JPH0824569B2 - ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ誘導体およびその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、生体に有毒なスーパーオキシドを分解する
スーパーオキシドジスムターゼの酵素活性を概ね保持し
たままで該スーパーオキシドジスムターゼに比べて大幅
に延長された血中半減期を有する新規なスーパーオキシ
ドジスムターゼ誘導体およびその製造法に関する。

本発明により提供されるスーパーオキシドジスムター
ゼ誘導体は活性酵素ラジカルが関与する種々の疾患に対
して有効であり、特に抗炎症剤、抗虚血障害剤、抗脳浮
腫剤、抗パラコート中毒剤として使用することができ
る。また該スーパーオキシドジスムターゼ誘導体は虚血
性疾患治療剤または活性酸素ラジカルに起因する制癌剤
の副作用を軽減するための医薬としても有用である。

従来の技術 従来、スーパーオキシドジスムターゼ〔以下、これを
SODと略記する〕は動物、植物、微生物などの生体内に
広く存在し、生体に有害なスーパーオキシドを分解する
酵素として知られている。最近、単離されたSODを抗炎
症剤として用いようとする試みがなされている〔フアル
マシア、17巻411頁（1981年）およびカレント・セラポ
イテイツク・リサーチ（Current Therapeutic Researc
h）、16巻706頁（1974年）参照〕。

SODを静脈内投与した場合、その血中半減期は僅か４
〜６分とされており、SODは速かに尿中に排泄代謝され
る。SODの血中半減期を延長させるためにSODをフイコー
ル、ポリエチレングリコールまたはラツトアルブミンで
修飾し、巨大分子化することが試みられてきたが、フイ
コールまたはポリエチレングリコールで修飾されたSOD
ではSODの酵素活性が大幅に低下し、またラツトアルブ
ミンで修飾されたSODには抗原性があることが報告され
ている。またイヌリンで修飾されたSODではSODに比べて
酵素活性の低下が認められるが、その血中半減期は大幅
に延長されることが知られている〔特開昭58−32826号
公報参照〕。

発明が解決しようとする問題点 従来知られている種々の修飾SODはすでに報告されて
いる上記の理由、または巨大分子化に伴う組織内浸透性
の低下などの点でいずれも実用上問題がある。

しかして、本発明の１つの目的は、SODの酵素活性を
概ね保持したままで該SODに比べて大幅に延長された血
中半減期を有する新規な非巨大分子化スーパーオキシド
ジスムターゼ誘導体を提供するにある。

本発明の他の１つの目的は、上記のスーパーオキシド
ジスムターゼ誘導体の製造法を提供するにある。

問題点を解決するための手段 本発明によれば、上記の１つの目的は、式 〔SOD〕〔Z〕_X 〔式中、〔SOD〕はアミノ基に換えてアミノ基から１個
の水素原子を除いた基を１ないし６個有するスーパーオ
キシドジスムターゼを表わし、〔Ｚ〕は または （これらの式中、R¹、R³およびR⁵はそれぞれ水素原子ま
たはメチル基を表わし、R²は水素原子、塩素原子、臭素
原子またはメチル基を表わし、R⁴は水素原子または炭素
数１ないし５のアルキル基を表わし、R⁶はメチル基また
はエチル基を表わす）で示される基からなる群から選ば
れる基、 （式中、R⁷は水素原子を表わすか、または炭素数１ない
し４のアルカノール、炭素数１ないし４のアルキル基部
分を含むエチレングリコールモノアルキルエーテルもし
くは炭素数１ないし４のアルキル基部分を含むグリセリ
ンジアルキルエーテルから水酸基を除いた残基を表わ
す）で示される基および （式中、カルボニル基の炭素原子の結合手は〔SOD〕と
結合するものであることを意味する）で示される基を構
成単位とし、かつ平均分子量が800ないし20000である共
重合体の一価の基を表わし、Ｘは〔SOD〕が有するアミ
ノ基から１個の水素原子を除いた基の数に対応する１な
いし６の整数を表わす〕 で示されるスーパーオキシドジスムターゼ誘導体（以
下、これをSOD誘導体と称す）を提供することによつて
達成される。

また本発明によれば、上記の他の１つの目的は、SOD
と または （これらの式中、R¹、R³およびR⁵はそれぞれ水素原子ま
たはメチル基を表わし、R²は水素原子、塩素原子、臭素
原子またはメチル基を表わし、R⁴は水素原子または炭素
数１ないし５のアルキル基を表わし、R⁶はメチル基また
はエチル基を表わす）で示される基からなる群から選ば
れる基、 （式中、R⁷は水素原子を表わすか、または炭素数１ない
し４のアルカノール、炭素数１ないし４のアルキル基部
分を含むエチレングリコールモノアルキルエーテルもし
くは炭素数１ないし４のアルキル基部分を含むグリセリ
ンジアルキルエーテルから水酸基を除いた残基を表わ
す）で示される基および で示される基を構成単位とし、かつ平均分子量が800な
いし20000である共重合体（以下、これを共重合体と略
称する）とをpH7〜11のアルカリ水溶液中で反応させる
ことを特徴とする上記のSOD誘導体の製造法を提供する
ことによつて達成される。

SODと共重合体との反応は、通常炭酸ナトリウム、重
炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムな
どの塩の水溶液中にSODを溶解し、得られた溶液に粉末
状の共重合体またはジメチルスルホキシドなどの有機溶
媒に溶解した共重合体を添加することにより行われる。
反応中、溶液のpHは７〜11に維持されていることが必要
であり、pHが７より低い場合には、共重合体の溶解性が
低下して反応は進行しない。また、pHが11より高い場合
には、SODの酵素活性が失活して本発明の目的とするSOD
誘導体を得ることはできない。反応温度としては、約３
〜50℃が好ましく、３〜40℃がさらに好ましい。また、
反応時間は反応温度、共重合体の添加方法により異なる
が、通常10分〜３時間である。共重合体の使用量はSOD1
モルに対して約0.5〜30モルの範囲である。この使用量
によつてSODに結合される共重合体の分子数を調整する
ことができる。

このようにして得られた反応液にはSOD誘導体と未反
応のSODおよび共重合体などが存在するが、かかる反応
液を濾過し、濾液をゲル濾過し、得られるSOD誘導体を
含む溶出液を必要に応じてハイドロフオービツク・クロ
マトグラフイーに付したのち限外濾過に対することによ
り濃縮したのち、凍結乾燥することによりSOD誘導体の
固型物を取得することができる。

