JPH08239404A

JPH08239404A - ヒアルロン酸産生促進剤

Info

Publication number: JPH08239404A
Application number: JP7059595A
Authority: JP
Inventors: Michiko Kamio; 美智子神尾; Shingo Sakai; 進吾酒井; Tetsuya Sayo; 哲也佐用; Shintaro Inoue; 紳太郎井上; Tadashi Matsui; 正松井
Original assignee: Kanebo Ltd
Current assignee: Kanebo Ltd
Priority date: 1995-03-02
Filing date: 1995-03-02
Publication date: 1996-09-17

Abstract

(57)【要約】【構成】牛血清の分子量５０００以下の低分子量画分を
含有することを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤。【効果】ヒト皮膚線維芽細胞のヒアルロン酸産生能を促
進させることにより、皮膚の老化防止またはヒアルロン
酸の異常分解を伴う疾病の治療に使用でき、且つ人体に
対して安全な効果を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト皮膚線維芽細胞の
ヒアルロン酸産生能を促進させることにより、皮膚の老
化防止またはヒアルロン酸の異常分解を伴う疾病の治療
に使用できる所の、且つ人体に対して安全なヒアルロン
酸産生促進剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒアルロン酸は、細胞間隙への水分の保
持、組織内にジェリー状のマトリックスを形成すること
に基づく細胞の保持、組織の潤滑性と柔軟性の保持、機
械的障害などの外力への抵抗、および、細菌感染の防止
等多くの機能を有している（ＢＩＯＩＮＤＵＳＴＲ
Ｙ、８巻、３４６頁、１９９１年）。

【０００３】ヒアルロン酸の中でも、たとえば皮膚のヒ
アルロン酸は、齢をとるにつれて減少し、その結果、小
ジワやかさつき等の老化をもたらすといわれている。

【０００４】このような老化した皮膚の改善剤として、
コラーゲンやヒアルロン酸を配合した化粧料が数多く提
案されているが、表面の保湿効果が改善されるだけであ
り、本質的に老化肌を改善するものではない。その他、
皮膚細胞賦活剤としてビタミン類や生薬類が使用されて
いるが、やはり、老化肌の治療にまでは至っていないの
が現状である。

【０００５】また、関節液中のヒアルロン酸は、関節軟
骨の表面を覆い、関節機能の円滑な作動に役立ってい
る。正常人関節液中のヒアルロン酸濃度は約２．３ｍｇ
／ｍｌであるが、慢性関節リウマチの場合、関節液中の
ヒアルロン酸濃度は約１．２ｍｇ／ｍｌへと低下し、同
時に関節液の粘度も著しく低下する（Ａｒｔｈｒｉｔｉ
ｓＲｈｅｕｍａｔｉｓｍ、１０巻、３５７頁、１９６
７年）。

【０００６】また、化膿性関節炎や痛風性関節炎等でも
慢性関節リウマチの場合と同様、ヒアルロン酸含量の低
下が起こることが知られている〔結合組織（金原出
版）、４８１項、１９８４年〕。

【０００７】上記疾患において、潤滑機能の改善、関節
軟骨の被覆・保護、疼痛抑制および病的関節液の性状改
善をするために、関節液中のヒアルロン酸量を増加させ
ることが考えられる。たとえば、慢性関節リウマチ患者
にヒアルロン酸ナトリウムの関節注入療法を行うと、上
記の改善が認められている（炎症、１１巻、１６頁、１
９９１年）。

【０００８】同様に、外傷性関節症、骨関節炎や変形性
関節症においても、ヒアルロン酸の関節注入療法により
上記の改善効果が報告されている〔結合組織と疾患（講
談社）、２４６頁、１９８０年〕。

【０００９】しかし、上記疾患の治療は長期にわたり、
しかも医師の処方を必要とする。従って、日常の生活の
中で手軽に治療できるヒアルロン酸産生促進剤を含有さ
せた軟膏あるいはゲルが望まれていた。

