JPH0827184A - ペプチド化合物、及びその製造方法、並びに抗ヒト免疫不全ウイルス剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 抗ヒト免役不全ウイルス作用に優れると共に
低毒性である抗ヒト免役不全ウイルス剤となりうるリー
ド化合物、及びその製造方法。 【構成】 下記化１で表されるペプチド化合物及びその
製造方法。 【化１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ペプチド化合物に関
し、特に、抗ＨＩＶ（抗ヒト免疫不全ウイルス）活性物
質ＮＰ−０６及びその製造方法、並びに、該抗ＨＩＶ活
性物質を有効成分として含有する抗ＨＩＶ剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、後天性免疫不全疾患（以下ＡＩＤ
Ｓと略称する）の患者は全世界的に増加傾向にある。特
にアジア、アフリカ地域においては、ＡＩＤＳの原因で
あるＨＩＶの感染爆発の状態にあり、今後ＡＩＤＳ患者
はこれらの地域を中心に急増すると考えられている。

【０００３】ＨＩＶは、ＲＮＡを遺伝子本体とするレト
ロウイルス科のウイルスである。ＨＩＶの感染は、血液
中に侵入したウイルス粒子が、該ウイルス粒子表面に有
するｇｐ−１２０と呼ばれる糖タンパクを介してＴ細胞
表面に存在するＣＤ４（クラスター オブ ディフェレ
ンシエイション アンチゲン ４）タンパクと特異的に
結合する吸着過程から始まる。細胞表面に吸着したウイ
ルス粒子は、細胞中にＨＩＶ遺伝子（ＲＮＡ）を放出し
て脱殻し、次いでＨＩＶ遺伝子が逆転写酵素によりＤＮ
Ａに書き換えられる（逆転写過程）。そして、ＤＮＡに
書き換えられたＨＩＶの遺伝情報が、更に、インテグラ
ーゼにより宿主細胞のＤＮＡ中に組み込まれる組み込み
過程を経て、ウイルス感染が成立する。

【０００４】感染した細胞内では、ウイルスの遺伝情報
を基にウイルス蛋白が生産される。生産されたウイルス
蛋白には、ＴａｔやＲｅｖと呼ばれるウイルス増殖制御
因子として作用する蛋白の存在することが明らかにされ
ている。宿主細胞内で生産されたウイルス蛋白は、プロ
テアーゼにより分割されたり、グリコシターゼにより糖
鎖が修飾されることにより、ウイルス構成蛋白質へと変
換される（成熟過程）。次に、合成されたウイルス蛋白
質とウイルス遺伝子とが集まり、新たなウイルス粒子が
形成される（パッケージング過程）。

【０００５】新しく産生されたウイルス粒子は細胞外に
放出され（放出過程）、新たな細胞に感染していく。Ｈ
ＩＶの感染により、免疫細胞は本来有する免疫機能を消
失し、或いは巨細胞形成を起こすことにより、通常、細
胞死に至る。ＨＩＶに感染した患者は、免疫細胞の減少
により極度の免疫不全状態に陥り、サイトメガロウイル
スやカリニ原虫といった病原菌による、日和見感染症が
引き起こされる。そこで現在では、ウイルスの細胞内増
殖或いは細胞感染を阻害する薬物を投与するという薬物
治療が、感染患者の免疫機能回復或いは延命効果をもた
らすと考えられている。

【０００６】最近では、ＨＩＶのヒト免疫細胞（Ｔ細
胞）における生活環（ライフサイクル）についてより詳
しい解明がなされつつあり、特に、ウイルスの増殖に関
与する酵素や、レセプターの阻害活性を有する化合物
に、ＡＩＤＳ治療薬としての可能性が見い出されてい
る。ところで、現在、ＡＺＴ（アジトチミジン）、ＤＤ
Ｃ（ジデオキシシチジン）、ＤＤＩ（ジデオキシイノシ
ン）という３種類の核酸系化合物が、ＡＩＤＳの治療薬
として認可を受けている。これらの核酸系の薬物はＨＩ
Ｖのライフサイクルにおける逆転写過程に作用すること
により、抗ＨＩＶ活性を発現する。

