JPH08245690A - 二糖類分解酵素活性促進ペプチド - Google Patents
二糖類分解酵素活性促進ペプチドInfo
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Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 カゼインをペプチダーゼ等の蛋白質分解酵素
によって処理し、分子量１７ｋＤａ以下の、小腸粘膜中
の二糖類分解酵素活性を促進する新規ペプチドを得る。
このペプチドは分子量１７ｋＤａ、１５ｋＤａ、１０ｋ
Ｄａの分子量を有しており、陰イオン交換体に結合性を
有する。 【効果】 得られた新規ペプチドは小腸粘膜に存在する
二糖類分解酵素の活性を促進し、食品、医薬品、生化学
試薬等に利用できる。
によって処理し、分子量１７ｋＤａ以下の、小腸粘膜中
の二糖類分解酵素活性を促進する新規ペプチドを得る。
このペプチドは分子量１７ｋＤａ、１５ｋＤａ、１０ｋ
Ｄａの分子量を有しており、陰イオン交換体に結合性を
有する。 【効果】 得られた新規ペプチドは小腸粘膜に存在する
二糖類分解酵素の活性を促進し、食品、医薬品、生化学
試薬等に利用できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、小腸粘膜に存在する二
糖類分解酵素活性を促進する作用を有する新規ペプチド
に関する。本発明のペプチドは食品、医薬品、生化学試
薬等の用途に有用である。
糖類分解酵素活性を促進する作用を有する新規ペプチド
に関する。本発明のペプチドは食品、医薬品、生化学試
薬等の用途に有用である。
【０００２】
【従来の技術】経口的に摂取された食物は、主に膵液で
粗分解され小腸粘膜に接触する。またデンプンなどの糖
質は唾液、膵液によってラクトース、スクロース、マル
トースなどの二糖類にまで分解されるが、腸管粘膜上で
粘膜消化酵素によりさらに単糖まで分解されて体内に吸
収される。この段階での消化を膜消化または終末消化と
呼ぶ。この膜消化の段階で粘膜消化酵素の活性を何らか
の方法で高めることができれば、消化吸収がよくなるこ
とが期待できる。乳幼児は粘膜細胞が未熟なため消化吸
収力が弱く、老人は細胞の代謝が不活発なため、消化吸
収力が劣る傾向にある。このような場合に、消化管内の
酵素活性を高めることで、このような消化吸収能力の低
下を補うことが可能である。このため、一般的には酵素
製剤を投与して、機能低下を補うことが行われている。
しかし、消化吸収能力の低下した患者の、腸管の機能そ
のものを向上させるような試みは全く行われていない。
小腸粘膜の二糖類分解酵素は、その基質である二糖類の
摂取によってその活性が上昇することが報告されてい
る。糖質の吸収を高めるためには糖質、特に二糖類の含
量を多くした食物を摂取すれば良いが、この場合、食物
のエネルギー（カロリー）あたりの糖質含量が多くな
り、効率的ではない。二糖類などの、基質ではなく、小
腸粘膜中の二糖類分解酵素活性の発現に関与する食品成
分を摂取することで、小腸粘膜の消化機能を調節できれ
ば、安全で消化吸収性の良い食品を供給することが可能
となることが考えられるが、このような成分が分離され
たとの報告は未だ見いだせないのが現状である。
粗分解され小腸粘膜に接触する。またデンプンなどの糖
質は唾液、膵液によってラクトース、スクロース、マル
トースなどの二糖類にまで分解されるが、腸管粘膜上で
粘膜消化酵素によりさらに単糖まで分解されて体内に吸
収される。この段階での消化を膜消化または終末消化と
呼ぶ。この膜消化の段階で粘膜消化酵素の活性を何らか
の方法で高めることができれば、消化吸収がよくなるこ
とが期待できる。乳幼児は粘膜細胞が未熟なため消化吸
収力が弱く、老人は細胞の代謝が不活発なため、消化吸
収力が劣る傾向にある。このような場合に、消化管内の
酵素活性を高めることで、このような消化吸収能力の低
下を補うことが可能である。このため、一般的には酵素
製剤を投与して、機能低下を補うことが行われている。
しかし、消化吸収能力の低下した患者の、腸管の機能そ
のものを向上させるような試みは全く行われていない。
小腸粘膜の二糖類分解酵素は、その基質である二糖類の
摂取によってその活性が上昇することが報告されてい
る。糖質の吸収を高めるためには糖質、特に二糖類の含
量を多くした食物を摂取すれば良いが、この場合、食物
のエネルギー（カロリー）あたりの糖質含量が多くな
り、効率的ではない。二糖類などの、基質ではなく、小
腸粘膜中の二糖類分解酵素活性の発現に関与する食品成
分を摂取することで、小腸粘膜の消化機能を調節できれ
ば、安全で消化吸収性の良い食品を供給することが可能
