogen Strept
okinase Activator Complex)、二本鎖ウロキナーゼ（Ｕ
Ｋ）、組換え型一本鎖ウロキナーゼ（組換え型プロウロ
キナーゼ）及び組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ-
ＰＡ）が使用されている(Collen 及び Lijnen, Blood
７８，３１１４（１９９１））。溶解治療の従来存在す
る経験から、閉塞された冠状血管の再切開は梗塞の発作
後数時間以内で、すなわち１〜４時間で最良の機能適結
果を生じることが明らかである。最適な再潅流（Reperf
usion)の目的を達成するために、多くの場合に、治療開
始は一定の吸収に先立って実際上始めねばならない。し
かしこれはこの時点でまだ安全でない診断法を顧慮すれ
ば副作用のあまりないかつ安全な繊維素溶解剤を用いて
しか行われない。しかしいわゆる第一タイプのすべての
繊維素溶解剤、たとえばストレプトキナーゼ、ＡＰＳＡ
Ｃ及びウロキナーゼは、急性梗塞の治療に於て必要な投
薬で全身性プラスミノーゲン活性化を生じる。このこと
は、高い出血危険を伴う。いわゆる第二タイプの繊維素
溶解剤、ｔ- ＰＡ及びプロウロキナーゼの使用は、多く
の梗塞患者に於て系統的プラスミノーゲン活性化を生じ
る。再潅流を成果あるものにし、かつ再閉塞を回避する
ために、ｔ- ＰＡ及びプロウロキナーゼを明らかな繊維
素溶解、すなわち系統的プラスミノーゲン活性化を生じ
る。高い投薬量で使用しなければならない。このこと
は、従来の研究に於て、出血性合併症の発生率の点でｔ
- ＰＡ又はプロウロキナーゼで治療した患者とストレプ
トキナーゼで治療した患者の間の著しい相違は検出する
ことができなかったという観察結果と一致する。 した
がってプラスミノーゲン活性化因子の薬理学的特徴を改
良するために、種々の試みが続けられた。
【０００５】更に、コウモリ- プラスミノーゲン活性化
因子(Gardell等、J. Biol. Chem.２６４，１７９４７
（１９８９）；ヨーロッパ特許第３８３４１７号明細
書）、スタフィロキナーゼ(Schlott等、Bio ／Technolo
gy １２，１８５（１９９４）；Collen及びVan De Wer
f, Circulation ８７，１８５０（１９９３））、組換
え型組織プラスミノーゲン活性化因子ＢＭ ０６．０２
２(Martin 等、J. Cardiovasc. Pharm. １８，１１１
（１９９１））並びにｔ- ＰＡ- 変異体のＴＮＫ-ｔ-
ＰＡ(Keyt 等、Proc. Natl. Acad. Sci.９１，３６７０
（１９９４））が開発されている。
因子(Gardell等、J. Biol. Chem.２６４，１７９４７
（１９８９）；ヨーロッパ特許第３８３４１７号明細
書）、スタフィロキナーゼ(Schlott等、Bio ／Technolo
gy １２，１８５（１９９４）；Collen及びVan De Wer
f, Circulation ８７，１８５０（１９９３））、組換
え型組織プラスミノーゲン活性化因子ＢＭ ０６．０２
２(Martin 等、J. Cardiovasc. Pharm. １８，１１１
（１９９１））並びにｔ- ＰＡ- 変異体のＴＮＫ-ｔ-
ＰＡ(Keyt 等、Proc. Natl. Acad. Sci.９１，３６７０
（１９９４））が開発されている。
【０００６】ストレプトキナーゼ、すなわち溶血性レン
サ球菌のたん白質はヒトプラスミノーゲンを活性化す
る。というのはこのたん白質はプラスミノーゲンと複合
体を生成し、それによってプラスミノーゲンが活性な構
造に変化するからである。この複合体それ自体は遊離の
プラスミノーゲンをプラスミンに変え、このプラスミン
はその時再びストレプトキナーゼと結合するプラスミノ
ーゲンを切断する。同様にスタフィロキナーゼ、すなわ
ち黄色ブドウ球菌から得られるたん白質も作用するが、
これはストレプトキナーゼに比してより高いフィブリン
特異性を有する。ストレプトキナーゼが更に開発された
ものは、ＡＰＳＡＣ、ストレプトキナーゼとヒトプラス
ミノーゲンから試験管内で産生された化合物である。Ａ
ＰＳＡＣは、プラスミノーゲンの活性中心の化学修飾に
よってストレプトキナーゼに比して高められた生物学的
半減期を有する。
サ球菌のたん白質はヒトプラスミノーゲンを活性化す
る。というのはこのたん白質はプラスミノーゲンと複合
体を生成し、それによってプラスミノーゲンが活性な構
造に変化するからである。この複合体それ自体は遊離の
プラスミノーゲンをプラスミンに変え、このプラスミン
はその時再びストレプトキナーゼと結合するプラスミノ
ーゲンを切断する。同様にスタフィロキナーゼ、すなわ
ち黄色ブドウ球菌から得られるたん白質も作用するが、
これはストレプトキナーゼに比してより高いフィブリン
特異性を有する。ストレプトキナーゼが更に開発された
ものは、ＡＰＳＡＣ、ストレプトキナーゼとヒトプラス
ミノーゲンから試験管内で産生された化合物である。Ａ
ＰＳＡＣは、プラスミノーゲンの活性中心の化学修飾に
よってストレプトキナーゼに比して高められた生物学的
半減期を有する。
【０００７】ウロキナーゼは、ヒトのたん白質であり、
これは２つの形態でたん白質分解に活性なたん白質とし
てウリンから得ることができる：高分子ウロキナーゼ
（ＨＵＫ）及び低分子ウロキナーゼ（ＬＵＫ(Stump等、
J. Biol. Chem. ２６１，１２６７（１９８６））。Ｈ
ＵＫ及びＬＵＫは、ウロキナーゼの活性型、すなわち二
本鎖分子である。ウロキナーゼを一本鎖ウロキナーゼ
（プロウロキナーゼ）として種々の組織中に生成し、プ
ロ酵素として少量でヒト血液中で検出することができる
(Wun等、J. Biol. Chem. ２５７，３２７６（１９８
２））。プロウロキナーゼの活性型はＨＵＫとして５４
キロダルトンの分子量を有し、３個のドメインから成
る：アミノ- 末端成長因子- ドメイン、クリングル及び
セリン- プロテアーゼ- ドメイン(Guenzler 等、Hoppe-
Seyler's Z. Physiol. Chem.３６３，１１５５（１９８
２）；Steffens等、Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem.
３６３，１０４３（１９８２））。プロウロキナーゼ及
びプラスミノーゲンはプロ酵素として存在けれども、プ
ロウロキナーゼは内的活性のゆえにプラスミノーゲンを
活性プラスミンに変えることができる。しかしこのプラ
スミノーゲン活性化因子は、生成されたプラスミンそれ
自体がプロウロキナーゼを 158リジン及び 159イソロイ
シンの間で切断した後に初めて十分な活性を維持する(L
ijnen 等、J. Biol.Chem. ２６１，１２５３（１９８
６））。大腸菌中でウロキナーゼを遺伝子工学で産生す
る方法は、Heyneker等によって初めて記載された(Proce
edings of the IVth International Symposium on Gene
tics of Industrial Microorganisms１９８２）。非グ
リコシル化されたプロウロキナーゼ(Saruplase) を合成
遺伝子の使用下に生成する(Brigelius-Flohe等、Appl.
Microbiol. Biotech. ３６，６４０（１９９２））。
これは２つの形態でたん白質分解に活性なたん白質とし
てウリンから得ることができる：高分子ウロキナーゼ
（ＨＵＫ）及び低分子ウロキナーゼ（ＬＵＫ(Stump等、
J. Biol. Chem. ２６１，１２６７（１９８６））。Ｈ
ＵＫ及びＬＵＫは、ウロキナーゼの活性型、すなわち二
本鎖分子である。ウロキナーゼを一本鎖ウロキナーゼ
（プロウロキナーゼ）として種々の組織中に生成し、プ
ロ酵素として少量でヒト血液中で検出することができる
(Wun等、J. Biol. Chem. ２５７，３２７６（１９８
２））。プロウロキナーゼの活性型はＨＵＫとして５４
キロダルトンの分子量を有し、３個のドメインから成
る：アミノ- 末端成長因子- ドメイン、クリングル及び
セリン- プロテアーゼ- ドメイン(Guenzler 等、Hoppe-
Seyler's Z. Physiol. Chem.３６３，１１５５（１９８
２）；Steffens等、Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem.
３６３，１０４３（１９８２））。プロウロキナーゼ及
びプラスミノーゲンはプロ酵素として存在けれども、プ
ロウロキナーゼは内的活性のゆえにプラスミノーゲンを
活性プラスミンに変えることができる。しかしこのプラ
スミノーゲン活性化因子は、生成されたプラスミンそれ
自体がプロウロキナーゼを 158リジン及び 159イソロイ
シンの間で切断した後に初めて十分な活性を維持する(L
ijnen 等、J. Biol.Chem. ２６１，１２５３（１９８
６））。大腸菌中でウロキナーゼを遺伝子工学で産生す
る方法は、Heyneker等によって初めて記載された(Proce
edings of the IVth International Symposium on Gene
tics of Industrial Microorganisms１９８２）。非グ
リコシル化されたプロウロキナーゼ(Saruplase) を合成
遺伝子の使用下に生成する(Brigelius-Flohe等、Appl.
