JPH08242897A - 遺伝子の複製及び増幅方法 - Google Patents
遺伝子の複製及び増幅方法Info
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- JPH08242897A JPH08242897A JP7074616A JP7461695A JPH08242897A JP H08242897 A JPH08242897 A JP H08242897A JP 7074616 A JP7074616 A JP 7074616A JP 7461695 A JP7461695 A JP 7461695A JP H08242897 A JPH08242897 A JP H08242897A
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-
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 塩基配列が不明である遺伝子の複製及び増幅
方法を提供する。 【構成】 塩基配列が不明である遺伝子の二本鎖ＤＮＡ
又はＲＮＡに相補的なＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離さ
せ、次いで一本鎖ＤＮＡの不特定位置にプライマーを部
分的に結合させ、次いで結合した該プライマーをＤＮＡ
合成の開始点として、ＤＮＡポリメラーゼにより、一本
鎖ＤＮＡに対して相補性を有するＤＮＡ部分を合成し、
前記操作を２回以上繰り返すことにより遺伝子の不特定
部分を複製することからなる遺伝子の複製方法、及び次
いでＰＣＲ法を用いることからなる該遺伝子の増幅方
法。 【効果】 塩基配列が不明である遺伝子を複製・増幅す
ることができ、未知の病原微生物の解明並びにその感染
症の診断やワクチン開発に利用できる。
方法を提供する。 【構成】 塩基配列が不明である遺伝子の二本鎖ＤＮＡ
又はＲＮＡに相補的なＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離さ
せ、次いで一本鎖ＤＮＡの不特定位置にプライマーを部
分的に結合させ、次いで結合した該プライマーをＤＮＡ
合成の開始点として、ＤＮＡポリメラーゼにより、一本
鎖ＤＮＡに対して相補性を有するＤＮＡ部分を合成し、
前記操作を２回以上繰り返すことにより遺伝子の不特定
部分を複製することからなる遺伝子の複製方法、及び次
いでＰＣＲ法を用いることからなる該遺伝子の増幅方
法。 【効果】 塩基配列が不明である遺伝子を複製・増幅す
ることができ、未知の病原微生物の解明並びにその感染
症の診断やワクチン開発に利用できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は遺伝子の不特定部分を複
製することによる塩基配列が不明である遺伝子の複製方
法及び複製された遺伝子の不特定部分を増幅することに
よる塩基配列が不明である遺伝子の増幅方法、更には、
増幅した遺伝子の各部分の塩基配列を決定することによ
る塩基配列が不明である遺伝子の塩基配列の決定方法及
び塩基配列が不明である遺伝子を有する未知の生物の検
出方法、並びに前記複製方法により得られる塩基配列が
不明である遺伝子の不特定部分の複製物、前記増幅方法
により得られる塩基配列が不明である遺伝子の不特定部
分の増幅物に関するものである。
製することによる塩基配列が不明である遺伝子の複製方
法及び複製された遺伝子の不特定部分を増幅することに
よる塩基配列が不明である遺伝子の増幅方法、更には、
増幅した遺伝子の各部分の塩基配列を決定することによ
る塩基配列が不明である遺伝子の塩基配列の決定方法及
び塩基配列が不明である遺伝子を有する未知の生物の検
出方法、並びに前記複製方法により得られる塩基配列が
不明である遺伝子の不特定部分の複製物、前記増幅方法
により得られる塩基配列が不明である遺伝子の不特定部
分の増幅物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】サイキ（Saiki ）らにより１９８５年に
耐熱性ＤＮＡ合成酵素を使用するポリメラーゼ・チェイ
ン・リアクション（ＰＣＲ）法が報告されて以来、生物
由来の試料、例えば血液、血漿、リンパ液、唾液、髄液
などの体液、組織からの抽出液等の中に存在する微生物
由来の微量なＤＮＡ又はＲＮＡを試験管内で容易に増幅
することができるようになった。
耐熱性ＤＮＡ合成酵素を使用するポリメラーゼ・チェイ
ン・リアクション（ＰＣＲ）法が報告されて以来、生物
由来の試料、例えば血液、血漿、リンパ液、唾液、髄液
などの体液、組織からの抽出液等の中に存在する微生物
由来の微量なＤＮＡ又はＲＮＡを試験管内で容易に増幅
することができるようになった。
【０００３】ＰＣＲ法及びその関連分野に関して、我が
国にも多くの特許出願がなされている。代表的な基本技
術に関するものとしては、例えば特開昭６３−１０２６
７７号公報、特開平２−４３４号公報、特開平３−１８
０１７８号公報、特開平３−１８０１８１号公報、特開
平３−１８０１８１号公報及び特開昭６２−２４０８６
２号公報が挙げられる。前記各公報に記載された発明の
うち、特開昭６３−１０２６７７号公報から特開平３−
１８０１８１号公報までの四つの公報に記載された発明
は、特開昭６３−１０２６７７号公報に記載された発明
を基礎とする一連の発明であり、ＰＣＲ法で使用する熱
安定性酵素及びその使用方法に関するものである。又、
特開昭６２−２４０８６２号公報に記載された発明は、
ＰＣＲ法で使用する装置及び該装置の使用方法の発明で
ある。以下に、特開昭６３−１０２６７７号公報及び特
開昭６２−２４０８６２号公報に記載された発明につい
て簡単に説明する。
国にも多くの特許出願がなされている。代表的な基本技
術に関するものとしては、例えば特開昭６３−１０２６
７７号公報、特開平２−４３４号公報、特開平３−１８
０１７８号公報、特開平３−１８０１８１号公報、特開
平３−１８０１８１号公報及び特開昭６２−２４０８６
２号公報が挙げられる。前記各公報に記載された発明の
うち、特開昭６３−１０２６７７号公報から特開平３−
１８０１８１号公報までの四つの公報に記載された発明
は、特開昭６３−１０２６７７号公報に記載された発明
を基礎とする一連の発明であり、ＰＣＲ法で使用する熱
安定性酵素及びその使用方法に関するものである。又、
特開昭６２−２４０８６２号公報に記載された発明は、
ＰＣＲ法で使用する装置及び該装置の使用方法の発明で
ある。以下に、特開昭６３−１０２６７７号公報及び特
開昭６２−２４０８６２号公報に記載された発明につい
て簡単に説明する。
【０００４】特開昭６３−１０２６７７号公報には以下
の各発明が記載されている：核酸の鋳型鎖に相補的な核
酸鎖を形成するためヌクレオチドトリホスフェートの結
合を触媒する精製された熱的に安定な酵素（特許請求の
範囲第１項）；ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子
（特許請求の範囲第２項）；ｐＦＣ８５又はｐＦＣ８３
から選択されるプラスミド（特許請求の範囲第１３
項）；バクテリオファージＣＨ３５；Ｔａｑ＃４−２
（特許請求の範囲第１４項）；特定緩衝液中に特定酵素
を含む安定な酵素組成物（特許請求の範囲第１５項）；
特定の工程からなる、核酸又は核酸の混合物に含まれる
少なくとも１種の特定の核酸配列を増幅する方法（特許
請求の範囲第１９項，第２０項）；特定の工程からな
る、核酸又は核酸の混合物を含む試料中の少なくとも１
種の特定の核酸配列の存在又は不存在を検出し、又は上
記試料中の２種の異なる配列を識別する方法（特許請求
の範囲第２１項，第２２項）；特定の工程からなる、試
料中に含まれる１種又は複数種の核酸中の、少なくとも
１つのヌクレオチド配列の変化の存在又は不存在を検出
する方法（特許請求の範囲第２３項，第２４項，第２５
項，第２６項，第２７項）；特定の工程からなる、核酸
又は核酸の混合物に含まれる１種又は複数種の特定の核
酸配列をクローニングベクターにクローン化する方法
（特許請求の範囲第２８項，第２９項，第３０項，第３
１項）；特定の増幅工程によって産生される特定配列の
複数のコピーを有する核酸又は核酸の混合物からの増幅
された核酸配列（特許請求の範囲第３２項）。
の各発明が記載されている：核酸の鋳型鎖に相補的な核
酸鎖を形成するためヌクレオチドトリホスフェートの結
合を触媒する精製された熱的に安定な酵素（特許請求の
範囲第１項）；ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子
（特許請求の範囲第２項）；ｐＦＣ８５又はｐＦＣ８３
から選択されるプラスミド（特許請求の範囲第１３
項）；バクテリオファージＣＨ３５；Ｔａｑ＃４−２
（特許請求の範囲第１４項）；特定緩衝液中に特定酵素
を含む安定な酵素組成物（特許請求の範囲第１５項）；
特定の工程からなる、核酸又は核酸の混合物に含まれる
少なくとも１種の特定の核酸配列を増幅する方法（特許
請求の範囲第１９項，第２０項）；特定の工程からな
る、核酸又は核酸の混合物を含む試料中の少なくとも１
種の特定の核酸配列の存在又は不存在を検出し、又は上
記試料中の２種の異なる配列を識別する方法（特許請求
の範囲第２１項，第２２項）；特定の工程からなる、試
料中に含まれる１種又は複数種の核酸中の、少なくとも
１つのヌクレオチド配列の変化の存在又は不存在を検出
する方法（特許請求の範囲第２３項，第２４項，第２５
項，第２６項，第２７項）；特定の工程からなる、核酸
又は核酸の混合物に含まれる１種又は複数種の特定の核
酸配列をクローニングベクターにクローン化する方法
（特許請求の範囲第２８項，第２９項，第３０項，第３
１項）；特定の増幅工程によって産生される特定配列の
複数のコピーを有する核酸又は核酸の混合物からの増幅
された核酸配列（特許請求の範囲第３２項）。
【０００５】特開昭６２−２４０８６２号公報には以下
の各発明が記載されている：特定の手段からなる、ＰＣ
Ｒ法において反応混合物の温度循環を行うための装置
（特許請求の範囲第１項）；特定の手段からなる、少な
くとも一つの特定の核酸配列の自動化された増幅を行う
ための装置（特許請求の範囲第４項，第７項）；特定の
工程からなる、少なくとも一つの特定の核酸配列を増幅
するための方法（特許請求の範囲第８項，第１３項）。
の各発明が記載されている：特定の手段からなる、ＰＣ
