JPH08254532A - ストレプトリジンｏの決定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ストレプトリジンＯが結合することができる
ステロイド化合物を固定化した担体を使用することを特
徴とする、ストレプトリジンＯを免疫学的に決定する方
法。 【効果】 ストレプトリジンＯの決定方法において、ス
トレプトリジンＯを特異的、かつ、安価に決定できる方
法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、被検液中のストレプト
リジンＯの免疫学的決定方法において、下記一般式
（１）

【０００２】

【化２】

【０００３】（ただし式中、Ｒ１は置換されたあるいは
非置換の、不飽和のあるいは飽和された、コレステロー
ル側鎖基またはコール酸側鎖基、Ｒ２は水素原子または
水酸基、破線部位は飽和または二重結合部位を示す。）
で表されるステロイド化合物の一種以上を固定化させた
担体を使用することを特徴とするストレプトリジンＯの
決定方法に関する。

【０００４】

【従来の技術】ストレプトリジンＯ（ｓｔｒｅｐｔｏｌ
ｙｓｉｎ Ｏ）は、例えば、ランスフィールド（Ｌａｎ
ｃｅｆｉｅｌｄ）の血清学的分類（Ｌａｎｃｅｆｉｅｌ
ｄ，Ｒ．Ｃ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第５７巻、５７
１頁〜５９５頁、１９３３年）によるＡ群溶血性連鎖球
菌（ｇｒｏｕｐ Ａ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ｓｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｉ）の産生する毒素の一つである、一般に
還元状態下、例えば、２−メルカプトエタノールの存在
下、赤血球の溶血を生じせしめる分子量５０，０００〜
７０，０００の範囲に含まれるタンパク質として知られ
ているものであり、コレステロールに対する親和性が高
く、細胞膜と結合して細胞を溶解せしめる活性を有する
（レンサ球菌感染症〔上〕−その基礎と臨床−、塩川優
一・吉岡守正・浜田茂幸編集、８８頁〜９７頁、廣川書
店（株）、１９９２年６月５日発行）。

【０００５】また、Ａ群溶血性連鎖球菌の感染によっ
て、ストレプトリジンＯに対する反応特異的な抗体（抗
ストレプトリジンＯ抗体）が患者血清中に存在すること
が知られている（巴山顕次ら、衛生検査、第２３巻、８
０３頁〜８０７頁、１９７４年）。ストレプトリジンＯ
を決定する方法としては、ストレプトリジンＯの有する
生物活性である溶血活性を指標とした方法が従来から広
く用いられてきたが、この方法は必然的に新鮮な赤血球
を必要とするため、用いる赤血球の安定性、ロット差等
により測定値のバラツキが生じやすいという問題点があ
った。

【０００６】また、抗原性物質を特異的に決定するため
の一般的な方法として、決定すべき抗原性物質に対する
抗体を吸着させた担体と抗原性物質とを接触させ、この
結果抗体を介して担体に結合した抗原性物質を免疫学的
手法により確認または定量する方法、例えば、「酵素免
疫測定法、蛋白質核酸酵素別冊第３１号、北川常廣・南
原利夫・辻章夫・石川榮治編集、１３頁〜２６頁、共立
出版（株）、１９８７年９月１０日発行」等に記載され
たサンドイッチＥＩＡ法等を挙げることができる。

【０００７】しかし、抗原性物質を担体に特異的に結合
させるためには、抗原性物質と反応特異的に結合する性
能を有し、かつ、高純度に精製された抗体を必要とする
（免疫測定法の新しい活用事例と診断試薬・治療薬開発
への応用、免疫測定法開発研究会企画、３頁〜６頁、経
営教育出版、１９８５年６月２０日発行）。このような
抗体を得るためには多大な労力とコストがかかり、結果
的に測定コストが高くなるという問題点があった。ま
た、抗体を吸着させた担体は、保存安定性が必ずしもよ
くなく、さらに、イオン強度を高めた緩衝液や酸性溶液
との接触により、容易に抗体が担体から離脱するという
問題点が指摘されていた（高阪 彰、臨床検査、第３２
巻、第８号、９３６頁〜９３８頁、１９８８年）。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】これらのストレプトリ
ジンＯの決定法が抱える問題点を解決すべく、ストレプ
トリジンＯが特異的に結合できる安定かつ安価な担体を
提供し、かつ、これを用いることによる被検液中のスト
レプトリジンＯを反応特異的に決定する方法を提供する
ことである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、下記一般式（１）

【００１０】

【化３】

【００１１】（ただし式中、Ｒ１は置換されたあるいは
非置換の、不飽和のあるいは飽和された、コレステロー
ル側鎖基またはコール酸側鎖基、Ｒ２は水素原子または
水酸基、破線部位は飽和または二重結合部位を示す。）
で表されるステロイド化合物を物理的もしくは化学的に
固定化させた担体とＡ群溶血性連鎖球菌由来のストレプ
トリジンＯ含有溶液とを反応させることによって、被検
液であるストレプトリジンＯ含有溶液中のストレプトリ
ジンＯのみを特異的に担体上に結合せしめることがで
き、かつ、このようにして得られたストレプトリジンＯ
結合担体が抗ストレプトリジンＯ抗体との反応性を保持
していること、およびこの性質を利用することにより被
検液中のストレプトリジンＯの量を決定することができ
ることを見出し本発明を完成するに至った。

【００１２】本発明は、上記の知見に基づいて完成され
たもので、被検液中のストレプトリジンＯの免疫学的決
定方法において、下記一般式（１）

【００１３】

【化４】

【００１４】（ただし式中、Ｒ１は置換されたあるいは
非置換の、不飽和のあるいは飽和された、コレステロー
ル側鎖基またはコール酸側鎖基、Ｒ２は水素原子または
水酸基、破線部位は飽和または二重結合部位を示す。）
で表されるステロイド化合物の一種以上を固定化させた
担体を使用することを特徴とするストレプトリジンＯの
決定方法である。

【００１５】本発明に係わるステロイド化合物として
は、上記一般式（１）で表されるもので、その式中、Ｒ
１は置換されたあるいは非置換の、不飽和のあるいは飽
和された、コレステロール側鎖基またはコール酸側鎖基
を示し、Ｒ２は水素原子または水酸基を示し、破線部位
は飽和または二重結合部位である。また、基Ｒ１の具体
的説明としては、例えば、水酸基、低級アルキル基また
は低級アシル基で置換あるいは非置換の、１または２個
の二重結合をもつ不飽和のあるいは飽和された、コレス
テロール側鎖基またはコール酸側鎖基である。また、コ
レステロール側鎖基としては、下記一般式（２）

【００１６】

【化５】

【００１７】（ただし式中、Ｒ３は水素原子、水酸基、
低級アルキル基または低級アシル基を示し、Ｒ４は水素
原子、水酸基、低級アルキル基または低級アシル基を示
し、Ｒ５は水素原子、水酸基、低級アルキル基または低
級アシル基を示し、破線部位は飽和または二重結合部位
を示す。）または、下記一般式（３）

【００１８】

【化６】

【００１９】（ただし式中、破線部位は飽和または二重
結合部位を示す。）で表されるコレステロール側鎖基が
挙げられ、好ましくは、上記一般式（２）において、Ｒ
３およびＲ４が水素原子であり、Ｒ５が水素原子、水酸
基、メチル基もしくはエチル基であることを特徴とする
コレステロール側鎖基が挙げられ、具体的には、例え
ば、コレステロール側鎖基、β−シトステロール側鎖
基、スチグマステロール側鎖基、カンペステロール側鎖
基、エルゴステロール側鎖基、セレブロステロール側鎖
基、デスモステロール側鎖基等が挙げられる。