上記の反応により、SODが有するアミノ基と共重合体
が有する無水マレイン酸環とが結合し、SOD誘導体が生
成する。例えば、ヒト型SODには１分子当りアミノ基が2
2個（ヒト赤血球型SODまたは酵母にて遺伝子組換え操作
により得られたヒト型SOD）または24個（大腸菌にて遺
伝子組換え操作により得られたヒト型SOD）存在する
が、上記の反応により、いずれかのアミノ基と共重合体
が有する１個の無水マレイン酸環とが反応し、SODの１
分子当り共重合体が１〜６分子結合したSOD誘導体が得
られる。原料として用いる共重合体には１分子中に通常
無水マレイン酸環が平均0.5〜２個存在するが、これら
の無水マレイン酸環のなかの１個がSODのアミノ基と結
合した場合、残りの無水マレイン酸環はさらに別のアミ
ノ基と反応することは少なく、水と反応して開環して で示されるマレイン酸由来の基となり易い。したがつ
て、SOD誘導体の構成単位には前記（ロ）の式においてR
⁷が水素原子である基も包含される。また原料として部
分半エステル化共重合体を用いる場合には、得られるSO
D誘導体の構成単位に前記（ロ）の基として上記のマレ
イン酸由来の基が半エステル化されたものだけでなく、
少量の該マレイン酸由来の基が含まれる。共重合体の１
分子とSODの複数分子とが反応して該共重合体の複数個
の無水マレイン酸環と各SODのアミノ基とがそれぞれ結
合した化合物が副生する可能性があるが、かかる副生物
が少量混入したSOD誘導体を本発明のSOD誘導体の医薬用
途に用いることに不都合はない。しかしながら、医薬の
有効成分化合物は単一の化学構造を有する化合物である
ことが好ましい状況にあることを考慮すれば、上記の副
生物の混入量が多いSOD誘導体については、これをゲル
濾過などの操作に付することにより該副生物を除外して
医薬の有効成分化合物として用いることが好ましい。ま
た、上記の反応によつて得られるSOD誘導体はSODに種々
の分子数の共重合体が結合して得られたものの混合物で
あり、それら個々のSOD誘導体のSODに結合している共重
合体の分子数は同一ではない。したがつて、本発明のSO
D誘導体を表わす前記式において、ＸはSOD1分子に結合
する共重合体分子数の平均値を表わすことを意味する。
しかしながら、SOD誘導体としてSODに結合する共重合体
の分子数が同数のSOD誘導体が所望される場合には、前
記の方法により得られるSOD誘導体をさらにゲル濾過な
どの操作に付することにより所望のSOD誘導体を取得す
ることが可能である。なお、前記の反応および反応後の
処理において、SOD誘導体が有するカルボキシル基がア
ルカリ金属塩またはアンモニウム塩を形成する可能性が
あるが、かかる塩を形成したカルボキシル基を有するSO
D誘導体も本発明のSOD誘導体に包含される。

SOD誘導体の酵素活性はSODに結合する共重合体の分子
数が増加するに従つて徐々に低下する傾向にある。SOD
に７分子以上の共重合体が結合したSOD誘導体の酵素活
性は低くなりすぎ、かかる誘導体は医薬の有効成分化合
物としては不適当である。SODに１〜３分子の共重合体
が結合したSOD誘導体は酵素活性を高く保持しており、
かつ血中半減期が延長されるなどの特長を有するので特
に好ましい。

原料として用いられるSODは、動物（ヒト、ウシな
ど）、植物、微生物などの生物中に含まれているものを
公知の方法によりそれぞれの生物体から抽出されたも
の、または遺伝子工学の手法を用いて取得されたものな
どである。SODの化学構造（配位金属、分子量、アミノ
酸配列など）はかなり解明されてきており、SODはFe配
位SOD、Mn配位SOD、Cu・Zn配位SODの３種類に分類さ
れ、存在している生体組織によつて異なるが３万〜８万
の分子量を有している。SODのアミノ酸配列も存在して
いる生体組織によつて若干相異しているが、その詳細は
スーパーオキサイドと医薬74−90（大柳善彦著、共立出
版刊、昭和56年５月25日発行）；ジヤーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー（Journal of Biological
Chemistry），246,2875〜2880（1971）；同250,6107〜6
112（1975）；プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナシヨ
ナル・アカデミイ・オブ・サイエンシス（Proceedings
of the National Academy of Sciences）70,3725〜3729
（1973）；アルカイブス・オブ・バイオケミストリー・
アンド・バイオフイジツクス（Archives of Biochemist
ry and Biophysics）179,243〜256（1977）などの文献
の記載を参照されたい。原料のSODとしてはヒト型のCu
・Zn配位SODが好ましい。このものは分子量約3.3万を有
し、また分子中に22個または24個のアミノ基を有する。
ヒト型SODは、例えば、ヒトの血液を順次熱処理、イオ
ン交換、ゲル濾過に付することにより、また遺伝子工学
の手法を用いることによつて取得される。

また原料として用いる共重合体は、上記（イ）の構成
単位に対応する単量体と無水マレイン酸との共重合体を
部分加水分解〔少量（１分子当り平均0.5〜２個）の無
水マレイン酸環が残存し、他の無水マレイン酸環は加水
分解〕することにより、また上記（イ）の構成単位に対
応する単量体と無水マレイン酸との共重合体をアルコー
ルで部分半エステル化〔少量（１分子当り平均0.5〜２
個）の無水マレイン酸環が残存し、他の無水マレイン酸
環は半エステル化〕することにより得られる。このよう
にして得られる共重合体として、例えば、部分加水分解
されたスチレン、ｐ−クロロスチレン、ｐ−ブロムスチ
レンまたはα−メチルスチレンと無水マレイン酸との共
重合体； 部分半エステル化（メチルエステル、エチルエステル、
プロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、メトキシエチ
ルエステル、エトキシエチルエステル、プロポキシエチ
ルエステル、２−ブトキシエチルエステル、1,3−ジメ
トキシ−２−プロピルエステル、2,3−ジメトキシ−１
−プロピルエステル、1,3−ジエトキシ−２−プロピル
エステル、２−エキトシ−３−メトキシ−１−プロピル
エステル、1,3−ジプロポキシ−２−プロピルエステ
ル、1,3−ジブトキシ−２−プロピルエステルなど）さ
れたスチレン、ｐ−クロロスチレン、ｐ−ブロムスチレ
ンまたはα−メチルスチレンと無水マレイン酸との共重
合体； 部分加水分解されたエチレン、プロピレン、α−ブチレ
ン、イソブチレン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブ
テン、１−ヘキセンまたは１−ヘプテンと無水マレイン
酸との共重合体； 部分半エステル化（エステルの例示は上記と同様、以下
同じ）されたエチレン、プロピレン、α−ブチレン、イ
ソブチレン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、
１−ヘキセンまたは１−ヘプテンと無水マレイン酸との
共重合体； 部分加水分解された酢酸ビニルと無水マレイン酸との共
重合体； 部分半エステル化された酢酸ビニルと無水マレイン酸と
の共重合体； 部分加水分解された（メタ）アクリル酸メチルと無水マ
レイン酸との共重合体； 部分半エステル化された（メタ）アクリル酸メチルと無
水マレイン酸との共重合体； 部分加水分解された（メタ）アクリル酸エチルと無水マ
レイン酸との共重合体； 部分半エステル化された（メタ）アクリル酸エチルと無
水マレイン酸との共重合体などが挙げられる。