Ｒ法において反応混合物の温度循環を行うための装置
（特許請求の範囲第１項）；特定の手段からなる、少な
くとも一つの特定の核酸配列の自動化された増幅を行う
ための装置（特許請求の範囲第４項，第７項）；特定の
工程からなる、少なくとも一つの特定の核酸配列を増幅
するための方法（特許請求の範囲第８項，第１３項）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】ところで、特開昭６３
−１０２６７７号公報に記載された発明（ＰＣＲ法）に
おいては、核酸鎖とプライマーとを接触させるにあた
り、例えば特許請求の範囲第１９項の工程（ａ）〔第２
頁右上欄下から第５行乃至下から第３行〕に「上記接触
を、それぞれのプライマーのその相補的核酸配列へのハ
イブリダイゼーションを促進する温度で行ない；」と記
載されている如く、核酸鎖の塩基配列が既知の特定部分
にプライマーをハイブリダイゼーションするために一定
以上の温度にて前記ハイブリダイゼーションを行ってい
る。
−１０２６７７号公報に記載された発明（ＰＣＲ法）に
おいては、核酸鎖とプライマーとを接触させるにあた
り、例えば特許請求の範囲第１９項の工程（ａ）〔第２
頁右上欄下から第５行乃至下から第３行〕に「上記接触
を、それぞれのプライマーのその相補的核酸配列へのハ
イブリダイゼーションを促進する温度で行ない；」と記
載されている如く、核酸鎖の塩基配列が既知の特定部分
にプライマーをハイブリダイゼーションするために一定
以上の温度にて前記ハイブリダイゼーションを行ってい
る。
【０００７】即ち、前記温度（アニーリング温度）に関
しては、前記公報第１４頁右下欄第３行に「約４５〜５
８℃で行い」と、同第２９頁左上欄第５行乃至第６行に
は「約３５℃〜６５℃又はそれ以上であり、好ましくは
約３７〜６０℃であり」と、同第２９頁左下欄下から第
５行乃至下から第３行には「Ｔａｑポリメラーゼについ
ては・・・３７℃程度へ、好ましくは約４５〜５８℃へ
低下させる」と記載されている。又、前記公報の各実施
例におけるアニーリング温度は実施例１では３７℃〔第
４４頁左上欄第６行；遺伝子ヒトβ−グロブリン，アニ
ーリング時間３分間〕、実施例２では３７℃〔第４５頁
左上欄第５行乃至第８行；第一サンプル，遺伝子ヒトβ
−グロブリン（Molt4)，アニーリング時間（３分間＋２
分間）〕、３７℃（第４５頁左下欄第５行乃至第７行；
第二サンプル，遺伝子ヒトβ−グロブリン（Molt4)，ア
ニーリング時間（１分間＋１分間）〕、実施例３では３
７℃〔第４７頁左上欄第９行乃至第１１行；遺伝子ヒト
β−グロブリン（Molt4,GM2064) ，アニーリング時間
（３０分間＋２分間）〕、実施例７では３７℃〔第５３
頁左上欄下から第３行；遺伝子バクテリオファージλＤ
ＮＡ，アニーリング時間２分間〕、実施例１０では３５
℃，４５℃，５５℃〔第５４頁左上欄下から第１行乃至
右上欄第２行；遺伝子ヒトβ−グロブリン（Molt4,GM20
64) ，遺伝子ＨＩＶ−陽性ＤＮＡ(368H)，アニーリング
時間（１分間＋１分間）〕及び実施例１１では３７℃
〔第５５頁右上欄下から第５行乃至下から第４行；第一
サンプル，遺伝子ラビット網状赤血球ｍＲＮＡのｃＤＮ
Ａ，アニーリング時間３分間〕、３７℃（第５５頁右下
欄下から第１行乃至第５６頁左上欄第２行；追加サンプ
ル，遺伝子ラビット網状赤血球ｍＲＮＡのｃＤＮＡ，ア
ニーリング時間（１分間＋３０秒間）〕である。
しては、前記公報第１４頁右下欄第３行に「約４５〜５
８℃で行い」と、同第２９頁左上欄第５行乃至第６行に
は「約３５℃〜６５℃又はそれ以上であり、好ましくは
約３７〜６０℃であり」と、同第２９頁左下欄下から第
５行乃至下から第３行には「Ｔａｑポリメラーゼについ
ては・・・３７℃程度へ、好ましくは約４５〜５８℃へ
低下させる」と記載されている。又、前記公報の各実施
例におけるアニーリング温度は実施例１では３７℃〔第
４４頁左上欄第６行；遺伝子ヒトβ−グロブリン，アニ
ーリング時間３分間〕、実施例２では３７℃〔第４５頁
左上欄第５行乃至第８行；第一サンプル，遺伝子ヒトβ
−グロブリン（Molt4)，アニーリング時間（３分間＋２
分間）〕、３７℃（第４５頁左下欄第５行乃至第７行；
第二サンプル，遺伝子ヒトβ−グロブリン（Molt4)，ア
ニーリング時間（１分間＋１分間）〕、実施例３では３
７℃〔第４７頁左上欄第９行乃至第１１行；遺伝子ヒト
β−グロブリン（Molt4,GM2064) ，アニーリング時間
（３０分間＋２分間）〕、実施例７では３７℃〔第５３
頁左上欄下から第３行；遺伝子バクテリオファージλＤ
ＮＡ，アニーリング時間２分間〕、実施例１０では３５
℃，４５℃，５５℃〔第５４頁左上欄下から第１行乃至
右上欄第２行；遺伝子ヒトβ−グロブリン（Molt4,GM20
64) ，遺伝子ＨＩＶ−陽性ＤＮＡ(368H)，アニーリング
時間（１分間＋１分間）〕及び実施例１１では３７℃
〔第５５頁右上欄下から第５行乃至下から第４行；第一
サンプル，遺伝子ラビット網状赤血球ｍＲＮＡのｃＤＮ
Ａ，アニーリング時間３分間〕、３７℃（第５５頁右下
欄下から第１行乃至第５６頁左上欄第２行；追加サンプ
ル，遺伝子ラビット網状赤血球ｍＲＮＡのｃＤＮＡ，ア
ニーリング時間（１分間＋３０秒間）〕である。
【０００８】特に前記実施例１０ではアニーリング温度
を３段階（３５℃，４５℃，５５℃）に変化させてアニ
ーリング温度の影響を調べている。そして、第５４頁左
下欄第７行乃至第１３行に「アニーリング温度が５５℃
では３５℃の場合に比べてＴａｑポリメラーゼの選択性
に１００倍の改良が見られ、Ｔａｑポリメラーゼの選択
性のためには、上昇したアニーリング温度が重要である
ことが示された。」旨の記載がある。これは５５℃でプ
ライマーのその相補的核酸配列へのハイブリダイゼーシ
ョン（アニーリング）において高い特異性（選択性）が
得られたことを示している。
を３段階（３５℃，４５℃，５５℃）に変化させてアニ
ーリング温度の影響を調べている。そして、第５４頁左
下欄第７行乃至第１３行に「アニーリング温度が５５℃
では３５℃の場合に比べてＴａｑポリメラーゼの選択性
に１００倍の改良が見られ、Ｔａｑポリメラーゼの選択
性のためには、上昇したアニーリング温度が重要である
ことが示された。」旨の記載がある。これは５５℃でプ
ライマーのその相補的核酸配列へのハイブリダイゼーシ
ョン（アニーリング）において高い特異性（選択性）が
得られたことを示している。
【０００９】ＰＣＲ法においてアニーリングの温度は極
めて重要な条件である。ＰＣＲ法に関する総説〔実験医
学，Vol.8 ，No.9増刊（1990）〕の第３６頁にも次のよ
うな記載がある。「例えばヒトのビトロネクチン遺伝子
の変異を検出するために、２０塩基のプライマーの配列
から５５℃で２分の条件を設定したが、いくつかの非特
異的バンドが見られたので、６５℃で１分の条件にした
ところ非特異的バンドは完全に消滅した。即ち、目的遺
伝子以外の部分が増幅されて混入することを避け、目的
とする遺伝子部分のみを増幅させるのがＰＣＲ法の特徴
であり、そのためにはプライマーを特定の部位に特異的
に結合させなければならず、ある程度高温の条件下での
アニーリングが必須となる。高温であるほどプライマー
はより完全な相補性を有する部分にしか結合しなくなり
上記目的を達成できるが、低温下では相補性の低い部分
にも非特異的に結合してしまい、目的外の遺伝子部分の
混入が増加する。通常、５５℃付近のアニーリング温度
を指示している文献が多い。
めて重要な条件である。ＰＣＲ法に関する総説〔実験医
学，Vol.8 ，No.9増刊（1990）〕の第３６頁にも次のよ
うな記載がある。「例えばヒトのビトロネクチン遺伝子
の変異を検出するために、２０塩基のプライマーの配列
から５５℃で２分の条件を設定したが、いくつかの非特
異的バンドが見られたので、６５℃で１分の条件にした
ところ非特異的バンドは完全に消滅した。即ち、目的遺
伝子以外の部分が増幅されて混入することを避け、目的
とする遺伝子部分のみを増幅させるのがＰＣＲ法の特徴
であり、そのためにはプライマーを特定の部位に特異的
に結合させなければならず、ある程度高温の条件下での
アニーリングが必須となる。高温であるほどプライマー
はより完全な相補性を有する部分にしか結合しなくなり
上記目的を達成できるが、低温下では相補性の低い部分
にも非特異的に結合してしまい、目的外の遺伝子部分の
混入が増加する。通常、５５℃付近のアニーリング温度
を指示している文献が多い。
【００１０】それ故、ＰＣＲ法においては高い特異性
（選択性）を確保するためにはアニーリング温度をある
程度以上の温度とすることが必要であり、前述の基本特
許に関する公報類の記載内容から、その温度は３５℃以
上であることが判る。
（選択性）を確保するためにはアニーリング温度をある
程度以上の温度とすることが必要であり、前述の基本特
許に関する公報類の記載内容から、その温度は３５℃以
上であることが判る。
【００１１】ＰＣＲ法はＤＮＡの特定部分を効率良く増
幅することが可能であるが、特定部位にプライマーを特
異的にハイブリダイズさせるためには、増幅しようとす
るＤＮＡの構造が予め決定されていなければならない。
遺伝子の塩基配列決定のためには通常、遺伝子のクロー
ニングを行うが、これにはある程度の量の遺伝子が必要
であり、そのためにはその遺伝子が由来する微生物（例
えばウイルス）を試料から分離・培養する必要がある。
それ故、試料中の微生物が微量すぎて分離できない場合
又は培養することが不可能な場合、遺伝子の塩基配列を
決定することは極めて困難である。具体的には例えば、
胎児、新生児、乳幼児、特殊な疾患の患者等に由来する
試料は、特殊な場合を除いて充分な量を入手することが
難しい。
幅することが可能であるが、特定部位にプライマーを特
異的にハイブリダイズさせるためには、増幅しようとす
るＤＮＡの構造が予め決定されていなければならない。
遺伝子の塩基配列決定のためには通常、遺伝子のクロー
ニングを行うが、これにはある程度の量の遺伝子が必要
であり、そのためにはその遺伝子が由来する微生物（例
えばウイルス）を試料から分離・培養する必要がある。
それ故、試料中の微生物が微量すぎて分離できない場合
又は培養することが不可能な場合、遺伝子の塩基配列を
決定することは極めて困難である。具体的には例えば、
胎児、新生児、乳幼児、特殊な疾患の患者等に由来する
試料は、特殊な場合を除いて充分な量を入手することが
難しい。
【００１２】本発明は前記従来技術では実施困難であっ