【００１０】また、熱傷受傷後の治癒過程で、壊死組織
の下方から増生してくる肉芽組織の初期から組織全体が
肉芽組織に置き換えられるまでの期間では、肉芽中にヒ
アルロン酸が著しく増加することが知られており〔結合
組織と疾患（講談社）、１５３頁、１９８０年〕、熱傷
の初期の治療薬としても、ヒアルロン酸産生促進剤が期
待されている。

【００１１】ヒト細胞のヒアルロン酸を産生促進する薬
剤としては、インシュリン様成長因子−１や上皮成長因
子（ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡ
ｃｔａ、１０１４、３０５頁、１９８９年）およびイン
ターロイキン−１（日本産科婦人科学会雑誌、４１巻、
１９４３頁、１９８９年）等のサイトカイン、あるいは
フォルボールエステル（ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＣ
ｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈ、１４８巻、３７７頁、１９
８３年）等が知られているが、いずれも化粧品、入浴剤
や医薬品として安心して使用できるものではない。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
とするところは、ヒト皮膚線維芽細胞のヒアルロン酸産
生能を促進させることにより、皮膚の老化防止またはヒ
アルロン酸の異常分解を伴う疾病、例えばリウマチ、変
形性関節症、歯肉炎等の治療に使用できる所の、且つ人
体に対し安全なヒアルロン酸産生促進剤を提供するにあ
る。

【００１３】

【課題を解決するための手段】上述の目的は、ウシ血清
の分子量５０００以下の低分子量画分を含有することを
特徴とするヒアルロン酸産生促進剤によって達成され
る。

【００１４】本発明に用いられるウシ血清としては、ウ
シ胎仔血清、ウシ新生仔血清等が挙げられる。

【００１５】本発明に用いられるウシ血清の分子量５０
００以下の低分子画分を分画する手段としては、例え
ば、分子篩用の限外濾過膜等を用いることができる。該
限外濾過膜の材質としては、セルロース、酢酸セルロー
ス、ポリアクリロニトリル、ポリエーテルスルホン等が
挙げられる。

【００１６】本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、それ
自身で、培養細胞または生体細胞に適用して、ヒアルロ
ン酸産生を促進することができるが、ウシ血清の分子量
５０００以下の低分子量画分の種類に応じて通常の化粧
料、医薬に使用される公知の成分を任意に組み合わせて
配合することができ、また通常の化粧料、医薬の組成物
形態に配合するのも良い。

【００１７】本発明のヒアルロン酸産生促進剤および組
成物の形態としては、液剤、固形剤あるいは半固形剤の
いずれでも良く、例えば、軟膏、ゲル、クリーム、スプ
レー剤、貼付剤、ローション、パック類、乳液、パウダ
ーおよび入浴剤等が挙げられる。

【００１８】これらの組成物を製造するに際し、使用さ
れる賦形剤または補助剤としては、通常、同目的に使用
されるものから剤形に応じて適宜選択すれば良く、特に
限定されるものではないが、例えば、ワセリン、スクワ
ラン等の炭化水素、ステアリルアルコール等の高級アル
コール、ミリスチン酸イソプロピル等の高級脂肪酸低級
アルキルエステル、ラノリン酸等の動物性油脂、グリセ
リン、プロピレングリコール等の多価アルコール、グリ
セリン脂肪酸エステル、モノステアリン酸ポリエチレン
グリコール、ポリエチレンアルキルエーテルリン酸等の
界面活性剤、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安
息香酸ブチル等の防腐剤、蝋、樹脂、各種香料、各種色
素、クエン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、乳酸等の各
種無機塩や各種酸、水、およびエタノール等が挙げられ
る。

【００１９】ウシ血清の分子量５０００以下の低分子量
画分の適用組成物中における含有量は、適用対象物によ
り異なり、一概には規定できないが、０．００５〜３．
０％（Ｗ／Ｗ）が好ましく、さらに好ましくは０．０１
〜２．０％（Ｗ／Ｗ）である。ただし、入浴剤のように
使用時に希釈されるものの場合は、適宜含有量を増やす
ことができる。