【０００７】しかしながら、これらの核酸系化合物を用
いて薬物治療を行った場合には、薬剤耐性株の出現によ
り抗ＨＩＶ活性が減少或いは消失するという問題や、強
い副作用等があるために長期間連続投与することが不可
能であるという問題が明らかとなっており、現在の認可
薬のみによるＡＩＤＳ治療には限界がある。このような
現状から、将来のＡＩＤＳ治療は、異なる作用機作を有
する複数の薬物を用いた併用療法が主流になると考えら
れている。そこで、現在、新たに、吸着阻害剤、脱殻阻
害剤、非核酸系逆転写阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、Ｔ
ａｔ阻害剤、グリコシル化阻害剤等を中心に、ＨＩＶの
増殖を特異的に抑える化合物の探索と開発が全世界的に
進められている。

【０００８】例えば、吸着阻害剤としては、ＣＤ４を可
溶性にした可溶性ＣＤ４（D.H.Smith,R.A.Byrn,S.A.Mar
sters,T.Gregory,J.E.Groopman and D.J.Capon, Scienc
e,238,1704(1987)他) 、デキストラン硫酸、ヘパリン硫
酸等の硫酸化多糖類(M.A.Skinner,R.Ting,A.Langlois,
K.J.Weinhold,H.K.Lyerly,K.Javaherian and,T.J.Matth
ews, AIDS Res.Hum.Retorovirus,4,187(1988)他) ；

【０００９】非核酸系逆転写阻害剤としては、ＴＩＢＯ
（テトラヒドロ−イミダゾ−ベンゾジアゼピン−オン
アンド−チオン）(Pauwels,R.,Andries,K.,Desmyter,
J.,et.al.,Nature（ネイチャー）,343:470(1990)他) 、
ＨＥＰＴ（１−〔（２−ヒドロキシエトキシ）メチル〕
−６−（フェニルチオ）チミン）(Miyasaka,T.,Tanaka,
H.,Baba,M.,Hayakawa,H.,et.al.,J.Med.Chem.(ジャーナ
ルオブメデカルケミストリー）,32,2507(1989)) 、プロ
テアーゼ阻害剤としては、Ro 31-8959(Roberts,N.A.,Ma
rtin,J.A.,Kinchington,D.,et.al.,Science,（サイエン
ス）248,358(1990))、KNI-272(Mimoto,T.,Imai,J.,Kisa
nuki,S.,Enomoto,H.,et.al.,Chem.Pharm.Bull.（ケミカ
ルファーマシュ−ティカルブルティン）,40,2251(199
2)) 等が見い出されている。

【００１０】又、新たな化合物の可能性を求めて、天然
物から抗ＨＩＶ活性物質を探索することも全世界的に行
われるようになりつつあり、既に、例えばＲＰ−７１９
５５(Gerard,H.,Catherine,D.,Jean-Francois,M.and Je
an,L.,J.Antibiotics,（ジャーナルオブアンチバイオテ
ィクス）46,1756(1993))等の抗ＨＩＶ活性物質が見つか
っている。しかしながら、抗ＨＩＶ作用に優れると共に
低毒性である抗ＨＩＶ剤、或いは、抗ＨＩＶ剤となりう
るリード化合物は未だ見い出されてない。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者等
は、in vitroにおいて効果的に抗ＨＩＶ活性を測定でき
るスクリーニング法（ＭＴＴアッセイ法）により、土壌
から分離された微生物の二次代謝産物をスクリーニング
した結果、特に、抗ＨＩＶ作用に優れ、且つ低毒性の抗
ＨＩＶ剤となりうるリード化合物及びその製造方法を見
出し、本発明に到達した。

【００１２】従って、本発明の第１の目的は、抗ＨＩＶ
作用に優れると共に低毒性である抗ＨＩＶ剤となりうる
リード化合物を提供することにある。また、本発明の第
２の目的は、抗ＨＩＶ作用に優れると共に低毒性である
抗ＨＩＶ剤となりうるリード化合物の製造方法を提供す
ることにある。更に、本発明の第３の目的は、抗ＨＩＶ
作用に優れると共に低毒性である抗ＨＩＶ剤となりうる
リード化合物を有効成分とする抗ＨＩＶ剤を提供するこ
とにある。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明の上記の諸目的
は、下記化２で表されるペプチド化合物、及びその製造
方法、並びにそれを有効成分とする抗ＨＩＶ剤によって
達成された。

【化２】

【００１４】以下本発明について詳述する。本発明者等
は、抗ＨＩＶ作用に優れた抗ＨＩＶ剤を提供することを
目的として、in vitro において効果的に抗ＨＩＶ活性
を測定できるスクリーニング法（ＭＴＴアッセイ法）を
用いた。この方法は、ＨＩＶ感染によって引き起こされ
るＣＤ４陽性細胞の感染死と、薬剤による前記感染死の
抑制を判定するものであり、抗ＨＩＶ活性と細胞毒性を
同時に、且つ、簡便に測定することが可能である優れた
方法である。