【００２０】上記一般式（１）で表されるステロイド化
合物の具体的化合物としては、例えば、コレステロール
（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、７−デヒドロコレステロ
ール（７−ｄｅｈｙｄｒｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、
コレスタノール（ｃｈｏｌｅｓｔａｎｏｌ）、コプロス
タノール（ｃｏｐｒｏｓｔａｎｏｌ）、Δ⁷ −コレステ
ノール（Δ⁷ −ｃｈｏｌｅｓｔｅｎｏｌ）、Δ⁷ −コプ
ロステノール（Δ⁷ −ｃｏｐｒｏｓｔｅｎｏｌ）、β−
シトステロール（β−ｓｉｔｏｓｔｅｒｏｌ）、７−デ
ヒドロ−β−シトステロール（７−ｄｅｈｙｄｒｏ−β
−ｓｉｔｏｓｔｅｒｏｌ）、スチグマステロール（ｓｔ
ｉｇｍａｓｔｅｒｏｌ）、７−デヒドロスチグマステロ
ール（７−ｄｅｈｙｄｒｏｓｔｉｇｍａｓｔｅｒｏ
ｌ）、カンペステロール（ｃａｍｐｅｓｔｅｒｏｌ）、
７−デヒドロカンペステロール（７−ｄｅｈｙｄｒｏｃ
ａｍｐｅｓｔｅｒｏｌ）、スチグマスタノール（ｓｔｉ
ｇｍａｓｔａｎｏｌ）、Δ⁷ −スチグマステノール（Δ
⁷ −ｓｔｉｇｍａｓｔｅｎｏｌ）、１１α−ヒドロキシ
コレステロール（１１α−ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓ
ｔｅｒｏｌ）、Δ²²−スチグマステノール（Δ²²−ｓｔ
ｉｇｍａｓｔｅｎｏｌ）、α−スピナステロール（α−
ｓｐｉｎａｓｔｅｒｏｌ）、カンペスタノール（ｃａｍ
ｐｅｓｔａｎｏｌ）、Δ⁷ −カンペステノール（Δ⁷ −
ｃａｍｐｅｓｔｅｎｏｌ）、２０α−ヒドロキシコレス
テロール（２０α−ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒ
ｏｌ）、ブラシカステロール（ｂｒａｓｓｉｃａｓｔｅ
ｒｏｌ）、エルゴステロール（ｅｒｇｏｓｔｅｒｏ
ｌ）、セレブロステロール（ｃｅｒｅｂｒｏｓｔｅｒｏ
ｌ）、７−デヒドロセレブロステロール（７−ｄｅｈｙ
ｄｒｏｃｅｒｅｂｒｏｓｔｅｒｏｌ）、セレブロスタノ
ール（ｃｅｒｅｂｒｏｓｔａｎｏｌ）、Δ⁷ −セレブロ
ステノール（Δ⁷ −ｃｅｒｅｂｒｏｓｔｅｎｏｌ）、デ
スモステロール（ｄｅｓｍｏｓｔｅｒｏｌ）、７−デヒ
ドロデスモステロール（７−ｄｅｈｙｄｒｏｄｅｓｍｏ
ｓｔｅｒｏｌ）、３β−ヒドロキシコラン酸（３β−ｈ
ｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌａｎｉｃ ａｃｉｄ）または３β
−ヒドロキシ−Δ⁵−コレン酸（３β−ｈｙｄｒｏｘｙ
−Δ⁵ −ｃｈｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）等が挙げられ
る。

【００２１】好ましくは、コレステロール、７−デヒド
ロコレステロール、コレスタノール、コプロスタノー
ル、Δ⁷ −コレステノール、Δ⁷ −コプロステノール、
β−シトステロール、７−デヒドロ−β−シトステロー
ル、スチグマステロール、７−デヒドロスチグマステロ
ール、カンペステロールまたは７−デヒドロカンペステ
ロール等が挙げられる。

【００２２】より好ましくは、コレステロール、７−デ
ヒドロコレステロール、コレスタノール、コプロスタノ
ール、Δ⁷ −コレステノールまたはΔ⁷ −コプロステノ
ール等が挙げられる。これらのステロイド化合物におい
て、１種または２種以上を含有するものが挙げられる。

【００２３】本発明における一般式（１）で表されるス
テロイド化合物（以下、単に本ステロイド化合物とい
う）は、好ましくは当業者によく知られた方法で担体上
に固定化することができ、これは、好適には担体表面上
に本ステロイド化合物を物理的に吸着させることによっ
て、あるいは本ステロイド化合物の反応性誘導体をこれ
と反応可能な官能基を有する表面または活性化された表
面へ化学的に結合させることによって行われる。

【００２４】本発明の実施において、本ステロイド化合
物を固定化させた担体の有利な態様としては、本ステロ
イド化合物が担体単位面積（ｃｍ² ）あたりに通常２５
０ｎｍｏｌ〜０．０２５ｎｍｏｌ、好ましくは２５ｎｍ
ｏｌ〜０．２５ｎｍｏｌの範囲で結合している担体を挙
げることができる。本発明に係わる担体としては、本発
明を実施可能なものであれば、その材質、形状および大
きさ等については何ら制限されなく、例えば、ポリスチ
レン、ポリエチレン、ポリプロピレン、アクリロニトリ
ルブタジエンスチレン共重合体、ブタジエンスチレン共
重合体、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化
ビニリデン、ポリアミド、ポリメチルメタアクリレー
ト、ポリメチルペンテン、ポリアセタール、ポリビニル
アセテート、ポリビニルアルコール、ポリビニルブチラ
ール、ポリイソブチレン、塩化ビニル酢酸ビニル共重合
体、フッ素樹脂（ポリテトラフルオロエチレン、テトラ
フルオロエチレンエチレン共重合体、パーフルオロアル
コキシ共重合体等）、ポリアクリロニトリル、ポリスチ
レンアクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリ
ブチレンテレフタレート、ポリウレタン、ユリア樹脂、
エポキシ樹脂、メラミン樹脂、フェノール樹脂、不飽和
ポリエステル樹脂、シリコン、ニトロセルロース、セル
ロースアセテート、セルロースアセテートブチレート、
セルロースアセテートプロピオネート、セルロースプロ
ピオネート、エチルセルロース、カルボキシメチルセル
ロースまたはポリビニリデンジフルオリド等の成形され
たポリマー、またはポリマーにカルボキシル基、ニトリ
ル基、一級アミノ基または二級アミノ基等の官応基をも
たせることを目的として、上記のポリマー合成時にこれ
らの官能基を有する物質がさらに共重合されてなる成形
されたポリマー、あるいは上記のポリマー形成後に表面
処理によってこれらの官応基が導入されてなる成形され
たポリマー、または成形されたガラスまたは金属等が使
用できる。

【００２５】また、本発明において、当業者によく知ら
れた免疫学的決定法において通常使用される材質、形状
および大きさ等を有する、例えばマイクロタイタープレ
ート、ラテックス粒子、ビーズ、ボール、テストチュー
ブまたはメンブレン等を担体として使用すると特に有利
である。本発明におけるステロイド化合物を担体に物理
的に吸着させることによって本ステロイド化合物を担体
に固定化する具体的方法の例としては、例えばマイクロ
タイタープレートを担体とする場合には、本ステロイド
化合物を、マイクロタイタープレートの構造等を損なわ
ず、かつ本ステロイド化合物を溶解、分散または懸濁せ
しめることができる親水性あるいは親油性の溶剤、最適
にはエタノールまたはメタノール溶液に通常１μｇ／ｍ
ｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜１ｍ
ｇ／ｍｌの濃度範囲で溶解、分散あるいは懸濁させ、マ
イクロタイタープレートのウエルにウエルあたり通常２
５μｌ〜２００μｌ、好ましくは５０μｌ〜１００μｌ
添加し、通常４℃〜６０℃、好ましくは４℃〜３０℃の
温度範囲で、通常１０分間〜２４時間、好ましくは３０
分間〜６時間の時間範囲で静置して反応させた後、ウエ
ルを水または適当な緩衝液で洗浄することによって本ス
テロイド化合物を固定化する方法を例として挙げること
ができる。

【００２６】このとき、反応液は、水を含んでいてもよ
く、またマイクロタイタープレートの構造を損なわず、
かつ反応に大きな影響を与えない濃度範囲のクロロホル
ム、アセトン、ヘキサン、ジクロロエタン、プロパノー
ル、イソプロパノール、キシレン、トルエン、ベンゼ
ン、エーテル、石油エーテル、酢酸メチル、酢酸エチル
またはその他の溶剤等を含んでいてもよい。

【００２７】あるいは、本ステロイド化合物を通常１０
０ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１μｇ／ｍｌ
〜１００μｇ／ｍｌの濃度範囲で、マイクロタイタープ
レートの構造等を損なわず、かつ本ステロイド化合物を
溶解、分散または懸濁せしめることができる親水性ある
いは親油性の溶剤、最適にはエタノールまたはメタノー
ル溶液に溶解、分散または懸濁せしめた液をマイクロタ
イタープレートのウエルにウエルあたり通常２５μｌ〜
２００μｌ、好ましくは５０μｌ〜１００μｌ添加し、
通常２０℃〜９０℃、好ましくは４０℃〜７０℃の温度
範囲で静置して溶媒を蒸発留去させた後、ウエルを水ま
たは適当な緩衝液で洗浄することによって本ステロイド
化合物を固定化する方法も便利でよい。