Microbiol. Biotech. ３６，６４０（１９９２））。
【０００８】ｔ- ＰＡは、血液中及び組織中に産生す
る、分子量７２キロダルトンのたん白質である。このプ
ラスミノーゲン活性化因子は５個のドメインから成る：
アミノ- 末端フィンガードメイン、成長- 因子- ドメイ
ン、クリングル一、クリングル２及びセリン- プロテア
ーゼ- ドメイン。プロウロキナーゼの様に、ｔ- ＰＡを
クリングル２とセリン- プロテアーゼ- ドメインの間、
すなわち 275Ａｒｇと276Ｉｌｅの間でプラスミン触媒
による切断によって活性な二本鎖型に変える。試験管内
試験及び動物実験による結果によればｔ- ＰＡはフィブ
リンと結合し、そしてその酵素活性はフィブリンによっ
て刺激されることが示されている(Collen 及び Lijnen,
Blood ７８，３１１４（１９９１））。ｔ- ＰＡのフ
ィブリン特異性によって、プラスミンが血液系全体中で
生成され、後にフィブリンばかりでなく、フィブリノー
ゲンも分解するのを回避しなければならない。この様な
系統的なプラスミノーゲン活性化並びにフィブリノーゲ
ンの著しい分解は望ましいものではない。というのはこ
れが出血の危険を高めるからである。いずれにせよ治療
実務で、前臨床実験から生じる、ｔ- ＰＡのフィブリン
特異性に関する期待は、満たされないことが明らかであ
る。また上述の様にｔ- ＰＡの短い生物学的半減期のた
めに、高い投薬量を注入しなければならない。この投薬
量はフィブリン特異性にもかかわらず系統的プラスミノ
ーゲンの活性化を生じる(Keyt等、Proc. Natl. Acad. S
ci. ９１，３６７０（１９９４））。
る、分子量７２キロダルトンのたん白質である。このプ
ラスミノーゲン活性化因子は５個のドメインから成る：
アミノ- 末端フィンガードメイン、成長- 因子- ドメイ
ン、クリングル一、クリングル２及びセリン- プロテア
ーゼ- ドメイン。プロウロキナーゼの様に、ｔ- ＰＡを
クリングル２とセリン- プロテアーゼ- ドメインの間、
すなわち 275Ａｒｇと276Ｉｌｅの間でプラスミン触媒
による切断によって活性な二本鎖型に変える。試験管内
試験及び動物実験による結果によればｔ- ＰＡはフィブ
リンと結合し、そしてその酵素活性はフィブリンによっ
て刺激されることが示されている(Collen 及び Lijnen,
Blood ７８，３１１４（１９９１））。ｔ- ＰＡのフ
ィブリン特異性によって、プラスミンが血液系全体中で
生成され、後にフィブリンばかりでなく、フィブリノー
ゲンも分解するのを回避しなければならない。この様な
系統的なプラスミノーゲン活性化並びにフィブリノーゲ
ンの著しい分解は望ましいものではない。というのはこ
れが出血の危険を高めるからである。いずれにせよ治療
実務で、前臨床実験から生じる、ｔ- ＰＡのフィブリン
特異性に関する期待は、満たされないことが明らかであ
る。また上述の様にｔ- ＰＡの短い生物学的半減期のた
めに、高い投薬量を注入しなければならない。この投薬
量はフィブリン特異性にもかかわらず系統的プラスミノ
ーゲンの活性化を生じる(Keyt等、Proc. Natl. Acad. S
ci. ９１，３６７０（１９９４））。
【０００９】ｒ- ＰＡ及びＴＮＫ- ｔ- ＰＡは、改良さ
れた性質を有するｔ- ＰＡ- 変異体である。ｒ- ＰＡ
（ＢＭ０６．０２２）の場合、最初の３つのｔ- ＰＡ-
ドメイン、すなわちフィンガードメイン、成長因子- ド
メイン及び第一クリンゲルを欠失するので、短くなった
分子は第二クリンゲルとプロテアーゼドメインしか含有
しない。ｒ- ＰＡは遺伝子工学で大腸菌中に産生され、
グリコシル化されない。ｔ- ＰＡに比してｒ- ＰＡはよ
り長い生物学的半減期を有し、より急速な再潅流を生じ
る。動物実験で、ボルスとして投与されるｒ- ＰＡはｔ
- ＰＡ- 注入と同様に有効であることが明らかである(M
artin 等、J. Cardiovasc. Pharmacol. １８，１１１
（１９９１））。
れた性質を有するｔ- ＰＡ- 変異体である。ｒ- ＰＡ
（ＢＭ０６．０２２）の場合、最初の３つのｔ- ＰＡ-
ドメイン、すなわちフィンガードメイン、成長因子- ド
メイン及び第一クリンゲルを欠失するので、短くなった
分子は第二クリンゲルとプロテアーゼドメインしか含有
しない。ｒ- ＰＡは遺伝子工学で大腸菌中に産生され、
グリコシル化されない。ｔ- ＰＡに比してｒ- ＰＡはよ
り長い生物学的半減期を有し、より急速な再潅流を生じ
る。動物実験で、ボルスとして投与されるｒ- ＰＡはｔ
- ＰＡ- 注入と同様に有効であることが明らかである(M
artin 等、J. Cardiovasc. Pharmacol. １８，１１１
（１９９１））。
【００１０】ｔ- ＰＡ- 変異体ＴＮＫ- ｔ- ＰＡは、次
の３つの点で天然ｔ- ＰＡと相違する： 103テオリンを
アスパラギンと交換、それによって新しいグリコシル化
部位を生じる； 117アスパラギンをグルタミンと交換、
それによってグリコシル化部位を除き、 296リジンと
299アルギニンの間の配列を４個の連続するアラニン-
単位と交換する。これらの３つの変異の組合せは、天然
ｔ- ＰＡに比してより高いフィブリン特異性及びより長
い生物学的半減期を有するポリペプチドを生じる。更
に、ＴＮＫ- ｔ- ＰＡは、天然ｔ- ＰＡに比して著しく
急速にＰＡＩ- １によって阻害される(Keyt 等、Proc.
Natl. Acad. Sci. ９１，３６７０（１９９４））。Ｔ
ＮＫ- ｔ- ＰＡの前駆体を用いて得られる動物実験の結
果は、ＴＮＫ- ｔ- ＰＡがボルス投与に適していること
を示している(Refino 等、Thromb. Haemost. ７０、３
１３（１９９３））。
の３つの点で天然ｔ- ＰＡと相違する： 103テオリンを
アスパラギンと交換、それによって新しいグリコシル化
部位を生じる； 117アスパラギンをグルタミンと交換、
それによってグリコシル化部位を除き、 296リジンと
299アルギニンの間の配列を４個の連続するアラニン-
単位と交換する。これらの３つの変異の組合せは、天然
ｔ- ＰＡに比してより高いフィブリン特異性及びより長
い生物学的半減期を有するポリペプチドを生じる。更
に、ＴＮＫ- ｔ- ＰＡは、天然ｔ- ＰＡに比して著しく
急速にＰＡＩ- １によって阻害される(Keyt 等、Proc.
Natl. Acad. Sci. ９１，３６７０（１９９４））。Ｔ
ＮＫ- ｔ- ＰＡの前駆体を用いて得られる動物実験の結
果は、ＴＮＫ- ｔ- ＰＡがボルス投与に適していること
を示している(Refino 等、Thromb. Haemost. ７０、３
１３（１９９３））。
【００１１】コウモリプラスミノーゲン活性化因子(bat
-PA)は、吸血コウモリ(FledermausDesmodus rotundus)
のつば中に見い出される。遺伝子工学で産生されたこれ
らのプラスミノーゲン活性化因子は、ｔ- ＰＡよりも更
に優れたフィブリン特異性を有し、動物実験で、高めら
れた生物学的半減期及び減少された系統的プラスミノー
ゲン活性化と共に改良された血栓溶解を示す(Gardell
等、Circulation ８４，２４４（１９９１））。
-PA)は、吸血コウモリ(FledermausDesmodus rotundus)
のつば中に見い出される。遺伝子工学で産生されたこれ
らのプラスミノーゲン活性化因子は、ｔ- ＰＡよりも更
に優れたフィブリン特異性を有し、動物実験で、高めら
れた生物学的半減期及び減少された系統的プラスミノー
ゲン活性化と共に改良された血栓溶解を示す(Gardell
等、Circulation ８４，２４４（１９９１））。
【００１２】血栓症疾患の治療に於て、プラスミノーゲ
ン活性化因子を一般に血液凝固阻止物質、たとえばヘパ
リンと一緒に投与する。それによってプラスミノーゲン
活性化因子での単独処理に於けるよりも改良された血栓
溶解が得られる(Tebbe等、Z.Kardiol. ８０，Suppl.
３，３２（１９９１））。臨床から得られた種々の所見
は、血栓の溶解に平行して高められた血液凝固傾向を生
じることを示している(Szczeklik等、Arterioscl. Thro
mb. １２，５４８（１９９２）；Goto等、Angiology ４
５，２７３（１９９４））。このことには血栓中に包含
され、血餅の溶解の際に再び遊離されるトロンビン分子
が原因になっていると考えられる。更に、プラスミノー
ゲン活性化因子それ自体もプロトロンビンの活性化を促
進し、それ故に血栓溶解を押さえるはたらきをすること
が示されている（Brommer 及びMeijer, Thromb. Haemos
tas.７０，９９５（１９９３））。血液凝固阻止物質、
たとえばヘパリン、ヒルゲン、ヒルジン、アルガドロバ
ン、プロテインＣ及び組換え型ダニ血液凝固阻止ペプチ
ド（ＴＡＰ）は、血栓溶解の間、強められた再閉塞傾向
を阻止し、それ故に溶解治療の結果を改良する(Yao等、
Am. J. Physiol. ２６２（HEART Circ. Physiol.３１）
Ｈ３４７−Ｈ３７９（１９９２）；Schneider, Theomb.
Res. ６４，６６７（１９９１）；Gruber等、Circulat
ion８４，２４５４（１９９１）；Martin等、J. Am. Co
ll. Cardiol. ２２，９１４（１９９３）；Vlasuk等、C
irculation ８４，Suppl.ＩＩ−４６７（１９９１）。
ン活性化因子を一般に血液凝固阻止物質、たとえばヘパ
リンと一緒に投与する。それによってプラスミノーゲン
活性化因子での単独処理に於けるよりも改良された血栓
溶解が得られる(Tebbe等、Z.Kardiol. ８０，Suppl.
３，３２（１９９１））。臨床から得られた種々の所見
は、血栓の溶解に平行して高められた血液凝固傾向を生
じることを示している(Szczeklik等、Arterioscl. Thro
mb. １２，５４８（１９９２）；Goto等、Angiology ４
５，２７３（１９９４））。このことには血栓中に包含
され、血餅の溶解の際に再び遊離されるトロンビン分子
が原因になっていると考えられる。更に、プラスミノー
ゲン活性化因子それ自体もプロトロンビンの活性化を促
進し、それ故に血栓溶解を押さえるはたらきをすること
が示されている（Brommer 及びMeijer, Thromb. Haemos
tas.７０，９９５（１９９３））。血液凝固阻止物質、
たとえばヘパリン、ヒルゲン、ヒルジン、アルガドロバ
ン、プロテインＣ及び組換え型ダニ血液凝固阻止ペプチ
ド（ＴＡＰ）は、血栓溶解の間、強められた再閉塞傾向
を阻止し、それ故に溶解治療の結果を改良する(Yao等、
Am. J. Physiol. ２６２（HEART Circ. Physiol.３１）
Ｈ３４７−Ｈ３７９（１９９２）；Schneider, Theomb.