【００１５】本発明者らは、このスクリーニング法を用
いて、土壌から分離された微生物の二次代謝産物をスク
リーニングするうちに、特に抗ＨＩＶ作用に優れた物質
を見い出し、これをＮＰ−０６と命名した。上記の抗Ｈ
ＩＶ活性物質ＮＰ−０６は、前記化２で表される構造を
有すると共に、以下の理化学的性質を有する物質であ
る。

【００１６】性状：白色粉末 分子式：Ｃ₉₇Ｈ₁₃₁ Ｏ₂₆Ｎ₂₃Ｓ₄ 分子量：２１６３ 溶解性：メタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチル
スルホキシドに易溶、水、酢酸エチル、クロロホルムに
難溶 酸加水分解生成物：グリシン（４）、シスチン（２）、
アラニン（２）、バリン（２）、フェニルアラニン
（２）、ロイシン（１）、アスパラギン酸（２）、セリ
ン（１）、イソロイシン（１）、チロシン（１） ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ^-1：701,746,1178,1219,1337,1390,
1407,1454,1517,1649(C=O),2934,2964,3009,3082(C=C),
3306,3317,3376,3387(OH,NH) 旋光度：［α］^D ₂₀＝−７５°（Ｃ０．１％，ＭｅＯ
Ｈ） 尚、構造決定に際しては、アミノ酸分析、ＭＡＳＳスペ
クトル測定、ＩＲ測定から得られたデータを基に、各種
ＮＭＲ測定及び化学的分解手法を用いた。

【００１７】本発明のＮＰ−０６は、先にGerard等によ
って報告されているＲＰ−７１９５５（Gerard,H.,Cath
erine,D.,Jean-Francois,M.,and Jean,L.,J.Antibiotic
s,46,1756(1993))と同じアミノ酸組成を有し、アミノ酸
配列においても非常に類似した構造を有していることが
明らかになった。即ち、ＮＰ−０６とＲＰ−７１９５５
との相違点は、２箇所においてアミノ酸の種類が異なっ
ていることである。

【００１８】本発明の抗ＨＩＶ活性物質ＮＰ−０６は、
山口県寂地峡から採取された土壌から分離された、スト
レプトミセス属に属する微生物ＳＫＨ−２３４４株を培
養して得られた培養物から単離され、従って、発明のＮ
Ｐ−０６は、ＳＫＨ−２３４４株を栄養源含有培地に接
種し、好気的に培養することにより製造されるが、本発
明で使用することのできるＮＰ−０６の生産菌は上記の
菌株に限らず、ストレプトミセス属に属しＮＰ−０６を
生産する能力を有するものであればよい。

【００１９】ところで、ＳＫＨ−２３４４株は以下の菌
学的性質を有する微生物である。 １．形態的特徴 本菌株を、１％酵母エキス及び１％グルコースを含む液
体培地で培養し、この菌体を６Ｎ塩酸を用いて１１０℃
で１８時間加水分解した後薄層クロマトグラフィーで分
析したところ、Ｌ，Ｌ−ジアミノピメリン酸を検出し
た。また、寒天平板培地上に発育させた物について顕微
鏡観察を行ったところ、気菌糸は螺旋状を呈しており、
この他に特筆すべき形態は認められなかった。

【００２０】２．各種培地上における生育状況（２７℃
１４日間培養、色調は日本規格協会発行の標準色表によ
る） （１）イーストエキス・モルトエキス寒天培地 発育： 良い 気菌糸： 多い 気菌糸色調： ５ＲＰ ６／２ 裏面色調： ５Ｒ ２／２ 可溶性色素： 無し

【００２１】（２）オートミル寒天培地 発育： 良い 気菌糸： 豊富 気菌糸色調： ７．５Ｒ ５／２ 裏面色調： ５Ｙ ４／２ 可溶性色素： 無し （３）スターチ・無機塩寒天培地 発育： 良い 気菌糸： 豊富 気菌糸色調： ７．５Ｒ ８／２ 裏面色調： ２．５ＧＹ ３／２ 可溶性色素： 無し