【００２０】また、ウシ血清の分子量５０００以下の低
分子量画分によって培養細胞にヒアルロン酸を産生させ
る時は、細胞の培養液中に０．０１％（Ｗ／Ｖ）以上含
有させるのが好ましく、特に好ましくは０．１〜２．０
％（Ｗ／Ｖ）である。

【００２１】

【発明の効果】本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、ヒ
ト皮膚線維芽細胞のヒアルロン酸産生能を促進させる
（後記試験例）ことから、皮膚の老化防止またはヒアル
ロン酸の異常分解を伴う疾病の治療に使用でき、且つ人
体に対して安全である。

【００２２】

【実施例】以下に実施例、比較例によって本発明を詳説
する。

【００２３】実施例１（ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の分子
量５０００以下の低分子量画分の調製法）ＦＢＳ１０ｍｌをセルロース限外ろ過膜（ミリポア製、
分画分子量５０００）に供し、加圧によりろ液９．２ｍ
ｌを得、凍結乾燥して、１４８．４ｍｇの低分子画分を
得た。

【００２４】実施例２（ウシ新生仔血清（ＮＢＳ）の分
子量５０００以下の低分子量画分の調製法）ＮＢＳ１０ｍｌをセルロース限外ろ過膜（ミリポア製、
分画分子量５０００）に供し、加圧によりろ液９．５ｍ
ｌを得、凍結乾燥して、１５５．８ｍｇの低分子画分を
得た。

【００２５】次に、本発明の効果を示す試験例を記載す
る。なお、各試験に用いる試薬の調製法および測定法は
次の通りである。

【００２６】（１）ＭＥＭ培地の調製法ＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ
(大日本製薬製、１０−１０１) １０．６ｇにそれぞれ
終濃度として１％（Ｖ／Ｖ）ＮｏｎＥｓｓｅｎｔｉａ
ｌＡｍｉｎｏＡｃｉｄ（大日本製薬製、１６−８１
０) 、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（大日本製薬製、１
６−８２０）、１．２％（Ｗ／Ｖ）炭酸水素ナトリウム
を添加し、蒸留水を加えて１ｌとした後、炭酸ガスを吹
き込んでｐＨを約７にした（以下ＭＥＭ培地と略記す
る）。

【００２７】（２）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の非働化ＦＢＳ（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製) を５
６℃で３０分間加熱処理した。

【００２８】（３）ＰＢＳの調製法塩化ナトリウム８ｇ、塩化カリウム０．２ｇ、リン酸水
素二ナトリウム・１２水塩２．９ｇ、リン酸二水素カリ
ウム０．２ｇを精製水１ｌに溶解し、Ｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ（以下ＰＢＳと略
す）とした。

【００２９】（４）トリプシン溶液０．１％トリプシン（シグマ製）含有ＰＢＳ

【００３０】（５）緩衝液Ｈ０．１Ｍ酢酸ナトリウムおよび０．０２％（Ｗ／Ｖ）ア
ジ化ナトリウム含有０．５Ｍ２−（Ｎ−モルフォリ
ン）エタンスルフォン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）。

【００３１】（６）緩衝液Ｃ０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％（Ｗ／Ｖ）アジ
化ナトリウムおよび０．０５％ブリッジ−３５含有５０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）。

【００３２】（７）プロナーゼ溶液２００μｇ／ｍｌプロナーゼ（カルビオケム−ベーリン
グ・コーポレイション製、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｇｒｉｓｅｕｓ由来）、０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよ
び０．０２％アジ化ナトリウム含有０．５Ｍトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ８．０）。

【００３３】（８）ヒアルロニダーゼ溶液６ＴＲＵ／ｍｌヒアルロニダーゼ（ＥＣ４．２．２．
１、生化学工業製、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙａ
ｌｕｒｏｌｙｔｉｃｕｓ由来）を含む緩衝液Ｈ。