Res. ６４，６６７（１９９１）；Gruber等、Circulat
ion８４，２４５４（１９９１）；Martin等、J. Am. Co
ll. Cardiol. ２２，９１４（１９９３）；Vlasuk等、C
irculation ８４，Suppl.ＩＩ−４６７（１９９１）。
【００１３】強められたトロンビン阻害剤の１つは、６
５個のアミノ酸から成る、チスイビル(Hirudo medicina
les)から得られるヒルジンである。いくつかのアミノ酸
が異なる種々のヒルジン- 同型が得られる。すべてのヒ
ルジン- 同型はトロンビンと物質、たとえばフィブリノ
ーゲンとの結合及びトロンビンの活性中心を遮断する(R
ydel等、Science ２４９，２７７（１９９０）；Bode及
びHuber, MolecularAspects of Inflammation, スプリ
ンガー、ベルリン、ハイデルベルク, １０３−１１５
（１９９１）；Stone 及び Hofsteenge, Prot. Enfinee
ring ２，２９５（１９９１）；Dodt等、Biol. Chem.
Hoppe-Seyler ３６６，３７９（１９８５）．更にヒル
ジンから生じる小さい分子は公知であり、これは同様に
トロンビン阻害活性を有する(Maraganore 等、Biochemi
stry ２９，７０９５（１９９０）；Krstenansky 等、
J. Med. Chem. ３０，１６８８（１９８７）；Yue 等、
Prot. Engineering ５，７７（１９９２））。
５個のアミノ酸から成る、チスイビル(Hirudo medicina
les)から得られるヒルジンである。いくつかのアミノ酸
が異なる種々のヒルジン- 同型が得られる。すべてのヒ
ルジン- 同型はトロンビンと物質、たとえばフィブリノ
ーゲンとの結合及びトロンビンの活性中心を遮断する(R
ydel等、Science ２４９，２７７（１９９０）；Bode及
びHuber, MolecularAspects of Inflammation, スプリ
ンガー、ベルリン、ハイデルベルク, １０３−１１５
（１９９１）；Stone 及び Hofsteenge, Prot. Enfinee
ring ２，２９５（１９９１）；Dodt等、Biol. Chem.
Hoppe-Seyler ３６６，３７９（１９８５）．更にヒル
ジンから生じる小さい分子は公知であり、これは同様に
トロンビン阻害活性を有する(Maraganore 等、Biochemi
stry ２９，７０９５（１９９０）；Krstenansky 等、
J. Med. Chem. ３０，１６８８（１９８７）；Yue 等、
Prot. Engineering ５，７７（１９９２））。
【００１４】ヒルジンをプラスミノーゲン活性化因子と
組合せて、血栓症疾患に使用することは、ヨーロッパ特
許第３２８９５７号及び第３６５４６８号明細書中に記
載されている。ヒルジン誘導体を血栓溶解剤と組合せて
使用することは、国際特許出願ＷＯ９１／０１１４２か
ら公知である。ヒルリンはチスイビル(Hirudo manillen
sis)から単離された６１個のアミノ酸を有するたん白質
である。ヒルリンはその作用及び阻害強度の点でヒルジ
ンと同等であるが、アミノ酸配列の点でヒルジンと著し
く異なる。ヒルリンから、トロンビンを極めて良好に阻
害するより小さい分子を生じることもできる(Krstenans
ky等、Febs Lett. ２６９，４６５（１９９０））。
組合せて、血栓症疾患に使用することは、ヨーロッパ特
許第３２８９５７号及び第３６５４６８号明細書中に記
載されている。ヒルジン誘導体を血栓溶解剤と組合せて
使用することは、国際特許出願ＷＯ９１／０１１４２か
ら公知である。ヒルリンはチスイビル(Hirudo manillen
sis)から単離された６１個のアミノ酸を有するたん白質
である。ヒルリンはその作用及び阻害強度の点でヒルジ
ンと同等であるが、アミノ酸配列の点でヒルジンと著し
く異なる。ヒルリンから、トロンビンを極めて良好に阻
害するより小さい分子を生じることもできる(Krstenans
ky等、Febs Lett. ２６９，４６５（１９９０））。
【００１５】更に、トロンビンを、ヒトトロンビンレセ
プターのアミノ- 末端配列から生じるペプチドによって
阻害することもできる(Vu 等、Nature ２５３，６７４
（１９９１））。このトロンビンレセプターは、細胞外
のアミノ- 末端域で隣接する切断部位を有するトロンビ
ン結合配列をトロンビンに対して有する。この配列は、
切断部位を42セリンから42フエニルアラニンに交換する
ことによってマスクする場合、トロンビンを阻害するこ
とができる。
プターのアミノ- 末端配列から生じるペプチドによって
阻害することもできる(Vu 等、Nature ２５３，６７４
（１９９１））。このトロンビンレセプターは、細胞外
のアミノ- 末端域で隣接する切断部位を有するトロンビ
ン結合配列をトロンビンに対して有する。この配列は、
切断部位を42セリンから42フエニルアラニンに交換する
ことによってマスクする場合、トロンビンを阻害するこ
とができる。
【００１６】Phaneuf 等は Thromb. Haemost. ７１，４
８１（１９９４）に、ストレプトキナーゼ及びヒルジン
の偶発性化学結合から成る複合体が記載されている。し
かしプラスミノーゲンを活性化する能力は、このストレ
プトキナーゼ- ヒルジン- 複合体の場合非修飾のストレ
プトキナーゼの下で因子８あたりにある。
８１（１９９４）に、ストレプトキナーゼ及びヒルジン
の偶発性化学結合から成る複合体が記載されている。し
かしプラスミノーゲンを活性化する能力は、このストレ
プトキナーゼ- ヒルジン- 複合体の場合非修飾のストレ
プトキナーゼの下で因子８あたりにある。
【００１７】
【発明を解決しようとする課題】本発明による課題は、
極めて短い時間内で完全な血栓溶解を生じさせ、同時に
血管の再度の閉塞を、まず第一に有効な血栓溶解後に阻
害する、血栓症が原因の血管閉塞を治療するための有効
物質を開発することである。更に、この有効物質を用い
て系統的プラスミノーゲン活性化因子を回避しなければ
ならない。
極めて短い時間内で完全な血栓溶解を生じさせ、同時に
血管の再度の閉塞を、まず第一に有効な血栓溶解後に阻
害する、血栓症が原因の血管閉塞を治療するための有効
物質を開発することである。更に、この有効物質を用い
て系統的プラスミノーゲン活性化因子を回避しなければ
ならない。
【００１８】
【問題を解決するための手段】本発明者は、プラスミノ
ーゲンを活性化するアミノ酸配列のＣ- 最終末端に、ト
ロンビンを阻害するアミノ酸配列を有する有効物質に対
して求められる高い要求が繊維素溶解性質を有するキメ
ラたん白質によってかなえられることを見い出した。
ーゲンを活性化するアミノ酸配列のＣ- 最終末端に、ト
ロンビンを阻害するアミノ酸配列を有する有効物質に対
して求められる高い要求が繊維素溶解性質を有するキメ
ラたん白質によってかなえられることを見い出した。
【００１９】したがって、本発明の対象はプラスミノー
ゲンを活性化するアミノ酸配列のＣ- 最終末端で式Ｉ
ゲンを活性化するアミノ酸配列のＣ- 最終末端で式Ｉ
【００２０】
【化４】
【００２１】（式中Ｘ1 はＰｒｏ又はＬｅｕ、Ｘ2 はＧ
ｌｙ、Ｖａｌ又はＰｒｏ、Ｘ3 はＬｙｓ、Ｖａｌ、Ａｒ
ｇ、Ｇｌｙ又はＧｌｕ、Ｘ4 はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｇｌ
ｙ、Ｌｅｕ又はＩｌｅ、Ｘ5 はＧｌｙ、Ｐｈｅ、Ｔｒ
ｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌ、Ｙ1 はＰｈｅ、Ｔｙｒ又はＴｒ
ｐ、Ｙ2 はＬｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ又
はＭｅｔ、Ｙ3 はＬｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｓ
ｅｒ又はＭｅｔ、Ｙ4 はＡｒｇ、Ｌｙｓ又はＨｉｓ及び
Ｚは式ＩＩ
ｌｙ、Ｖａｌ又はＰｒｏ、Ｘ3 はＬｙｓ、Ｖａｌ、Ａｒ
ｇ、Ｇｌｙ又はＧｌｕ、Ｘ4 はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｇｌ
ｙ、Ｌｅｕ又はＩｌｅ、Ｘ5 はＧｌｙ、Ｐｈｅ、Ｔｒ
ｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌ、Ｙ1 はＰｈｅ、Ｔｙｒ又はＴｒ
ｐ、Ｙ2 はＬｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ又
はＭｅｔ、Ｙ3 はＬｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｓ
ｅｒ又はＭｅｔ、Ｙ4 はＡｒｇ、Ｌｙｓ又はＨｉｓ及び
Ｚは式ＩＩ
【００２２】
【化５】
【００２３】（式中Ｚ1 はＰｈｅ又はＴｙｒを示す。）
又は式ＩＩＩ
又は式ＩＩＩ
【００２４】
【化６】
【００２５】のアミノ酸配列を示す。）のアミノ酸配列
と結合する、繊維素溶解性のトロンビン阻害性質を有す
るキメラたん白質である。本発明によるキメラたん白質
は、式Ｉのトロンビン- 阻害アミノ酸配列を介してトロ
ンビンと結合する。それによって血餅に於てキメラたん
白質の高い濃度が達成される。急性心筋梗塞又は脳梗塞
で生じる血餅はトロンビンが豊富であるので、本発明に
よるたん白質の血栓特異性は、プラスミノーゲン活性化
因子の血栓溶解有効性及び選択性を高める可能性を提供
する。これによって系統的プラスミノーゲン活性化及び
繊維素溶解を回避し、有効物質の安全性が明らかに増加
する。血栓特異性によって投薬量も慣用のプラスミノー
ゲン活性化因子に比して減少する。このことは調製物の
安全性も増加させる。同時に抗凝固性共薬剤（たとえば
ヘパリン含有）の投薬量は本発明によるたん白質の使用
で減少することが予想される。更に抗凝固剤の追加は必
要でなくなる。
と結合する、繊維素溶解性のトロンビン阻害性質を有す
るキメラたん白質である。本発明によるキメラたん白質
は、式Ｉのトロンビン- 阻害アミノ酸配列を介してトロ
ンビンと結合する。それによって血餅に於てキメラたん
白質の高い濃度が達成される。急性心筋梗塞又は脳梗塞
で生じる血餅はトロンビンが豊富であるので、本発明に
よるたん白質の血栓特異性は、プラスミノーゲン活性化
因子の血栓溶解有効性及び選択性を高める可能性を提供
する。これによって系統的プラスミノーゲン活性化及び
繊維素溶解を回避し、有効物質の安全性が明らかに増加
する。血栓特異性によって投薬量も慣用のプラスミノー
ゲン活性化因子に比して減少する。このことは調製物の