【００２２】（４）グリセリン・アスパラギン寒天培地 発育： 良い 気菌糸： 少ない 気菌糸色調： 白 裏面色調： ２．５ＧＹ ４／２ 可溶性色素： 無し （５）チロシン寒天培地 発育： 良い 気菌糸： 豊富 気菌糸色調： ７．５Ｒ ７／２ 裏面色調： ２．５ＧＹ ３／２ 可溶性色素： 無し

【００２３】（６）シュクロース・硝酸塩寒天培地 発育： 良い 気菌糸： 無し 気菌糸色調： − 裏面色調： ２．５ＧＹ ６／２ 可溶性色素： 無し （７）グルコース・アスパラギン寒天培地 発育： 良い 気菌糸： 少ない 気菌糸色調： 白 裏面色調： ２．５ＧＹ ４／２ 可溶性色素： 無し

【００２４】（８）栄養寒天培地 発育： 良い 気菌糸： 無し 気菌糸色調： − 裏面色調： ２．５Ｙ ９／４ 可溶性色素： 無し （９）ベネット寒天培地 発育： 良い 気菌糸： 少ない 気菌糸色調： 白 裏面色調： ２．５ＧＹ ６／２ 可溶性色素： 無し

【００２５】３．生育温度範囲（イーストエキス・モル
トエキス寒天培地、７日間） ７℃ 発育： しない １０℃ 発育： 普通 １４℃ 発育： 普通 １７℃ 発育： 普通 ２１℃ 発育： 良い ２５℃ 発育： 良い ２９℃ 発育： 良い ３２℃ 発育： 良い ３７℃ 発育： 普通 ４０℃ 発育： しない ４５℃ 発育： しない ５０℃ 発育： しない

【００２６】４．糖の利用 Ｄ−グルコース 発育： 良い Ｄ−フラクトース 発育： 良い Ｌ−ラムノース 発育： 良い ラフィノース 発育： 普通 Ｄ−キシロース 発育： 普通 Ｌ−アラビノース 発育： 良い シュクロース 発育： 良い イノシトール 発育： 良い Ｄ−マンニトール 発育： 良い

【００２７】上記の諸性質から、ＳＫＨ−２３４４株
が、ストレプトミセス属に属する微生物であることが明
らかである。尚、本菌株は、工業技術院生命工学工業技
術研究所に平成６年３月２２日付けで、ＦＥＲＭ Ｐ−
１４２３９として寄託されている。上記微生物の培養方
法は、原則的には一般の微生物の培養方法に準ずるが、
通常は液体培地による振盪培養法又は通気攪拌培養法で
行うのが好適である。培養に用いられる培地としては、
ストレプトミセス属に属する微生物が利用できる栄養源
を含有する培地であればよく、各種の合成培地、半合成
培地、天然培地等のいずれの培地も用いることができ
る。

【００２８】培地組成の炭素源としては、グルコース、
シュークロース、フルクトース、グリセリン、デキスト
リン、糖蜜、コーン・スティーブリカー、有機酸等を単
独或いは組み合わせて使用できる。窒素源としてはペプ
トン、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、カゼイン、尿
素、アミノ酸等の有機窒素源、硫酸アンモニウム、硝酸
ナトリウムなどの無機窒素源を、単独或いは組み合わせ
て使用できる。ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウ
ム塩、リン酸塩、その他の重金属等やビタミン類も必要
に応じて使用することができる。尚、培養中に発泡が著
しい場合には、アデカノールやシリコーンオイル等の公
知の消泡剤を適宜培地中に添加することもできる。

【００２９】培地のｐＨは、微生物が良好に生育する中
性付近とすることが望ましい。また、培地の温度は微生
物が良好に生育する１０〜３７℃とすることが好まし
く、特に２５〜３０℃に保つことが好ましい。更に、培
養時間は一般に３〜６日程度である。これらの培養条件
は、使用する微生物の種類や特性などの条件に応じて、
適宜変更することができる。上記の培養により、ＮＰ−
０６が菌体中及び培地中に蓄積される。

【００３０】上記の培養によって生産されたＮＰ−０６
の単離は、培養物（菌体及び培地）中にＮＰ−０６が蓄
積された後、好ましくは蓄積が最大になった時に、発酵
生産物を採取する一般的方法に準じて、例えば塩析法、
抽出法、各種ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロ
マトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等の各種手段
を単独または組み合わせて実施される。尚、ＮＰ−０６
は、バイオアッセイ法やＨＰＬＣ法、ＴＬＣ法などによ
って検出する事ができる。