【００３４】試験例１（ウシ血清の分子量５０００以下
の低分子量画分のヒアルロン酸産生促進作用）（１）細胞培養正常ヒト線維芽細胞株〔デトロイト５５１株（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ１１０）〕の細胞数を１０％（Ｖ／Ｖ）の非
働化ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて１ｘ１０⁵個／ｍｌに
調製し、１２穴プレート（ファルコン製）に１ｍｌずつ
播種し、９５％（Ｖ／Ｖ）空気−５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガ
スの雰囲気下、３７℃で３日間静置培養した。

【００３５】培養上清を吸引除去し、ＭＥＭ培地で１
回、１ｍｌ／ウェルで洗浄し、ＭＥＭ培地を１ｍｌ／ウ
ェルずつ添加し、９５％（Ｖ／Ｖ）空気−５％（Ｖ／
Ｖ）炭酸ガスの雰囲気下、３７℃で１日間静置培養し
た。

【００３６】培養上清を吸引除去し、ＰＢＳで２回およ
びＭＥＭ培地で１回それぞれ１ｍｌ／ウェルで洗浄し
た。

【００３７】つぎに、終濃度０．５％、１．０％、２．
０％（Ｗ／Ｖ）となるようにウシ血清の分子量５０００
以下の低分子量画分（実施例１，２）を添加した１０μ
Ｃｉ／ｍｌグルコサミン塩酸塩Ｄ−〔１，６─３Ｈ
（Ｎ）〕（デュ・ポン製、ＮＥＴ−５５７Ａ、以下
［³H］グルコサミンという）を含むＭＥＭ培地を１ｍｌ
ずつ各ウェルに添加し、ヒアルロン酸の測定用とした
（ｎ＝４）。尚、比較例１としてウシ血清の分子量５０
００以下の低分子量画分の代わりにＭＥＭ培地を添加
し、対照とした。

【００３８】上記のプレートを９５％（Ｖ／Ｖ）空気−
５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガスの雰囲気下、３７℃で３日間静
置培養した。

【００３９】（２）ヒアルロン酸産生量の測定（[³H]グ
ルコサミン取り込み活性法）ヒアルロン酸産生量の測定用ウェルから培養上清を回収
し、１００℃で１０分間加熱した後、その中の０．７２
ｍｌにプロナーゼ溶液０．０８ｍｌを加え、ヒアルロン
酸に結合した蛋白質を分解させた。

【００４０】３７℃で１８時間静置した後、１００℃で
１０分間加熱処理し、プロナーゼを失活させた。

【００４１】次に、上記反応液０．８ｍｌのうち０．３
ｍｌずつを２つのチューブにいれ、一方には緩衝液Ｈ
０．３ｍｌを、他方にはヒアルロニダーゼ溶液０．３ｍ
ｌを加え３７℃で１８時間静置した後、１００℃で１０
分間加熱処理し、ヒアルロニダーゼを失活させた。

【００４２】ヒアルロニダーゼ無添加およびヒアルロニ
ダーゼ添加の上記各反応混液０．６ｍｌのうち、それぞ
れ０．５ｍｌを、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２
％アジ化ナトリウムおよび０．０５％ブリッジ−３５含
有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化し
たＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラム（ファルマシア製）
に供し、２．５〜３．５ｍｌの高分子量画分を分取し
た。

【００４３】各高分子量画分１ｍｌに１０ｍｌのシンチ
ゾールＥＸ−Ｈ（同仁化学研究所製）を添加し、液体シ
ンチレーション・カウンター（アロカ製）により高分子
量画分に取り込まれた［³H］放射活性を測定した。