となることが考えられるが、このような成分が分離され
たとの報告は未だ見いだせないのが現状である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、消化管
の粘膜中に存在する二糖類分解酵素の活性を促進する物
質について検討を進めた結果、乳蛋白質を摂取すること
によって、この酵素活性が促進されることを初めて見い
だした。さらにこの作用は、乳蛋白質特にカゼインを摂
取した時に強く誘導されることを確認した。この二糖類
分解酵素活性促進物質はカゼインが酵素分解されて生成
するペプチド画分に存在することが明らかとなった。本
発明は、カゼインを酵素分解して得られるペプチド画分
中に存在し、小腸粘膜中に存在する二糖類分解酵素の活
性を促進する新規ペプチドを提供することを課題とす
る。
の粘膜中に存在する二糖類分解酵素の活性を促進する物
質について検討を進めた結果、乳蛋白質を摂取すること
によって、この酵素活性が促進されることを初めて見い
だした。さらにこの作用は、乳蛋白質特にカゼインを摂
取した時に強く誘導されることを確認した。この二糖類
分解酵素活性促進物質はカゼインが酵素分解されて生成
するペプチド画分に存在することが明らかとなった。本
発明は、カゼインを酵素分解して得られるペプチド画分
中に存在し、小腸粘膜中に存在する二糖類分解酵素の活
性を促進する新規ペプチドを提供することを課題とす
る。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明では、カゼインを
酵素分解して得られ、小腸粘膜に存在する二糖類分解酵
素活性を促進させるペプチドが提供される。このペプチ
ドの一つは、下記特性を有し、小腸粘膜に存在する二糖
類分解酵素活性を促進させるペプチドである。Ｎ末端ア
ミノ酸配列： Val-Ala-Pro-Phe-Pro-Xaa-Val-Phe-Gly-Lys-Glu-Lys-Va
l-Asn-Glu-Leu-Ser-Lys-Asp-Ile-Gly-Ser-Glu-Ser-Thr-
Glu-Asp-Gln-Ala-Met- ( なおXaa はGlu またはGln のいずれかを表す。) 分子量： ＳＤＳ─ＰＡＧＥによる分子量：約１７ｋＤａ 電気的性質：陰イオン交換体に吸着し、０．２８Ｍ以上
の濃度の塩溶液で溶出される 作用：小腸粘膜上皮細胞のラクターゼ活性およびスクラ
ーゼ活性を促進させる
酵素分解して得られ、小腸粘膜に存在する二糖類分解酵
素活性を促進させるペプチドが提供される。このペプチ
ドの一つは、下記特性を有し、小腸粘膜に存在する二糖
類分解酵素活性を促進させるペプチドである。Ｎ末端ア
ミノ酸配列： Val-Ala-Pro-Phe-Pro-Xaa-Val-Phe-Gly-Lys-Glu-Lys-Va
l-Asn-Glu-Leu-Ser-Lys-Asp-Ile-Gly-Ser-Glu-Ser-Thr-
Glu-Asp-Gln-Ala-Met- ( なおXaa はGlu またはGln のいずれかを表す。) 分子量： ＳＤＳ─ＰＡＧＥによる分子量：約１７ｋＤａ 電気的性質：陰イオン交換体に吸着し、０．２８Ｍ以上
の濃度の塩溶液で溶出される 作用：小腸粘膜上皮細胞のラクターゼ活性およびスクラ
ーゼ活性を促進させる
【０００５】さらにまた、本発明のペプチドの一つは、
下記特性を有し、小腸粘膜に存在する二糖類分解酵素活
性を促進させるペプチドである。 Ｎ末端アミノ酸配列： Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro- 分子量： ＳＤＳ─ＰＡＧＥによる分子量：約１５ｋＤａまたは１
０ｋＤａ 電気的性質：陰イオン交換体に吸着し、０．２８Ｍ以上
の濃度の塩溶液で溶出される 作用：小腸粘膜上皮細胞のラクターゼ活性およびスクラ
ーゼ活性を促進させる
下記特性を有し、小腸粘膜に存在する二糖類分解酵素活
性を促進させるペプチドである。 Ｎ末端アミノ酸配列： Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro- 分子量： ＳＤＳ─ＰＡＧＥによる分子量：約１５ｋＤａまたは１
０ｋＤａ 電気的性質：陰イオン交換体に吸着し、０．２８Ｍ以上
の濃度の塩溶液で溶出される 作用：小腸粘膜上皮細胞のラクターゼ活性およびスクラ
ーゼ活性を促進させる
【０００６】本発明のペプチドは、乳蛋白質中に存在す
るカゼインを出発物質として、これをプロテアーゼまた
はペプチダーゼで分解して得られる。分解に使用する酵
素としては、ペプシン、トリプシン、キモトリプシンな
どの動物性プロテアーゼ、微生物由来のプロテアーゼ、