【００２８】さらに、例えば、テストチューブ等を担体
とする場合には、担体となるテストチューブ等の構造等
を損なわない条件下において、テストチューブ等の内容
積およびその他の要因を考慮して、マイクロタイタープ
レートの方法に準じて行えばよい。さらに、例えば、ラ
テックス粒子を担体とする場合には、本ステロイド化合
物とラテックス粒子とをラテックス粒子の構造等を損な
わず、かつ本ステロイド化合物を溶解、分散または懸濁
せしめることができる親水性あるいは親油性の溶剤、最
適にはエタノールまたはメタノール溶液中にて接触さ
せ、通常４℃〜６０℃、好ましくは４℃〜３０℃の温度
範囲で、通常１０分間〜２４時間、好ましくは３０分間
〜１０時間の時間範囲で撹拌、振とうあるいは静置して
反応させた後、必要に応じてラテックス粒子を水または
適当な緩衝液で洗浄することによって本ステロイド化合
物を固定化する方法を挙げることができる。

【００２９】このとき、反応液中のラテックス粒子の濃
度として表される固形物濃度が、通常０．０１％〜１０
％、好ましくは０．０５％〜５％の濃度範囲であり、ま
た本ステロイド化合物の濃度が、通常０．１μｇ／ｍｌ
〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／
ｍｌの濃度範囲であることが望ましい。また、反応液は
水を含んでいてもよく、またラテックス粒子の構造を損
なわず、かつ反応に大きな影響を与えない濃度範囲のク
ロロホルム、アセトン、ヘキサン、ジクロロエタン、プ
ロパノール、イソプロパノール、キシレン、トルエン、
ベンゼン、エーテル、石油エーテル、酢酸メチル、酢酸
エチルまたはその他の溶剤等を含んでいてもよい。

【００３０】また、例えば、ビーズまたはボール等を担
体とする場合には、担体となるビーズまたはボール等の
材質の構造を損なわない条件下において、ビーズまたは
ボール等の表面積、体積、個数およびその他の要因を考
慮して、ラテックス粒子の方法に準じて行えばよい。さ
らに、例えば、メンブレン等を担体とする場合には、担
体となるメンブレン等の構造等を損なわず、かつ本ステ
ロイド化合物を溶解、分散または懸濁せしめることがで
きる親水性あるいは親油性の溶剤、最適には、エタノー
ルまたはメタノール溶液に溶解、分散または懸濁させた
本ステロイド化合物をメンブレン単位面積（ｃｍ² ）あ
たり通常２５０ｎｍｏｌ〜０．０２５ｎｍｏｌ、好まし
くは２５ｎｍｏｌ〜０．２５ｎｍｏｌの量範囲で、好ま
しくは当業者によく知られた方法、例えばドットスポッ
ト等によりメンブレン等と接触させ、本ステロイド化合
物を固定化する方法を挙げることができる。このとき、
スポットの大きさ等は任意であり、また、本ステロイド
化合物を溶解、分散または懸濁した溶液は、水を含んで
いてもよく、またメンブレン等の構造を損なわず、かつ
反応に大きな影響を与えない濃度範囲のクロロホルム、
アセトン、ヘキサン、ジクロロエタン、プロパノール、
イソプロパノール、キシレン、トルエン、ベンゼン、エ
ーテル、石油エーテル、酢酸メチル、酢酸エチルまたは
その他の溶剤等を含んでいてもよい。

【００３１】本発明におけるステロイド化合物を担体に
化学的に結合させる方法は、本ステロイド化合物に官能
基、例えば、カルボキシル基、水酸基、チオール基、１
級アミノ基、２級アミノ基、アミド基、ニトロ基または
アルデヒド基等が導入された本ステロイド化合物の反応
性誘導体と本ステロイド化合物に導入された官応基と反
応することができる官能基を有する担体または活性化さ
れた担体とを、自体よく知られた方法、例えば、「実験
と応用 アフィニティクロマトグラフィー、千畑一郎・
土佐哲也・松尾雄志著、３０頁〜１０９頁、講談社
（株）、１９７６年９月１０日発行」あるいは「酵素免
疫測定法、石川榮治・河合 忠・室井 潔編集、第３
版、７５頁〜１５１頁、医学書院（株）、１９８７年５
月１５日発行」等に記載された方法に準じて、化学的に
結合させることによって行うことができる。

【００３２】本発明におけるステロイド化合物を担体に
化学的に結合させる方法の例としては、例えば、下記一
般式（４）

【００３３】

【化７】

【００３４】（ただし式中、Ｒ６は置換されたあるいは
非置換の、飽和されたコレステロール側鎖基またはコー
ル酸側鎖基、Ｒ７は水素原子または水酸基、破線部位は
飽和または二重結合部位を示す。）で表されるステロイ
ド化合物において、Ｒ６が置換されたあるいは非置換
の、飽和されたコレステロール側鎖基またはコール酸側
鎖基であり、Ｒ７が水素原子または水酸基であり、破線
部位のいずれか一箇所が二重結合であるステロイド化合
物を反応出発物質として、これに、「細田 宏ら、Ｃｈ
ｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、第２８巻、１２９４頁
〜１２９９頁、１９８０年」等に記載の方法に準じて、
５，６−エポキシ体、７，８−エポキシ体あるいは１
４，１５−エポキシ体の環開裂反応を経て、６位、７位
あるいは１５位にチオエーテル結合により架橋されたカ
ルボキシル基、１級アミノ基、２級アミノ基、アミド
基、ニトロ基またはアルデヒド基等を導入することによ
って、本ステロイド化合物の反応性誘導体を形成せし
め、これと反応可能な官能基をもつ担体表面に結合させ
る方法等を挙げることができる。

【００３５】より具体的には、上記一般式（４）で表さ
れるステロイド化合物のうち、例えば、Δ⁷ −コレステ
ノール、Δ⁷ −コプロステノール、Δ⁷ −スチグマステ
ノール、Δ⁷ −カンペステノールあるいはΔ⁷ −セレブ
ロステノール等の７−８位に二重結合をもつステロイド
化合物を反応出発物質として、この反応出発物質の７位
にカルボキシル基を導入することによって本ステロイド
化合物の反応性誘導体を形成せしめる例を用いて示す
と、まず、反応出発物質としての上記ステロイド化合物
を、これを溶解、分散または懸濁せしめることができる
親水性有機溶剤（好ましくは、メタノールまたはエタノ
ール等）中で、過酸（好ましくは、過酸化水素等）およ
びアルカリ試薬（好ましくは、水酸化ナトリウムまたは
水酸化カリウム等）と接触させ、通常０℃〜４０℃、好
ましくは０℃〜１０℃の温度範囲で、通常３０分間〜１
２時間、好ましくは１時間〜６時間の時間範囲で撹拌、
振とうまたは静置した後、反応液を中和することによっ
て反応出発物質のエポキシ誘導体を形成せしめる。

【００３６】このとき、反応液中の反応出発物質として
のステロイド化合物の濃度は、通常０．０１ｍｍｏｌ／
ｍｌ〜１ｍｍｏｌ／ｍｌ、好ましくは０．０５ｍｍｏｌ
／ｍｌ〜０．５ｍｍｏｌ／ｍｌの濃度範囲にあり、過酸
の濃度は、通常０．１％〜１０％、好ましくは０．５％
〜５％の濃度範囲にあり、アルカリ試薬の濃度は、通常
０．５％〜１０％、好ましくは１％〜５％の濃度範囲に
あり、かつ、反応液中の水分含量が、好ましくは２０％
以下の範囲にあることが望ましい。形成されたエポキシ
誘導体の分離法は、例えば、「生化学研究法Ｉ、第７
版、安藤鋭郎・寺山宏・西沢一俊・山川民夫編集、４９
頁〜９６頁、朝倉書店（株）、１９７３年３月２０日発
行」等に記載の方法に準じて行えばよい。

【００３７】次いで、得られたエポキシ誘導体を、これ
を溶解、分散または懸濁せしめることができる親水性有
機溶剤、最適にはメタノールまたはエタノール中で、メ
ルカプトモノカルボン酸（好ましくは、２−メルカプト
酢酸または３−メルカプトプロピオン酸等）およびアル
カリ試薬（好ましくは、水酸化ナトリウムまたは水酸化
カリウム等）と接触させ、通常０℃〜６０℃、好ましく
は１０℃〜４０℃の温度範囲で、通常３０分間〜１２時
間、好ましくは１時間〜６時間の時間範囲で撹拌、振と
うまたは静置した後、反応液のｐＨを酸性に変えること
によって、反応出発物質としてのステロイド化合物の７
位にチオエーテル結合により架橋されたカルボキシル基
を導入せしめることができる。