た課題を解決するものであり、従来の既知塩基配列の増
幅方法であるＰＣＲ法と異なり、微量のため塩基配列が
決定できなかった遺伝子に対して適用可能な塩基配列の
複製及び増幅方法、及びその種々の用途を提供すること
を目的とする。具体的には、本発明は以下に例示する事
柄を目的とする： イ） 塩基配列が不明である遺伝子の複製方法、 ロ） 塩基配列が不明である遺伝子の増幅方法、 ハ） 塩基配列が不明である遺伝子の塩基配列の決定方
法、 ニ） 塩基配列が不明である遺伝子を有する未知の生物
の検出方法、 ホ） 塩基配列が不明である遺伝子の不特定部分の複製
物、及び ヘ） 塩基配列が不明である遺伝子の不特定部分の増幅
物。
た課題を解決するものであり、従来の既知塩基配列の増
幅方法であるＰＣＲ法と異なり、微量のため塩基配列が
決定できなかった遺伝子に対して適用可能な塩基配列の
複製及び増幅方法、及びその種々の用途を提供すること
を目的とする。具体的には、本発明は以下に例示する事
柄を目的とする： イ） 塩基配列が不明である遺伝子の複製方法、 ロ） 塩基配列が不明である遺伝子の増幅方法、 ハ） 塩基配列が不明である遺伝子の塩基配列の決定方
法、 ニ） 塩基配列が不明である遺伝子を有する未知の生物
の検出方法、 ホ） 塩基配列が不明である遺伝子の不特定部分の複製
物、及び ヘ） 塩基配列が不明である遺伝子の不特定部分の増幅
物。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】即ち、本発明の遺伝子
の複製方法は、塩基配列が不明である遺伝子の二本鎖Ｄ
ＮＡ又はＲＮＡに相補的なＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離
させ、次いで一本鎖ＤＮＡの不特定位置にプライマーを
部分的に結合させ、次いで結合した該プライマーをＤＮ
Ａ合成の開始点として、ＤＮＡポリメラーゼにより、一
本鎖ＤＮＡに対して相補性を有するＤＮＡ部分を合成
し、前記操作を２回以上繰り返すことにより遺伝子の不
特定部分を前記プライマーに相等する塩基配列を末端に
持つＤＮＡとして複製することを特徴とする（以下、ｉ
と称する）。
の複製方法は、塩基配列が不明である遺伝子の二本鎖Ｄ
ＮＡ又はＲＮＡに相補的なＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離
させ、次いで一本鎖ＤＮＡの不特定位置にプライマーを
部分的に結合させ、次いで結合した該プライマーをＤＮ
Ａ合成の開始点として、ＤＮＡポリメラーゼにより、一
本鎖ＤＮＡに対して相補性を有するＤＮＡ部分を合成
し、前記操作を２回以上繰り返すことにより遺伝子の不
特定部分を前記プライマーに相等する塩基配列を末端に
持つＤＮＡとして複製することを特徴とする（以下、ｉ
と称する）。
【００１４】本発明の塩基配列が不明である遺伝子の増
幅方法は、ｉの方法に続いて更に、複製された二本鎖Ｄ
ＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させ、次いで複製された遺伝
子の一本鎖ＤＮＡの特定位置に前記ｉで用いたプライマ
ーと同じプライマーを結合させ、次いで結合した該プラ
イマーをＤＮＡ合成の開始点として、ＤＮＡポリメラー
ゼにより、一本鎖ＤＮＡに対して相補性を有するＤＮＡ
部分を合成し、前記操作を所望回繰り返すことにより遺
伝子の不特定部分を増幅することを特徴とする（以下、
iiと称する）。
幅方法は、ｉの方法に続いて更に、複製された二本鎖Ｄ
ＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させ、次いで複製された遺伝
子の一本鎖ＤＮＡの特定位置に前記ｉで用いたプライマ
ーと同じプライマーを結合させ、次いで結合した該プラ
イマーをＤＮＡ合成の開始点として、ＤＮＡポリメラー
ゼにより、一本鎖ＤＮＡに対して相補性を有するＤＮＡ
部分を合成し、前記操作を所望回繰り返すことにより遺
伝子の不特定部分を増幅することを特徴とする（以下、
iiと称する）。
【００１５】前記ｉの塩基配列が不明である遺伝子の複
製方法は、より具体的には、（ａ） 塩基配列が不明で
ある遺伝子をＤＮＡの形態で含む試料に２種類以上のプ
ライマー、反応基質、ＤＮＡポリメラーゼ及び必須金属
塩を加え、（ｂ） 遺伝子の二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮ
Ａに解離させるために変性温度に加熱し、次いで（ｃ）
一本鎖ＤＮＡの不特定位置に各プライマーを部分的に
結合させるために３５℃未満のアニーリング温度で保持
し、次いで（ｄ） 一本鎖ＤＮＡの不特定位置に結合し
た各プライマーをＤＮＡ合成の開始点として、ＤＮＡポ
リメラーゼにより、各々の一本鎖ＤＮＡに対して相補性
を有するＤＮＡ部分を合成するために伸長温度に加温
し、（ｅ） 工程（ｂ），（ｃ）及び（ｄ）を２回以上
繰り返すことにより遺伝子の不特定部分を前記プライマ
ーに相等する塩基配列を末端に持つＤＮＡとして複製す
ることを特徴とする（以下、iii と称する）。
製方法は、より具体的には、（ａ） 塩基配列が不明で
ある遺伝子をＤＮＡの形態で含む試料に２種類以上のプ
ライマー、反応基質、ＤＮＡポリメラーゼ及び必須金属
塩を加え、（ｂ） 遺伝子の二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮ
Ａに解離させるために変性温度に加熱し、次いで（ｃ）
一本鎖ＤＮＡの不特定位置に各プライマーを部分的に
結合させるために３５℃未満のアニーリング温度で保持
し、次いで（ｄ） 一本鎖ＤＮＡの不特定位置に結合し
た各プライマーをＤＮＡ合成の開始点として、ＤＮＡポ
リメラーゼにより、各々の一本鎖ＤＮＡに対して相補性
を有するＤＮＡ部分を合成するために伸長温度に加温
し、（ｅ） 工程（ｂ），（ｃ）及び（ｄ）を２回以上
繰り返すことにより遺伝子の不特定部分を前記プライマ
ーに相等する塩基配列を末端に持つＤＮＡとして複製す
ることを特徴とする（以下、iii と称する）。
【００１６】前記iiの塩基配列が不明である遺伝子の増
幅方法は、より具体的には、iii の方法に続いて更に、
（ｆ） 複製された二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離
させるために変性温度に加熱し、次いで（ｇ） 複製さ
れた遺伝子の一本鎖ＤＮＡの特定位置に前記iii で用い
たプライマーと同じプライマーを結合させるために３５
℃以上のアニーリング温度で保持し、次いで（ｈ） 複
製された一本鎖ＤＮＡの特定位置に結合した各プライマ
ーをＤＮＡ合成の開始点として、ＤＮＡポリメラーゼに
より、各々の一本鎖ＤＮＡに対して相補性を有するＤＮ
Ａ部分を合成するために伸長温度に加温し、（ｉ） 前
記（ｆ），（ｇ）及び（ｈ）の工程を所望回繰り返すこ
とにより遺伝子の不特定部分を増幅することを特徴とす
る（以下、ivと称する）。
幅方法は、より具体的には、iii の方法に続いて更に、
（ｆ） 複製された二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離
させるために変性温度に加熱し、次いで（ｇ） 複製さ
れた遺伝子の一本鎖ＤＮＡの特定位置に前記iii で用い
たプライマーと同じプライマーを結合させるために３５
℃以上のアニーリング温度で保持し、次いで（ｈ） 複
製された一本鎖ＤＮＡの特定位置に結合した各プライマ
ーをＤＮＡ合成の開始点として、ＤＮＡポリメラーゼに
より、各々の一本鎖ＤＮＡに対して相補性を有するＤＮ
Ａ部分を合成するために伸長温度に加温し、（ｉ） 前
記（ｆ），（ｇ）及び（ｈ）の工程を所望回繰り返すこ
とにより遺伝子の不特定部分を増幅することを特徴とす
る（以下、ivと称する）。
【００１７】前記ｉの方法、及びiii の方法の工程
（ａ）において使用するプライマーは、複製を目的とす
る遺伝子の塩基配列が不明であるから、如何なる種類の
プライマーを利用してもよく、従来のＰＣＲ法において
用いられているプライマーを適宜選択して使用すること
ができる。後述するように、本発明方法の特徴はアニー
リングを低温で行うことにより、塩基配列の不明な遺伝
子の不特定部分にランダムにプライマーを結合させ、そ
れを起点として遺伝子の複製を行うものであるからプラ
イマーの種類は問わないのである。プライマーの長さ
は、従来のＰＣＲ法と同様にプライマー間の結合の排除
や核酸鎖との直線的な結合の理由により、２０塩基前後
（１５〜３０塩基程度）のものが好ましく利用できる。
又、使用するプライマーの種類としては、複製された遺
伝子片のその後の遺伝子解析の操作の点を考慮すると、
基本的には２〜１０種類程度を用いるのが好ましく、５
種類前後（４〜７種類）が実用上利用しやすい。
（ａ）において使用するプライマーは、複製を目的とす
る遺伝子の塩基配列が不明であるから、如何なる種類の
プライマーを利用してもよく、従来のＰＣＲ法において
用いられているプライマーを適宜選択して使用すること
ができる。後述するように、本発明方法の特徴はアニー
リングを低温で行うことにより、塩基配列の不明な遺伝
子の不特定部分にランダムにプライマーを結合させ、そ
れを起点として遺伝子の複製を行うものであるからプラ
イマーの種類は問わないのである。プライマーの長さ
は、従来のＰＣＲ法と同様にプライマー間の結合の排除
や核酸鎖との直線的な結合の理由により、２０塩基前後
（１５〜３０塩基程度）のものが好ましく利用できる。
又、使用するプライマーの種類としては、複製された遺
伝子片のその後の遺伝子解析の操作の点を考慮すると、
基本的には２〜１０種類程度を用いるのが好ましく、５
種類前後（４〜７種類）が実用上利用しやすい。
【００１８】本発明の複製方法及び増幅方法において使
用する反応基質、ＤＮＡポリメラーゼ及び必須金属塩も
従来のＰＣＲ法において用いられるものを適宜選択して
使用することができる。即ち、反応基質としてはデオキ
シアデノシン３燐酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン３
燐酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン３燐酸（ｄＧＴ
Ｐ）、デオキシチミジン３燐酸（ｄＴＴＰ）〔又はチミ
ジン３燐酸（ＴＴＰ）〕を、ＤＮＡポリメラーゼを活性
化するための金属塩としてはマグネシウム塩又はマンガ