安全性も増加させる。同時に抗凝固性共薬剤（たとえば
ヘパリン含有）の投薬量は本発明によるたん白質の使用
で減少することが予想される。更に抗凝固剤の追加は必
要でなくなる。
【００２６】好ましいキメラたん白質は、プラスミノー
ゲンを活性化するアミノ酸配列は、プロウロキナーゼの
不変化アミノ酸配列；欠失、置換、挿入及び（又は）付
加によって修飾されたプロウキナーゼのアミノ酸配列の
少なくとも１種、ウロキナーゼの不変化アミノ酸配列；
欠失、置換、挿入及び（又は）付加によって修飾された
ウロキナーゼのアミノ酸配列少なくとも１種、組織プラ
スミノーゲン活性化因子（ｔ- ＰＡ）の不変化アミノ酸
配列；欠失、置換、挿入及び（又は）付加によって修飾
されたｔ- ＰＡのアミノ酸配列、コウモリ- プラスミノ
ーゲン活性化因子（ｂａｔ- ＰＡ）の不変化アミノ酸配
列；欠失、置換、挿入及び（又は）付加によって修飾さ
れたｂａｔ- ＰＡのアミノ酸配列少なくとも１種及び
（又は）ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ及び
（又は）ＡＰＳＡＣのアミノ酸配列を含有する。
ゲンを活性化するアミノ酸配列は、プロウロキナーゼの
不変化アミノ酸配列；欠失、置換、挿入及び（又は）付
加によって修飾されたプロウキナーゼのアミノ酸配列の
少なくとも１種、ウロキナーゼの不変化アミノ酸配列；
欠失、置換、挿入及び（又は）付加によって修飾された
ウロキナーゼのアミノ酸配列少なくとも１種、組織プラ
スミノーゲン活性化因子（ｔ- ＰＡ）の不変化アミノ酸
配列；欠失、置換、挿入及び（又は）付加によって修飾
されたｔ- ＰＡのアミノ酸配列、コウモリ- プラスミノ
ーゲン活性化因子（ｂａｔ- ＰＡ）の不変化アミノ酸配
列；欠失、置換、挿入及び（又は）付加によって修飾さ
れたｂａｔ- ＰＡのアミノ酸配列少なくとも１種及び
（又は）ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ及び
（又は）ＡＰＳＡＣのアミノ酸配列を含有する。
【００２７】プラスミノーゲンを活性化するアミノ酸配
列は、プロウロキナーゼの不変化アミノ酸配列；欠失、
置換、挿入及び（又は）付加によって修飾されたプロウ
ロキナーゼのアミノ酸配列少なくとも１種、ｔ- ＰＡの
不変化アミノ酸配列及び（又は）欠失、置換、挿入及び
（又は）付加によって修飾された、ｔＰＡのアミノ酸配
列少なくとも１種を含有する。プラスミノーゲンを活性
化するアミノ酸配列が、不変化の、アミノ酸４１１個か
ら成るプロウロキナーゼの配列───これの中でアミノ
酸は407 Ａｓｎ又はＧｌｎの位置にある───から、プ
ロウロキナーゼのアミノ酸配列47Ｓｅｒ〜 411Ｌｅｕ─
──これ中でアミノ酸は407 Ａｓｎ又はＧｌｎの位置に
ある───から、プロウロキナーゼのアミノ酸配列 138
Ｓｅｒ〜 411Ｌｅｕ ───これ中でアミノ酸は407 Ａ
ｓｎ又はＧｌｎの位置にある───から、不変化の、ア
ミノ酸５２７個から成るｔ- ＰＡのアミノ酸配列Ｓｅｒ
− 89Ａｒｇ〜 527Ｐｒｏから及び（又は）ｔ- ＰＡの
アミノ酸配列 174Ｓｅｒ〜 527Ｐｒｏから成るたん白質
が特に好ましい。
列は、プロウロキナーゼの不変化アミノ酸配列；欠失、
置換、挿入及び（又は）付加によって修飾されたプロウ
ロキナーゼのアミノ酸配列少なくとも１種、ｔ- ＰＡの
不変化アミノ酸配列及び（又は）欠失、置換、挿入及び
（又は）付加によって修飾された、ｔＰＡのアミノ酸配
列少なくとも１種を含有する。プラスミノーゲンを活性
化するアミノ酸配列が、不変化の、アミノ酸４１１個か
ら成るプロウロキナーゼの配列───これの中でアミノ
酸は407 Ａｓｎ又はＧｌｎの位置にある───から、プ
ロウロキナーゼのアミノ酸配列47Ｓｅｒ〜 411Ｌｅｕ─
──これ中でアミノ酸は407 Ａｓｎ又はＧｌｎの位置に
ある───から、プロウロキナーゼのアミノ酸配列 138
Ｓｅｒ〜 411Ｌｅｕ ───これ中でアミノ酸は407 Ａ
ｓｎ又はＧｌｎの位置にある───から、不変化の、ア
ミノ酸５２７個から成るｔ- ＰＡのアミノ酸配列Ｓｅｒ
− 89Ａｒｇ〜 527Ｐｒｏから及び（又は）ｔ- ＰＡの
アミノ酸配列 174Ｓｅｒ〜 527Ｐｒｏから成るたん白質
が特に好ましい。
【００２８】キメラたん白質に於て、プラスミノーゲン
を活性化するアミノ酸配列はＣ- 最終末端で好ましくは
式Ｉのトロンビンを阻害するアミノ酸配列（式中Ｘ1 は
Ｐｒｏ、Ｘ2 はＶａｌ、Ｘ3 はＬｙｓ又はＶａｌ、Ｘ4
はＡｌａ、Ｘ5 はＰｈｅを示す。）と結合する。式Ｉの
アミノ酸配列中、Ｙ1 は好ましくはＰｈｅ、Ｙ2 は好ま
しくはＬｅｕ、Ｙ3 は好ましくはＬｅｕ、Ｙ4 は好まし
くはＡｒｇを示す。式Ｉのアミノ酸配列中、変化可能な
Ｚは、特に式ＩＩ又はＩＶのアミノ酸配列を示す。
を活性化するアミノ酸配列はＣ- 最終末端で好ましくは
式Ｉのトロンビンを阻害するアミノ酸配列（式中Ｘ1 は
Ｐｒｏ、Ｘ2 はＶａｌ、Ｘ3 はＬｙｓ又はＶａｌ、Ｘ4
はＡｌａ、Ｘ5 はＰｈｅを示す。）と結合する。式Ｉの
アミノ酸配列中、Ｙ1 は好ましくはＰｈｅ、Ｙ2 は好ま
しくはＬｅｕ、Ｙ3 は好ましくはＬｅｕ、Ｙ4 は好まし
くはＡｒｇを示す。式Ｉのアミノ酸配列中、変化可能な
Ｚは、特に式ＩＩ又はＩＶのアミノ酸配列を示す。
【００２９】公知のプラスミノーゲン活性化因子；プラ
スミノーゲン活性化因子とトロンビン阻害剤とから成る
公知の混合物並びに公知のストレプトキナーゼ- ヒルジ
ン-複合体に比して、本発明によるたん白質は良好にト
ロンビンを阻害する性質と共に、強められた繊維素溶解
作用の点で優れている。更に本発明によるポリペプチド
によってプラズマフィブリノーゲンが明らかにより僅か
な量で消費される。これから結果として生じるフィブリ
ン特異性、特にプラスミノーゲン活性化因子とトロンビ
ン阻害剤との公知の混合物と比較しても著しく高められ
たフィブリン特異性は次のことを生じさせる。それは血
液の凝固性にほんの僅かにしか影響を与えず、そして制
御されていない出血の危険を系統的フィブリノーゲン分
解の起こりうる併発症として最も少なくすることであ
る。したがって本発明によるたん白質の高いフィブリン
特異性は、公知の血栓溶解剤のボルス投与に比して明ら
かに減少された出血の危険を有するボルス投与を可能に
する。
スミノーゲン活性化因子とトロンビン阻害剤とから成る
公知の混合物並びに公知のストレプトキナーゼ- ヒルジ
ン-複合体に比して、本発明によるたん白質は良好にト
ロンビンを阻害する性質と共に、強められた繊維素溶解
作用の点で優れている。更に本発明によるポリペプチド
によってプラズマフィブリノーゲンが明らかにより僅か
な量で消費される。これから結果として生じるフィブリ
ン特異性、特にプラスミノーゲン活性化因子とトロンビ
ン阻害剤との公知の混合物と比較しても著しく高められ
たフィブリン特異性は次のことを生じさせる。それは血
液の凝固性にほんの僅かにしか影響を与えず、そして制
御されていない出血の危険を系統的フィブリノーゲン分
解の起こりうる併発症として最も少なくすることであ
る。したがって本発明によるたん白質の高いフィブリン
特異性は、公知の血栓溶解剤のボルス投与に比して明ら
かに減少された出血の危険を有するボルス投与を可能に
する。
【００３０】したがってもう１つの本発明の対象は、本
発明によるたん白質を有効物質として含有する血栓溶解
剤である。血栓症の原因となる血管閉塞、たとえば心筋
梗塞、脳梗塞、末梢の急性動脈閉塞、肺塞栓、不安定な
狭心症及び深在性下肢- 及び骨盤静脈血栓症に、本発明
によるポリペプチド０．１〜１ｍｇ／ｋｇが必要であ
る。本発明によるたん白質は静脈内にボルス注射又は注
入によって投与される。
発明によるたん白質を有効物質として含有する血栓溶解
剤である。血栓症の原因となる血管閉塞、たとえば心筋
梗塞、脳梗塞、末梢の急性動脈閉塞、肺塞栓、不安定な
狭心症及び深在性下肢- 及び骨盤静脈血栓症に、本発明
によるポリペプチド０．１〜１ｍｇ／ｋｇが必要であ
る。本発明によるたん白質は静脈内にボルス注射又は注
入によって投与される。
【００３１】本発明による血栓溶解剤は、少なくとも１
種の本発明によるポリペプチドの他に助剤、たとえば賦
形剤、溶剤、希釈剤、染料及び結合剤を含有する。これ
らの助剤の選択並びにその使用すべき量それ自体は、薬
剤が投与されてよいこと、及び薬剤が当業者に問題なく
調製されることに依る。本発明によるたん白質の産生
は、遺伝子工学の方法によって行われる。更に、対応す
る遺伝子を、合成オリゴヌクレオチドから適当なプラス
ミド中に定着し、これはｔｒｐ- 又はｔａｃ- プロモー
ターの制御下、特にｔｒｐ- プロモーターの制御下に大
腸菌中で発現する。
種の本発明によるポリペプチドの他に助剤、たとえば賦
形剤、溶剤、希釈剤、染料及び結合剤を含有する。これ
らの助剤の選択並びにその使用すべき量それ自体は、薬
剤が投与されてよいこと、及び薬剤が当業者に問題なく
調製されることに依る。本発明によるたん白質の産生
は、遺伝子工学の方法によって行われる。更に、対応す
る遺伝子を、合成オリゴヌクレオチドから適当なプラス
ミド中に定着し、これはｔｒｐ- 又はｔａｃ- プロモー
ターの制御下、特にｔｒｐ- プロモーターの制御下に大
腸菌中で発現する。
【００３２】したがって本発明の対象は、本発明による
キメラたん白質を産生する際に使用するプラスミドにも
あり、そのオペロンは制御可能なプロモーター、リボソ
ーム結合部位として有効なシャイン・ダルガーノ配列、
開始コドン、本発明によるたん白質に対する合成構造遺
伝子及び構造遺伝子から上流へターミネーター１又は２
個を有する。
キメラたん白質を産生する際に使用するプラスミドにも
あり、そのオペロンは制御可能なプロモーター、リボソ
ーム結合部位として有効なシャイン・ダルガーノ配列、
開始コドン、本発明によるたん白質に対する合成構造遺
伝子及び構造遺伝子から上流へターミネーター１又は２
個を有する。
【００３３】本発明によるプラスミドの発現を、大腸菌
株、特にグループＫ１２の大腸菌、たとえばＥ．ｃｏｌ
ｉ Ｋ１２ ＪＭ１０１（ＡＴＣＣ３３８７６）、Ｅ．
ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＭ１０３（ＡＴＣＣ３９４０
３）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ＪＭ１０５（ＤＳＭ４１６
２）及びＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３
８４９）中で行う。細菌細胞中に、本発明によるポリペ
プチドは、たん白質が変性された形で存在する封入体の
形で高収率で生じる。封入体の単離後、変性されたたん