これらの共重合体はいずれも疎水性基と親水性基の両
者を持つことによる適度な疎水性を有し、かつ極性の高
いカルボキシル基を有する。したがつて、かかる共重合
体が結合しているSOD誘導体は血清蛋白および生体膜と
の可逆的な結合性を有しており、このことにより血中半
減期が延長され、また臓器への移行性が良好となる。な
かでも構成単位（イ）としてスチレン由来の基を有する
SOD誘導体および構成単位（ロ）として半エステル化さ
れた基を有するSOD誘導体は疎水性がより高く、これら
の効果を発現する点で好ましい。

共重合体において、構成単位（イ）と構成単位（ロ）
および（ハ）の構成モル比「（イ）／（ロ）＋（ハ）」
は実質的に約１〜1.3の範囲であることが好ましく、通
常は１である。構成モル比が１よりも小さいものは構成
単位（イ）に相当する単量体と無水マレイン酸との共重
合で得ることは困難である。また、構成モル比が1.3よ
りも大きいものは、構成単位（ロ）が半エステル化され
たものである場合、かかる共重合体を塩の水溶液中に溶
解させてSODと反応させる際に、共重合体の水溶液への
溶解性が不良となるので好ましくない。

上記の共重合体はいずれも公知のものであり、それら
の重量平均分子量は通常800〜20000の範囲である。これ
らの共重合体から得られるSOD誘導体の疾患局所への移
行性の点から、共重合体の重量平均分子量は3000以下で
あることが好ましい。共重合体の分子量分布については
特に制限はない。上記の構成単位（イ）に相当する単量
体と無水マレイン酸とをラジカル共重合することにより
得られる共重合体（重量平均分子量／数平均分子量との
比が約2.0またはそれ以上のもの）を分別することな
く、そのまま部分加水分解または部分半エステル化した
ものを原料として用いることもできるし、また分別して
分子量分布を狭くしたものを部分加水分解または部分半
エステル化して原料として用いてもよい。

次に、SOD誘導体の薬理学的特性についての試験例を
示す。

試験例１ 局所pHが低下した組織へのSOD誘導体の特異的集積作
用 マウス（20g）の左側大腿筋に0.15Mのヘペス（HEPE
S）バツフアー（pH6.0）を0.2ml、また右側大腿筋に生
理食塩水を0.2mlそれぞれ筋肉内投与した直後に、合成
例２の記載の方法に準じて調製した¹²⁵I標識SOD誘導体
（14nmol）、または合成例２で用いたBu−SMA（部分半
ブチルエステル化したスチレン−無水マレイン酸共重合
体を意味する。以下、本明細書において同じ。）と同様
の³H標識Bu−SMA（0.22μmol）を静脈内投与し、経時的
に左右の大腿筋に集積した放射活性を測定した。結果を
第13図に示す。右側大腿筋（コントロール側）に比べ
て、左側大腿筋（酸性側）の放射活性は有意に高い。こ
のことから、合成例２で得られるSOD誘導体はBu−SMAが
結合していることによつて酸性組織（炎症局所のpHは低
下している）へ選択的に取りこまれることがわかる。

試験例２ 抗虚血障害作用および抗炎症作用 試験方法 SD系雄性ラツト（体重200g）を一晩絶食させたのち、
１群６匹としてストレスケージに入れて拘束し、ラツト
の胸から下を22℃の水に浸漬し、ラツトにストレスを負
荷した。かかるストレス負荷により、ラツトの胃粘膜で
の血流量が減少し、局所的虚血が起こる結果、急性炎症
が誘起され、潰瘍が発生する。上記のストレス負荷の２
時間後、４時間後および６時間後にラツトを水から引揚
げて殺し、胃を摘出した。胃内腔に10％ホルマリンを注
入して組織を固定した。固定後、粘膜面の線状潰瘍の長
さを測定し、その総和を潰瘍係数（Ulcer Index）とし
て表示した。

なお、被検化合物はラツトに水浸拘束直前に投与し
た。コントロール群には0.5mlの生理食塩水を、また試
験群には1mg/ラツトのSODまたは後述の合成例２で得ら
れたSOD誘導体を0.5mlの生理食塩水溶液としてそれぞれ
静脈内投与（i.v.）した。

試験結果 得られた潰瘍係数（mm/tissue）をストレス負荷時間
とともに第14図に示す。第14図において○印および△印
はそれぞれコントロール群およびSOD誘導体投与群の試
験結果を表わす。なお、SOD投与群の試験結果はコント
ロール群のものとほぼ同時であつたため図中に表示する
ことを省略する。

SOD投与群には潰瘍の発生を抑制する作用は全く認め
られなかつたが、合成例２で得られたSOD誘導体の投与
群では潰瘍の発生が顕著に抑制されていることは第14図
から明らかである。

このようにSOD誘導体は局所組織のpHが低下する疾患
における抗虚血障害剤、抗炎症剤として優れた特性を有
する。

試験例３ 抗脳浮腫作用 ラツト（200g）の右大脳半球を頭髄骨外側から液体窒
素にて30秒間処理すると著明な右側性脳浮腫が起こる。
このラツトに0.2μmolの試験例１で用いたと同じ³H標識
Bu−SMAを静脈内投与すると、浮腫を起こしてpHが低下
した病巣側に放射活性の特異的集積が起こつた〔第15図
（２）参照〕。また、このラツトに27nmolの試験例１で
用いたと同じ¹²⁵I標識SOD誘導体を静脈内投与すると、
障害側に放射活性の特異的集積が見られた〔第15図
（１）参照〕。このことにより、Bu−SMAが結合した合
成例２で得られるSOD誘導体は脳障害局所へよく集積す
ることがわかる。なお、SOD誘導体の集積により浮腫の
発現は著明に低下した。