ン塩を用いることができる。本発明方法を行うときの反
応液としては特別な反応液は必要なく、従来のＰＣＲ法
と同様の反応液を使用することができ、例えば塩化カリ
ウム、ゼラチン、所望により他の添加剤を含む適当な緩
衝液を使用することができる。
用する反応基質、ＤＮＡポリメラーゼ及び必須金属塩も
従来のＰＣＲ法において用いられるものを適宜選択して
使用することができる。即ち、反応基質としてはデオキ
シアデノシン３燐酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン３
燐酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン３燐酸（ｄＧＴ
Ｐ）、デオキシチミジン３燐酸（ｄＴＴＰ）〔又はチミ
ジン３燐酸（ＴＴＰ）〕を、ＤＮＡポリメラーゼを活性
化するための金属塩としてはマグネシウム塩又はマンガ
ン塩を用いることができる。本発明方法を行うときの反
応液としては特別な反応液は必要なく、従来のＰＣＲ法
と同様の反応液を使用することができ、例えば塩化カリ
ウム、ゼラチン、所望により他の添加剤を含む適当な緩
衝液を使用することができる。
【００１９】前記ｉの方法、及びiii の方法の工程
（ｂ）におけるアニーリング温度は本発明の重要な特徴
である。塩基配列が不明である遺伝子の二本鎖ＤＮＡ又
はＲＮＡに相補的なＤＮＡを解離させた一本鎖ＤＮＡの
不特定位置にプライマーを結合させるためには３５℃未
満のアニーリング温度で行う必要がある。アニーリング
温度が３５℃以上であると、プライマーはその塩基配列
と極めて高い相同性を有する部分にしか結合できず、本
発明が目的とする遺伝子ＤＮＡの不特定位置へのランダ
ムなプライマーの結合は達成されない。それ故、本発明
におけるアニーリング温度は３５℃未満、一本鎖ＤＮＡ
に対する充分な非選択性を確保し且つ実用上好ましくは
３０℃以下、より好ましくは２５℃以下である。アニー
リング温度の下限に関しては、反応液が凍結しない温度
内であれば本発明の複製方法を実施することができる。
（ｂ）におけるアニーリング温度は本発明の重要な特徴
である。塩基配列が不明である遺伝子の二本鎖ＤＮＡ又
はＲＮＡに相補的なＤＮＡを解離させた一本鎖ＤＮＡの
不特定位置にプライマーを結合させるためには３５℃未
満のアニーリング温度で行う必要がある。アニーリング
温度が３５℃以上であると、プライマーはその塩基配列
と極めて高い相同性を有する部分にしか結合できず、本
発明が目的とする遺伝子ＤＮＡの不特定位置へのランダ
ムなプライマーの結合は達成されない。それ故、本発明
におけるアニーリング温度は３５℃未満、一本鎖ＤＮＡ
に対する充分な非選択性を確保し且つ実用上好ましくは
３０℃以下、より好ましくは２５℃以下である。アニー
リング温度の下限に関しては、反応液が凍結しない温度
内であれば本発明の複製方法を実施することができる。
【００２０】工程（ｂ），（ｃ）及び（ｄ）の繰り返し
数は、２回以上であれば両端に使用したプライマーに相
当する塩基配列を末端に有するＤＮＡ複製物が得られ
る。この場合、繰り返し数が多いほど複製物の種類は増
大するが、あまり複製物の種類が多いとその後の遺伝子
の検出操作（例えばサザンブロット法による）が繁雑と
なるので、繰り返し数は適宜設定できるが通常２回で目
的が達せられる。
数は、２回以上であれば両端に使用したプライマーに相
当する塩基配列を末端に有するＤＮＡ複製物が得られ
る。この場合、繰り返し数が多いほど複製物の種類は増
大するが、あまり複製物の種類が多いとその後の遺伝子
の検出操作（例えばサザンブロット法による）が繁雑と
なるので、繰り返し数は適宜設定できるが通常２回で目
的が達せられる。
【００２１】上述した本発明の複製方法によって、両端
に使用したプライマーに相当する塩基配列を末端に有す
るＤＮＡ複製物を得ることができる。両端のプライマー
部分に挟まれたＤＮＡ部分は、未知の遺伝子の不特定部
分である。次にこの未知遺伝子部分の塩基配列を決定す
るためには、上記複製方法によって得られたＤＮＡ複製
物を分析可能な量に増幅させる必要がある。該ＤＮＡ複
製物の両端の塩基配列は既知であり（使用したプライマ
ーに相当する塩基配列である）、従ってこれに対しては
従来のＰＣＲ法を適用することによって、このＤＮＡ断
片を増幅させることができる。実際には、前記工程
（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）を所望回繰り返すことにより
実施できる。この増幅方法で使用するプライマーは、得
られたＤＮＡ複製物の両端に存在すると考えられる１種
又は２種のプライマーを当然用いることになる。変性温
度、アニーリング温度、伸長温度、反応基質、ＤＮＡポ
リメラーゼ、必須金属塩、緩衝液、添加剤、増幅工程の
繰り返し回数など各種の反応条件は、通常のＰＣＲ法で
使用されているものから適宜選択して従来法と同様に行
えばよい。
に使用したプライマーに相当する塩基配列を末端に有す
るＤＮＡ複製物を得ることができる。両端のプライマー
部分に挟まれたＤＮＡ部分は、未知の遺伝子の不特定部
分である。次にこの未知遺伝子部分の塩基配列を決定す
るためには、上記複製方法によって得られたＤＮＡ複製
物を分析可能な量に増幅させる必要がある。該ＤＮＡ複
製物の両端の塩基配列は既知であり（使用したプライマ
ーに相当する塩基配列である）、従ってこれに対しては
従来のＰＣＲ法を適用することによって、このＤＮＡ断
片を増幅させることができる。実際には、前記工程
（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）を所望回繰り返すことにより
実施できる。この増幅方法で使用するプライマーは、得
られたＤＮＡ複製物の両端に存在すると考えられる１種
又は２種のプライマーを当然用いることになる。変性温
度、アニーリング温度、伸長温度、反応基質、ＤＮＡポ
リメラーゼ、必須金属塩、緩衝液、添加剤、増幅工程の
繰り返し回数など各種の反応条件は、通常のＰＣＲ法で
使用されているものから適宜選択して従来法と同様に行
えばよい。
【００２２】本発明の増幅方法により増幅した遺伝子は
電気泳動法等で分離した後、各部分の塩基配列を慣用の
方法を用いて決定すれば、元の遺伝子の塩基配列を決定
することができる。又、前記方法により増幅した遺伝子
の各部分の塩基配列の一部又は全部を検査又は決定すれ
ば、元の遺伝子が由来する未知の生物（例えばウイルス
などの未知の微生物）を検出することができる。更に、
本発明の複製方法により塩基配列が不明である遺伝子の
不特定部分の複製物を得ることができ、又、本発明の増
幅方法により塩基配列が不明である遺伝子の不特定部分
の増幅物を得ることができる。
電気泳動法等で分離した後、各部分の塩基配列を慣用の
方法を用いて決定すれば、元の遺伝子の塩基配列を決定
することができる。又、前記方法により増幅した遺伝子
の各部分の塩基配列の一部又は全部を検査又は決定すれ
ば、元の遺伝子が由来する未知の生物（例えばウイルス
などの未知の微生物）を検出することができる。更に、
本発明の複製方法により塩基配列が不明である遺伝子の
不特定部分の複製物を得ることができ、又、本発明の増
幅方法により塩基配列が不明である遺伝子の不特定部分
の増幅物を得ることができる。
【００２３】
【作用】Ｉ．基本原理 １） 遺伝子の塩基配列には、平均して１４００乃至１
５００ｂｐに一箇所の割合で、プライマー（２０塩基程
度の場合）の塩基配列と約５０％の相同性を持ち、更
に、プライマーの３′側（ＤＮＡ合成の起点となる）の
連続した２以上の塩基が１００％相同性を持つ部分が存
在する。遺伝子の二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡに相補的なＤ
ＮＡを解離させた一本鎖ＤＮＡにプライマーを結合させ
る場合において、アニーリング温度を下げると、遺伝子
の塩基配列が不明であっても、前記部分（一本鎖ＤＮＡ
の不特定位置）にプライマーが部分的に結合する。即
ち、このランダムに結合したプライマーを起点としてＤ
ＮＡを合成伸長することによって、遺伝子の不特定部分
を複製することができる。 ２） 複数種類のプライマーを用いて上記の遺伝子複製
を行い、その後、２種類ずつのプライマーを用いて遺伝
子増幅を行えば、複雑な組み合わせの末端塩基配列（個
々のプライマーの塩基配列に相当する）を有する複製Ｄ
ＮＡ群から、ある特定のグループを抽出することができ
る。
５００ｂｐに一箇所の割合で、プライマー（２０塩基程
度の場合）の塩基配列と約５０％の相同性を持ち、更
に、プライマーの３′側（ＤＮＡ合成の起点となる）の
連続した２以上の塩基が１００％相同性を持つ部分が存
在する。遺伝子の二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡに相補的なＤ
ＮＡを解離させた一本鎖ＤＮＡにプライマーを結合させ
る場合において、アニーリング温度を下げると、遺伝子
の塩基配列が不明であっても、前記部分（一本鎖ＤＮＡ
の不特定位置）にプライマーが部分的に結合する。即
ち、このランダムに結合したプライマーを起点としてＤ
ＮＡを合成伸長することによって、遺伝子の不特定部分
を複製することができる。 ２） 複数種類のプライマーを用いて上記の遺伝子複製
を行い、その後、２種類ずつのプライマーを用いて遺伝
子増幅を行えば、複雑な組み合わせの末端塩基配列（個
々のプライマーの塩基配列に相当する）を有する複製Ｄ
ＮＡ群から、ある特定のグループを抽出することができ
る。
【００２４】II．一般的な操作 １） 核酸抽出 試料の選定 例えば未知のウイルス粒子（Ｘ）を含むと考えられる血
漿材料を用いる。 逆転写反応（必要な場合） 逆転写酵素を用いる通常の逆転写反応によってＲＮＡか
らｃＤＮＡを得る。試料がＤＮＡのみを含むことが明ら
かな場合は行わなくてもよい。プライマーとしては、例
えばａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅの５種類を用いることとする。 ２） 遺伝子複製 複製操作 プライマー（ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ）を用い、二本鎖ＤＮ
Ａを熱解離させた一本鎖ＤＮＡの不特定位置へ該プライ
マーを結合させ（アニーリング；例えば２５℃以下）、
次いでＤＮＡ合成の各操作を行う。数サイクル（例えば