【００３８】このとき、反応液中のエポキシ誘導体の濃
度は通常０．０１ｍｍｏｌ／ｍｌ〜１ｍｍｏｌ／ｍｌ、
好ましくは０．０５ｍｍｏｌ／ｍｌ〜０．５ｍｍｏｌ／
ｍｌの濃度範囲にあり、メルカプトモノカルボン酸の濃
度は通常０．０５ｍｍｏｌ／ｍｌ〜５ｍｍｏｌ／ｍｌ、
好ましくは０．１ｍｍｏｌ／ｍｌ〜１ｍｍｏｌ／ｍｌの
濃度範囲にあり、アルカリ試薬の濃度は通常０．５％〜
１０％、好ましくは１％〜５％の濃度範囲にあり、かつ
反応液中の水分含量が、好ましくは２０％以下の範囲で
あることが望ましい。また、反応液はジオキサン等を含
んでいてもよい。形成された誘導体の分離法は前述のエ
ポキシ誘導体の分離法に準ずれば足りる。

【００３９】上記の方法により、上記一般式（４）で表
されるステロイド化合物のうち、例えば、Δ⁷ −コレス
テノール、Δ⁷ −コプロステノール、Δ⁷ −スチグマス
テノール、Δ⁷ −カンペステノールあるいはΔ⁷ −セレ
ブロステノール等の７−８位に二重結合をもつステロイ
ド化合物を反応出発物質として、それぞれコレスタノー
ル、コプロスタノール、スチグマスタノール、カンペス
タノールあるいはセレブロスタノール等の７位にチオエ
ーテル結合により架橋されたカルボキシル基が導入され
た反応性誘導体を形成せしめることができる。

【００４０】また、上記の方法により、例えば、５−６
位に二重結合をもつコレステロール、β−シトステロー
ル、カンペステロールまたはセレブロステロール等を反
応出発物質として、それぞれコレスタノール、スチグマ
スタノール、カンペスタノールまたはセレブロスタノー
ル等の６位にチオエーテル結合により架橋されたカルボ
キシル基が導入された反応性誘導体を形成せしめること
ができる。

【００４１】これらのカルボキシル基が導入された本ス
テロイド化合物の反応性誘導体は、自体よく知られた方
法で、例えば、酸無水物法、カルボジイミド法またはＮ
−ヒドロキシサクシンイミド法等で表面にアミノ基をも
つ担体の表面アミノ基と反応させて固定化を行うことが
できる。本発明において、本ステロイド化合物を固定化
させた担体を使用した被検液中のストレプトリジンＯの
免疫学的決定方法は被検液中のストレプトリジンＯと抗
ストレプトリジンＯ抗体とによる免疫反応を主体とする
もので、例えば抗原抗体反応を阻害せず、かつ、用いら
れる試薬類の性質（例えば、標識剤が用いられる場合に
おいては標識剤の有する検出可能な性質等）等を失活さ
せない条件下で、本発明によるステロイド化合物を固定
化させた担体と被検液および抗ストレプトリジンＯ抗体
溶液とを順次、または、同時に反応させ、この結果担体
上に結合した抗原抗体複合体を確認または定量すること
により特徴づけられる。

【００４２】本発明に係わる被検液とは、ストレプトリ
ジンＯを含む液体すべてが挙げられ、本発明において決
定することができるストレプトリジンＯ、例えば、Ａ
群、Ｃ群またはＧ群に属する溶血性連鎖球菌によって生
産された、あるいは遺伝子組み換え技術を用いることに
よって大腸菌、酵母、その他の宿主によって生産された
ストレプトリジンＯ、その誘導体または変異体等、ある
いは本発明におけるステロイド化合物との結合能を保持
し、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体と反応するストレ
プトリジンＯ様のもの、例えば、溶血活性部位の一部ま
たは全部を欠損せしめたストレプトリジンＯである合成
タンパク質または合成ペプチド等、を含む血清、血漿、
唾液、尿等の生体体液、組織抽出液、組織培養液、菌体
抽出液または菌体培養液等が例として挙げられる。これ
らの被検液は、本発明において用いられるストレプトリ
ジンＯの決定方法の原理、検出感度、測定レンジあるい
は他の要因を考慮して、被検液原液で、あるいは被検液
原液を適当な緩衝液等により適宜希釈して本発明に用い
られる。

【００４３】また上記の如くの被検液中のストレプトリ
ジンＯの安定化あるいは担体へのタンパク質等の非特異
的吸着を防止する目的での添加剤として、例えば、ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチン、スキムミルクま
たはミルク由来のタンパク質等のタンパク質や糖、グリ
セロール、エチレングリコール、キレート剤、還元剤等
を水または緩衝液中に適宜添加することは任意である。
その濃度範囲等は、例えば自体公知の抗原抗体反応を利
用した抗ストレプトリジンＯ抗体の免疫学的決定方法に
おいて通常用いられる濃度範囲等から適宜選択すれば足
りる。ただし、ストレプトリジンＯは、水溶液中では比
較的不安定であるので、安定化の目的のために、例え
ば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチン、スキム
ミルクまたはミルク由来のタンパク質等のタンパク質を
通常０．００１％〜１０％、好ましくは０．０１％〜１
％の濃度範囲で水または緩衝液中に添加しておくことが
望ましい。

【００４４】また、担体へのタンパク質等の非特異的吸
着を防止する目的で、本ステロイド化合物を固定化した
担体を、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラ
チン、スキムミルクまたはミルク由来タンパク質等のタ
ンパク質等を水または緩衝液に溶解させた溶液で予め処
理しておくことは任意である。その濃度範囲等は、例え
ば自体公知の抗原抗体反応を利用した抗体の免疫学的決
定方法において通常用いられる濃度範囲等から適宜選択
されればよいが、通常０．０５％〜１０％、好ましくは
０．５％〜５％の濃度範囲から選択されれば足りる。

【００４５】本発明において使用される抗ストレプトリ
ジンＯ抗体は、ストレプトリジンＯと結合するものであ
れば特に制限はなく、例えば、本発明において使用され
る抗ストレプトリジンＯ抗体の給源の一つとして、Ａ群
溶血性連鎖球菌に感染した患者の血清を挙げることがで
き、適宜希釈して、あるいは精製して使用できる。ま
た、特表平６−５０３００２号公報、特開平１−２９０
６９８号公報等に開示された方法に準じて、実験動物、
例えば、ウサギやマウスなどにストレプトリジンＯを含
む免疫源で免疫して得られるポリクローナル抗体、ある
いはモノクローナル抗体等を使用できる。さらに、簡便
には、国立予防衛生研究所から入手できる抗ストレプト
リジンＯ抗体国内標準品を使用すればよい。

【００４６】また、当然のことながら、本発明において
用いられるストレプトリジンＯの決定方法の原理等を考
慮して、これらの抗体にパパイン、またはペプシン等の
タンパク質分解酵素を作用させることによって得ること
ができる酵素分解フラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ’）
₂ 、Ｆ（ａｂ）₂ 、Ｆａｂ’、Ｆａｂ等を使用すること
は任意である。

【００４７】本発明において使用される緩衝液は、通常
用いられる緩衝液であれば特に限定されないが、通常ｐ
Ｈ４〜１０、好ましくはｐＨ６〜８の範囲である緩衝液
を用いることが望ましく、例えばリン酸緩衝液、ホウ酸
緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、ベロナール緩衝
液、グッド（Ｇｏｏｄ’ｓ）緩衝液（例えば、ヘペス
（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、ピペス（ＰＩＰＥＳ）緩衝液、
メス（ＭＥＳ）緩衝液等）等を用いることができる。

【００４８】本発明において、ストレプトリジンＯを決
定するための方法は、本ステロイド化合物を固定化した
担体の種類あるいは抗原抗体複合体を確認または定量す
る方法の原理等の違いにより自ずから異なるが、これら
の要因を勘案して下記に示す例に準じて行えばよく、そ
の反応条件は、それぞれの決定法に通常用いられる公知
の反応条件から最適と思われる条件を選択すればよい。

【００４９】例えば、本ステロイド化合物を固定化させ
た、マイクロタイタープレート、ビーズ、ボールまたは
テストチューブ等を用いた場合には、まず、被検液原液
または希釈した被検液と、該担体とを接触させ、通常４
℃〜４０℃、好ましくは４℃〜３０℃の温度範囲で、通
常５分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜１２時間の
時間範囲で静置、撹拌あるいは振とうして反応させた
後、該担体を水または前述の緩衝液で洗浄して該担体に
非結合性の成分を除く。