カルボキシペプチダーゼなどのペプチダーゼを用いて行
うことができる。好ましくは、ペプチダーゼＲ（商品
名、天野製薬株式会社）などの微生物由来のペプチダー
ゼを用いることが好ましい。ペプチダーゼＲはリゾプス
由来のプロテナーゼ、ペプチダーゼを含有する酵素であ
る。酵素処理にあたっては、カゼインと酵素を反応温度
２５〜５０℃においてｐＨ３〜８で１〜２４時間反応さ
せ、カゼインの酵素分解物を得て、ついで酵素反応を加
熱処理あるいは酸処理等の適切な方法で停止させ、酵素
および未反応のカゼインを沈殿除去する。ペプチドを精
製するためには、溶媒抽出や限外濾過などの方法によっ
て目的の分子量１７，０００以下のペプチドを含有する
画分を得て、これをさらに高速液体クロマトグラフィー
等の手法によって精製することができる。本発明のペプ
チドは陰イオン交換体に吸着し、０．２８Ｍ以上の濃度
の塩の水溶液によって溶出される。このため、例えばＭ
ｏｎｏ Ｑカラム（ファルマシア製）などのイオン交換
体を充填したカラムによって、活性画分を吸着させ、塩
濃度勾配溶液等で溶出させることができる。得られた活
性画分は透析処理によって塩分を除去し、さらに逆相カ
ラムクロマトグラフィー等によって目的とする活性画分
を分離する。
るカゼインを出発物質として、これをプロテアーゼまた
はペプチダーゼで分解して得られる。分解に使用する酵
素としては、ペプシン、トリプシン、キモトリプシンな
どの動物性プロテアーゼ、微生物由来のプロテアーゼ、
カルボキシペプチダーゼなどのペプチダーゼを用いて行
うことができる。好ましくは、ペプチダーゼＲ（商品
名、天野製薬株式会社）などの微生物由来のペプチダー
ゼを用いることが好ましい。ペプチダーゼＲはリゾプス
由来のプロテナーゼ、ペプチダーゼを含有する酵素であ
る。酵素処理にあたっては、カゼインと酵素を反応温度
２５〜５０℃においてｐＨ３〜８で１〜２４時間反応さ
せ、カゼインの酵素分解物を得て、ついで酵素反応を加
熱処理あるいは酸処理等の適切な方法で停止させ、酵素
および未反応のカゼインを沈殿除去する。ペプチドを精
製するためには、溶媒抽出や限外濾過などの方法によっ
て目的の分子量１７，０００以下のペプチドを含有する
画分を得て、これをさらに高速液体クロマトグラフィー
等の手法によって精製することができる。本発明のペプ
チドは陰イオン交換体に吸着し、０．２８Ｍ以上の濃度
の塩の水溶液によって溶出される。このため、例えばＭ
ｏｎｏ Ｑカラム（ファルマシア製）などのイオン交換
体を充填したカラムによって、活性画分を吸着させ、塩
濃度勾配溶液等で溶出させることができる。得られた活
性画分は透析処理によって塩分を除去し、さらに逆相カ
ラムクロマトグラフィー等によって目的とする活性画分
を分離する。
【０００７】得られた精製ペプチドは、エドマン分解法
等によってそのＮ末端アミノ酸配列を確認し、本発明の
ペプチドを特定することができる。
等によってそのＮ末端アミノ酸配列を確認し、本発明の
ペプチドを特定することができる。
【０００８】得られたペプチドは、必要によって凍結乾
燥等の処理によって粉末化することができる。またペプ
チドは塩酸塩、硫酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石
酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の製
薬上許容される塩とすることもできる。
燥等の処理によって粉末化することができる。またペプ
チドは塩酸塩、硫酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石
酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の製
薬上許容される塩とすることもできる。
【０００９】本発明のペプチドは、そのまま、または食
品等に配合して経口的に投与することができる。投与に
あたっては、対象によって異なるが、通常１日当たり、
成人で１００ｍｇ以上投与することができる。本発明の
ペプチドは、カゼインを酵素分解した中に存在するもの
であり、安全性の高いものである。
品等に配合して経口的に投与することができる。投与に
あたっては、対象によって異なるが、通常１日当たり、
成人で１００ｍｇ以上投与することができる。本発明の
ペプチドは、カゼインを酵素分解した中に存在するもの
であり、安全性の高いものである。
【００１０】本発明ペプチドの作用である、小腸粘膜中
の二糖類分解酵素活性の促進作用はMillerの方法(Mille
r , The American Journal of Clinical Nutriton , Vo