試験例４ 抗酸素毒性作用 マウス（20g）に200mg/kgのパラコートを腹腔内投与
すると、酸素ラジカルが発生し、肝細胞障害が起こり、
血中のGOTレベルが著明に増加する。このパラコート処
理マウスに20mg/kgの前記と同じSOD誘導体を静脈内投与
すると血中GOTの増加が顕著に抑えられた（第16図参
照）。Bu−SMAが結合していないSODを投与した場合に
は、この様な保護効果が認められず、血中のGOTレベル
はコントロール群のそれと差がなかつた。

また、SOD誘導体は毒性試験においても低毒性である
ことが確認されている。

以上の結果より、SOD誘導体は活性酸素ラジカルが関
与する種々の疾患に対して有効であり、特に抗炎症剤、
抗虚血障害剤、抗脳浮腫剤、抗パラコート中毒剤として
使用することができる。

さらにSOD誘導体は虚血性心疾患治療剤または活性酸
素ラジカルに起因する制癌剤の副作用を軽減するための
医薬としても有用である。

SOD誘導体の投与量は疾病、患者の重篤度、薬物に対
する忍容性などにより異なるが、通常成人１日あたり0.
1〜500mg、好ましくは0.5〜100mgの量であり、これを１
回または分割して投与するのがよい。投与に際しては投
与ルートに適した任意の形態をとることができる。

SOD誘導体は任意慣用の製剤方法を用いて投与用に調
製することができる。SOD誘導体を少なくとも１種含有
する医薬組成物は任意所要の製薬用担体、賦形剤などの
医薬上許容される添加剤などを使用して慣用の手段によ
つて調製される。

この組成物が経口用製剤である場合には、該製剤は消
化管からの吸収に好適な形態で提供されるのが望まし
い。経口投与の錠剤およびカプセルは単位量投与形態で
あり、結合剤、例えばシロツプ、アラビアゴム、ゼラチ
ン、ソルビツト、トラガカント、ポリビニルピロリドン
など；賦形薬、例えば乳糖、とうもろこし澱粉、りん酸
カルシウム、ソルビツト、グリシンなど；潤滑剤、例え
ばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレング
リコール、シリカなど；崩壊剤、例えば馬鈴薯澱粉な
ど；または許容し得る潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナト
リウムなどのような慣用の賦形剤を含有していてもよ
い。錠剤は当業界において周知の方法でコーテイングし
てもよい。経口用液体製剤は水性または油性懸濁剤、溶
液、シロツプ、エリキシル剤、その他であつてもよく、
あるいは使用する前に水または他の適当なビヒクルで再
溶解させる乾燥生成物であつてもよい。このような液体
製剤は普通に用いられる添加剤、例えば懸濁化剤、例え
ばソルビツトシロツプ、メチルセルロース、グルコース
／糖シロツプ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロー
ス、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミ
ニウムゲル、水素化食用脂など；乳化剤、例えばレシチ
ン、モノオレイン酸ソルビタン、アラビアゴムなど；非
水性ビヒクル、例えばアーモンド油、分別ココナツト
油、油性エステル、プロピレングリコール、エチルアル
コールなど；防腐剤、例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸メ
チル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、ソルビン酸な
どを含有してもよい。

また注射剤を調製する場合には、SOD誘導体を生理食
塩水、注射用ブトウ糖液などの溶剤に溶解し、SOD誘導
体２〜20mg/溶剤２〜10mlの濃度に調整し、常法により
皮下、筋肉内、静脈内注射剤とする。調製時に必要によ
り水溶液にpH調整剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤、可溶
化剤などを添加することができる。

上記の医薬組成物は、その形態等に依存して、SOD誘
導体を一般に約0.01〜50重量％、好ましくは約0.1〜20
重量％の濃度で含有することができる。

実施例 以下に、実施例により本発明を説明する。なお、本発
明はこれらの実施例により限定されるものではない。

参考例１ スチレン−無水マレイン酸共重合体の合成 無水マレイン酸383g（3.9mole）をクメン3.7lに加え
てクメン還流下に攪拌した。この溶液にジクミルパーオ
キシド16.3g（60mmole）およびスチレン203g（1.95mol
e）をクメン1.7lに溶解させて得られた溶液を約40分間
を要して徐々に滴下した。滴下終了後、１時間加熱攪拌
を続けた。得られた反応液を一夜静置し、上澄液を除去
したのち、容器に付着した粘稠生成物をアセトンに溶解
させて回収した。得られた回収液からアセトンを減圧下
に留去してスチレン−無水マレイン酸共重合体（以下、
これをSMAと略称する）を353g得た。

SMAの分別 上記の方法で得られたSMA120.0gをアセトン3lに溶解
し、この溶液にｎ−ヘキサン4.9lを攪拌下に約１時間で
滴下した。白濁したアセトンとｎ−ヘキサンとの混合液
を別の容器に移し、この混合液にｎ−ヘキサン9.74lを
攪拌下に約1.5時間で滴下した。容器の器壁に付着した
アメ状物をアセトンに溶解させて回収した。得られた回
収液からアセトンを減圧下に留去したのち、70〜80℃の
温度で一夜真空乾燥を行い、SMAの分別沈殿物を49.2g得
た。

このようにして得られたSMAの分別沈殿物40.0gをアセ
トン１に溶解し、この溶液に表面シラン処理をしたガ
ラスビーズ（平均粒径0.1mm）3.8kgを加えたのち、アセ
トンを蒸発させることによりガラスビーズ表面にSMAを
付着させた。

内径80mm、長さ80cmのカラムに上記のSMAを付着した
ガラスビーズおよびアセトンとｎ−ヘキサンとの混合液
（25℃における容積比が24:76であるもの）1.4lを充填
したカラム系の温度を25℃に保ちつつ２種の容積比のア
セトンとｎ−ヘキサンとの混合液〔アセトンとｎ−ヘキ
サンとの25℃における容積比が（ｉ）24:76の混合液1.6
lおよび（ii）37:63の混合液6.0lの順で〕、ついでアセ
トン3.0lの順でカラムの上部より滴下供給した。上記の
アセトンとｎ−ヘキサンとの容積比が37:63の混合液が
溶出する流出分を集めた。この流出分から減圧下に低沸
点物を留去し、ついで70〜80℃の温度で一夜真空乾燥す
ることにより目的とする分別SMAを31.8g得た。このもの
のゲルパーミエーシヨンクロマトグラフイー（以下、こ
れをGPCと略称する；テトラヒドロフラン溶出液、ポリ
スチレン標準）による分析で重量平均分子量（ｗ）お
よび数平均分子量（ｎ）を求めたところ、ｗは1340
であり、ｎは1220であつた（w/ｎ＝1.10）。蒸気
圧浸透圧計による測定ではｎは1210であつた。また得
られた分別SMA中の無水マレイン酸含有率を電位差滴定
法により求めたところ、47.3モル％であつた。