【００３１】即ち、上記培養により生産されるＮＰ−０
６は、菌体内と培地中の両方に存在するので、濾過、遠
心分離等の手段で培養濾液と菌体固形分とを分離した
後、菌体固形分からは、メタノール、アセトン等の溶剤
を用いてＮＰ−０６を抽出し、必要に応じて更にエバポ
レーターなどで有機溶剤を減圧・溜去して抽出濃縮液を
得る。

【００３２】抽出液及び培養濾液中からは、アンバーラ
イトＩＲＡ−４０２、アンバーライトＩＲＡ−９０４、
アンバーライトＩＲＡ−９５８、アンバーライトＩＲＡ
−６８、アンバーライトＩＲＡ−９３やアンバーライト
ＩＲＡ−３５（オルガノ株式会社製陰イオン交換樹脂の
商品名）に吸着・溶離させる事によって、効率よく目的
物を回収する事ができる。また、ｎ−ブタノール、酢酸
エチル等で目的物を抽出して回収しても良い。

【００３３】次いで目的物を含有する抽出液を濃縮した
後、ダイヤイオンＨＰ−２０カラム、セファデックスＬ
Ｈ−２０カラム、シリカゲルカラム、逆相カラム等を用
いたクロマトグラフィー等により精製する。このように
して得られたＮＰ−０６に、例えば、結晶セルロース等
を添加し、必要に応じて公知の如く錠剤とすることによ
り、ＮＰ−０６を有効成分とする極めて優れた抗ＨＩＶ
剤を得ることができる。

【００３４】

【発明の効果】本発明のペプチド化合物であるＮＰ−０
６は、抗ＨＩＶ作用に優れていると共に、毒性が低いの
で、大量に、長期間服用することも可能であり、新たな
ＡＩＤＳ治療薬として極めて有望である。

【００３５】

【実施例】以下、本発明を実施例によって更に詳述する
が、本発明はこれによって限定されるものではない。
尚、％は、他に特定されない限り重量％を意味する。

【００３６】実施例１．３０リットルのジャーファーメ
ンターを用いて、放線菌ＳＫＨ−２３４４株をで２０リ
ットルの培地（グルコース２０ｇ、スターチ１０ｇ、麦
芽エキス１ｇ、乾燥酵母４ｇ、大豆粉２５ｇ、食塩２
ｇ、リン酸水素二カリウム５４ｍｇ、水１リットル、ｐ
Ｈ７．３）によって２５℃で５日間培養した後、遠心分
離により、菌体と培養上清に分離した。

【００３７】菌体は１０リットルのメタノール中で一晩
攪拌、溶菌させた後、残渣を濾過により除去した。メタ
ノール溶液を減圧濃縮により乾固させた後、得られた固
形分を水飽和ブタノールに溶解し、等量の水で洗浄し、
活性成分をブタノール層に回収した。一方、培養上清を
減圧濃縮して得られた乾固物をメタノール１リットルに
一晩浸漬した後、不溶物を濾過により除去した。次い
で、メタノール溶液を減圧濃縮により乾固した後、得ら
れた固形分を水飽和ブタノールに溶解し、等量の水で洗
浄して活性成分をブタノール層に回収した。

【００３８】活性成分を含む二つのブタノール溶液を合
わせ、ブタノールを溜去した後、得られた活性成分を少
量のメタノールに溶解し、シリカゲルカラムクロマトグ
ラフィーに付した（カラム径４ｃｍ×長さ２５ｃｍ）。
展開溶媒としては酢酸エチル・メタノール・水（１０：
５：０．２５）の混合溶媒を用いた。カラム体積の約２
倍量の展開溶媒を流したときに、活性成分が溶出した。
活性画分を集めて減圧濃縮し、高速液体クロマトグラフ
ィー（カラム；ＹＭＣ製ＯＤＳ−ＡＱカラム径２ｃｍ×
長さ３０ｃｍ）に付した。移動溶媒としては、０．５％
のトリフルオロ酢酸含有アセトニトリルの３８％水溶液
を使用した。活性画分を集めて溶媒を溜去し、白色の粉
末を得た。２０リットルの培養液から得られたＮＰ−０
６は約１００ｍｇであった。

【００３９】次に、得られた白色粉末のＮＰ−０６につ
いて下記の分析及び各種活性試験を行った。 １．ＮＰ−０６のアミノ酸分析 下記の如く、塩酸加水分解法によって、ＮＰ−０６の構
成アミノ酸分析を行った。ＮＰ−０６の構成アミノ酸分
析を塩酸加水分解法により行った。ＮＰ−０６の減圧乾
燥粉末０．２ｍｇを入れたアミノ酸分解用試験管に、６
Ｎの塩酸２００μｌを加えて減圧封管した。１１０℃で
２４時間及び７２時間、それぞれ加水分解を行った後、
試料をＮａＯＨ上で減圧乾燥した。