２サイクル）実施。 複製産物Ｍ（混合物） ５種類のプライマー（ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ）を用いてい
るので、各プライマーペアの組み合わせにより複製産物
はＭ１，Ｍ２，Ｍ３・・・Ｍ15〔ＭＸ（Ｘ＝１〜15）〕
の１５種類に分類することができる。ＭＸは複製産物の
プライマー末端の組み合わせによって下記表１の如く定
まる。 表１より、例えばＭ１はａ───ａ、Ｍ２はａ───ｂ
という末端プライマー構造を有することが判る。なお、
各ＭＸも又、１種又は２種のプライマー末端に挟まれた
長さ及び塩基配列の異なる未知遺伝子の複数部分の混合
物である。 ３） 遺伝子増幅 増幅操作 好ましい態様としては、まず遺伝子産物からの遺伝子増
幅を遺伝子複製時と同様の５種類のプライマーを用いて
行う〔前記工程（ｆ）〜（ｉ）に相当〕。この増幅方法
は通常のＰＣＲ法と同様に行うことができ、例えばアニ
ーリング温度は３５℃以上に設定する。このように遺伝
子複製時と同様の５種類のプライマー（ａ，ｂ，ｃ，
ｄ，ｅ）を用いて増幅操作を行うのは、次に行う２種類
又は１種類のプライマーを使った複製産物の個別の増幅
操作に充分な量に予め複製産物量を増加させておくため
である。この増幅操作は従来のＰＣＲ法と同様に数十サ
イクル、例えば前記工程（ｆ）〜（ｈ）を３０サイクル
繰り返して実施するが、充分な増幅を行うため例えばも
う一回（３０サイクル）操作を繰り返してもよい。次い
で５種類のプライマー（ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ）のうち２
種類又は１種類のプライマーを使って、複製産物Ｍから
再度遺伝子増幅を行うことにより、Ｍ１，Ｍ２，Ｍ３・
・・Ｍ15を個別に増幅する。例えば、プライマーａを使
用すればＭ１を増幅でき、プライマーａ及びｂを使用す
ればＭ２を個別に増幅することができる。この個別の増
幅操作も通常のＰＣＲ法と同様に数十サイクル（例えば
３０サイクル）繰り返して実施できる。 ４） ウイルス（Ｘ）遺伝子の検出 慣用の方法、例えばサザンブロット法を用いる。 ＜サザンブロット法＞ Ｍ１，Ｍ２，Ｍ３・・・Ｍ15をブロット。プローブは対
照由来の増幅産物（ｍ１，ｍ２，ｍ３・・・ｍ15）を用
いる。対照とは、検出することを目的とする未知のウイ
ルス等を含まない試料、例えば健常状態の血漿などであ
る。プローブによって検出されなかったＤＮＡ断片が、
未知のウイルス（Ｘ）由来の遺伝子の一部であることが
強く示唆される。 ５） Ｘ由来遺伝子の塩基配列決定 Ｘ由来と示唆された遺伝子を慣用操作（例えば抽出）に
より純粋に取り出し、上記５種類のプライマー（ａ，
ｂ，ｃ，ｄ，ｅ）のうち適当なプライマーを用いてＰＣ
Ｒ法で増幅し、慣用の方法を用いて塩基配列を決定す
る。
漿材料を用いる。 逆転写反応（必要な場合） 逆転写酵素を用いる通常の逆転写反応によってＲＮＡか
らｃＤＮＡを得る。試料がＤＮＡのみを含むことが明ら
かな場合は行わなくてもよい。プライマーとしては、例
えばａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅの５種類を用いることとする。 ２） 遺伝子複製 複製操作 プライマー（ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ）を用い、二本鎖ＤＮ
Ａを熱解離させた一本鎖ＤＮＡの不特定位置へ該プライ
マーを結合させ（アニーリング；例えば２５℃以下）、
次いでＤＮＡ合成の各操作を行う。数サイクル（例えば
２サイクル）実施。 複製産物Ｍ（混合物） ５種類のプライマー（ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ）を用いてい
るので、各プライマーペアの組み合わせにより複製産物
はＭ１，Ｍ２，Ｍ３・・・Ｍ15〔ＭＸ（Ｘ＝１〜15）〕
の１５種類に分類することができる。ＭＸは複製産物の
プライマー末端の組み合わせによって下記表１の如く定
まる。 表１より、例えばＭ１はａ───ａ、Ｍ２はａ───ｂ
という末端プライマー構造を有することが判る。なお、
各ＭＸも又、１種又は２種のプライマー末端に挟まれた
長さ及び塩基配列の異なる未知遺伝子の複数部分の混合
物である。 ３） 遺伝子増幅 増幅操作 好ましい態様としては、まず遺伝子産物からの遺伝子増
幅を遺伝子複製時と同様の５種類のプライマーを用いて
行う〔前記工程（ｆ）〜（ｉ）に相当〕。この増幅方法
は通常のＰＣＲ法と同様に行うことができ、例えばアニ
ーリング温度は３５℃以上に設定する。このように遺伝
子複製時と同様の５種類のプライマー（ａ，ｂ，ｃ，
ｄ，ｅ）を用いて増幅操作を行うのは、次に行う２種類
又は１種類のプライマーを使った複製産物の個別の増幅
操作に充分な量に予め複製産物量を増加させておくため
である。この増幅操作は従来のＰＣＲ法と同様に数十サ
イクル、例えば前記工程（ｆ）〜（ｈ）を３０サイクル
繰り返して実施するが、充分な増幅を行うため例えばも
う一回（３０サイクル）操作を繰り返してもよい。次い
で５種類のプライマー（ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ）のうち２
種類又は１種類のプライマーを使って、複製産物Ｍから
再度遺伝子増幅を行うことにより、Ｍ１，Ｍ２，Ｍ３・
・・Ｍ15を個別に増幅する。例えば、プライマーａを使
用すればＭ１を増幅でき、プライマーａ及びｂを使用す
ればＭ２を個別に増幅することができる。この個別の増
幅操作も通常のＰＣＲ法と同様に数十サイクル（例えば
３０サイクル）繰り返して実施できる。 ４） ウイルス（Ｘ）遺伝子の検出 慣用の方法、例えばサザンブロット法を用いる。 ＜サザンブロット法＞ Ｍ１，Ｍ２，Ｍ３・・・Ｍ15をブロット。プローブは対
照由来の増幅産物（ｍ１，ｍ２，ｍ３・・・ｍ15）を用
いる。対照とは、検出することを目的とする未知のウイ
ルス等を含まない試料、例えば健常状態の血漿などであ
る。プローブによって検出されなかったＤＮＡ断片が、
未知のウイルス（Ｘ）由来の遺伝子の一部であることが
強く示唆される。 ５） Ｘ由来遺伝子の塩基配列決定 Ｘ由来と示唆された遺伝子を慣用操作（例えば抽出）に
より純粋に取り出し、上記５種類のプライマー（ａ，
ｂ，ｃ，ｄ，ｅ）のうち適当なプライマーを用いてＰＣ
Ｒ法で増幅し、慣用の方法を用いて塩基配列を決定す
る。
【００２５】
【実施例】以下の実施例において、本発明を更に詳細に
説明する。なお、下記実施例は本発明を説明するための
ものであり、限定的な意味を有するものではない。
説明する。なお、下記実施例は本発明を説明するための
ものであり、限定的な意味を有するものではない。
【００２６】実施例１：アニーリング温度の検討 アニーリング温度が微量ＤＮＡ増幅に及ぼす影響につい
て検討した。遺伝子増幅の実施工程のフローチャートを
図１に示す。 ＜方法＞ 反応液の組成 下記組成の反応液を用いた。 ５０ ｍＭ ：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３） ６ ｍＭ ：ＭｇＣｌ2 ４０ ｍＭ ：ＫＣｌ ２．５ｍＭ ：ｄＡＴＰ ２．５ｍＭ ：ｄＴＴＰ ２．５ｍＭ ：ｄＧＴＰ ２．５ｍＭ ：ｄＣＴＰ １０％（ｗ／ｖ） ：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ） １．５μＭ ：プライマー（２０ｍｅｒ；後述の５種類を含む） ０．５ユニット ：耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ） ０〜０．５３ｎｇ：０〜１０9 コピー；ｐＢＲ３２２（鋳型ＤＮＡ） 遺伝子増幅の実施 Ｉ．複写操作 ａ） 低温アニーリングの検討例 アニーリング温度（Ｔ℃）をＴ＝４，２０，２５，３
０，３５（℃）と変化させて、各場合について下記条件
での反応を２サイクル行った。 ９４℃ ：１分 Ｔ℃ ：２分 〔３７℃ ：１分，Ｔ（℃）が２０（℃）の場合に、
この工程の有無の影響も調べた。即ち、２０℃から一気
に７２℃まで昇温するとプライマーがはずれることを懸
念して、一旦３７℃に保持し、段階的に昇温することの
是非を検討した。〕 ７２℃ ：２分 ｂ） 通常のＰＣＲ法での５５℃アニーリング（対照
例） ９４℃ ：１分 ５５℃ ：１分 ７２℃ ：２分 II．１回目の増幅操作 前記Ｉ．のａ），ｂ）に続いて、何れの場合も下記条件
で１回目の増幅操作（１回目のＰＣＲ）を２８サイクル
行った。 ９４℃ ：１分 ５５℃ ：１分 ７２℃ ：２分 III ．２回目の増幅操作 何れの場合も、１回目の増幅操作終了後の反応液１０μ
ＭをＤＮＡを含まない新しい反応液１０μＭと混合し
て、下記条件下で２回目の増幅操作（２回目のＰＣＲ）
を１５サイクル行った。 ９４℃ ：１分 ５５℃ ：１分 ７２℃ ：２分 IV．ＤＮＡ断片の分離 何れの場合も、２回目の増幅操作終了後の反応液を用い
て、慣用の電気泳動（法）によってＤＮＡ断片を分離し
た。 Ｖ．検出と定量 何れの場合もサザン法を用いて、分離したＤＮＡ断片か
らｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ断片を検出し且つ定量し
た。
て検討した。遺伝子増幅の実施工程のフローチャートを
図１に示す。 ＜方法＞ 反応液の組成 下記組成の反応液を用いた。 ５０ ｍＭ ：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３） ６ ｍＭ ：ＭｇＣｌ2 ４０ ｍＭ ：ＫＣｌ ２．５ｍＭ ：ｄＡＴＰ ２．５ｍＭ ：ｄＴＴＰ ２．５ｍＭ ：ｄＧＴＰ ２．５ｍＭ ：ｄＣＴＰ １０％（ｗ／ｖ） ：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ） １．５μＭ ：プライマー（２０ｍｅｒ；後述の５種類を含む） ０．５ユニット ：耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ） ０〜０．５３ｎｇ：０〜１０9 コピー；ｐＢＲ３２２（鋳型ＤＮＡ） 遺伝子増幅の実施 Ｉ．複写操作 ａ） 低温アニーリングの検討例 アニーリング温度（Ｔ℃）をＴ＝４，２０，２５，３
０，３５（℃）と変化させて、各場合について下記条件
での反応を２サイクル行った。 ９４℃ ：１分 Ｔ℃ ：２分 〔３７℃ ：１分，Ｔ（℃）が２０（℃）の場合に、
この工程の有無の影響も調べた。即ち、２０℃から一気