【００５０】次に、例えば、当業者によく知られたエン
ザイムイムノアッセイ（ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓ
ｓａｙ；ＥＩＡ）法等に準じて、該担体と抗ストレプト
リジンＯ抗体、および、この抗ストレプトリジンＯ抗体
と反応することができかつ標識剤で標識された第二抗体
（以下、標識第二抗体という）とを順次または同時に反
応させ、次いで、抗原抗体複合体を介して担体に結合し
た標識剤の活性を測定し、任意のストレプトリジンＯ標
準液で求めた検量線よりストレプトリジンＯを決定する
方法、または、ビタミンＢ群の一種であるビオチンが、
卵白の塩基性糖タンパク質アビジンと選択的に結合する
性質を利用し、上記の測定方法において、ビオチンを結
合させた抗体を標識第二抗体の代わりに使用し、次いで
標識剤で標識されたアビジンもしくストレプトアビジン
を反応させ、次いで抗原抗体複合体を介して担体に結合
した標識剤の活性を測定し、任意のストレプトリジンＯ
標準液で求めた検量線よりストレプトリジンＯを決定す
る方法等により被検液中のストレプトリジンＯを決定す
ることができる。

【００５１】また例えば、本ステロイド化合物を固定化
させた、マイクロタイタープレート、ビーズ、ボールま
たはテストチューブ等を用いた場合には、被検液原液ま
たは希釈した被検液と、該担体とを接触させ、通常４℃
〜４０℃、好ましくは４℃〜３０℃の温度範囲で、通常
５分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜１２時間の時
間範囲で静置、撹拌あるいは振とうして反応させた後、
該担体を水または前述の緩衝液で洗浄して該担体に非結
合性の成分を除き、次に、自体よく知られたエンザイム
イムノアッセイ法に準じて、標識剤で標識された抗スト
レプトリジンＯ抗体（以下、標識抗ストレプトリジンＯ
抗体という）を反応させ、次いで、抗原抗体複合体を介
して担体に結合した標識剤の活性を測定し、任意のスト
レプトリジンＯ標準液で求めた検量線よりストレプトリ
ジンＯを決定することができる。このとき使用される標
識抗ストレプトリジンＯ抗体は、例えば、「酵素免疫測
定法、蛋白質核酸酵素別冊第３１号、北川常廣・南原利
夫・辻章夫・石川榮治編集、３７頁〜４５頁、共立出版
（株）、１９８７年９月１０日発行」等に記載の方法に
準じて、本発明において使用できる抗ストレプトリジン
Ｏ抗体に対して標識したものを使用すれば足りる。

【００５２】さらに、例えば、本ステロイド化合物を固
定化させたメンブレン等を用いた場合には、例えば、当
業者によく知られたエンザイムイムノアッセイ法の一つ
の手法である免疫染色（ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎ
ｇ）法等に準じて、まず、適当な反応容器中で被検液原
液または希釈した被検液と、該メンブレンとを接触さ
せ、あるいは被検液原液または希釈した被検液を本ステ
ロイド化合物のスポット上に滴下して接触させ、通常４
℃〜４０℃、好ましくは４℃〜３０℃の温度範囲で、通
常５分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜１２時間の
時間範囲で静置、撹拌あるいは振とうして反応させた
後、該メンブレンを水または前述の緩衝液で洗浄する。
次いで、前記の方法に準じて、抗ストレプトリジンＯ抗
体および標識第二抗体を順次または同時に反応させ、あ
るいは標識抗ストレプトリジンＯ抗体を反応させる。さ
らに、抗原抗体複合体を介して担体に結合した標識剤の
活性を検出し、これを目視で確認、あるいはデンシトメ
ーター等で定量することによって被検液中のストレプト
リジンＯを決定することができる。

【００５３】上記の方法において、標識剤としては、例
えば、エンザイムイムノアッセイ法において通常使用さ
れるすべての酵素が挙げられ、好ましくはペルオキシダ
ーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダー
ゼまたはグルコースオキシダーゼから適宜選択すればよ
い。酵素活性の検出は、「酵素免疫測定法、蛋白質核酸
酵素別冊第３１号、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川
榮治編集、５１頁〜６３頁、共立出版（株）、１９８７
年９月１０日発行」等に記載の方法に準じて行えばよ
い。

【００５４】また、当業者によく知られた、ラジオイム
ノアッセイ法において通常使用される放射性物質、ある
いは免疫蛍光法等において通常使用される蛍光物質等で
あってもよい。標識される第二抗体またはビオチン結合
抗体としては、該反応に用いられる抗ストレプトリジン
Ｏ抗体と結合するものであれば特に制限はなく、ポリク
ローナル抗体、モノクローナル抗体またはこれらの抗体
の酵素分解フラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ’）₂ 、Ｆ
（ａｂ）₂ 、Ｆａｂ’、Ｆａｂ等にかかわらず使用する
ことができる。また、抗体タンパクがいかなる動物種に
由来するものであってもよく、また、遺伝子組み換え技
術によって大腸菌、酵母、その他の宿主等によって生産
されたものであってもよい。通常、例えば、抗ストレプ
トリジンＯ抗体がヒト由来の場合には、簡便には、ヒト
イムノグロブリンを抗原としてヒト以外の動物に免疫し
て得られる抗体を用いればよく、さらに簡便には、市販
の抗ヒトイムノグロブリン抗体を用いればよい。また、
例えば、抗ストレプトリジンＯ抗体がマウス由来の場合
には、簡便には、マウスイムノグロブリンを抗原として
マウス以外の動物に免疫して得られる抗体を用いればよ
く、さらに簡便には、市販の抗マウスイムノグロブリン
抗体を用いればよい。

【００５５】抗体に標識剤を標識する方法は、例えば、
「酵素免疫測定法、蛋白質核酸酵素別冊第３１号、北川
常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、３７頁〜４５
頁、共立出版（株）、１９８７年９月１０日発行」等に
記載の方法に準じて行えばよい。また、当然のことなが
ら、一般的な免疫学的測定法において通常用いられる市
販の標識第二抗体の中から適宜選択して本発明に用いて
もよい。

【００５６】さらに、本発明において、ストレプトリジ
ンＯを決定するための方法の例として、例えば、本ステ
ロイド化合物を固定化したラテックス粒子を用いた場合
には、まず被検液原液または希釈した被検液と、本ステ
ロイド化合物を固定化したラテックス粒子とを水または
前述の緩衝液中で接触させ、通常０℃〜５０℃、好まし
くは４℃〜４０℃の温度範囲で、通常５分間〜２４時
間、好ましくは１０分間〜１２時間の時間範囲で静置、
撹拌あるいは振とうして反応させた後、必要に応じて該
ラテックス粒子を水または前述の緩衝液等で洗浄する。

【００５７】このとき、反応液中のラテックス粒子の濃
度は、固形物濃度として通常０．０１％〜１０％、好ま
しくは０．０５％〜５％の範囲であることが望ましい。
次に、例えば、ラテックススライド凝集法（柴田里美
ら、機器・試薬、第１１巻、３３８頁〜３４２頁、１９
８８年）に準じて、該ラテックス粒子と抗ストレプトリ
ジンＯ抗体溶液とを判定板上で混合し、抗原抗体反応に
よるラテックス粒子の凝集の有無を目視で確認する方
法、免疫比ろう測定（ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃｉｍ
ｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＮＩＡ）法（山岸安子、臨床検
査、第２３巻、臨時増刊、１２８６頁〜１２８９頁、１
９７９年）に準じて、該ラテックス粒子と抗ストレプト
リジンＯ抗体溶液とを混合することにより生じた抗原抗
体複合体に光（レーザー光）を照射し、その散乱光の強
度の変化量を測定し、任意のストレプトリジンＯ標準液
で求めた検量線よりストレプトリジンＯを決定する方
法、ラテックス凝集免疫測定（ｌａｔｅｘ ｐｈｏｔｏ
ｍｅｔｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＬＰＩＡ）法
（櫻林郁之介ら、日本臨床、第４８巻、増刊号（下
巻）、１３５６頁〜１３６１頁、１９９０年）に準じ
て、該ラテックス粒子と抗ストレプトリジンＯ抗体溶液
とを混合し、抗原抗体反応の結果生じる濁りを光学的に
測定し、任意のストレプトリジンＯ標準液で求めた検量
線よりストレプトリジンＯを決定する方法、または、カ
ウンティングイムノアッセイ（ｃｏｕｎｔｉｎｇｉｍｍ
ｕｎｏａｓｓａｙ；ＣＩＡ）法（橋本好一ら、検査と技
術、第２２巻、第５号、増刊号、６７頁〜６８頁、１９
９４年）に準じて、該ラテックス粒子と抗ストレプトリ
ジンＯ抗体溶液とを混合し、抗原抗体反応の結果生じる
凝集物の大きさおよび数を測定し、任意のストレプトリ
ジンＯ標準液で求めた検量線よりストレプトリジンＯを
決定する方法等により被検液中のストレプトリジンＯを
決定できる。