【００４０】得られた固形分を水５０μｌに溶解した
後、アミノ酸分析装置を用いてアミノ酸分析を行った。
アミノ酸分析結果（実測値）は表１に示した通りであ
る。

【表１】 尚、トリプトファンは酸加水分解反応中に分解するため
に、上記の方法では検出されず、アスパラギンは分解さ
れてアスパラギン酸となる。

【００４１】２．ＮＰ−０６のＣ末端アミノ酸分析 ヒドラジン分解法によりＮＰ−０６のＣ末端アミノ酸分
析を行った。まず、ＮＰ−０６の減圧乾燥粉末２ｍｇを
入れたアミノ酸分解用試験管に、無水ヒドラジン１００
μｌを加え、減圧封管した。１００℃で１８時間分解反
応を行った後、２ｍｌのＤＥＡＥ樹脂カラム（東ソー株
式会社製カラムの商品名）に通液して、副生成物のヒド
ラジドを除去し、Ｃ末端アミノ酸の精製を行った。

【００４２】得られたＣ末端アミノ酸は、ＴＬＣ〔ＴＬ
Ｃプレート：Merk製シリカゲル６０Ｆ₂₄₅ 、展開溶媒：
（１）クロロホルム／メタノール／２８％アンモニア水
（２：２：１）（２）ｎ−ブタノール／酢酸／水（３：
１：１）、検出：ニンヒドリン試薬〕により同定し結
果、トリプトファンであることが判明した。

【００４３】３．ＮＰ−０６のＮＭＲ構造解析 使用機器：ＪＮＭ ＥＸ−４００（ＪＥＯＬ社製の商品
名） 測定条件：１）測定溶媒：ＤＭＳＯ−ｄ６（内部標準Ｔ
ＭＳ）、試料濃度：１００ｍＭ。測定温度：２５℃ ２）測定溶媒：ＣＤ₃ ＯＨ−Ｈ₂ Ｏ（５０％−５０％）
（内部標準ＴＭＳ）、試料濃度：１０ｍＭ。測定温度：
４０℃ 測定データ：ＨＨ−ＣＯＳＹスペクトル（ＤＱＦ−ＣＯ
ＳＹスペクトル） ＨＯＨＡＨＡスペクトル ＮＯＥＳＹスペクトル

【００４４】（１）ＨＨ−ＣＯＳＹ、ＨＯＨＡＨＡスペ
クトル解析結果 ＨＨ−ＣＯＳＹ、ＨＯＨＡＨＡスペクトルの解析によ
り、２１個のアミノ酸のうち、ロイシン（Ｌｅｕ）、イ
ソロイシン（ＩＬｅ）、バリン（Ｖａｌ）×２、アラニ
ン（Ａｌａ）×２、グリシン（Ｇｌｙ）×４、セリン
（Ｓｅｒ）の１１個のアミノ酸を確認した。残りの１０
個のアミノ酸残基は、同じＡＭＸスピン系列を示し、Ｈ
Ｈ−ＣＯＳＹ、ＨＯＨＡＨＡスペクトルでは区別できな
かった。

【００４５】（２）ＮＯＥＳＹスペクトル解析結果 ＨＯＨＡＨＡスペクトルでは同定できない１０個のアミ
ノ残基についての同定を行った。フェニルアラニン（Ｐ
ｈｅ）×２、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔ
ｒｐ）の各アミノ酸残基については、それぞれフェニル
基とβ−プロトンとのＮＯＥ相関ピークによって同定し
た。残りの６アミノ酸残基については、アミノ酸分析結
果のシステイン（Ｃｙｓ）×４、アスパラギン（Ａｓ
ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）及び、Ｈβのケミカル
シフト値によって同定した。

【００４６】同定されたアミノ酸のケミカルシフト値
（ｐｐｍ）を表２に示す。

【表２】

【００４７】（３）ＮＰ−０６のアミノ酸配列 ＮＭＲにより同定した２１個のアミノ酸残基の配列を、
Ｈα_i −ＨＮ_i+1 間のＮＯＥ強度で読み取ることによっ
て決定した。Ｃ末端のアミノ酸では、Ｔｒｐ（２１）の
ＨＮとＰｈｅ（２０）のＨαとの相関ピークのみが認め
られたので、Ｔｒｐ（２１）をＣ末端アミノ酸と決定し
た。この結果はヒドラジン分解法によるＣ末端アミノ酸
解析の結果と一致する。ＮＯＥ強度解析結果を図１に、
ＮＰ−０６のアミノ酸配列を図２に示す。