に７２℃まで昇温するとプライマーがはずれることを懸
念して、一旦３７℃に保持し、段階的に昇温することの
是非を検討した。〕 ７２℃ ：２分 ｂ） 通常のＰＣＲ法での５５℃アニーリング（対照
例） ９４℃ ：１分 ５５℃ ：１分 ７２℃ ：２分 II．１回目の増幅操作 前記Ｉ．のａ），ｂ）に続いて、何れの場合も下記条件
で１回目の増幅操作（１回目のＰＣＲ）を２８サイクル
行った。 ９４℃ ：１分 ５５℃ ：１分 ７２℃ ：２分 III ．２回目の増幅操作 何れの場合も、１回目の増幅操作終了後の反応液１０μ
ＭをＤＮＡを含まない新しい反応液１０μＭと混合し
て、下記条件下で２回目の増幅操作（２回目のＰＣＲ）
を１５サイクル行った。 ９４℃ ：１分 ５５℃ ：１分 ７２℃ ：２分 IV．ＤＮＡ断片の分離 何れの場合も、２回目の増幅操作終了後の反応液を用い
て、慣用の電気泳動（法）によってＤＮＡ断片を分離し
た。 Ｖ．検出と定量 何れの場合もサザン法を用いて、分離したＤＮＡ断片か
らｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ断片を検出し且つ定量し
た。
【００２７】＜結果と考察＞図２は、５３ｐｇの鋳型Ｄ
ＮＡ（ｐＢＲ３２２）由来の増幅産物をサザン法により
検出し、それをデンシトメーターで定量したものであ
る。横軸はアニーリングに用いた温度（アニーリング温
度；℃）を示し、縦軸は増幅産物の量（４℃における量
を１００％とした場合の増幅率％）を示す。アニーリン
グ温度が３５℃以上では、増幅産物は４℃における値の
１／１００以下であるが、３５℃未満、特に３０℃以下
では増幅産物の著しい増加が見られ、２５℃以下でほぼ
一定となった。このことから、未知微量遺伝子の増幅に
適した温度は３５℃未満、好ましくは３０℃以下、より
好ましくは２５℃以下であることが判った。又、低温に
よるアニーリング後３７℃で１分間保持する工程は、こ
の工程が有る場合の増幅率が１００％であり、この工程
が無い場合の増幅率が９７％であったので、最終的には
増幅産物量に影響しないことも判った。
ＮＡ（ｐＢＲ３２２）由来の増幅産物をサザン法により
検出し、それをデンシトメーターで定量したものであ
る。横軸はアニーリングに用いた温度（アニーリング温
度；℃）を示し、縦軸は増幅産物の量（４℃における量
を１００％とした場合の増幅率％）を示す。アニーリン
グ温度が３５℃以上では、増幅産物は４℃における値の
１／１００以下であるが、３５℃未満、特に３０℃以下
では増幅産物の著しい増加が見られ、２５℃以下でほぼ
一定となった。このことから、未知微量遺伝子の増幅に
適した温度は３５℃未満、好ましくは３０℃以下、より
好ましくは２５℃以下であることが判った。又、低温に
よるアニーリング後３７℃で１分間保持する工程は、こ
の工程が有る場合の増幅率が１００％であり、この工程
が無い場合の増幅率が９７％であったので、最終的には
増幅産物量に影響しないことも判った。
【００２８】実施例２ 下記実施例２においては未知のウイルス（Ｘ）と仮定し
てヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）を用い、こ
のＨＩＶ−１由来の遺伝子を本発明方法によって検出す
ることができるかどうかを確認した。 ＜方法＞ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）を含
む培養液を希釈してヒト血漿に加え測定用試料とし、孔
径０．２μｍのフィルターで濾過した。濾液を５０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈し、等量の水飽和フ
ェノールを加えて激しく混合した後、水層を遠心分離し
た。これをクロロフォルムと混合し、遠心した後、水層
を採取して凍結乾燥した。凍結乾燥材料に滅菌蒸留水を
加えて完全に溶解し、その一部に、プライマーとしてＨ
ＩＶ−１の塩基配列とは全く関係のない任意の塩基配列
２０個からなる一本鎖ＤＮＡ５種類；反応基質としてデ
オキシアデノシン３燐酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジ
ン３燐酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン３燐酸（ｄ
ＧＴＰ）及びチミジン３燐酸（ＴＴＰ）；トリス緩衝液
（ｐＨ８．３）、ＲＮＡａｓｅ阻害剤、塩化マグネシウ
ム、塩化カリウム、ジチオスレイトール及び逆転写酵素
を加え、室温に２０分間放置した後、３７℃に６０分間
置き、逆転写反応を行った。本実施例にて使用したプラ
イマーは以下のとおりである。 〔プライマーの塩基配列；５′末端−３′末端〕 ＣＡＡＴＴＧＧＧＧＴＴＧＡＧＣＴＣＡＣＡ ＡＣＡＧＡＧＴＣＣＴＴＴＴＣＴＧＡＣＡＴ ＡＣＣＡＡＣＴＡＴＴＧＣＴＴＣＡＧＣＴＣ ＣＣＡＴＴＣＡＴＴＴＧＴＣＴＴＴＴＴＡＧ ＣＡＣＡＴＣＡＧＴＴＴＴＡＴＴＣＴＴＧＧ
てヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）を用い、こ
のＨＩＶ−１由来の遺伝子を本発明方法によって検出す
ることができるかどうかを確認した。 ＜方法＞ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）を含
む培養液を希釈してヒト血漿に加え測定用試料とし、孔
径０．２μｍのフィルターで濾過した。濾液を５０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈し、等量の水飽和フ
ェノールを加えて激しく混合した後、水層を遠心分離し
た。これをクロロフォルムと混合し、遠心した後、水層
を採取して凍結乾燥した。凍結乾燥材料に滅菌蒸留水を
加えて完全に溶解し、その一部に、プライマーとしてＨ
ＩＶ−１の塩基配列とは全く関係のない任意の塩基配列
２０個からなる一本鎖ＤＮＡ５種類；反応基質としてデ
オキシアデノシン３燐酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジ
ン３燐酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン３燐酸（ｄ
ＧＴＰ）及びチミジン３燐酸（ＴＴＰ）；トリス緩衝液
（ｐＨ８．３）、ＲＮＡａｓｅ阻害剤、塩化マグネシウ
ム、塩化カリウム、ジチオスレイトール及び逆転写酵素
を加え、室温に２０分間放置した後、３７℃に６０分間
置き、逆転写反応を行った。本実施例にて使用したプラ
イマーは以下のとおりである。 〔プライマーの塩基配列；５′末端−３′末端〕 ＣＡＡＴＴＧＧＧＧＴＴＧＡＧＣＴＣＡＣＡ ＡＣＡＧＡＧＴＣＣＴＴＴＴＣＴＧＡＣＡＴ ＡＣＣＡＡＣＴＡＴＴＧＣＴＴＣＡＧＣＴＣ ＣＣＡＴＴＣＡＴＴＴＧＴＣＴＴＴＴＴＡＧ ＣＡＣＡＴＣＡＧＴＴＴＴＡＴＴＣＴＴＧＧ
【００２９】次に、遺伝子複製・増幅反応を実施した
が、これは、３段階６０サイクルの複製・増幅反応から
なる。先ず、逆転写反応液の一部と、トリス緩衝液（ｐ
Ｈ８．３）、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ジチオ
スレイトール、ジメチルスルフォキシド及び耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼ（ＤＮＡ合成酵素）を混合し、９４℃で
１分、２０℃で２分、７２℃で２分を１サイクルとする
反応を２サイクル実施した（遺伝子複製反応）。
が、これは、３段階６０サイクルの複製・増幅反応から
なる。先ず、逆転写反応液の一部と、トリス緩衝液（ｐ
Ｈ８．３）、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ジチオ
スレイトール、ジメチルスルフォキシド及び耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼ（ＤＮＡ合成酵素）を混合し、９４℃で
１分、２０℃で２分、７２℃で２分を１サイクルとする
反応を２サイクル実施した（遺伝子複製反応）。
【００３０】その後、９４℃で１分、５５℃で１分、７
２℃で２分を１サイクルとする反応を２８サイクル実施
し、その一部とデオキシアデノシン３燐酸（ｄＡＴ
Ｐ）、デオキシシチジン３燐酸（ｄＣＴＰ）、デオキシ
グアノシン３燐酸（ｄＧＴＰ）、チミジン３燐酸（ＴＴ
Ｐ）；トリス緩衝液（ｐＨ８．３）、塩化マグネシウ
ム、塩化カリウム、ジチオスレイトール、ジメチルスル
フォキシド及び耐熱性ＤＮＡ合成酵素（５種類のプライ
マーを追加してもよい）を混合し、９４℃で１分、５５
℃で１分、７２℃で２分を１サイクルとする反応を３０
サイクル実施した（遺伝子増幅反応）。
２℃で２分を１サイクルとする反応を２８サイクル実施
し、その一部とデオキシアデノシン３燐酸（ｄＡＴ
Ｐ）、デオキシシチジン３燐酸（ｄＣＴＰ）、デオキシ
グアノシン３燐酸（ｄＧＴＰ）、チミジン３燐酸（ＴＴ
Ｐ）；トリス緩衝液（ｐＨ８．３）、塩化マグネシウ
ム、塩化カリウム、ジチオスレイトール、ジメチルスル
フォキシド及び耐熱性ＤＮＡ合成酵素（５種類のプライ
マーを追加してもよい）を混合し、９４℃で１分、５５
℃で１分、７２℃で２分を１サイクルとする反応を３０
サイクル実施した（遺伝子増幅反応）。
【００３１】陽性対照実験では、同じ凍結乾燥材料を蒸
留水で溶解したものの同量に、プライマーとしてＨＩＶ
−１の塩基配列と１００％の相補性がある一本鎖ＤＮＡ
２種類（一方はＨＩＶ−１遺伝子のセンス、もう一方は
ＨＩＶ−１遺伝子のアンチセンスの配列を持つプライマ
ーペア）；反応基質としてデオキシアデノシン３燐酸
（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン３燐酸（ｄＣＴＰ）、
デオキシグアノシン３燐酸（ｄＧＴＰ）、チミジン３燐
酸（ＴＴＰ）；トリス緩衝液（ｐＨ８．３）、ＲＮＡａ
ｓｅ阻害剤、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ジチオ
スレイトール、ジメチルスルフォキシド及び逆転写酵素
を加え、３７℃で６０分間逆転写反応を行った。
留水で溶解したものの同量に、プライマーとしてＨＩＶ
−１の塩基配列と１００％の相補性がある一本鎖ＤＮＡ
２種類（一方はＨＩＶ−１遺伝子のセンス、もう一方は
ＨＩＶ−１遺伝子のアンチセンスの配列を持つプライマ
ーペア）；反応基質としてデオキシアデノシン３燐酸