【００５８】本発明における抗原抗体反応の生成物を確
認または定量する方法は、用手法に限らず、自動分析装
置を利用した方法であってもよい。本発明において、例
えば、エンザイムイムノアッセイ法により、本ステロイ
ド化合物固定化マイクロタイタープレートまたは本ステ
ロイド化合物固定化テストチューブ等を用いて被検液中
のストレプトリジンＯを決定する場合においては、例え
ば、被検液分注、試薬分注、洗浄操作、吸光度測定、デ
ータ処理等を自動システム化した装置であるＢＥＣＫＭ
ＡＮ Ｂｉｏｍｅｋ １０００ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ベッ
クマン社製）、ＣＥＬＬ ＡＳＳＡＹ−２０００ＲＯＢ
ＯＴＩＣ ＡＳＳＡＹ ＳＹＳＴＥＭ（モリテックス
（株）製）等が利用でき、詳しくは、本ステロイド化合
物固定化マイクロタイタープレートまたは本ステロイド
化合物固定化テストチューブに被検液、抗ストレプトリ
ジンＯ抗体溶液、酵素標識第二抗体溶液および基質液を
洗浄操作を挿んで順次反応させ、必要に応じて酵素反応
停止液を反応させた後、標識酵素と用いた基質との関係
による酵素反応での発色を公知の測定条件から選択され
た任意の波長にて測定し、この結果と任意のストレプト
リジンＯ標準液で求めた検量線とを比較することによっ
て被検液中のストレプトリジンＯを決定できる。

【００５９】さらに、例えば、エンザイムイムノアッセ
イ法により、本ステロイド化合物を固定化させた、ビー
ズまたはボール等を用いて被検液中のストレプトリジン
Ｏを決定する場合においては、例えば、被検液分注、試
薬分注、洗浄操作、吸光度測定、データ処理等を自動シ
ステム化した装置であるアロカ ＡＥＣ−２０００ＰＯ
ＳＥＩＤＯＮＩＩ（アロカ社製）等が利用でき、詳しく
は本ステロイドを固定化させた、ビーズまたはボールに
被検液、抗ストレプトリジンＯ抗体溶液、酵素標識第二
抗体溶液および基質液を洗浄操作を挿んで順次反応さ
せ、必要に応じて酵素反応停止液を反応させた後、標識
酵素と用いた基質との関係による酵素反応での発色を公
知の測定条件から選択された任意の波長にて測定し、こ
の結果と任意のストレプトリジンＯ標準液で求めた検量
線とを比較することによって被検液中のストレプトリジ
ンＯを決定できる。

【００６０】本発明の方法は、本発明の実施に必要な試
薬類をキットにしておくと、操作がさらに容易となる。
また、自動分析装置を使って本発明を実施する場合にお
いても有利である。本発明で用いられる試薬キットは、
本発明において用いられるステロイド化合物固定化担体
がキット構成試薬の一つとなっていると特に有利であ
る。また、本発明で用いられる試薬キットには、当然の
ことながら、本発明の実施に必要なその他の試薬類（例
えば、緩衝剤、標準物質、標識抗体、基質、基質溶解
剤、反応停止剤等）がキットの構成試薬として適宜含ま
れていてもよい。

【００６１】

【実施例】以下に実施例によりさらに詳しく説明する
が、本発明は、これらによって限定されるものではな
い。

【００６２】

【実施例１】 固定化ステロイド化合物とストレプトリジンＯとの反応
性の検討 （１）ストレプトリジンＯの調製 トッド−ヘウイトブロス（Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ Ｂ
ｒｏｔｈ：Ｄｉｆｃｏ社製）培地２．５リットルにてＡ
群溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙ
ｏｇｅｎｅｓ）３型菌Ｄ５８Ｘ株（ＡＴＣＣ１２３８
３）を３７℃で１６時間培養した後、遠心分離およびろ
過にて除菌培養液を回収した。この除菌培養液に飽和硫
安を添加して４０％飽和とし、生じた沈澱を１００ｍｌ
の精製水に溶解した。この液を精製水およびＰＢＳに対
して透析を行って硫安を除去した後、ＰＢＳで平衡化し
たセファデックスＧ−１００（ゲル量１リットル）にて
ゲルろ過を行い、溶血活性を指標にしてストレプトリジ
ンＯ分画を回収した。濃縮により、２８０ｎｍにて測定
される吸光度が０．８２５を示し、溶血活性が８，１９
２溶血単位（ＨＵ）／ｍｌを示すストレプトリジンＯ含
有サンプル１２ｍｌを得た。

【００６３】溶血活性の測定は、新鮮なウサギ脱繊維赤
血球（日本バイオテスト研究所（株）製）をＰＢＳにて
５回遠心洗浄した後、１％赤血球懸濁液になるようＰＢ
Ｓにて調製した液２ｍｌとストレプトリジンＯ含有サン
プルをＰＢＳにて等比希釈した液１ｍｌとをガラス試験
管中で混合し、３７℃で３０分間インキュベートした
後、１００％溶血を示すストレプトリジンＯ含有サンプ
ルの最高希釈倍数を確認し、それをストレプトリジンＯ
含有サンプル１ｍｌあたりのＨＵ値と定めた。 （２）コレステロール固定化担体の作製 マイクロタイタープレート（住友ベークライト（株）
製）に１ｍｇ／ｍｌ濃度のコレステロール（半井化学薬
品（株）製）エタノール溶液をウエルあたり１００μl
添加し、６０℃で２時間静置し、溶媒を留去させること
によってコレステ ロール固定化マイクロタイタープレートを作製した。 （３−１）コレステロール固定化担体とストレプトリジ
ンＯ含有溶液との反応１（１）により調製されたストレ
プトリジンＯ含有サンプルをＰＢＳにて２０培希釈し、
（２）により作製されたコレステロール固定化マイクロ
タイタープレートおよびコレステロール非固定化マイク
ロタイタープレートのウエルにウエルあたり５０μｌ添
加し、室温で２時間反応させた。反応液をウエルから回
収し、回収液についてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析および溶血活性の測
定（実施例１（１）に記載の方法）を行い、反応前と比
較した。

【００６４】ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
は、１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用い、ラエン
ムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．、Ｎａｔｕｒｅ、第２
２７巻、６８０頁〜６８５頁、１９７０年）の方法に準
じて行った。同一のゲルにおいて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分
子量スタンダードローレンジ（ホスフォリラーゼＢ：９
２，５００、ウシ血清アルブミン：６６，２００、オボ
アルブミン：４５，０００、カルボニックアンヒドラー
ゼ：３１，０００、ソイビーントリプシンインヒビタ
ー：２１，５００、リゾチーム：１４，４００；バイオ
ラッド社製）を泳動し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により分離された回収液および反応前液の各
タンパクバンドの分子量を確認するための目安とした
（図１中、レーン１）。泳動後のゲルは、銀染色キット
ワコー（和光純薬工業（株）製）にて銀染色を施した。
（３−２）コレステロール固定化担体とストレプトリジ
ンＯ含有溶液との反応２（１）により調製されたストレ
プトリジンＯ含有サンプルをＰＢＳにて２０培希釈し、
（２）により作製されたコレステロール固定化マイクロ
タイタープレートのウエルにウエルあたり１００μｌ添
加し、室温で４時間反応させた。反応液をウエルから除
去し、ＰＢＳでウエルを３回洗浄した後、０．１％ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（和光純薬（株）製）を
含むＰＢＳをウエルあたり１００μｌ添加し、室温で１
時間プレートを振とうさせて吸着物質を抽出した。

【００６５】この抽出液についてＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析を行い、
反応前と比較した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動は、１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用い、
ラエンムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．、Ｎａｔｕｒ
ｅ、第２２７巻、６８０頁〜６８５頁、１９７０年）の
方法に準じて行った。