白質をたん白質化学でレドックス系の作用下所望の三次
構造に折りたたむ。
株、特にグループＫ１２の大腸菌、たとえばＥ．ｃｏｌ
ｉ Ｋ１２ ＪＭ１０１（ＡＴＣＣ３３８７６）、Ｅ．
ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＭ１０３（ＡＴＣＣ３９４０
３）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ＪＭ１０５（ＤＳＭ４１６
２）及びＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３
８４９）中で行う。細菌細胞中に、本発明によるポリペ
プチドは、たん白質が変性された形で存在する封入体の
形で高収率で生じる。封入体の単離後、変性されたたん
白質をたん白質化学でレドックス系の作用下所望の三次
構造に折りたたむ。
【００３４】
【実施例】次に例によって本発明を説明する。 〔例１〕本発明によるたん白質の産生、単離及び精製。 ａ）定着処理 大腸菌中で本発明によるポリペプチドを遺伝子工学によ
る産生に使用される発現プラスミドを公知の方法で生成
する。各生成工程の順序を図１〜２に示す。プラスミド
生成の出発物は、プラスミド pBlueskript ＫＳＩＩ＋
(Stratagene社、ハイデルベルグ）、ｐＵＣ８及びｐＳ
Ｌ１１９０（Pharmacia 社、フライブルグ）並びにｐＧ
Ｒ２０１である。ｐＧＲ２０１は、ヨーロッパ特許第４
０８９４５号明細書及び Appl. Microbiol. Biotechn.
３６，６４０−６４９（１９９２）に記載されているプ
ラスミドｐＢＦ１６０と同一である。制限エンドヌクレ
アーゼBan II, BamHI, ClaI, HindIII, NcoI, NdeI, Nh
eI及びNotl, 並びにＤＮＡ- 修飾された酵素、たとえば
アルカリ性ホスファターゼ、Ｔ４- リガーゼ、Ｔ４- キ
ナーゼ及びＴ７- ポリメラーゼを Pharmacia社、Strata
gene社、Boehringer Mannheim及び Gibco（エゲンシュ
タイン）から入手する。その生成の間のプラスミドの変
化を、制限分析及びＤＮＡ- 配列分析によって検査す
る。ＤＮＡ-配列分析を製造者の説明書に従って Pharma
cia社の試薬コレクションを用いて行う。プラスミドの
生成にあたり、種々のオリゴデスオキシリボヌクレオチ
ド(Oligos)を使用し、その配列を、関連する表示と共に
表１中に記載する。
る産生に使用される発現プラスミドを公知の方法で生成
する。各生成工程の順序を図１〜２に示す。プラスミド
生成の出発物は、プラスミド pBlueskript ＫＳＩＩ＋
(Stratagene社、ハイデルベルグ）、ｐＵＣ８及びｐＳ
Ｌ１１９０（Pharmacia 社、フライブルグ）並びにｐＧ
Ｒ２０１である。ｐＧＲ２０１は、ヨーロッパ特許第４
０８９４５号明細書及び Appl. Microbiol. Biotechn.
３６，６４０−６４９（１９９２）に記載されているプ
ラスミドｐＢＦ１６０と同一である。制限エンドヌクレ
アーゼBan II, BamHI, ClaI, HindIII, NcoI, NdeI, Nh
eI及びNotl, 並びにＤＮＡ- 修飾された酵素、たとえば
アルカリ性ホスファターゼ、Ｔ４- リガーゼ、Ｔ４- キ
ナーゼ及びＴ７- ポリメラーゼを Pharmacia社、Strata
gene社、Boehringer Mannheim及び Gibco（エゲンシュ
タイン）から入手する。その生成の間のプラスミドの変
化を、制限分析及びＤＮＡ- 配列分析によって検査す
る。ＤＮＡ-配列分析を製造者の説明書に従って Pharma
cia社の試薬コレクションを用いて行う。プラスミドの
生成にあたり、種々のオリゴデスオキシリボヌクレオチ
ド(Oligos)を使用し、その配列を、関連する表示と共に
表１中に記載する。
【００３５】オリゴデスオキシリボヌクレオチドを、脱
トリチル化された形で０．１μＭｏｌ- スケールで、工
場で適用されるバイオシステム(Weitersadt)の合成酵素
（モデル３９１）を用いて製造者の説明書に従ってβ-
シアノエチル- 保護されたジイソプロピルアミノホスホ
アミジトの使用下に行う。夫々１００ｐｍｏｌのオリゴ
デスオキシリボヌクレオチドを、５０ｍＭトリ（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン／ＨＣｌ（トリス／ＨＣ
ｌ）、１０ｍＭ塩化マグネシウム及び５ｍＭジチオスレ
イトール中で７．５のｐＨ- 値で酵素単位Ｔ４- キナー
ゼを用いて１０ｍＭアデノシントリホスフアートの存在
下にホスホリル化し、次いで同一の緩衝液中で二本鎖Ｄ
ＮＡ- 分子に変える。得られた合成の二本鎖ＤＮＡ- 分
子をゲル電気泳動によってポリアクリルアミドゲル（５
％ポリアクリルアミド）上で精製し、次いで前もって調
製されたプラスミドとの連結反応に使用する。制限酵素
で消化、対応する制限フラグメントの単離及び５'-末端
の脱ホスホリル化、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＭ１０３
中での引き続きの連結反応及び形質転換並びにすべての
他の遺伝子工学処理によるプラスミドの前もっての調製
は、公知方法で行われ、Sambrook等、"Molecular Cloni
ng: A Laboratory Manual", 2. Auflage, ColdSpring H
arbor Laboratory Press, Cold Spring Harbour, アメ
リカ, １９８９中に記載されている。
トリチル化された形で０．１μＭｏｌ- スケールで、工
場で適用されるバイオシステム(Weitersadt)の合成酵素
（モデル３９１）を用いて製造者の説明書に従ってβ-
シアノエチル- 保護されたジイソプロピルアミノホスホ
アミジトの使用下に行う。夫々１００ｐｍｏｌのオリゴ
デスオキシリボヌクレオチドを、５０ｍＭトリ（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン／ＨＣｌ（トリス／ＨＣ
ｌ）、１０ｍＭ塩化マグネシウム及び５ｍＭジチオスレ
イトール中で７．５のｐＨ- 値で酵素単位Ｔ４- キナー
ゼを用いて１０ｍＭアデノシントリホスフアートの存在
下にホスホリル化し、次いで同一の緩衝液中で二本鎖Ｄ
ＮＡ- 分子に変える。得られた合成の二本鎖ＤＮＡ- 分
子をゲル電気泳動によってポリアクリルアミドゲル（５
％ポリアクリルアミド）上で精製し、次いで前もって調
製されたプラスミドとの連結反応に使用する。制限酵素
で消化、対応する制限フラグメントの単離及び５'-末端
の脱ホスホリル化、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＭ１０３
中での引き続きの連結反応及び形質転換並びにすべての
他の遺伝子工学処理によるプラスミドの前もっての調製
は、公知方法で行われ、Sambrook等、"Molecular Cloni
ng: A Laboratory Manual", 2. Auflage, ColdSpring H
arbor Laboratory Press, Cold Spring Harbour, アメ
リカ, １９８９中に記載されている。
【００３６】
【表１】
【００３７】ｂ）連続培養及び発酵の調製。 組換え型発現プラスミドｐＳＥ１（Ｍ３８）及びｐＳＥ
９（３７）大腸菌 Ｋ１２ ＪＭ１０３（ＡＴＣＣ３９
４０３）中に入れ、標準- Ｉ- 栄養寒天（MERCK 社、ア
ンピシリン１５０ｍｇ／ｌ）上に塗布する(Sambrook
等、"MolecularCloning: A Laboratory Manual") 。各
形質転換の単一コロニーの夫々を、標準- Ｉ- 栄養ブイ
ヨン(Merck社、ｐＨ７．０；アンピシリン１５０ｍｇ／
ｌ）中で２０℃で５７８ｎｍで１の光学密度（ＯＤ）ま
で培養し、連続培養物として２ｍｌづつ分けてジメチル
スルホキシド（ＤＭＳＯ）（７．５％最終濃度）の添加
下に−７０℃で凍結し、保存する。本発明によるポリペ
プチドの産生のために、各連続培養物の夫々１ｍｌを標
準- Ｉ- 栄養ブイヨン２０ｍｌ（ｐＨ７．０；１５０ｍ
ｇ／ｌアンピシリン）中で懸濁し、３７℃で５７８ｎｍ
で１のＯＤまで培養する。
９（３７）大腸菌 Ｋ１２ ＪＭ１０３（ＡＴＣＣ３９
４０３）中に入れ、標準- Ｉ- 栄養寒天（MERCK 社、ア
ンピシリン１５０ｍｇ／ｌ）上に塗布する(Sambrook
等、"MolecularCloning: A Laboratory Manual") 。各
形質転換の単一コロニーの夫々を、標準- Ｉ- 栄養ブイ
ヨン(Merck社、ｐＨ７．０；アンピシリン１５０ｍｇ／
ｌ）中で２０℃で５７８ｎｍで１の光学密度（ＯＤ）ま
で培養し、連続培養物として２ｍｌづつ分けてジメチル
スルホキシド（ＤＭＳＯ）（７．５％最終濃度）の添加
下に−７０℃で凍結し、保存する。本発明によるポリペ
プチドの産生のために、各連続培養物の夫々１ｍｌを標
準- Ｉ- 栄養ブイヨン２０ｍｌ（ｐＨ７．０；１５０ｍ
ｇ／ｌアンピシリン）中で懸濁し、３７℃で５７８ｎｍ
で１のＯＤまで培養する。
【００３８】次いで得られた培養物の全量を標準- Ｉ-
栄養ブイヨン１ｌ（ｐＨ７．０；１５０ｍｇ／ｌアンピ
シリン）中に懸濁し、振盪フラスコ中で３７℃で発酵す
る。誘発はインドールアクリル酢酸溶液２ｍｌ（エタノ
ール２ｍｌ中に６０ｍｇ）の添加によって５７８ｎｍで
０．５〜１のＯＤで行われる。 ｃ）発現テスト 発現度をテストするために、誘発の直前及び誘発後の各
時間（全体で６時間）で、５７８ｎｍで１のＯＤを有す
る細胞懸濁液１ｍｌに相当する細胞を遠心分離する。沈
降された細胞を、リゾチーム（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ
- 緩衝液、ｐＨ８．０、５０ｍＭエチレンジアミンテト
ラ酢酸（ＥＤＴＡ）及び１５％サッカロース中でｍｌあ
たりリゾチーム１ｍｇ）を用いて加水分解する。溶解さ
れた細胞のホモジネートを、４〜５Ｍグアニジニウムハ
イドロクロライド溶液中に溶解し、１．２Ｍグアニジニ
ウムハイドロクロライドに希釈後、還元剤（グルタチオ
ン又はシスティン）の添加下に２〜５時間折りたたみ反
応を行う(Winkler等、Biochemistry ２５ ４０４１〜
４０４５（１９８６））。得られた一本鎖の本発明によ
るポリペプチドを、プラスミンの添加によって対応する
二本鎖分子に変え、その活性を色素産生基質ｐｙｒｏ-
Ｇｌｕ- Ａｒｇ- ｐ- ニトロアニリドを用いて測定す
る。本発明によるポリペプチドのプラスミンによる活性