l.34,pp.1153-1170,1981) に準じて以下の操作方法によ
って行った。 （１）基質の調製 ０．１Ｍマロン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で、
ラクトース、スークロースを０．２８Ｍ濃度に調製し、
使用直前まで凍結保存する。 （２）ＴＧ
Ｏ試薬の調製 ０．５Ｍトリス─塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍｌ
にグルコースオキシダーゼを４ｍｇ溶解させた溶液、９
５％エタノール８０ｇにトリトンＸを２０ｇ混合溶解さ
せた溶液１．０ｍｌ、３，３’−ジメトキシベンジジン
１％のエタノール溶液１．０ｍｌ、０．１％ペルオキダ
ーゼ水溶液０．５ｍｌを混合し、ＴＧＯ試薬として冷蔵
保存した。 （３）測定方法 ヒト由来培養細胞株ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ４０７（ＡＴ
ＣＣ ＣＣＬ６）またはラット小腸粘膜由来培養上皮細
胞ＩＥＣ１８（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８９）を、ＰＢＳ
で２回洗浄する。ついでこの細胞約１ｍｇを１０ｍｌの
試験管に取り、さらに基質３００μｌを各試験管に１５
秒間隔で加え３７℃で１時間反応させる。ついでＴＧＯ
試薬２ｍｌを１５秒間隔で各試験管に加え、３７℃で１
時間１５分反応させた後、基質溶液を細胞に加えたもの
をブランクとし、水を対照として４５０ｎｍの吸光度を
測定する。あらかじめ求めた検量線によって遊離してく
るグルコース量を得て、細胞蛋白質量を色素結合法（バ
イオラッド製、商品名：プロテインアッセイキット）に
よって求め、細胞蛋白質あたりの酵素活性を測定する。
酵素活性の測定方法は以下の式（１）によって求める。
の二糖類分解酵素活性の促進作用はMillerの方法(Mille
r , The American Journal of Clinical Nutriton , Vo
l.34,pp.1153-1170,1981) に準じて以下の操作方法によ
って行った。 （１）基質の調製 ０．１Ｍマロン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で、
ラクトース、スークロースを０．２８Ｍ濃度に調製し、
使用直前まで凍結保存する。 （２）ＴＧ
Ｏ試薬の調製 ０．５Ｍトリス─塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍｌ
にグルコースオキシダーゼを４ｍｇ溶解させた溶液、９
５％エタノール８０ｇにトリトンＸを２０ｇ混合溶解さ
せた溶液１．０ｍｌ、３，３’−ジメトキシベンジジン
１％のエタノール溶液１．０ｍｌ、０．１％ペルオキダ
ーゼ水溶液０．５ｍｌを混合し、ＴＧＯ試薬として冷蔵
保存した。 （３）測定方法 ヒト由来培養細胞株ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ４０７（ＡＴ
ＣＣ ＣＣＬ６）またはラット小腸粘膜由来培養上皮細
胞ＩＥＣ１８（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８９）を、ＰＢＳ
で２回洗浄する。ついでこの細胞約１ｍｇを１０ｍｌの
試験管に取り、さらに基質３００μｌを各試験管に１５
秒間隔で加え３７℃で１時間反応させる。ついでＴＧＯ
試薬２ｍｌを１５秒間隔で各試験管に加え、３７℃で１
時間１５分反応させた後、基質溶液を細胞に加えたもの
をブランクとし、水を対照として４５０ｎｍの吸光度を
測定する。あらかじめ求めた検量線によって遊離してく
るグルコース量を得て、細胞蛋白質量を色素結合法（バ
イオラッド製、商品名：プロテインアッセイキット）に
よって求め、細胞蛋白質あたりの酵素活性を測定する。
酵素活性の測定方法は以下の式（１）によって求める。
【００１１】
【数１】 ６０分間に遊離したグルコース（μｇ）／細胞蛋白質量（ｍｇ） ＝Ｅ（μｇ／ｍｇ）（１）
【００１２】酵素活性の促進は、各試験管に測定試料を
加え、この試料を入れた試験管を上記方法で測定し、遊
離グルコース量を得て、下記の式（２）によって求め
る。
加え、この試料を入れた試験管を上記方法で測定し、遊
離グルコース量を得て、下記の式（２）によって求め
る。
【００１３】
【数２】 （試料添加試験管の活性Es／対照試験管の活性Ec─１）／試料の蛋白量（ｍｇ） ×１００＝Ｓ（Ｕｎｉｔ） （２）
【００１４】以下に実施例を示しさらに本発明を詳細に
説明する。
説明する。