【００６６】同一のゲルにおいて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分
子量スタンダードローレンジ（ホスフォリラーゼＢ：９
２，５００、ウシ血清アルブミン：６６，２００、オボ
アルブミン：４５，０００、カルボニックアンヒドラー
ゼ：３１，０００、ソイビーントリプシンインヒビタ
ー：２１，５００、リゾチーム：１４，４００；バイオ
ラッド社製）を泳動し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により分離された抽出液および反応前液の各
タンパクバンドの分子量を確認するための目安とした
（図２中、レーン３）。泳動後のゲルは、銀染色キット
ワコー（和光純薬工業（株）製）にて銀染色を施した。 （４）結果 （３−１）の結果、図１に示すＳＤＳ−ＰＡＧＥパター
ンを得た。図１中、レーン２はコレステロール固定化マ
イクロタイタープレートまたはコレステロール非固定化
マイクロタイタープレートに反応させる前の液（反応前
液）、すなわち（１）により調製されたストレプトリジ
ンＯ含有サンプルをＰＢＳにて２０培希釈した液に含ま
れるタンパク質の分離パターンを意味し、また、図１
中、レーン３はコレステロール固定化マイクロタイター
プレートから回収された回収液に含まれるタンパク質の
分離パターンを意味し、さらに、図１中、レーン４はコ
レステロール非固定化マイクロタイタープレートから回
収された回収液に含まれるタンパク質の分離パターンを
意味するもので、この結果から、（３−１）の結果分子
量６６，０００〜６９，０００および５５，０００〜５
８，０００を示すストレプトリジンＯのバンドが、コレ
ステロール固定化担体と反応させることによって選択的
に結合して消失したことが確認された。また、コレステ
ロール固定化マイクロタイタープレートからの回収液残
渣の溶血活性は、反応前の活性の０．８％が回収された
にすぎなかった。

【００６７】一方、（３−２）の結果、図２に示すＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥパターンを得た。図２中、レーン１はコレ
ステロール固定化マイクロタイタープレートから（３−
２）の方法によって抽出された抽出液に含まれるタンパ
ク質の分離パターンを意味し、また、図２中、レーン２
はコレステロール固定化マイクロタイタープレートに反
応させる前の液（反応前液）、すなわち（１）により調
製されたストレプトリジンＯ含有サンプルをＰＢＳにて
２０培希釈した液に含まれるタンパク質の分離パターン
を意味するもので、この結果から、（３−１）の結果ス
トレプトリジンＯ含有溶液中から消失した分子量６６，
０００〜６９，０００および５５，０００〜５８，００
０を示すストレプトリジンＯが、実際にコレステロール
固定化担体に結合していたことが確認された。

【００６８】以上の結果より、ストレプトリジンＯ含有
溶液中の生物活性を有するストレプトリジンＯが特異的
にコレステロール固定化担体に結合することが判明し
た。

【００６９】

【実施例２】 ストレプトリジンＯの測定 （１）コレステロール固定化担体の作製 １０％エタノール水溶液にコレステロール（半井化学薬
品（株）製）を１００μｇ／ｍｌの濃度になるよう懸濁
させた液を、マイクロタイタープレート（住友ベークラ
イト（株）製）のウエルにウエルあたり５０μｌ添加
し、室温で２時間静置した後、ウエルを精製水で２回洗
浄した。次いで、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．６、０．１４Ｍ塩化ナトリウム含有）に５％濃度と
なるようスキムミルク（雪印乳業（株）製）を溶解した
液（以下、ブロッキング液と称す）をウエルあたり１０
０μｌ添加し、室温で２時間反応させた後、２０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６、０．１４Ｍ塩化ナトリ
ウム含有）（以下、洗浄液と称す）にてウエルを２回洗
浄した。 （２）ストレプトリジンＯ標準液の調製 市販のストレプトリジンＯ（Ｓ−５２６５、Ｌｏｔ３４
Ｈ４１２４、シグマ社）を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．６、０．１４Ｍ塩化ナトリウム含有）にて溶
解し、このストレプトリジンＯ溶解液について実施例１
（１）に記載の方法に準じて溶血活性を求めた。このス
トレプトリジンＯ溶解液の溶血活性を基に、０．５％の
スキムミルクを含有する２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．６、０．１４Ｍ塩化ナトリウム含有）（以
下、希釈液と称す）にてストレプトリジンＯ溶解液を希
釈し、溶血活性１６０溶血単位（ＨＵ）／ｍｌを示す液
を調製し、これをストレプトリジンＯ標準液として用い
た。 （３）検量線の作製 ＢＥＣＫＭＡＮ Ｂｉｏｍｅｋ １０００ Ａｕｔｏｍ
ａｔｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉ
ｏｎを使用してストレプトリジンＯの測定を行った。
（１）により作製されたコレステロール固定化マイクロ
タイタープレートに対し、（２）により調製されたスト
レプトリジンＯ標準液を希釈液にて等比希釈した液をウ
エルあたり５０μｌ添加し、室温で２時間反応させた。
洗浄液にてウエルを７回洗浄した後、抗ストレプトリジ
ンＯ抗体国内標準品（国立予防衛生研究所より入手）を
希釈液にて１国際単位（ＩＵ）／ｍｌになるよう調製し
た溶液をウエルあたり５０μｌ添加し、室温で１時間反
応させた後、洗浄液にてウエルを７回洗浄した。

【００７０】次いで、アルカリホスファターゼ標識ヤギ
Ｆ（ａｂ’）₂ 抗ヒトＩｇＧ（タゴ社製）を希釈液にて
１，０００倍希釈した液をウエルあたり５０μｌ添加
し、室温で１時間反応させた後、洗浄液でウエルを７回
洗浄した。次いで、基質液としてｐ−ニトロフェニルリ
ン酸（和光純薬工業（株）製）を０．５ｍｇ／ｍｌ濃度
となるようにジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．５）
にて溶解した液をウエルあたり１００μｌ添加し、室温
で１５分間反応させた。さらに、０．５Ｎ水酸化ナトリ
ウム水溶液をウエルあたり１００μｌ添加して酵素反応
を停止し、ＩｍｍｕｎｏＲｅａｄｅｒ ＮＪ−２００１
（インターメッド社製）にて４０５ｎｍにおける吸光度
（ΔＥ）を測定した。 （４）結果 本法での検量線を図３に示した。図３の結果から、本発
明の方法により良好な検量線が得られることが判明し
た。

【００７１】

【実施例３】 コレステロール固定化担体に結合したストレプトリジン
Ｏの結合安定性を調べるための試験 （１）コレステロール固定化担体の作製 １０％エタノール水溶液にコレステロール（半井化学薬
品（株）製）を１００μｇ／ｍｌの濃度になるよう懸濁
させた液を、マイクロタイタープレート（住友ベークラ
イト（株）製）のウエルにウエルあたり５０μｌ添加
し、室温で２時間静置した後、ウエルを精製水で２回洗
浄した。次いで、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．６、０．１４Ｍ塩化ナトリウム含有）に５％濃度と
なるようスキムミルク（雪印乳業（株）製）を溶解した
液（以下、ブロッキング液と称す）をウエルあたり１０
０μｌ添加し、室温で２時間反応させた。２０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６、０．１４Ｍ塩化ナトリウ
ム含有）（以下、洗浄液と称す）にてウエルを２回洗浄
した。 （２）ストレプトリジンＯの測定 ＢＥＣＫＭＡＮ Ｂｉｏｍｅｋ １０００ Ａｕｔｏｍ
ａｔｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉ
ｏｎを使用してストレプトリジンＯの測定を行った。
（１）により作製されたコレステロール固定化担体に対
し、市販のストレプトリジンＯ（Ｓ−５２６５、Ｌｏｔ
３４Ｈ４１２４、シグマ社）を０．５％のスキムミルク
を含有する２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６、
０．１４Ｍ塩化ナトリウム含有）（以下、希釈液と称
す）にて実施例１（１）に記載の方法によって求められ
る溶血活性が２０溶血単位（ＨＵ）／ｍｌを示すように
調製した液をウエルあたり５０μｌ添加し、室温で２時
間反応させた。

【００７２】洗浄液にてウエルを７回洗浄した後、次の
種々の媒体（イオン強度の高い媒体、酸性域〜弱アルカ
リ性域の媒体、キレート剤含有媒体、コレステロール可
溶溶媒含有媒体等）、１ＭＮａＣｌ含有ＰＢＳ、１
ＭＫＣｌ含有ＰＢＳ、０．１Ｍクエン酸水溶液、
０．１Ｍ重炭酸水素ナトリウム水溶液、０．２％ＥＤ
ＴＡ含有ＰＢＳ、２０％エタノール水溶液、または、
対照液としてのＰＢＳをそれぞれウエルあたり５０μ
ｌ添加し、室温で１５分間処理した。洗浄液にてウエル
を３回洗浄した後、抗ストレプトリジンＯ抗体国内標準
品（国立予防衛生研究所より入手）を希釈液にて１国際
単位（ＩＵ）／ｍｌになるよう調製した溶液をウエルあ
たり５０μｌ添加し、室温で１時間反応させた。