【００４８】（４）ＮＰ−０６の１次構造解析 ＮＰ−０６の１次構造解析の際に重要であることは、
４つのＣｙｓが、どのような組み合わせでＳＳ結合を形
成しているかということ、及びＣｙｓ（１）のＮ末端
アミノ基が、どのような状態であるのかということであ
る。そこで、この２点について詳しくLonge Range ＮＯ
Ｅ相関ピークを検討した。Ｃｙｓ（１）のＨＮとＡｓｐ
（９）のＨβとの相関ピークから、Ｃｙｓ（１）のＮ末
端とＡｓｐ（９）のβ位カルボキシル基がアミド結合し
ていることを確認した。Ｃｙｓ（１）のＨβとＧｌｙ
（１４）のＨαとの相関ピークにより、Ｃｙｓ（１）と
Ｃｙｓ（１３）がＳＳ結合していることを確認した。Ｃ
ｙｓ（７）のＨβとＣｙｓ（１９）のＨβの相関ピーク
により、Ｃｙｓ（７）とＣｙｓ（１９）がＳＳ結合して
いることを確認した。解析結果を図３に示す。

【００４９】以上の結果を基にＮＰ−０６の１次構造を
化３と決定した。

【化３】 この構造は前述した通り、最近報告されたＲＰ−７１９
５５と非常に類似しているが、Ｖａｌ（４）、ＩＬｅ
（１７）の位置が異なっている。

【００５０】４．ＮＰ−０６の抗ＨＩＶ活性 ＮＰ−０６の抗ＨＩＶ活性を、ＭＴ−４細胞を用いた以
下の試験方法により測定した。この方法は、ＨＩＶ感染
によって引き起こされるＣＤ４陽性細胞の感染死と、薬
剤によるその抑制を判定するものであり、抗ＨＩＶ活性
と細胞毒性を、同時に且つ簡便に測定することが可能で
ある優れた方法である。

【００５１】（試験方法）１×１０⁴ 個のＨＩＶ−１
（ＨＴＬＶ−３Ｂ）に感染させたＭＴ−４細胞と非感染
のＭＴ−４細胞を、種々の濃度のＮＰ−０６と共に、９
６穴マイクロプレートの各穴に加えた。３７℃のＣＯ₂
インキュベーター中で５日間培養した後、3-(4,5-dimet
hyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H tetrazolium bromi
de（ＭＴＴ）を加え、更に２時間培養を続けた。この間
に生細胞に取り込まれた、ＭＴＴは細胞中のミトコンド
リアの有する酵素により還元され、青紫色の水不溶性色
素（formazan) を生成した。５％Ｔriton Ｘ−１００を
含む塩酸酸性２−プロピルアルコール溶液を添加し、生
成した色素を可溶化させた後、５９５ｎｍにおける特異
的吸光度と６５５ｎｍにおける非特異的吸光度をマイク
ロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤモデル３５５０）
を用いて測定することにより、両吸光度の差を求めた。

【００５２】得られた数値を用いてコンピューター処理
（ＢＩＯ−ＲＡＤ Microplate Manager for Macintosh
）を行い、５０％細胞死阻止濃度（ＥＣ₅₀）と５０％
細胞毒性濃度（ＣＣ₅₀）を求め、治療係数（ＣＣ₅₀／Ｅ
Ｃ₅₀）を算出した。ＮＰ−０６、及び、既に抗ＨＩＶ効
果が明らかであると報告されている、デキストラン硫酸
ナトリウム（分子量５０００）（比較薬剤）に対する抗
ＨＩＶアッセイ結果を、表３に示す。

【表３】

【００５３】５．ＮＰ−０６の巨細胞形成阻害効果 ＨＩＶがＴ細胞に感染すると、感染細胞が互いに融合し
て巨細胞を形成することが知られている。そこで、ＮＰ
−０６の巨細胞形成阻害効果を検討した。 （試験方法）５×１０⁴ 個のＨＩＶ−１非感染ＭＯＬＴ
細胞とＨＩＶ−１持続感染ＭＯＬＴ−４細胞を、種々の
濃度のＮＰ−０６と共に、９６穴マイクロプレートの各
穴に加え、３７℃のＣＯ₂ インキュベーター中で２４時
間培養した後、顕微鏡を用いて観察若しくは写真撮影を
行い、多核巨細胞形抑制作用の程度を観察し、抗ＨＩＶ
−１活性（ＨＩＶ−１吸着阻害活性）を評価した。