分別SMAの部分半ブチルエステル化 上記の方法で分別されたSMA10.0g、ｎ−ブチルアルコ
ール2.20g、無水酢酸リチウム0.10gおよびジオキサン20
mlを磁気攪拌子を備えた約40ml容のアンプルに仕込み封
管した。このアンプルの内容物を攪拌下に90℃の温度で
20時間加熱した。得られた反応液の一部を取り、反応液
中の未反応ｎ−ブチルアルコール量をエチルセロソルブ
を内部標準としてガスクロマトグラフイーにより定量
し、仕込みｎ−ブチルアルコールの反応率から共重合体
中に存在していた無水マレイン酸環の半ブチルエステル
化度を算出したところ62％であつた。次に、反応液をジ
オキサン20mlで希釈し、この希釈液をｎ−ヘキサン400m
l中に滴下して再沈殿の操作を行い、得られた沈殿を回
収して約60℃の温度で一夜真空乾燥することにより、目
的とする部分半ブチルエステル化スチレン−無水マレイ
ン酸共重合体を11.5g得た。このものの赤外線吸収スペ
クトル（FT−IR,KBrデイスク法）の波数1780cm^-1および
700cm^-1における吸収強度を基にして、残存無水マレイ
ン酸環の含有率を求めたところ30.3モル％（Bu−SMA1分
子中に含まれる無水マレイン酸環は平均1.8個存在）で
あつた。またGPCの測定から、このもののｗは1530で
あり、ｎは1440であつた（w/ｎ＝1.06）。

合成例１ ヒト赤血球型SOD（3,000単位/mg）50mg（1.5×10^-6モ
ル）を0.1M重炭酸ナトリウム水溶液（pH8.0）10mlに37
℃で攪拌しながら溶解させた。溶解後、この溶液にスチ
レン−無水マレイン酸共重合体〔ジクミルパーオキシド
を開始剤としてクメン中でラジカル重合したもの、スチ
レンと無水マレイン酸との共重合モル比1:1、ｗ＝128
0、分子量分布：w/ｎ＝1.20以下〕を部分半ブチル
エステル化したスチレン−無水マレイン酸共重合体〔
ｗ＝1600、エステル化度＝60モル％、無水マイレン酸環
含有量＝25モル％（１分子中に含まれる無水マレイン酸
環は平均1.6個存在）〕80mg（5mM、反応液中の最終Bu−
SMA濃度を意味する。以下同様。）を固体粉末のまま徐
々に添加し、一時間反応させた。

ヒト赤血球型SODのアミノ基がBu−SMAと反応する経過
を観察するためにトリニトロベンゼンスルホン酸ナトリ
ウム（TMBS）で残存アミノ基を定量した。用いたヒト赤
血球型SODには１分子当り22個のアミノ基が存在してお
り、これらのアミノ基のうちでTNBS法により定量可能な
アミノ基は約10〜11個であるが、上記の反応条件下では
ヒト赤血球型SODのアミノ基の20モル％（定量可能なア
ミノ基の約44モル％に相当）がBu−SMAと反応したこと
が確認された。反応液を濾過後、濾液をセフアデツクス
Ｇ−100（商品名、フアーマシア社製、スエーデン国）
を充填したK50/30カラム（商品名、フアーマシア社製、
スエーデン国）に注入し、ゲル濾過した。20mMの重炭酸
アンモニウムと炭酸アンモニウムとの混合液を溶出液と
し、流出液を280nmで検出し、吸収部分の溶出液を分取
し、限外濾過膜（ザルトリウスSM145−39）により濃縮
し、これを凍結乾燥し、白色粉末52mgを得た。得られた
粉末のUV吸収スペクトル〔第２図においてSOD誘導体
（Ｉ）として示す〕および原料SODとBu−SMAのUV吸収ス
ペクトルをリン酸緩衝液を用いてpH7.4で測定し、それ
ぞれ第２図に示した。また、同様にして作成した５μｌ
の⁵¹Crラベル標品（反応生成物）を用いてアンフオライ
ンによる等電点分画（pH1.5〜6.0、700mV、12時間通
電、1ml/フラクシヨンで分画）を行い、pHと放射活性を
測定し、その結果を第８図に示した。得られた粉末の等
電点は2.0であつた。さらに、得られた白色粉末の蛋白
質含有量をローリー法で測定したところ80％であつた。
これらの結果に基づき、SOD1分子当り結合したBu−SMA
の分子数を決定した。

以上のことより、得られた白色粉末はSOD1分子当りBu
−SMA とのモル比1:1、60％ブチルエステル化、ｗ＝1600）
が平均５分子結合（SODのアミノ基とBu−SMAの無水マレ
イン酸環との反応による結合）したSOD誘導体であると
同定した。

合成例２ ヒト赤血球型SOD（3,000単位/mg）50mgを0.1M重炭酸
ナトリウム水溶液（pH8.0）10mlに37℃で攪拌しながら
溶解させた。得られた溶液に合成例１で用いたBu−SMA
と同じもの30mg（1.9mM）を徐々に添加し、合成例１と
同様に上記ヒト赤血球型SODと反応させ、得られた反応
液を合成例１と同様に処理し、白色粉末45mgを得た。得
られた白色粉末について合成例１と同様に測定したUV吸
収スペクトルを第２図〔SOD誘導体（II）として示す〕
に示し、等電点分画を行い、pHと放射活性を測定した結
果を第９図に示した。得られた粉末の等電点は4.4であ
つた。また、残存アミノ基をTNBS法で定量した結果、原
料SODのアミノ基の約９モル％（定量可能なアミノ基の
約20モル％に相当）がBu−SMAと反応したことが確認さ
れた。