【実施例】 （実施例１）ヒト由来培養細胞株ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ
４０７（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６）またはラット小腸粘膜由
来培養上皮細胞ＩＥＣ１８（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８
９）をを１×１０4 細胞／ｃｍ2 底面積となるように、
２４ウェルマルチウェルプレート（コースター社）に播
き、５％ＣＯ2 雰囲気下で、３７℃で培養した。細胞が
コンフルエントもしくはサブコンフルエントに達した
ら、培養液に対して最大２０％になるように試料を加
え、１日から６日間培養した。膜消化酵素はラクター
ゼ、スクラーゼ活性を測定した。ラクターゼおよびスク
ラーゼ活性は上記に示したMillerによるDahlqvist の変
法で測定した。すなわち、培養容器から培養液を取り除
き、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）で軽く細胞表面を洗浄した
のち、ラクトースおよびスクロース溶液を基質として加
えた。３７℃で１時間反応させたのち、ＴＧＯ試薬
（０．００４％グルコースオキシダーゼ、０．０００５
％ペルオキシダーゼ、０．０１％３，３’─ジメトキシ
ベンジジン、０．２％トリトンＸ−１００を含む０．５
Ｍトリス─塩酸，ｐＨ７．０）を加え、１時間１５分発
色させ、反応液を波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定
した。試料の活性促進作用は、無添加対照に対する相対
比として上記に示した計算式によって求めた。この測定
法によって牛乳の小腸粘膜二糖類分解酵素促進作用を調
べたところ、ラクターゼ、スクラーゼ活性を亢進する作
用があることを確認した。さらに常法により全乳を脱脂
乳とクリームに分画し、クリームはさらにバターとバタ
ーミルクに分画した。脱脂乳とバターミルクに亢進作用
が存在した。
４０７（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６）またはラット小腸粘膜由
来培養上皮細胞ＩＥＣ１８（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８
９）をを１×１０4 細胞／ｃｍ2 底面積となるように、
２４ウェルマルチウェルプレート（コースター社）に播
き、５％ＣＯ2 雰囲気下で、３７℃で培養した。細胞が
コンフルエントもしくはサブコンフルエントに達した
ら、培養液に対して最大２０％になるように試料を加
え、１日から６日間培養した。膜消化酵素はラクター
ゼ、スクラーゼ活性を測定した。ラクターゼおよびスク
ラーゼ活性は上記に示したMillerによるDahlqvist の変
法で測定した。すなわち、培養容器から培養液を取り除
き、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）で軽く細胞表面を洗浄した
のち、ラクトースおよびスクロース溶液を基質として加
えた。３７℃で１時間反応させたのち、ＴＧＯ試薬
（０．００４％グルコースオキシダーゼ、０．０００５
％ペルオキシダーゼ、０．０１％３，３’─ジメトキシ
ベンジジン、０．２％トリトンＸ−１００を含む０．５
Ｍトリス─塩酸，ｐＨ７．０）を加え、１時間１５分発
色させ、反応液を波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定
した。試料の活性促進作用は、無添加対照に対する相対
比として上記に示した計算式によって求めた。この測定
法によって牛乳の小腸粘膜二糖類分解酵素促進作用を調
べたところ、ラクターゼ、スクラーゼ活性を亢進する作
用があることを確認した。さらに常法により全乳を脱脂
乳とクリームに分画し、クリームはさらにバターとバタ
ーミルクに分画した。脱脂乳とバターミルクに亢進作用
が存在した。
【００１５】脱脂乳を細口径０．１μｍの精密濾過（Ｍ
Ｆ）にてカゼイン画分と乳清画分に分画したところ、カ
ゼイン画分に促進作用が認められた。図１にカゼインの
添加量を１００μｌ（１．５ｍｇ）、３００μｌ（４．
５ｍｇ）と変えて測定した時の測定結果を示した。小腸
粘膜二糖類分解酵素促進作用は用量依存性を示した。バ
ターミルクにもカゼインが多量に含まれていることか
ら、バターミルク中の作用物質もカゼインによるものと
考えられた。
Ｆ）にてカゼイン画分と乳清画分に分画したところ、カ
ゼイン画分に促進作用が認められた。図１にカゼインの