【００５４】その結果は、表４に示した通りであり、Ｎ
Ｐ−０６濃度が１０μｇ／ｍｌ以上で、巨細胞阻害効果
が確認された。

【表４】

【００５５】実施例２．実施例１と同様に、３０リット
ルのジャーファーメンターを用い、２０リットルの培地
（グルコース２０ｇ、スターチ１０ｇ、麦芽エキス１
ｇ、乾燥酵母４ｇ、大豆粉２５ｇ、食塩２ｇ、リン酸水
素二カリウム５４ｍｇ、水１リットル、ｐＨ７．３）に
よって放線菌ＳＫＨ−２３４４株を５日間培養した後、
遠心分離によって菌体と培養上清に分離した。菌体を１
０リットルのメタノール中で一晩攪拌した後、固形分を
濾過により除去した。次いで減圧濃縮してメタノールを
溜去し、水溶液を得た。

【００５６】培養上清と合わせて、ｐＨを７．０に調製
した後、陰イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ−９
３（オルガノ株式会社製の商品名）塩酸塩型、カラム径
８ｃｍ×５０ｃｍ）に通液し、活性成分を吸着させた。
０．５Ｍ燐酸一カリウム液（ｐＨ４．５）、水、５０％
メタノールを順にそれぞれのカラムの３倍量通液した
後、０．１Ｍ酢酸含有５０％メタノール溶液にて活性成
分を溶出させた。活性画分は減圧乾固して粗精製物３２
０ｍｇを得た（純度約８０％）。以上の結果は本発明の
有効性を実証するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＮＰ−０６におけるアミノ酸のＮＯＥ強度解析
結果を示す図である。

【図２】ＮＰ−０６のアミノ酸配列を示す図である。

【図３】ＮＰ−０６におけるLong range ＮＯＥ相関解
析結果を示す図である。

【図４】ＮＰ−０６の ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す実
測図である。

【図５】ＮＰ−０６の¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す実
測図である。

【図６】ＮＰ−０６のＨＨ−ＣＯＳＹスペクトルを示す
実測図である。

【図７】ＮＰ−０６のＨＯＨＡＨＡスペクトルを示す実
測図である。

【図８】ＮＰ−０６のＮＯＥＳＹスペクトルを示す実測
図である。

【図９】ＮＰ−０６のＩＲスペクトルを示す実測図であ
る。

【図１０】ＮＰ−０６のＭＡＳＳ（ＦＡＢ⁺ ）スペクト
ルを示す実測図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 大田 久美子 山口県岩国市飯田町２丁目８番１号 日本 製紙株式会社岩国技術研究所内 (72)発明者 渡辺 和浩 山口県岩国市飯田町２丁目８番１号 日本 製紙株式会社岩国技術研究所内 (72)発明者 町田 誠 山口県岩国市飯田町２丁目８番１号 日本 製紙株式会社岩国技術研究所内 (72)発明者 村上 邦睦 山口県岩国市飯田町２丁目８番１号 日本 製紙株式会社岩国技術研究所内 (72)発明者 吉岡 英敏 東京都北区王子５丁目21番１号 日本製紙 株式会社中央研究所内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記化１で表されるペプチド化合物。 【化１】
2. 【請求項２】 ストレプトミセス属に属するペプチド化
   合物生産菌を培養し、培養物から請求項１に記載された
   ペプチド化合物を採取することを特徴とする、ペプチド
   化合物の製造方法。
3. 【請求項３】 ストレプトミセス属に属するペプチド化
   合物生産菌が、放線菌ＳＫＨ−２３４４株である、請求
   項２に記載されたペプチド化合物の製造方法。
4. 【請求項４】 ペプチド化合物生産菌培養物から、陰イ
   オン交換樹脂を使用して、請求項１に記載されたペプチ
   ド化合物を採取、精製する、請求項２又は請求項３に記
   載されたペプチド化合物の製造方法。
5. 【請求項５】 請求項１に記載されたペプチド化合物を
   有効成分とすることを特徴とする抗ヒト免疫不全ウイル
   ス剤。