化は、５０ｍＭトリス／ＨＣｌ- 緩衝液、１２ｍＭ塩化
ナトリウム、０．０２％トウィーン８０中でｐＨ７．４
及び３７℃で行われる。本発明によるポリペプチドとプ
ラスミンの割合は、酵素単位あたり約８，０００−３
６，０００である。試験培養は、５０ｍＭトリス／ＨＣ
ｌ- 緩衝液及び３８ｍＭ塩化ナトリウム中でｐＨ８．８
で０．３６μＭアプロチニン（プラスミンの阻害のため
に）及び０．２７ｍＭ基質ｐｙｒｏ- Ｇｌｕ- Ｇｌｙ-
Ａｒｇ- ｐ- ニトロアニリドの存在下に３７℃で行われ
る。本発明によるポリペプチド濃度に関係なく、反応を
５〜６０分培養後５０％酢酸の添加によって停止し、４
０５ｎｍで吸光を測定する。基質の製造者(Kadi Vitru
m, スウェーデン) の説明書によれば、この処理で４０
５ｎｍで１分あたり０．０５の吸光変化は、試験溶液１
ｍｌあたり２５プラーク- 単位のウロキナーゼ- 活性に
相当する。本発明によるポリペプチドは、たん白質１ｍ
ｇあたり１２０，０００〜１５５，０００プラーク- 単
位の比活性を有する。溶液のたん白質含有量は、Pierce
社のＢＣＡ- 検定法を用いて測定する。 ｄ）単離及び精製 ６時間後、１ｂ）に記載された条件で行われた発酵を終
了し（５７．８ｎｍで密度５〜６ＯＤ）、細胞を遠心分
離によって収得する。細胞沈降物を水２００ｍｌで再懸
濁し、高圧ホモジナイザー中で分解する。新たに遠心分
離した後、一本鎖の本発明によるポリペプチドの全量を
含有する沈澱を、５Ｍグアニジニウムハイドロクロライ
ド５００ｍｌ、４０ｍＭシステイン、１ｍＭ ＥＤＴＡ
中にｐＨ- 値８．０で溶解し、ｐＨ- 値９．０の２５ｍ
Ｍトリス／ＨＣｌ ２０００ｍｌを用いて希釈する。折
りたたみ反応を約１２時間後に完了する。
栄養ブイヨン１ｌ（ｐＨ７．０；１５０ｍｇ／ｌアンピ
シリン）中に懸濁し、振盪フラスコ中で３７℃で発酵す
る。誘発はインドールアクリル酢酸溶液２ｍｌ（エタノ
ール２ｍｌ中に６０ｍｇ）の添加によって５７８ｎｍで
０．５〜１のＯＤで行われる。 ｃ）発現テスト 発現度をテストするために、誘発の直前及び誘発後の各
時間（全体で６時間）で、５７８ｎｍで１のＯＤを有す
る細胞懸濁液１ｍｌに相当する細胞を遠心分離する。沈
降された細胞を、リゾチーム（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ
- 緩衝液、ｐＨ８．０、５０ｍＭエチレンジアミンテト
ラ酢酸（ＥＤＴＡ）及び１５％サッカロース中でｍｌあ
たりリゾチーム１ｍｇ）を用いて加水分解する。溶解さ
れた細胞のホモジネートを、４〜５Ｍグアニジニウムハ
イドロクロライド溶液中に溶解し、１．２Ｍグアニジニ
ウムハイドロクロライドに希釈後、還元剤（グルタチオ
ン又はシスティン）の添加下に２〜５時間折りたたみ反
応を行う(Winkler等、Biochemistry ２５ ４０４１〜
４０４５（１９８６））。得られた一本鎖の本発明によ
るポリペプチドを、プラスミンの添加によって対応する
二本鎖分子に変え、その活性を色素産生基質ｐｙｒｏ-
Ｇｌｕ- Ａｒｇ- ｐ- ニトロアニリドを用いて測定す
る。本発明によるポリペプチドのプラスミンによる活性
化は、５０ｍＭトリス／ＨＣｌ- 緩衝液、１２ｍＭ塩化
ナトリウム、０．０２％トウィーン８０中でｐＨ７．４
及び３７℃で行われる。本発明によるポリペプチドとプ
ラスミンの割合は、酵素単位あたり約８，０００−３
６，０００である。試験培養は、５０ｍＭトリス／ＨＣ
ｌ- 緩衝液及び３８ｍＭ塩化ナトリウム中でｐＨ８．８
で０．３６μＭアプロチニン（プラスミンの阻害のため
に）及び０．２７ｍＭ基質ｐｙｒｏ- Ｇｌｕ- Ｇｌｙ-
Ａｒｇ- ｐ- ニトロアニリドの存在下に３７℃で行われ
る。本発明によるポリペプチド濃度に関係なく、反応を
５〜６０分培養後５０％酢酸の添加によって停止し、４
０５ｎｍで吸光を測定する。基質の製造者(Kadi Vitru
m, スウェーデン) の説明書によれば、この処理で４０
５ｎｍで１分あたり０．０５の吸光変化は、試験溶液１
ｍｌあたり２５プラーク- 単位のウロキナーゼ- 活性に
相当する。本発明によるポリペプチドは、たん白質１ｍ
ｇあたり１２０，０００〜１５５，０００プラーク- 単
位の比活性を有する。溶液のたん白質含有量は、Pierce
社のＢＣＡ- 検定法を用いて測定する。 ｄ）単離及び精製 ６時間後、１ｂ）に記載された条件で行われた発酵を終
了し（５７．８ｎｍで密度５〜６ＯＤ）、細胞を遠心分
離によって収得する。細胞沈降物を水２００ｍｌで再懸
濁し、高圧ホモジナイザー中で分解する。新たに遠心分
離した後、一本鎖の本発明によるポリペプチドの全量を
含有する沈澱を、５Ｍグアニジニウムハイドロクロライ
ド５００ｍｌ、４０ｍＭシステイン、１ｍＭ ＥＤＴＡ
中にｐＨ- 値８．０で溶解し、ｐＨ- 値９．０の２５ｍ
Ｍトリス／ＨＣｌ ２０００ｍｌを用いて希釈する。折
りたたみ反応を約１２時間後に完了する。
【００３９】得られた本発明によるポリペプチドを、シ
リカゲル８ｇの添加後２時間の攪拌によって完全にシリ
カゲルと結合する。結合されたシリカゲルを分離し、酢
酸塩- 緩衝液（ｐＨ４．０）で洗滌する。ポリペプチド
を、０．５Ｍトリメチルアンモニウムクロライド（ＴＭ
ＡＣ）を用いて０．１Ｍ酢酸塩- 緩衝液（ｐＨ４）溶離
する。２つのクロマトグラフィー分離（銅- キレート-
カラムとカチオン交換体）後、ポリペプチドが純粋な形
で得られる。Ｎ- 末端配列分析によって一本鎖を確認す
る。
リカゲル８ｇの添加後２時間の攪拌によって完全にシリ
カゲルと結合する。結合されたシリカゲルを分離し、酢
酸塩- 緩衝液（ｐＨ４．０）で洗滌する。ポリペプチド
を、０．５Ｍトリメチルアンモニウムクロライド（ＴＭ
ＡＣ）を用いて０．１Ｍ酢酸塩- 緩衝液（ｐＨ４）溶離
する。２つのクロマトグラフィー分離（銅- キレート-
カラムとカチオン交換体）後、ポリペプチドが純粋な形
で得られる。Ｎ- 末端配列分析によって一本鎖を確認す
る。
【００４０】すべての単離された本発明によるポリペプ
チド──そのアミノ酸配列は図１３〜１４に記載されて
いる──は、ウロキナーゼに対する色素産生基質を用い
る直接的な活性度試験で全く又は極めて僅かしか活性度
を示さない（１％以下）。プラスミンで分解した後に初
めて（条件は１ｃの項に記載した）完全な酵素活性が得
られる。したがって本発明によるポリペプチドは、大腸
菌Ｋ１２ ＪＭ１０３中で一本鎖たん白質として発現す
る。 ２．トロンビン阻害作用の測定 本発明によるポリペプチドの阻害活性を、ヒトクエン酸
プラズマをベロナール緩衝液中でトロンビン溶液５０μ
ｌ（０．２単位）で１：１０に希釈されたプラズマ２０
０μｌと本発明によるポリペプチド０．４〜３０μｇを
含有する水性溶液５０μｌを混合することによるトロン
ビン存続期間の測定によって決定する。表２中に記載さ
れたトロンビン存続期間をプロウロキナーゼ又は本発明
によるたん白質Ｍ３７及びＭ３８の存在下に測定する。
プロウロキナーゼに反してＭ３７及びＭ３８は投薬量に
関係なくトロンビン存続期間を延長し、したがって血液
凝固の阻害剤として作用する 表 ２： トロンビン存続期間〔秒〕 たん白質 プロウロキナーゼ Ｍ３７ Ｍ３８ ０ ３１ ３２ ３２ ０．４ ４０ ０．８ ７９ １．２ １４８ １．６ １９５ ２．０ ２６６ ４．０ ３１ ＞３００ ５８ ８．０ ８１ １２．０ １０４ １６．０ １３０ ２０．０ ３３ １５０ ３０．０ ３３ ＞３００
チド──そのアミノ酸配列は図１３〜１４に記載されて
いる──は、ウロキナーゼに対する色素産生基質を用い
る直接的な活性度試験で全く又は極めて僅かしか活性度
を示さない（１％以下）。プラスミンで分解した後に初
めて（条件は１ｃの項に記載した）完全な酵素活性が得
られる。したがって本発明によるポリペプチドは、大腸
菌Ｋ１２ ＪＭ１０３中で一本鎖たん白質として発現す
る。 ２．トロンビン阻害作用の測定 本発明によるポリペプチドの阻害活性を、ヒトクエン酸
プラズマをベロナール緩衝液中でトロンビン溶液５０μ
ｌ（０．２単位）で１：１０に希釈されたプラズマ２０
０μｌと本発明によるポリペプチド０．４〜３０μｇを
含有する水性溶液５０μｌを混合することによるトロン
ビン存続期間の測定によって決定する。表２中に記載さ
れたトロンビン存続期間をプロウロキナーゼ又は本発明
によるたん白質Ｍ３７及びＭ３８の存在下に測定する。
プロウロキナーゼに反してＭ３７及びＭ３８は投薬量に
関係なくトロンビン存続期間を延長し、したがって血液
凝固の阻害剤として作用する 表 ２： トロンビン存続期間〔秒〕 たん白質 プロウロキナーゼ Ｍ３７ Ｍ３８ ０ ３１ ３２ ３２ ０．４ ４０ ０．８ ７９ １．２ １４８ １．６ １９５ ２．０ ２６６ ４．０ ３１ ＞３００ ５８ ８．０ ８１ １２．０ １０４ １６．０ １３０ ２０．０ ３３ １５０ ３０．０ ３３ ＞３００
【図面の簡単な説明】
【図１】繊維素溶解性質を有するたん白質を生成するた
めのプラスミドを産生する方法を示す。
めのプラスミドを産生する方法を示す。
【図２】繊維素溶解性質を有するたん白質を生成するた
めのプラスミドを産生する方法を示す。
めのプラスミドを産生する方法を示す。
【図３】繊維素溶解性質を有するたん白質を生成するた
めのプラスミドを産生する方法を示す。
めのプラスミドを産生する方法を示す。
【図４】繊維素溶解性質を有するたん白質を生成するた
めのプラスミドを産生する方法を示す。
めのプラスミドを産生する方法を示す。
【図５】繊維素溶解性質を有するたん白質を生成するた
めのプラスミドを産生する方法を示す。
めのプラスミドを産生する方法を示す。
【図６】繊維素溶解性質を有するたん白質を生成するた
めのプラスミドを産生する方法を示す。
めのプラスミドを産生する方法を示す。
【図７】繊維素溶解性質を有するたん白質を生成するた
めのプラスミドを産生する方法を示す。
めのプラスミドを産生する方法を示す。
【図８】繊維素溶解性質を有するたん白質を生成するた
めのプラスミドを産生する方法を示す。
めのプラスミドを産生する方法を示す。
【図９】繊維素溶解性質を有するたん白質を生成するた
めのプラスミドを産生する方法を示す。
めのプラスミドを産生する方法を示す。
【図１０】繊維素溶解性質を有するたん白質を生成する
ためのプラスミドを産生する方法を示す。
ためのプラスミドを産生する方法を示す。
【図１１】繊維素溶解性質を有するたん白質を生成する
ためのプラスミドを産生する方法を示す。
ためのプラスミドを産生する方法を示す。
【図１２】繊維素溶解性質を有するたん白質を生成する
ためのプラスミドを産生する方法を示す。
ためのプラスミドを産生する方法を示す。
【図１３】本発明によるポリペプチドのアミノ酸配列を
示す。
示す。
【図１４】本発明によるポリペプチドのアミノ酸配列を