（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン３燐酸（ｄＣＴＰ）、
デオキシグアノシン３燐酸（ｄＧＴＰ）、チミジン３燐
酸（ＴＴＰ）；トリス緩衝液（ｐＨ８．３）、ＲＮＡａ
ｓｅ阻害剤、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ジチオ
スレイトール、ジメチルスルフォキシド及び逆転写酵素
を加え、３７℃で６０分間逆転写反応を行った。
【００３２】又、遺伝子増幅反応は２段階６０サイクル
からなり、先ず、逆転写反応液の一部とトリス緩衝液
（ｐＨ８．３）、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ジ
チオスレイトール、ジメチルスルフォキシド及び耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼを混合し、９４℃で１分、５５℃で
１分、７２℃で２分を１サイクルとする反応を３０サイ
クル実施し、更に、その一部とデオキシアデノシン３燐
酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン３燐酸（ｄＣＴ
Ｐ）、デオキシグアノシン３燐酸（ｄＧＴＰ）、チミジ
ン３燐酸（ＴＴＰ）；トリス緩衝液（ｐＨ８．３）、塩
化マグネシウム、塩化カリウム、ジチオスレイトール、
ジメチルスルフォキシド及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
を混合し、９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で２分
を１サイクルとする反応を３０サイクル実施した。
からなり、先ず、逆転写反応液の一部とトリス緩衝液
（ｐＨ８．３）、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ジ
チオスレイトール、ジメチルスルフォキシド及び耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼを混合し、９４℃で１分、５５℃で
１分、７２℃で２分を１サイクルとする反応を３０サイ
クル実施し、更に、その一部とデオキシアデノシン３燐
酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン３燐酸（ｄＣＴ
Ｐ）、デオキシグアノシン３燐酸（ｄＧＴＰ）、チミジ
ン３燐酸（ＴＴＰ）；トリス緩衝液（ｐＨ８．３）、塩
化マグネシウム、塩化カリウム、ジチオスレイトール、
ジメチルスルフォキシド及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
を混合し、９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で２分
を１サイクルとする反応を３０サイクル実施した。
【００３３】陰性対照実験では、ヒト免疫不全ウイルス
−１（ＨＩＶ−１）を加えていないヒト血漿を出発材料
として陽性対照実験と同様な実験を実施した。
−１（ＨＩＶ−１）を加えていないヒト血漿を出発材料
として陽性対照実験と同様な実験を実施した。
【００３４】遺伝子増幅反応が終了した材料を６％ポリ
アクリルアミド電気泳動で分離し、更にナイロン膜に転
写した後、ＨＩＶ−１と同じ塩基配列を持つＤＮＡに32
Ｐを標識したものをハイブリダイズさせ、オートラジオ
グラフィーを実施して増幅させたＨＩＶ−１遺伝子の検
出を行った。
アクリルアミド電気泳動で分離し、更にナイロン膜に転
写した後、ＨＩＶ−１と同じ塩基配列を持つＤＮＡに32
Ｐを標識したものをハイブリダイズさせ、オートラジオ
グラフィーを実施して増幅させたＨＩＶ−１遺伝子の検
出を行った。
【００３５】遺伝子増幅に使用した５種類のプライマー
を１種類又は２種類ずつ組み合わせ、遺伝子増幅反応の
終了したＨＩＶ遺伝子を含む材料及び陰性対照の材料を
用いて再び遺伝子増幅を行った（各々１５種類のプライ
マーペアを有する遺伝子産物ができあがる）。これらを
全て６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ゲ
ル内のＤＮＡ断片を染色した。次にゲル内のＤＮＡ断片
をポリアミド（ナイロン）膜等に転写し、陰性対照由来
の増幅産物を32Ｐで標識したプローブを用いて、サザン
法によりＤＮＡ断片の検出を行った。６％ポリアクリル
アミドゲル上で展開されたＨＩＶ遺伝子由来の増幅産物
のうち、サザン法で検出されなかったＤＮＡ断片は同増
幅産物に特異的であると考えられたので、ＤＮＡ断片を
抽出して純化し、増幅に使用したプライマーを用いて再
度遺伝子増幅（ＰＣＲ法）を行った後、常法に従い塩基
配列の解読を行った。
を１種類又は２種類ずつ組み合わせ、遺伝子増幅反応の
終了したＨＩＶ遺伝子を含む材料及び陰性対照の材料を
用いて再び遺伝子増幅を行った（各々１５種類のプライ
マーペアを有する遺伝子産物ができあがる）。これらを
全て６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ゲ
ル内のＤＮＡ断片を染色した。次にゲル内のＤＮＡ断片
をポリアミド（ナイロン）膜等に転写し、陰性対照由来
の増幅産物を32Ｐで標識したプローブを用いて、サザン
法によりＤＮＡ断片の検出を行った。６％ポリアクリル
アミドゲル上で展開されたＨＩＶ遺伝子由来の増幅産物
のうち、サザン法で検出されなかったＤＮＡ断片は同増
幅産物に特異的であると考えられたので、ＤＮＡ断片を
抽出して純化し、増幅に使用したプライマーを用いて再
度遺伝子増幅（ＰＣＲ法）を行った後、常法に従い塩基
配列の解読を行った。
【００３６】＜結果＞本発明の方法により、感染性のあ
るＨＩＶ−１粒子の数を１とした場合（非感染性粒子の
１００〜１０００に相当する）、その０．１に相当する
粒子（非感染性粒子の１０〜１００に相当する）からの
遺伝子増幅が観察された。一方、陽性対照実験（従来の
ＰＣＲ法）では、０．０１（非感染性粒子の１〜１０に
相当する）からの遺伝子増幅が観察された。本発明によ
る増幅率は、オートラジオグラフィーのシグナルから判
断すると１０万倍以上であり、実用上充分な増幅率を得
ることができる。分離されたＤＮＡ断片の塩基配列を調
べたところ、ＨＩＶ−１（ＨＩＶ−IIIB株）のＬＴＲ
（末端反復配列）領域に高い相同性（９４％以上）が見
られた。又、プライマーが結合していると考えられる領
域を調べたところ、増幅に使用されたプライマーと５５
％の相同性が見られ、しかも、プライマーの３′末端部
がＨＩＶ−１の配列に完全に一致していた。従来のＰＣ
Ｒ法では塩基配列が不明である微量遺伝子は増幅するこ
とができないので、これを分離して塩基配列を決定する
ことはできない。よって、本発明は極めて有用であるこ
とが判る。
るＨＩＶ−１粒子の数を１とした場合（非感染性粒子の
１００〜１０００に相当する）、その０．１に相当する
粒子（非感染性粒子の１０〜１００に相当する）からの
遺伝子増幅が観察された。一方、陽性対照実験（従来の
ＰＣＲ法）では、０．０１（非感染性粒子の１〜１０に
相当する）からの遺伝子増幅が観察された。本発明によ
る増幅率は、オートラジオグラフィーのシグナルから判
断すると１０万倍以上であり、実用上充分な増幅率を得
ることができる。分離されたＤＮＡ断片の塩基配列を調
べたところ、ＨＩＶ−１（ＨＩＶ−IIIB株）のＬＴＲ
（末端反復配列）領域に高い相同性（９４％以上）が見
られた。又、プライマーが結合していると考えられる領
域を調べたところ、増幅に使用されたプライマーと５５
％の相同性が見られ、しかも、プライマーの３′末端部
がＨＩＶ−１の配列に完全に一致していた。従来のＰＣ
Ｒ法では塩基配列が不明である微量遺伝子は増幅するこ
とができないので、これを分離して塩基配列を決定する
ことはできない。よって、本発明は極めて有用であるこ
とが判る。
【００３７】
【発明の効果】従来のＰＣＲ法は、塩基配列が既知の遺
伝子（ＤＮＡ）を対象とするものであり、目的とする遺
伝子領域を挟む２種類のプライマーを用いることによ
り、１回の反応でその領域を倍化でき、このＤＮＡポリ
メラーゼ反応を繰り返すのがＰＣＲ法の原理である。前
述したとおり目的遺伝子以外の部分の混入を避け、目的
とする遺伝子部分のみを増幅させるのがＰＣＲ法の特徴
であり、そのためにはプライマーを特定の部位に特異的
に結合させなければならず、ある程度高温の条件下でア
ニーリングが必須となる。高温であるほどプライマーは
より完全な相補性を有する部分にしか結合しなくなり上
記目的を達成できるが、低温下では相補性の低い部分に
も非特異的にプライマーが結合してしまい、目的外の遺
伝子部分の混入が増加する。本発明方法は、従来のＰＣ
Ｒ法ではなるべく避けようとしていた目的外の遺伝子増
幅を利用して、塩基配列が不明である遺伝子の検出を行
うための方法である。即ち、低温でアニーリングを行う
ことにより、遺伝子の不特定部分にプライマーをランダ
ムに結合させ、とにかく未知遺伝子のどの部分でもよい
から複製・増幅させることを目的とする。
伝子（ＤＮＡ）を対象とするものであり、目的とする遺
伝子領域を挟む２種類のプライマーを用いることによ
り、１回の反応でその領域を倍化でき、このＤＮＡポリ
メラーゼ反応を繰り返すのがＰＣＲ法の原理である。前
述したとおり目的遺伝子以外の部分の混入を避け、目的
とする遺伝子部分のみを増幅させるのがＰＣＲ法の特徴
であり、そのためにはプライマーを特定の部位に特異的
に結合させなければならず、ある程度高温の条件下でア
ニーリングが必須となる。高温であるほどプライマーは
より完全な相補性を有する部分にしか結合しなくなり上
記目的を達成できるが、低温下では相補性の低い部分に
も非特異的にプライマーが結合してしまい、目的外の遺
伝子部分の混入が増加する。本発明方法は、従来のＰＣ
Ｒ法ではなるべく避けようとしていた目的外の遺伝子増
幅を利用して、塩基配列が不明である遺伝子の検出を行
うための方法である。即ち、低温でアニーリングを行う
ことにより、遺伝子の不特定部分にプライマーをランダ
ムに結合させ、とにかく未知遺伝子のどの部分でもよい
から複製・増幅させることを目的とする。
【００３８】それ故本発明の方法によれば、例えば病原
微生物が未だ知られていない（未同定）感染症患者由来
の血漿等を材料として、遺伝子の複製・増幅を行い、得
られたＤＮＡの塩基配列が感染症特異的な微生物由来で