【００４４】ヒアルロニダーゼ無添加で高分子量画分に
取り込まれた［³H］放射活性値（ＤＰＭ／ウェル）か
ら、ヒアルロニダーゼによってヒアルロン酸を特異的に
分解したときの高分子量画分に取り込まれた［³H］放射
活性値（ベース）を引いた値をヒアルロン酸産生量（Ｄ
ＰＭ／ウェル）とした。

【００４５】ウシ血清の分子量５０００以下の低分子量
画分（実施例１，２）を終濃度０．５％、１．０％、
２．０％（Ｗ／Ｖ）で添加したときの培養上清中のヒア
ルロン酸産生量を測定した（表１）。その結果、比較例
１に対し、実施例１および２のいずれの濃度においても
デトロイト５５１株のヒアルロン酸産生量が上昇するこ
とがわかった。

【００４６】

【表１】

【００４７】以下に本発明の処方例を挙げる。なお、表
中の値は重量％を示す。また、ヒアルロン酸産生促進剤
をＨＡ産生促進剤と標記する。

【００４８】処方例１〜３（クリーム）下記に示す組成でクリームを調製した。

【００４９】

【表２】

【００５０】調製法：成分（Ａ）を８０℃で均一に混
合溶解した後それに成分（Ｂ）を混合溶解した（混合
液Ｉ）。これとは別に、成分（Ｄ）を８０℃で均一に混
合溶解した後、それに成分（Ｃ）を混合溶解した（混合
液II）。つぎに、混合液Ｉに、徐々に混合液IIを加え
て、充分攪拌しながら３０℃まで冷却し、クリームを得
た。

【００５１】処方例４〜６（ローション）下記に示す組成でローションを調製した。

【００５２】

【表３】

【００５３】調製法：各成分を混合溶解して、ローシ
ョンを調製した。

【００５４】処方例７〜８（入浴剤）下記に示す組成で入浴剤を調製した。

【００５５】

【表４】

【００５６】調製法：各成分を混合し、入浴剤を調製し
た。なお、この入浴剤は使用時に約約３０００倍に希釈
される。

【００５７】処方例９〜１１（軟膏）下記に示す組成で軟膏を調製した。

【００５８】

【表５】

【００５９】調製法：上記（Ｂ）の各成分を湯浴で８
０℃に加温しながら混合し、これを、８０℃に加温した
上記（Ａ）の各成分の混合物中に攪拌しながら徐々に加
えた。つぎに、ホモジナイザー（Ｔｏｋｕｓｙｕｋｉｋ
ａＫｏｇｙｏｕ製）で２．５分間激しく攪拌（２５０
０ｒｐｍ）して各成分を充分乳化分散させた後、攪拌し
ながら徐々に冷却して軟膏を得た。

【００６０】処方例１２〜１４（ゲル）下記に示す組成でゲルを調製した。

【００６１】

【表６】

【００６２】調製法：（Ａ）を一部の水（Ｄ）で膨潤
させ、残りの水（Ｄ）で成分（Ｃ）を溶解させた後、両
者を均一に混合した（混合液Ｉ）。成分（Ｂ）を均一に
混合解させた（混合液II）。混合液Ｉに混合液IIを加え
て分散し、ゲルを得た。

【００６３】処方例１５〜１７（ヘアトニック）下記に示す組成でヘアトニックを調製した。

【００６４】

【表７】

【００６５】調製法：香料可溶化剤で香料を溶解した
後、常温で攪拌しながらエタノールに加えて溶解し、成
分（Ｂ）を順次加えて溶解した（混合液Ｉ）。成分
（Ｃ）を溶解させ、攪拌しながら混合液Ｉに加えて均一
にした後、ろ過してヘアトニックを得た。

フロントページの続き (72)発明者井上紳太郎神奈川県小田原市寿町５丁目３番28号鐘紡株式会社生化学研究所内 (72)発明者松井正神奈川県小田原市寿町５丁目３番28号鐘紡株式会社化粧品研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ウシ血清の分子量５０００以下の低分子
量画分を含有することを特徴とするヒアルロン酸産生促
進剤。