以上のことより、得られた白色粉末は、SOD1分子当り
平均２分子のBu−SMAが結合したSOD誘導体であると同定
した。

合成例３ ヒト赤血球型SOD（3,000単位/mg）50mg（1.5×10^-7モ
ル）を0.1M重炭酸ナトリウム水溶液（pH8.0）1mlに溶解
したのち、得られた溶液に合成例１で用いたBu−SMAと
同じもの4mg（2.5mM）を加えて37℃で反応させ、反応時
間の経過とSODが有するアミノ基量との関係を第５図に
示した。なお、アミノ基の定量はTNBS法により行つた。
用いたヒト赤血球型SODには１分子当り22個のアミノ基
が存在しており、これらのアミノ基のうちでTNBS法によ
り定量可能なアミノ基は約10〜11個であるが、上記の反
応条件下では１時間に定量可能なアミノ基の約38モル％
がBu−SMAと反応したことが確認され、SOD1分子に約４
分子のBu−SMAが結合したSOD誘導体を得ることができ
た。２時間反応させたのち、反応液にさらに同量のBu−
SMAを添加した場合、第１図に示すように（……・…
…）アミノ基量はさらに減少した。これより明らかなよ
うに、反応させるBu−SMAの量を変えることにより、SOD
分子に結合するBu−SMAの量をコントロールすることが
可能であることがわかる。

合成例４ ヒト赤血球型SOD（3,000単位/mg）10mg（3.0×10^-7モ
ル）を0.1M重炭酸ナトリウム水溶液（pH8.0）1mlに溶解
し、得られた溶液に第１表に示す種々の部分加水分解さ
れたスチレン−無水マレイン酸共重合体または部分半エ
ステル化されたスチレン−無水マレイン酸共重合体を反
応液における最終濃度が2.5mMになるように加え、37℃
で１時間反応させた。反応後、SOD中の残存アミノ基をT
NBS法で定量した結果、いずれの場合も定量可能なアミ
ノ基の15〜25モル％のアミノ基が減少していることが確
認された。いずれの場合もSOD1分子に平均1.7〜2.8個の
スチレン−マレイン酸共重合体が結合したSOD誘導体が
得られた。

合成例５ 合成例４においてスチレン−無水マレイン酸共重合体
の代りに部分加水分解されたイソブテン−無水マレイン
酸共重合体（ｗ＝2500、無水マレイン酸環含量＝3.0
個/1分子）を用いる以外は合成例４と同様に反応および
分離操作を行い、SOD1分子に約４個のイソブテン−マレ
イン酸共重合体が結合したSOD誘導体を得た。

合成例６ 合成例４においてスチレン−無水マレイン酸共重合体
の代りに第２表に示す種々の共重合体を用いる以外は合
成例４と同様に反応および分離操作を行い、それぞれ対
応するSOD誘導体を得た。

合成例７ 所定量のヒト赤血球型SOD（シグマ社製、）を0.1M重
炭酸ナトリウム水溶液（pH8.0）に5mg/mlの濃度となる
ように溶解させた。この溶液に部分加水分解されたスチ
レンと無水マレイン酸との共重合体（分子量約1400、１
分子あたりの無水マレイン酸環含量約1.0個）、部分加
水分解されたｐ−ブロムスチレンと無水マレイン酸との
共重合体（分子量約1600、１分子あたりの無水マレイン
酸環含量約1.5個）、部分加水分解されたα−メチルス
チレンと無水マレイン酸との共重合体（分子量約1600 1
分子あたりの無水マレイン酸環含量約3.3個）または部
分加水分解されたイソブチレンと無水マレイン酸との共
重合体（分子量2500、１分子あたりの無水マレイン酸環
含量約3.5個）の所定量を各々加え、25℃の温度で１時
間反応させた。得られた反応液をセフアデツクスＧ−75
スーパーフアイン（商品名、フアーマシア社製、スエー
デン国）を充填したK26/40カラム（商品名、フアーマシ
ア社製、スエーデン国）に注入し、ゲル濾過した。10mM
の重炭酸アンモニウムと炭酸アンモニウムとの混合液を
溶出液とし、流出液を280nm、254nmで検出し、未反応の
共重合体を除いた吸収部分の溶出液を分取し、これを凍
結乾燥し、白色粉末状のSOD誘導体を各々得た。結果を
第３表に示す。なお、SOD中の反応したアミノ基の定量
はTNBS法により行つた。用いたヒト赤血球型SODには１
分子当り22個のアミノ基が存在しており、これらのアミ
ノ基のうちでTNBS法により定量可能なアミノ基は約10〜
11個である。

ヒト赤血球型SODおよびウシ赤血球型SODのIR吸収スペ
クトル（FT−IR、KBrデイスク法）を各々第４図（１）
および第４図（２）に示し、第３表中のNo.7−１、No.7
−２およびNo.7−３のSOD誘導体のIR吸収スペクトル（F
T−IR、KBrデイスク法）を各々第５〜７図に示す。

第５〜７図には第４図（１）に示されるヒト赤血球型
SODの吸収スペクトルに加えて各共重合体由来の吸収ス
ペクトル（矢印で示す部分）が認められ、これらの図に
示される吸収スペクトルからSODに各共重合体が結合し
ていることがわかる。

また上記の方法においてヒト赤血球型SODの代りにウ
シ赤血球型SODを用いる以外は同様の反応および分離操
作を行うことにより、対応する同様のIR吸収スペクトル
を有するSOD誘導体を得た。

試験例５ ヒト赤血球型SOD5mg/mlを37℃、pH8.0で種々の濃度
（0.14、0.37、0.75、1.5、３、６および12mM）のBu−S
MAと１時間反応させ、Bu−SMAの結合量の変化した種々
のSOD誘導体を調製し、得られたSOD誘導体のBu−SMAの
結合量と酵素活性との関係を調べた。なお、酵素活性の
測定はジヤーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー
（Journal of Biological Chemistry），244,6049〜605
5（1965）に記載されている方法に従つた。反応液中のB
u−SMA濃度と得られたSOD誘導体が有する残存アミノ基
量（TNBS法で測定）および酵素活性との関係を第３図に
示した。第３図によればBu−SMA濃度が6mMの場合、得ら
れたSOD誘導体中のTNBS反応性アミノ基の残存量は約50
％であるが（前述のように原料SOD1分子中のアミノ基22
個のうちでTNBS反応性アミノ基は約10〜11個であるの
で、この場合５個のアミノ基が反応し、17個のアミノ基
が未反応で残つていることになる）、酵素活性が50％維
持されていること、またそれ以上Bu−SMAの結合量が増
加すると酵素活性が50％以下に低下することがわかる。
したがつて、SODへの極度の化学修飾は酵素活性の維持
に好ましくなく、SODの酵素活性を維持させるためにはS
OD1分子に結合される共重合体の数は約６分子までに抑
える必要がある。なお、第３図に示されるように、SOD1
分子に２分子のBu−SMAが結合したSOD誘導体の場合には
SODそのものの酵素活性に対して80％の酵素活性が維持
されている。