添加量を１００μｌ（１．５ｍｇ）、３００μｌ（４．
５ｍｇ）と変えて測定した時の測定結果を示した。小腸
粘膜二糖類分解酵素促進作用は用量依存性を示した。バ
ターミルクにもカゼインが多量に含まれていることか
ら、バターミルク中の作用物質もカゼインによるものと
考えられた。
【００１６】（実施例２） 小腸粘膜二糖類分解酵素活性促進物質の製造 カゼインを蛋白質分解酵素で分解したところ、いくつか
の酵素分解物に亢進作用が残存した。このため亢進作用
はカゼイン分子の特定の構造によるものであることが明
らかとなった。そこで作用を示すカゼイン分子中のアミ
ノ酸配列を明確にするために、カゼインをペプチダーゼ
Ｒ（天野製薬）で酵素分解した。乳酸カゼイン（ニュー
ジーランドデイリーボード社）１ｋｇを１０ｌの水に懸
濁し、１Ｎの水酸化ナトリウムでｐＨを７．０に調整
し、カゼインの溶解液を得た。溶液を３７℃に保持した
のち、ペプチダーゼＲ酵素粉末を２０ｇ加え、１時間反
応させた。反応は１００℃で３０分保持することにより
停止させた。反応液を分画分子量１３０００の限外濾過
（ＵＦ；旭化成ＡＣＰ−１０１０）により透過液と濃縮
液に分画した。得られた透過液２００ｍｌに対し４０％
濃度となるように硫酸アンモニウムを加え、１５０００
×ｇ、３０分の遠心分離によって沈殿画分と上清画分に
分けた。両画分は蒸留水に対して透析をおこなった。３
７ｍｌの沈殿と３６０ｍｌの上清液を得た。蛋白質濃度
はそれぞれ１８．２ｍｇ／ｍｌと２．７ｍｇ／ｍｌであ
った。これらの画分のうち、上清液に酵素活性促進作用
がみとめられた。
の酵素分解物に亢進作用が残存した。このため亢進作用
はカゼイン分子の特定の構造によるものであることが明
らかとなった。そこで作用を示すカゼイン分子中のアミ
ノ酸配列を明確にするために、カゼインをペプチダーゼ
Ｒ（天野製薬）で酵素分解した。乳酸カゼイン（ニュー
ジーランドデイリーボード社）１ｋｇを１０ｌの水に懸
濁し、１Ｎの水酸化ナトリウムでｐＨを７．０に調整
し、カゼインの溶解液を得た。溶液を３７℃に保持した
のち、ペプチダーゼＲ酵素粉末を２０ｇ加え、１時間反
応させた。反応は１００℃で３０分保持することにより
停止させた。反応液を分画分子量１３０００の限外濾過
（ＵＦ；旭化成ＡＣＰ−１０１０）により透過液と濃縮
液に分画した。得られた透過液２００ｍｌに対し４０％
濃度となるように硫酸アンモニウムを加え、１５０００
×ｇ、３０分の遠心分離によって沈殿画分と上清画分に
分けた。両画分は蒸留水に対して透析をおこなった。３
７ｍｌの沈殿と３６０ｍｌの上清液を得た。蛋白質濃度
はそれぞれ１８．２ｍｇ／ｍｌと２．７ｍｇ／ｍｌであ
った。これらの画分のうち、上清液に酵素活性促進作用
がみとめられた。
【００１７】さらに上清液を陰イオン交換カラムで分離
した。０．０２Ｍのトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７．２で
平衡化したＭｏｎｏ Ｑ（ファルマシア社，ＦＰＬＣシ
ステム）に上清液１０ｍｌを添加し、塩化ナトリウム濃
度０から１Ｍのグラジェントで溶出したピークを分取し
た。なおモニターは、２８０ｎｍの吸収で行った。この
操作を繰り返し、計５０ｍｌの上清液をカラムに添加し
た。得られた画分について、上記の方法によって、小腸
粘膜二糖類分解酵素活性促進作用を測定した。測定結果
を図２に示した。Ｍｏｎｏ Ｑによって分画したフラク
ションの４番目の画分（Ｆｒ．ＩＶ、図３）に酵素活性
促進活性がみとめられた。またこのフラクションをＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲルによる電気泳動を行ったとこ
ろ１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、１７ｋＤａの３本のバンド
が観察された。次に、Ｆｒ．ＩＶを逆相クロマトグラフ
ィーによってさらに分離精製を行った。Ｃ１８カラム
（バイダック社製 ２１８Ｐ５２ ０．２１×２５ｃ
ｍ）を装着したＨＰＬＣを用い、これにＦｒ．ＩＶを２
６０μｇ負荷し、０．１％トリフルオロ酢酸含有アセト
ニトリルの、０〜６５％の直線濃度勾配で、０．２ｍｌ
／分の流速で溶出を行った。２２０ｎｍの吸収による溶
出パターンを図４に示した。各フラクションを分取し、
ＳＤＳポリアクリルアミドゲルによる電気泳動を行った
ところ、ピーク９に１７ｋＤａのバンドが、そしてピー
ク７に１０ｋＤａと１５ｋＤａのバンドが検出された。
図５にカゼイン、Ｆｒ．ＩＶ、ピーク７、ピーク９の
ＳＤＳポリアクリルアミドゲルによる電気泳動パターン
を示した。