【００７３】洗浄液にてウエルを７回洗浄した後、酵素
標識第二抗体としてアルカリホスファターゼ標識ヤギＦ
（ａｂ’）₂ 抗ヒトＩｇＧ（タゴ社製）を希釈液にて
１，０００倍希釈した液をウエルあたり５０μｌ添加
し、室温で１時間反応させた。洗浄液でウエルを７回洗
浄し、次いで、基質液としてｐ−ニトロフェニルリン酸
（和光純薬工業（株）製）を０．５ｍｇ／ｍｌ濃度とな
るようにジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．５）にて
溶解した液をウエルあたり１００μｌ添加し、室温で１
５分間反応させた。さらに、０．５Ｎ水酸化ナトリウム
水溶液をウエルあたり１００μｌ添加して酵素反応を停
止させ、ＩｍｍｕｎｏＲｅａｄｅｒ ＮＪ−２００１
（インターメッド社製）にて４０５ｎｍにおける吸光度
（ΔＥ）を測定した。 （３）結果 本法でのストレプトリジンＯ測定結果を図４に示した。
図４の結果から、対照液（ＰＢＳ）と比較して、１ＭＮ
ａＣｌ含有ＰＢＳ、１ＭＫＣｌ含有ＰＢＳ、０．１Ｍク
エン酸水溶液、０．１Ｍ重炭酸水素ナトリウム水溶液、
０．２％ＥＤＴＡ含有ＰＢＳまたは２０％エタノール水
溶液との接触によるストレプトリジンＯ測定値の変化は
認められず、イオン強度の高い媒体、酸性域〜弱アルカ
リ性域の媒体、キレート剤含有媒体、コレステロール可
溶溶媒含有媒体の種々の媒体を用いても本発明における
ステロイド固定化担体とストレプトリジンＯとの結合は
安定であり、極めて再現性よく定量し得るものであるこ
とが判明した。

【００７４】

【実施例４】 コレステロール固定化担体の保存安定性を調べるための
試験 （１）コレステロール固定化担体の作製 １０％エタノール水溶液にコレステロール（半井化学薬
品（株）製）を１００μｇ／ｍｌの濃度になるよう懸濁
させた液を、マイクロタイタープレート（住友ベークラ
イト（株）製）のウエルにウエルあたり５０μｌ添加
し、室温で２時間静置した後、ウエルを精製水で２回洗
浄した。洗浄後、ウエルに０．０２％アジ化ナトリウム
を含む精製水を２５０μｌ添加した。この操作で形成さ
れるコレステロール固定化マイクロタイタープレートを
８枚作製し、使用の日まで４℃で保存した。 （２）ストレプトリジンＯの測定 （１）により作製されたコレステロール固定化マイクロ
タイタープレートをそれぞれ使用して、マイクロタイタ
ープレート作製日および作製日より１、２、５、１０、
２０、３０、３５日目にＢＥＣＫＭＡＮ Ｂｉｏｍｅｋ
１０００ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを使用してストレプトリジ
ンＯの測定を行った。まず、（１）により作製されたコ
レステロール固定化担体に対し、２０ｍＭトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７．６、０．１４Ｍ塩化ナトリウム含有）
に５％濃度となるようスキムミルク（雪印乳業（株）
製）を溶解した液（以下、ブロッキング液と称す）をウ
エルあたり１００μｌ添加し、室温で２時間反応させ
た。

【００７５】次いで、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．６、０．１４Ｍ塩化ナトリウム含有）（以下、洗
浄液と称す）にてウエルを２回洗浄した。市販のストレ
プトリジンＯ（Ｓ−５２６５、Ｌｏｔ３４Ｈ４１２４、
シグマ社）を０．５％のスキムミルクを含有する２０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６、０．１４Ｍ塩化ナ
トリウム含有）（以下、希釈液と称す）にて実施例１
（１）に記載の方法によって求められる溶血活性が２０
溶血単位（ＨＵ）／ｍｌを示すように調製した液をウエ
ルあたり５０μｌ添加し、室温で２時間反応させた。洗
浄液にてウエルを７回洗浄した後、抗ストレプトリジン
Ｏ抗体国内標準品（国立予防衛生研究所より入手）を希
釈液にて１国際単位（ＩＵ）／ｍｌになるよう調製した
溶液をウエルあたり５０μｌ添加し、室温で１時間反応
させた。

【００７６】洗浄液にてウエルを７回洗浄した後、酵素
標識第二抗体としてアルカリホスファターゼ標識ヤギＦ
（ａｂ’）₂ 抗ヒトＩｇＧ（タゴ社製）を希釈液にて
１，０００倍希釈した液をウエルあたり５０μｌ添加
し、室温で１時間反応させた。洗浄液でウエルを７回洗
浄し、次いで、基質液としてｐ−ニトロフェニルリン酸
（和光純薬工業（株）製）を０．５ｍｇ／ｍｌ濃度とな
るようにジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．５）にて
溶解した液をウエルあたり１００μｌ添加し、室温で１
５分間反応させた。さらに、０．５Ｎ水酸化ナトリウム
水溶液をウエルあたり１００μｌ添加して酵素反応を停
止させ、ＩｍｍｕｎｏＲｅａｄｅｒ ＮＪ−２００１
（インターメッド社製）にて４０５ｎｍにおける吸光度
（ΔＥ）を測定した。 （３）結果 本法でのストレプトリジンＯ測定結果を図５に示した。
図５の結果から、本発明によって形成されるコレステロ
ール固定化担体の保存安定性は良好であることが示され
た。

【００７７】

【発明の効果】本発明によれば、ストレプトリジンＯが
結合することができるステロイド化合物を固定化した担
体を用いることにより、ストレプトリジンＯを免疫学的
手法を用いて特異的に決定できる。しかも不安定な赤血
球を必要とせず、安定、かつ、安価な決定法を提供でき
る。本発明は、以上の点において従来法に比し顕著な効
果を奏するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、実施例１（３−１）によりコレステロ
ール固定化担体とストレプトリジンＯ含有溶液とを接触
させた後の回収液の電気泳動パターンを示す。

【図２】図２は、実施例１（３−２）によりコレステロ
ール固定化担体とストレプトリジンＯ含有溶液とを接触
させた結果、担体に結合した成分の電気泳動パターンを
示す。

【図３】図３は、実施例２におけるストレプトリジンＯ
決定法による検量線を示す。

【図４】図４は、実施例３における担体に結合したスト
レプトリジンＯの結合安定性を示す。

【図５】図５は、実施例４におけるコレステロール固定
化担体の保存安定性を示す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成７年３月２２日

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２】

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被検液中のストレプトリジンＯの免疫学
   的決定方法において、下記一般式（１） 【化１】 （ただし式中、Ｒ１は置換されたあるいは非置換の、不
   飽和のあるいは飽和された、コレステロール側鎖基また
   はコール酸側鎖基、Ｒ２は水素原子または水酸基、破線
   部位は飽和または二重結合部位を示す。）で表されるス
   テロイド化合物の一種以上を固定化させた担体を使用す
   ることを特徴とするストレプトリジンＯの決定方法。
2. 【請求項２】 ステロイド化合物が、２５０ｎｍｏｌ／
   ｃｍ² 〜０．０２５ｎｍｏｌ／ｃｍ² の担体単位面積あ
   たりの結合量である請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 ステロイド化合物が、２５ｎｍｏｌ／ｃ
   ｍ² 〜０．２５ｎｍｏｌ／ｃｍ² の担体単位面積あたり
   の結合量である請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 一般式（１）におけるステロイド化合物
   が、コレステロール、７−デヒドロコレステロール、コ
   レスタノール、コプロスタノール、Δ⁷ −コレステノー
   ル、Δ⁷ −コプロステノール、β−シトステロール、７
   −デヒドロ−β−シトステロール、スチグマステロー
   ル、７−デヒドロスチグマステロール、カンペステロー
   ル、７−デヒドロカンペステロール、スチグマスタノー
   ル、Δ⁷−スチグマステノール、１１α−ヒドロキシコ
   レステロール、Δ²²−スチグマステノール、α−スピナ
   ステロール、カンペスタノール、Δ⁷ −カンペステノー
   ル、２０α−ヒドロキシコレステロール、ブラシカステ
   ロール、エルゴステロール、セレブロステロール、７−
   デヒドロセレブロステロール、セレブロスタノール、Δ
   ⁷ −セレブロステノール、デスモステロール、７−デヒ
   ドロデスモステロール、３β−ヒドロキシコラン酸また
   は３β−ヒドロキシ−Δ⁵ −コレン酸である請求項１記
   載の方法。
5. 【請求項５】 担体が、マイクロタイタープレート、ラ
   テックス粒子、ビーズ、ボール、テストチューブまたは
   メンブレンである請求項１記載の方法。