合成例２で得られたSOD誘導体と原料SODのプロテアー
ゼ感受性を比較検討した。反応はpH7.4、37℃で行つ
た。SOD誘導体およびSODを1ml当り15ユニット（５μg/m
l）で各々0.1mg/mlのトリプシン、キモトリプシンおよ
びパパインと反応させた。それらの結果を第11図に示し
た。両者ともパパインで僅かに酵素活性が低下するが、
他のプロテアーゼでは失活することなく、両者とも安定
であつた。したがつて、SODを共重合体が修飾してもそ
の酵素化学的安定性は変化しないと結論される。

試験例６ 合成例２で得られたSOD誘導体と原料のSODのそれぞれ
をウシ血清アルブミン−セフアロースカラムによるアフ
イニテイクロマトグラフイーに付した。それらの結果を
第10図に示した。原料のSODはアルブミンに結合せず、
すべてカラムを素通りした。SOD誘導体は95％以上がア
ルブミンカラムに結合した。SOD誘導体のかなりの部分
が0.1％のドデシル硫酸ナトリウム（SOD）処理によりカ
ラムから溶出されたが、この条件下では依然として約30
％のSOD誘導体がカラムに結合しており、次にカラムを
塩酸グアニジンで変性処理することによつてSOD誘導体
のすべてが溶出された。また、0.5％のSDS処理ではほぼ
全量のSOD誘導体がアルブミンカラムから溶出された。
このことはBu−SMAが結合したSOD誘導体は原料SODとは
異なり、アルブミンと強く結合することを示す。

次に、合成例２で得られたSOD誘導体または原料のSOD
のそれぞれをラツトに静脈内投与し、血中での濃度変化
を測定した。それらの結果を第12図に示す。第12図から
明らかなように、原料SODは血中濃度が短時間で低下す
る（半減期５分）のに比し、SOD誘導体の血中濃度は極
めて長時間高いレベルに保たれる（半減期６時間）。こ
のことはSOD誘導体がBu−SMAの存在によつて血中のアル
ブミンと強く結合することによるものと推察される。

合成例４、５および６で得られたSOD誘導体について
も、上記と同様にウシ血清アルブミン−セフアロースカ
ラムによるアフイニテイクロマトグラフイーを行つた。
いずれのSOD誘導体についても、その90％以上がアルブ
ミンカラムに結合し、カラムからの溶出にはドデシル硫
酸ナトリウム（SDS）処理を必要とした。このことはい
ずれのSOD誘導体もアルブミンと強く結合することを示
すものであり、SODと結合している共重合体中の疎水性
基およびカルボキシル基の存在によるものと推察され
る。

また、合成例２においてヒト赤血球型SODの代りにウ
シ赤血球型SODを用いる以外は合成例２と同様の反応お
よび分離操作を行うことにより、ウシ赤血球型SOD1分子
にBu−SMAが２分子結合したSOD誘導体から得られた。こ
のSOD誘導体についても上記の試験結果と同様の結果が
得られ、ヒト赤血球型SODとウシ赤血球型SODとでは差は
みられなかつた。

試験例７ 合成例２で得られたSOD誘導体をラツト血清と混和
し、混和物をゲル濾過の操作（セフアクリルＳ−200、S
Dラツト血清0.2ml、サンプル0.2mg）に付した場合、SOD
誘導体はアルブミンを主体とする血清蛋白質に結合して
溶出することが認められた。一方、原料SODをラツト血
清と混和し、混和物について同様のゲル濾過を行つたと
ころ、SODは血清蛋白質と相互作用することなく、それ
自信の分子量約33,000の位置に溶出された。

また、アルブミンを欠損する無アルブミンラツトの血
清と上記のSOD誘導体を混和し、混和物について同様に
ゲル濾過を行つた場合、かなりの量のSOD誘導体が非ア
ルブミン画分の血清蛋白質に結合して溶出された。した
がつて、血中のアルブミン濃度が低い場合には、SOD誘
導体は他の血清蛋白質に結合して挙動すると考えられ
る。このことは血清アルブミン濃度が低下する疾患に対
してもSOD誘導体が有効に作用できることを示す。

試験例８ 合成例２に記載の方法に準じて調製した⁵¹Cr標識した
SOD誘導体、合成例２で用いたBu−SMAと同様の³H標識し
たBu−SMAおよびSODをそれぞれラツト（体重200g）に20
0,000cpm/rat量静脈内投与し、１時間後の臓器中の放射
活性を測定した。それらの結果を第４表に示す。第４表
から明らかなとおり、SOD誘導体の尿中排泄は著明に抑
制されており、血中半減期が延長し、SOD誘導体は各臓
器に高濃度に移行することがわかる。

以上の試験例の結果から明らかなように、SOD誘導体
は、SODそのものに近い酵素活性を有し、かつSODそのも
のに比べ大幅に延長された血中半減期を有する。また、
SOD誘導体は血清蛋白質との可逆的な相互作用を有して
おり、SODを疾患局所へ移行させるうえで非常に有利で
ある。一般に、炎症局所および虚血性疾患局所のpHは低
下しており、このような局所にはプロトン化されたカル
ボキシル基含有化合物が集積分布すると言われている。
SOD誘導体はカルボキシル基を有していることから、こ
のカルボキシル基がプロトン化されることにより、炎症
局所および虚血性疾患局所に効率よく集積分布されるこ
とが期待される。

次に、本発明のSOD誘導体のうち合成例２で得られたS
OD誘導体を有効成分として含有する製剤例を示す。

製剤例１ 下記の成分を用いて常法により腸溶性カプセル剤を調
製した。

合成例２で得られたSOD誘導体 20mg 乳 糖 46mg コーンスターチ 16mg 結晶性セルロース 12mg グリコール酸セルロース 5mgソルビトール 10mg （１カプセル当り） 109mg 上記の腸溶性カプセル剤は、通常大人に１回２カプセ
ルを食後に１日３回投与する。

製剤例２ 下記の成分を用いて常法により腸溶錠剤を調製した。

合成例２で得られたSOD誘導体 20mg 乳 糖 79mg コーンスターチ 45.5mgステアリン酸マグネシウム 0.5mg （１錠当り） 145mg 上記の腸溶錠剤は、通常大人に１回２錠を食後に１日
３回投与する。

製剤例３ 次の方法により注射用製剤を調製した。

合成例２で得られたSOD誘導体10mgを生理食塩水に溶
解して容積を5mlとし、滅菌ミクロポア・フイルターで
濾過した。濾液を滅菌こはく色ガラスびん（１型、3m
l）に封入した。