示す。
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 エルケ・ヤノカ ドイツ連邦共和国、52441 リンニッヒ、 ヘールストラーセ、65 (72)発明者 レジナ・ハインツエル−ウイーラント ドイツ連邦共和国、64295 ダルムシユタ ット、ライヒエンベルゲル・ウエーク、16
Claims (12)
- 【請求項１】 プラスミノーゲンを活性化するアミノ酸
配列のＣ- 最終末端で式Ｉ 【化１】 （式中Ｘ1 はＰｒｏ又はＬｅｕ、Ｘ2 はＧｌｙ、Ｖａｌ
又はＰｒｏ、Ｘ3 はＬｙｓ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ又
はＧｌｕ、Ｘ4 はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ又は
Ｉｌｅ、Ｘ5 はＧｌｙ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶ
ａｌ、Ｙ1 はＰｈｅ、Ｔｙｒ又はＴｒｐ、Ｙ2 はＬｅ
ｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ又はＭｅｔ、Ｙ3
はＬｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ又はＭｅ
ｔ、Ｙ4 はＡｒｇ、Ｌｙｓ又はＨｉｓ及びＺは式ＩＩ 【化２】 （式中Ｚ1 はＰｈｅ又はＴｙｒを示す。）又は式ＩＩＩ 【化３】 のアミノ酸配列を示す。）のアミノ酸配列と結合する、
繊維素溶解性のトロンビン阻害性質を有するキメラたん
白質。 - 【請求項２】 プラスミノーゲンを活性化するアミノ酸
配列は、プロウロキナーゼの不変化アミノ酸配列；欠
失、置換、挿入及び（又は）付加によって修飾されたプ
ロウキナーゼのアミノ酸配列の少なくとも１種、ウロキ
ナーゼの不変化アミノ酸配列；欠失、置換、挿入及び
（又は）付加によって修飾されたウロキナーゼのアミノ
酸配列少なくとも１種、組織プラスミノーゲン活性化因
子（ｔ- ＰＡ）の不変化アミノ酸配列；欠失、置換、挿
入及び（又は）付加によって修飾されたｔ- ＰＡのアミ
ノ酸配列、コウモリ- プラスミノーゲン活性化因子（ｂ
ａｔ- ＰＡ）の不変化アミノ酸配列；欠失、置換、挿入
及び（又は）付加によって修飾されたｂａｔ- ＰＡのア
ミノ酸配列少なくとも１種及び（又は）ストレプトキナ
ーゼ、スタフィロキナーゼ及び（又は）ＡＰＳＡＣのア
ミノ酸配列を含有する、請求項１記載のたん白質。 - 【請求項３】プラスミノーゲンを活性化するアミノ酸配
列は、プロウロキナーゼの不変化アミノ酸配列；欠失、
置換、挿入及び（又は）付加によって修飾されたプロウ
ロキナーゼのアミノ酸配列少なくとも１種、ｔ- ＰＡの
不変化アミノ酸配列及び（又は）欠失、置換、挿入及び
（又は）付加によって修飾されたｔ-ＰＡのアミノ酸配
列少なくとも１種を含有する、請求項２記載のたん白
質。 - 【請求項４】 プラスミノーゲンを活性化するアミノ酸
配列は、不変化の、アミノ酸４１１個から成るプロウロ
キナーゼの配列───これの中でアミノ酸は 407 Ａｓｎ
又はＧｌｎの位置にある───から、プロウロキナーゼ
のアミノ酸配列47Ｓｅｒ〜 411Ｌｅｕ───これ中でア
ミノ酸は407 Ａｓｎ又はＧｌｎの位置にある───か
ら、プロウロキナーゼのアミノ酸配列 138Ｓｅｒ〜 411
Ｌｅｕ───これ中でアミノ酸は407 Ａｓｎ又はＧｌｎ
の位置にある───から、不変化の、アミノ酸５２７個
から成るｔ- ＰＡのアミノ酸配列Ｓｅｒ−89Ａｒｇ〜
527Ｐｒｏから及び（又は）ｔ- ＰＡのアミノ酸配列
174Ｓｅｒ〜 527Ｐｒｏから成る、請求項３記載のたん
白質。 - 【請求項５】 式Ｉのアミノ酸配列中、Ｘ1 はＰｒｏ、
Ｘ2 はＶａｌ、Ｘ3はＬｙｓ又はＶａｌ、Ｘ4 はＡｌ
ａ、Ｘ5 はＰｈｅを示す、請求項１ないし４のいずれか
に記載のたん白質。 - 【請求項６】 式Ｉのアミノ酸配列中、Ｙ1 はＰｈｅ、
Ｙ2 はＬｅｕ、Ｙ3はＬｅｕ、Ｙ4 はＡｒｇを示す、請
求項１ないし５のいずれかに記載のたん白質。 - 【請求項７】 式Ｉのアミノ酸配列中、Ｚは式ＩＩ又は
式ＩＶのアミノ酸配列を示す、請求項１ないし６のいず
れかに記載のたん白質。 - 【請求項８】 オペロンは制御可能なプロモーター、リ
ボソーム結合部位として有効なシャイン・ダルガーノ配
列、開始コドン、請求項１ないし７による繊維素溶解性
質を有するたん白質に対する合成構造遺伝子及び構造遺
伝子から上流へターミネーター１又は２個を有し、そし
てプラスミドは、大腸菌株中で繊維素溶解性質を有する
たん白質の発現に適する、請求項１ないし７のいずれか
に記載の繊維素溶解性質を有するたん白質を産生するた
めのプラスミド。 - 【請求項９】 ｐＳＥ１及びｐＳＥ９より成る群から選
ばれる、請求項８記載のプラスミド。 - 【請求項１０】 請求項８又は９に記載されたプラスミ
ドを産生するにあたり、これを図１〜１２に記載された
プラスミドｐＢｌｕｅ- ｓｋｒｉｐｔ ＫＳＩＩ+ 、ｐ
ＵＣ８及びｐＧＲ２０１から産生することを特徴とする
上記プラスミドの産生方法。 - 【請求項１１】 プラスミドを用いて大腸菌- 株を公知
方法で形質転換し、構造遺伝子の発現を誘発し、生じた
たんぱく質前駆体を培地及び溶解された細菌細胞から分
離し、溶解し、次いでレドックス系の作用によって繊維
素溶解性質を有するたん白質に折りたたむことを特徴と
する、請求項１ないし７のいずれかに記載された繊維素
溶解性質を有するたん白質の産生に請求項８又は９に記
載されたプラスミドを使用する方法。 - 【請求項１２】 有効物質として請求項１ないし７のい
ずれかに記載のキメラたん白質を含有する血栓溶解剤。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4442665:8 | 1994-11-30 | ||
| DE4442665A DE4442665A1 (de) | 1994-11-30 | 1994-11-30 | Chimäre Proteine mit fibrinolytischen und thrombinhemmenden Eigenschaften |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08231595A true JPH08231595A (ja) | 1996-09-10 |
Family
ID=6534566
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7298570A Withdrawn JPH08231595A (ja) | 1994-11-30 | 1995-11-16 | 繊維素溶解性のトロンビン阻害性質を有するキメラたん白質 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6133011A (ja) |
| EP (1) | EP0714982A3 (ja) |
| JP (1) | JPH08231595A (ja) |
| KR (1) | KR960017685A (ja) |
| CA (1) | CA2163925A1 (ja) |
| DE (1) | DE4442665A1 (ja) |
| FI (1) | FI955755L (ja) |
| IL (1) | IL116164A0 (ja) |
| ZA (1) | ZA9510154B (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004509847A (ja) * | 2000-06-05 | 2004-04-02 | ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク | ヒト骨髄由来内皮前駆細胞の同定、及び虚血性傷害後の心筋細胞の機能を改善するためのヒト骨髄由来内皮前駆細胞の使用 |
| US8242091B2 (en) | 2002-04-23 | 2012-08-14 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Treatment of tumor with dnazyme directed to peroxiredoxin |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4440892A1 (de) * | 1994-11-17 | 1996-05-23 | Gruenenthal Gmbh | Proteine mit fibrinolytischen und gerinnungshemmenden Eigenschaften |
| DE19729591A1 (de) * | 1997-07-10 | 1999-02-11 | Therasorb Medizinische Systeme | Mittel zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Mikrozirkulationsstörungen |
| CN101094867B (zh) | 2004-10-19 | 2011-08-24 | 隆萨股份公司 | 用于固相肽合成的方法 |
| WO2006082974A1 (ja) * | 2005-02-07 | 2006-08-10 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 虚血性疾患治療剤 |
| EP2600891B1 (en) | 2010-08-05 | 2018-01-17 | Council of Scientific & Industrial Research | Protein fusion constructs possessing thrombolytic and anticoagulant properties |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3823805A1 (de) * | 1988-07-14 | 1990-01-18 | Basf Ag | Neue polypeptide, ihre herstellung und verwendung |
| EP0383417B1 (en) * | 1989-02-13 | 1995-12-27 | Schering Aktiengesellschaft | Vampire bat salivary Plasminogen activator vPA-alpha 1 |