あることが疫学的に確認されれば、感染を診断すること
やその感染症のワクチンの作製が可能となる。
微生物が未だ知られていない（未同定）感染症患者由来
の血漿等を材料として、遺伝子の複製・増幅を行い、得
られたＤＮＡの塩基配列が感染症特異的な微生物由来で
あることが疫学的に確認されれば、感染を診断すること
やその感染症のワクチンの作製が可能となる。
【００３９】又、本発明の方法により増幅した遺伝子の
各部分の塩基配列を決定することにより、塩基配列が不
明である遺伝子の塩基配列を決定することができる。更
に、本発明の方法により増幅した遺伝子の各部分の塩基
配列の一部又は全部を検査又は決定することにより、塩
基配列が不明である遺伝子を有する未知の生物を検出す
ることができる。それ故、本発明は塩基配列が不明であ
る遺伝子の塩基配列の決定方法及び塩基配列が不明であ
る遺伝子を有する未知の生物の検出方法として有用であ
る。
各部分の塩基配列を決定することにより、塩基配列が不
明である遺伝子の塩基配列を決定することができる。更
に、本発明の方法により増幅した遺伝子の各部分の塩基
配列の一部又は全部を検査又は決定することにより、塩
基配列が不明である遺伝子を有する未知の生物を検出す
ることができる。それ故、本発明は塩基配列が不明であ
る遺伝子の塩基配列の決定方法及び塩基配列が不明であ
る遺伝子を有する未知の生物の検出方法として有用であ
る。
【００４０】更に、塩基配列が不明である遺伝子の不特
定部分の複製物及び増幅物は、本発明の方法により容易
に得ることができ、これらは遺伝子の構造や機能を検査
したり分析する際の対象として役立つ。
定部分の複製物及び増幅物は、本発明の方法により容易
に得ることができ、これらは遺伝子の構造や機能を検査
したり分析する際の対象として役立つ。
【図１】アニーリング温度の影響を調べるための、遺伝
子増幅方法の実施工程のフローチャートである。
子増幅方法の実施工程のフローチャートである。
【図２】５３ｐｇの鋳型ＤＮＡ（ｐＢＲ３２２）由来の
増幅産物をサザン法により検出し、それをデンシトメー
ターで定量した実験（実施例１）におけるアニーリング
温度と増幅産物量との関係を示す図である。
増幅産物をサザン法により検出し、それをデンシトメー
ターで定量した実験（実施例１）におけるアニーリング
温度と増幅産物量との関係を示す図である。
Claims (9)
- 【請求項１】 塩基配列が不明である遺伝子の二本鎖Ｄ
ＮＡ又はＲＮＡに相補的なＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離
させ、次いで一本鎖ＤＮＡの不特定位置にプライマーを
部分的に結合させ、次いで結合した該プライマーをＤＮ
Ａ合成の開始点として、ＤＮＡポリメラーゼにより、一
本鎖ＤＮＡに対して相補性を有するＤＮＡ部分を合成
し、前記操作を２回以上繰り返すことにより遺伝子の不
特定部分を前記プライマーに相等する塩基配列を末端に
持つＤＮＡとして複製することを特徴とする遺伝子の複
製方法。 - 【請求項２】 請求項１の方法に続いて更に、複製され
た二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させ、次いで複製
された遺伝子の一本鎖ＤＮＡの特定位置に請求項１で用
いたプライマーと同じプライマーを結合させ、次いで結
合した該プライマーをＤＮＡ合成の開始点として、ＤＮ
Ａポリメラーゼにより、一本鎖ＤＮＡに対して相補性を
有するＤＮＡ部分を合成し、前記操作を所望回繰り返す
ことにより遺伝子の不特定部分を増幅することを特徴と
する塩基配列が不明である遺伝子の増幅方法。 - 【請求項３】 （ａ） 塩基配列が不明である遺伝子を
ＤＮＡの形態で含む試料に２種類以上のプライマー、反
応基質、ＤＮＡポリメラーゼ及び必須金属塩を加え、 （ｂ） 遺伝子の二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離さ
せるために変性温度に加熱し、次いで （ｃ） 一本鎖ＤＮＡの不特定位置に各プライマーを結
合させるために３５℃未満のアニーリング温度で保持
し、次いで （ｄ） 一本鎖ＤＮＡの不特定位置に部分的に結合した
各プライマーをＤＮＡ合成の開始点として、ＤＮＡポリ
メラーゼにより、各々の一本鎖ＤＮＡに対して相補性を
有するＤＮＡ部分を合成するために伸長温度に加温し、 （ｅ） 工程（ｂ），（ｃ）及び（ｄ）を２回以上繰り
返すことにより遺伝子の不特定部分を前記プライマーに
相等する塩基配列を末端に持つＤＮＡとして複製するこ
とを特徴とする遺伝子の複製方法。 - 【請求項４】 請求項３の方法に続いて更に、 （ｆ） 複製された二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離
させるために変性温度に加熱し、次いで （ｇ） 複製された遺伝子の一本鎖ＤＮＡの特定位置に
請求項３で用いたプライマーと同じプライマーを結合さ
せるために３５℃以上のアニーリング温度で保持し、次
いで （ｈ） 複製された一本鎖ＤＮＡの特定位置に結合した
各プライマーをＤＮＡ合成の開始点として、ＤＮＡポリ
メラーゼにより、各々の一本鎖ＤＮＡに対して相補性を
有するＤＮＡ部分を合成するために伸長温度に加温し、 （ｉ） 前記（ｆ），（ｇ）及び（ｈ）の工程を所望回
繰り返すことにより遺伝子の不特定部分を増幅すること
を特徴とする塩基配列が不明である遺伝子の増幅方法。 - 【請求項５】 工程（ｂ），（ｃ）及び（ｄ）を２回繰
り返すことを特徴とする請求項３又は４記載の方法。 - 【請求項６】 請求項４記載の方法により増幅した遺伝
子の各部分の塩基配列を決定することによる塩基配列が
不明である遺伝子の塩基配列の決定方法。 - 【請求項７】 請求項４記載の方法により増幅した遺伝
子の各部分の塩基配列の一部又は全部を検査又は決定す
ることによる未知の生物の検出方法。 - 【請求項８】 請求項３記載の方法により得られる塩基
配列が不明である遺伝子の不特定部分の複製物。 - 【請求項９】 請求項４記載の方法により得られる塩基
配列が不明である遺伝子の不特定部分の増幅物。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7074616A JPH08242897A (ja) | 1995-03-07 | 1995-03-07 | 遺伝子の複製及び増幅方法 |
| EP96103567A EP0731176A3 (en) | 1995-03-07 | 1996-03-07 | Method of gene duplication and amplification |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7074616A JPH08242897A (ja) | 1995-03-07 | 1995-03-07 | 遺伝子の複製及び増幅方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08242897A true JPH08242897A (ja) | 1996-09-24 |
Family
ID=13552294
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7074616A Pending JPH08242897A (ja) | 1995-03-07 | 1995-03-07 | 遺伝子の複製及び増幅方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0731176A3 (ja) |
| JP (1) | JPH08242897A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU3607099A (en) * | 1998-04-17 | 1999-11-08 | Institut Fur Hormon- Und Fortpflanzungsforschung An Der Univ ersitat Hamburg | The alzheimer-associated beta-amyloid binding protein (erab) is highly upregulated in the testicular leydig cells of the azoospermic w/w v mouse: identification by differential display rt-pcr |
| ATE439454T1 (de) * | 2001-04-02 | 2009-08-15 | Point 2 Point Genomics Ltd | Analyse von polynukleotiden mittels kombinatorischer pcr |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL9000134A (nl) * | 1990-01-19 | 1991-08-16 | Stichting Res Fonds Pathologie | Primers en werkwijze voor het detecteren van humaan papilloma virus genotypen m.b.v. pcr. |
| JP3602550B2 (ja) * | 1993-03-03 | 2004-12-15 | 財団法人地球環境産業技術研究機構 | Ｄｎａ配列の増幅法 |
| NZ263779A (en) * | 1993-04-16 | 1997-03-24 | F B Investments Pty Ltd Former | Method for random amplification of dna |
-
1995
- 1995-03-07 JP JP7074616A patent/JPH08242897A/ja active Pending
-
1996
- 1996-03-07 EP EP96103567A patent/EP0731176A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0731176A3 (en) | 1999-11-24 |
| EP0731176A2 (en) | 1996-09-11 |
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