した。０．０２Ｍのトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７．２で
平衡化したＭｏｎｏ Ｑ（ファルマシア社，ＦＰＬＣシ
ステム）に上清液１０ｍｌを添加し、塩化ナトリウム濃
度０から１Ｍのグラジェントで溶出したピークを分取し
た。なおモニターは、２８０ｎｍの吸収で行った。この
操作を繰り返し、計５０ｍｌの上清液をカラムに添加し
た。得られた画分について、上記の方法によって、小腸
粘膜二糖類分解酵素活性促進作用を測定した。測定結果
を図２に示した。Ｍｏｎｏ Ｑによって分画したフラク
ションの４番目の画分（Ｆｒ．ＩＶ、図３）に酵素活性
促進活性がみとめられた。またこのフラクションをＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲルによる電気泳動を行ったとこ
ろ１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、１７ｋＤａの３本のバンド
が観察された。次に、Ｆｒ．ＩＶを逆相クロマトグラフ
ィーによってさらに分離精製を行った。Ｃ１８カラム
（バイダック社製 ２１８Ｐ５２ ０．２１×２５ｃ
ｍ）を装着したＨＰＬＣを用い、これにＦｒ．ＩＶを２
６０μｇ負荷し、０．１％トリフルオロ酢酸含有アセト
ニトリルの、０〜６５％の直線濃度勾配で、０．２ｍｌ
／分の流速で溶出を行った。２２０ｎｍの吸収による溶
出パターンを図４に示した。各フラクションを分取し、
ＳＤＳポリアクリルアミドゲルによる電気泳動を行った
ところ、ピーク９に１７ｋＤａのバンドが、そしてピー
ク７に１０ｋＤａと１５ｋＤａのバンドが検出された。
図５にカゼイン、Ｆｒ．ＩＶ、ピーク７、ピーク９の
ＳＤＳポリアクリルアミドゲルによる電気泳動パターン
を示した。
【００１８】ピーク７および９のフラクションを用い
て、Ｆｒ．ＩＶに含まれている作用ペプチドのアミノ酸
配列をエドマン分解で決定した。配列は４７７Ａおよび
１２０Ａ型気相自動シーケンサー（アプライド・バイオ
システム・インコーポレーテッド製）による分析の結
果、配列表配列番号１及び配列表配列番号２の配列をＮ
末端アミノ酸配列として含むことが明らかとなった。こ
のＮ末端アミノ酸配列は、１７ｋＤａのペプチドの場合
は公知のαs-1 カゼインの２５番目から５４番目の残基
に一致し、１０または１５ｋＤａのペプチドの場合は公
知のβカゼインの１番目から９番目の残基に一致するこ
とが判明した。またこの１７ｋＤａのペプチドのアミノ
酸配列で、６番目の残基はＧｌｕであったが、遺伝子の
変異によってＧｌｎとなるものも存在することが、ＤＮ
Ａ配列から明らかとなった。
て、Ｆｒ．ＩＶに含まれている作用ペプチドのアミノ酸
配列をエドマン分解で決定した。配列は４７７Ａおよび
１２０Ａ型気相自動シーケンサー（アプライド・バイオ
システム・インコーポレーテッド製）による分析の結
果、配列表配列番号１及び配列表配列番号２の配列をＮ
末端アミノ酸配列として含むことが明らかとなった。こ
のＮ末端アミノ酸配列は、１７ｋＤａのペプチドの場合
は公知のαs-1 カゼインの２５番目から５４番目の残基
に一致し、１０または１５ｋＤａのペプチドの場合は公
知のβカゼインの１番目から９番目の残基に一致するこ
とが判明した。またこの１７ｋＤａのペプチドのアミノ
酸配列で、６番目の残基はＧｌｕであったが、遺伝子の
変異によってＧｌｎとなるものも存在することが、ＤＮ
Ａ配列から明らかとなった。
【００１９】
【発明の効果】本発明により小腸粘膜に存在する二糖類
分解酵素活性を促進するペプチドが提供される。本発明
ペプチドは、食品や医薬品として使用することができ
る。
分解酵素活性を促進するペプチドが提供される。本発明
ペプチドは、食品や医薬品として使用することができ
る。
【００２０】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Val Ala Pro Phe Pro Glu Val Phe Gly Lys Glu Lys Val Asn Glu Leu 1 5 10 15 Ser Lys Asp Ile Gly Ser Glu Ser Thr Glu Asp Gln Ala Met 20 25 30
【００２１】配列番号：２ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００２２】
【図１】カゼインが小腸粘膜中のラクターゼ活性を促進
することを確認した結果を示す。
することを確認した結果を示す。
【図２】カゼインおよびカゼインの酵素分解物が、ラク
ターゼ活性を促進することを確認した結果を示す。