| CA1335361C (en) * | 1989-05-24 | 1995-04-25 | Andrei Z. Budzynski | Thrombus-targeted complexes of plasminogen activator and fibrin fragments |
| IE901849A1 (en) * | 1989-07-19 | 1991-06-19 | Gruenenthal Gmbh | Plasmids, their preparation and their use in the manufacture¹of a plasminogen activator |
| GB8927722D0 (en) * | 1989-12-07 | 1990-02-07 | British Bio Technology | Proteins and nucleic acids |
| US5242810A (en) * | 1990-12-07 | 1993-09-07 | Biogen, Inc. | Bifunctional inhibitors of thrombin and platelet activation |
| JPH0578397A (ja) * | 1991-01-29 | 1993-03-30 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | 血栓溶解タンパク質 |
| WO1992018139A1 (en) * | 1991-04-09 | 1992-10-29 | Brigham And Women's Hospital | Chimeric molecule with plasminogen activator activity and affinity for atherosclerotic plaques |
| DE4323754C1 (de) * | 1993-07-15 | 1994-12-01 | Gruenenthal Gmbh | Bifunktionelle Urokinasevarianten mit verbesserten fibrinolytischen Eigenschaften und thrombinhemmender Wirkung |
-
1994
- 1994-11-30 DE DE4442665A patent/DE4442665A1/de not_active Withdrawn
-
1995
- 1995-11-16 EP EP95118050A patent/EP0714982A3/de not_active Withdrawn
- 1995-11-16 JP JP7298570A patent/JPH08231595A/ja not_active Withdrawn
- 1995-11-28 CA CA002163925A patent/CA2163925A1/en not_active Abandoned
- 1995-11-28 IL IL11616495A patent/IL116164A0/xx unknown
- 1995-11-29 KR KR1019950044513A patent/KR960017685A/ko not_active Ceased
- 1995-11-29 ZA ZA9510154A patent/ZA9510154B/xx unknown
- 1995-11-29 FI FI955755A patent/FI955755L/fi unknown
-
1997
- 1997-11-10 US US08/967,024 patent/US6133011A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004509847A (ja) * | 2000-06-05 | 2004-04-02 | ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク | ヒト骨髄由来内皮前駆細胞の同定、及び虚血性傷害後の心筋細胞の機能を改善するためのヒト骨髄由来内皮前駆細胞の使用 |
| US8486416B2 (en) | 2000-06-05 | 2013-07-16 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Use of SDF-1 to improve ischemic myocardial function |
| JP2014001221A (ja) * | 2000-06-05 | 2014-01-09 | Trustees Of Columbia Univ In The City Of New York | ヒト骨髄由来内皮前駆細胞の同定、及び虚血性傷害後の心筋細胞の機能を改善するためのヒト骨髄由来内皮前駆細胞の使用 |
| US8242091B2 (en) | 2002-04-23 | 2012-08-14 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Treatment of tumor with dnazyme directed to peroxiredoxin |
| US8663652B2 (en) | 2002-04-23 | 2014-03-04 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Regeneration of endogenous myocardial tissue |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE4442665A1 (de) | 1996-06-05 |
| US6133011A (en) | 2000-10-17 |
| IL116164A0 (en) | 1996-01-31 |
| ZA9510154B (en) | 1996-05-06 |
| EP0714982A3 (de) | 1999-09-08 |
| FI955755A7 (fi) | 1996-05-31 |
| KR960017685A (ko) | 1996-06-17 |
| FI955755L (fi) | 1996-05-31 |
| EP0714982A2 (de) | 1996-06-05 |
| CA2163925A1 (en) | 1996-05-31 |
| FI955755A0 (fi) | 1995-11-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2529816B2 (ja) | 新規なヒト組織プラスミノゲン活性化因子突然変異体 | |
| US5550213A (en) | Inhibitors of urokinase plasminogen activator | |
| US5219569A (en) | Protease resistant urokinase | |
| SK279029B6 (sk) | Tkanivový aktivátor plazminogénu t-pa, spôsob jeho | |
| RU2143490C1 (ru) | Бифункциональный вариант урокиназы, плазмида, содержащая синтетический структурный ген, кодирующий бифункциональную урокиназу, плазмида (варианты), способ получения плазмиды, способ получения бифункционального варианта урокиназы, тромболитическое средство | |
| US5338546A (en) | Tissue plasminogen activator variants with decreased clearance | |
| US6133011A (en) | Chimeric proteins having fibrinolytic and thrombin-inhibiting properties | |
| JPH08231594A (ja) | 繊維素溶解性の血液凝固阻害性質を有するたん白質 | |
| EP0666920B1 (en) | Thrombin activatable plasminogen derivatives | |
| JPH1080271A (ja) | 血管障害治療のための改良法 | |
| JP2000504941A (ja) | トロンビンによって活性化され得るプラスミノーゲンアクチベーター | |
| US5908625A (en) | Use of the protease domain of human plasminogen activator for the treatment of thromboembolic diseases | |
| HU211335A9 (en) | New polipeptide compounds | |
| HK1010111A (en) | Chimera proteins with fibrinolytic and coagulation inhibiting characteristics | |
| WO1996017928A1 (en) | Use of the protease domain of human plasminogen activator for the treatment of thromboembolic diseases | |
| HK1010109B (en) | Bifunctional derivatives of urokinase with improved fibrinolytic activity and thrombin inhibiting activity | |
| HK1010110A (en) | Proteins with fibrinolytic and coagulation inhibiting characteristics | |
| JPH03130231A (ja) | 医薬製剤 | |
| MXPA99000966A (en) | Plasminogen activator capable of being activated by thrombin | |
| IE861054L (en) | Protease resistant single-chain urokinase | |
| JPH0686673A (ja) | 新規なｔ−ＰＡ改変体 | |
| JPH0775580A (ja) | 新規なｔ−ＰＡ改変体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20030204 |