発明の効果 本発明によれば、SODの酵素活性を概ね保持したまま
で該SODに比べて大幅に延長された血中半減期を有する
新規な非巨大分子化SOD誘導体が提供される。SOD誘導体
は血清蛋白質との可逆的な相互作用を有しており、SOD
を疾患局所へ移行させるうえで非常に有利である。また
SOD誘導体は抗炎症作用、抗虚血障害作用、抗脳浮腫作
用、抗パラコート中毒作用を併わせ有する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、合成例３に示すSODとBu−SMAとの反応におい
て、反応時間とSOD中のTNBS反応性アミノ基減少率との
関係を示した図である。第２図は合成例１および合成例
２で得られたSOD誘導体ならびに原料であるSODおよびBu
−SMAのUVスペクトルを示した図である。第３図は試験
例５に示す反応液中のBu−SMA濃度と得られたSOD誘導体
が有するTNBS反応性アミノ基量およびSOD活性との関係
を示した図である。第４図（１）はヒト赤血球型SODのI
Rスペクトルを示した図であり、第４図（２）はウシ赤
血球型SODのIRスペクトルを示した図である。第５図、
第６図および第７図は各々合成例７のNo.7−１、No.7−
２およびNo.7−３で得られた各々のSOD誘導体のIRスペ
クトルを示した図である。第８図は合成例１で得られた
SOD誘導体を⁵¹Crでラベルし、等電点分画を行い、pHと
放射活性を測定した結果を示した図である。第９図は合
成例２で得られたSOD誘導体を⁵¹Crでラベルし、等電点
分画を行い、pHと放射活性を測定した結果を示した図で
ある。第10図は合成例２で得られたSOD誘導体および原
料SODのウシ血清アルブミン−セフアロースカラムによ
るアフイニテイクロマトグラフイーの結果を示した図で
ある。第11図は合成例２で得られたSOD誘導体および原
料SODの各種プロテアーゼに対する抵抗性を比較した図
である。第12図は合成例２で得られたSOD誘導体または
原料SODのそれぞれをラツトに静脈内投与したときの経
過時間による血中濃度の変化を示した図である。第13図
は左側大腿筋に0.2mlのヘペスバツフアー（pH6.0）を、
また右側大腿筋に0.2mlの生理食塩水をそれぞれ筋肉内
投与したマウスにSOD誘導体またはBu−SMAを静脈内投与
し、左側（酸性側）と右側（コントロール側）における
SOD誘導体またはBu−SMAの経時的組織集積量を示した図
である。第14図は水浸拘束により誘起されるラツトの急
性胃粘膜障害に対するSOD誘導体の抗消化性潰瘍作用に
関し、潰瘍係数（mm/tissue）とストレス負荷時間との
関係を示した図である。第15図（１）はラツトの脳浮腫
を起こした右大脳半球（病側）、左大脳半球（健側）ま
たは血液中におけるSOD誘導体の組織集積量を示した図
であり、第15図（２）は同じラツトの病側、健側または
血液中におけるBu−SMAの組織集積量を示した図であ
る。第16図は、パラコート処理マウスにSOD誘導体を投
与した場合と、投与しない場合（コントロール）とにつ
いて、パラコート投与後の時間と血漿中のGOTレベルと
の関係を示した図である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】式 〔SOD〕〔Z〕_X 〔式中、〔SOD〕はアミノ基に換えてアミノ基から１個
   の水素原子を除いた基を１ないし６個有するスーパーオ
   キシドジスムターゼを表わし、 〔Ｚ〕は または （これらの式中、R¹、R³およびR⁵はそれぞれ水素原子ま
   たはメチル基を表わし、R²は水素原子、塩素原子、臭素
   原子またはメチル基を表わし、R⁴は水素原子または炭素
   数１ないし５のアルキル基を表わし、R⁶はメチル基また
   はエチル基を表わす）で示される基からなる群から選ば
   れる基、 （式中、R⁷は水素原子を表わすか、または炭素数１ない
   し４のアルカノール、炭素数１ないし４のアルキル基部
   分を含むエチレングリコールモノアルキルエーテルもし
   くは炭素数１ないし４のアルキル基部分を含むグリセリ
   ンジアルキルエーテルから水酸基を除いた残基を表わ
   す）で示される基および （式中、カルボニル基の炭素原子の結合手は〔SOD〕と
   結合するものであることを意味する）で示される基を構
   成単位とし、かつ平均分子量が800ないし20000である共
   重合体の一価の基を表わし、Ｘは〔SOD〕が有するアミ
   ノ基から１個の水素原子を除いた基の数に対応する１な
   いし６の整数を表わす〕 で示されるスーパーオキシドジスムターゼ誘導体。
2. 【請求項２】スーパーオキシドジスムターゼと または （これらの式中、R¹、R³およびR⁵はそれぞれ水素原子ま
   たはメチル基を表わし、R²は水素原子、塩素原子、臭素
   原子またはメチル基を表わし、R⁴は水素原子または炭素
   数１ないし５のアルキル基を表わし、R⁶はメチル基また
   はエチル基を表わす）で示される基からなる群から選ば
   れる基、 （式中、R⁷は水素原子を表わすか、または炭素数１ない
   し４のアルカノール、炭素数１ないし４のアルキル基部
   分を含むエチレングリコールモノアルキルエーテルもし
   くは炭素数１ないし４のアルキル基部分を含むグリセリ
   ンジアルキルエーテルから水酸基を除いた残基を表わ
   す）で示される基および で示される基を構成単位とし、かつ平均分子量が800な
   いし20000である共重合体とをpH7〜11のアルカリ水溶液
   中で反応させることを特徴とする式 〔SOD〕〔Z〕_X 〔式中、〔SOD〕はアミノ基に換えてアミノ基から１個
   の水素原子を除いた基を１ないし６個有するスーパーオ
   キシドジスムターゼを表わし、〔Ｚ〕は または （これらの式中、R¹、R²、R³、R⁴、R⁵およびR⁶は前記定
   義のとおりである）で示される基からなる群から選ばれ
   る基、 （式中、R⁷は前記定義のとおりである）で示される基お
   よび （式中、カルボニル基の炭素原子の結合手は〔SOD〕と
   結合するものであることを意味する）で示される基を構
   成単位とし、かつ平均分子量が800ないし20000である共
   重合体の一価の基を表わし、Ｘは〔SOD〕が有するアミ
   ノ基から１個の水素原子を除いた基の数に対応する１な
   いし６の整数を表わす〕 で示されるスーパーオキシドジスムターゼ誘導体の製造
   法。