ターゼ活性を促進することを確認した結果を示す。
【図３】カゼインの酵素分解物を陰イオン交換体によっ
て分画したクロマトグラフィーパターンを示す。
て分画したクロマトグラフィーパターンを示す。
【図４】カゼインの酵素分解物に存在する活性画分を逆
相クロマトグラフィーによって分画したパターンを示
す。
相クロマトグラフィーによって分画したパターンを示
す。
【図５】活性画分のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動パターンを示す。図中の１は分子量標準、２はカゼ
イン、３はＦｒ．ＩＶ、４はピーク７、５はピーク９、
６は分子量標準をそれぞれ示す。
泳動パターンを示す。図中の１は分子量標準、２はカゼ
イン、３はＦｒ．ＩＶ、４はピーク７、５はピーク９、
６は分子量標準をそれぞれ示す。
Claims (3)
- 【請求項１】カゼインを酵素分解して得られ、小腸粘膜
に存在する二糖類分解酵素活性を促進させることを特徴
とする分子量１７ｋＤａ以下のペプチド。 - 【請求項２】下記特性を有し、小腸粘膜に存在する二糖
類分解酵素活性を促進させるペプチド。 （１）Ｎ末端アミノ酸配列 Val-Ala-Pro-Phe-Pro-Xaa-Val-Phe-Gly-Lys-Glu-Lys-Va
l-Asn-Glu-Leu-Ser-Lys-Asp-Ile-Gly-Ser-Glu-Ser-Thr-
Glu-Asp-Gln-Ala-Met- ( なおXaa はGln またはGlu のいずれかを表す ) （２）分子量 ＳＤＳ─ＰＡＧＥによる分子量：約１７ｋＤ （３）陰イオン交換体に吸着し、０．２８Ｍ以上の濃度
の塩溶液で溶出される （４）小腸粘膜上皮細胞のラクターゼ活性およびスクラ
ーゼ活性を促進させる - 【請求項３】下記特性を有し、小腸粘膜に存在する二糖
類分解酵素活性を促進させるペプチド。 （１）Ｎ末端アミノ酸配列 Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro- （２）分子量 ＳＤＳ─ＰＡＧＥによる分子量：約１５ｋＤa または１
０ｋＤa （３）陰イオン交換体に吸着し、０．２８Ｍ以上の濃度
の塩溶液で溶出される （４）小腸粘膜上皮細胞のラクターゼ活性およびスクラ
ーゼ活性を促進させる
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7056965A JPH08245690A (ja) | 1995-03-16 | 1995-03-16 | 二糖類分解酵素活性促進ペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7056965A JPH08245690A (ja) | 1995-03-16 | 1995-03-16 | 二糖類分解酵素活性促進ペプチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08245690A true JPH08245690A (ja) | 1996-09-24 |
Family
ID=13042249
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7056965A Pending JPH08245690A (ja) | 1995-03-16 | 1995-03-16 | 二糖類分解酵素活性促進ペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08245690A (ja) |
-
1995
- 1995-03-16 JP JP7056965A patent/JPH08245690A/ja active Pending
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Legal Events
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040210 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
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|
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|
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|
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20041207 |