JPH06339390A - Ｂｕ−４１６４ｅ−ａ及びｂ、プロリルエンドペプチダーゼインヒビター - Google Patents

Ｂｕ−４１６４ｅ−ａ及びｂ、プロリルエンドペプチダーゼインヒビター

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JPH06339390A
JPH06339390A JP3216761A JP21676191A JPH06339390A JP H06339390 A JPH06339390 A JP H06339390A JP 3216761 A JP3216761 A JP 3216761A JP 21676191 A JP21676191 A JP 21676191A JP H06339390 A JPH06339390 A JP H06339390A
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compound
strain
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JP3216761A
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Soichiro Toda
惣一郎 戸田
Yasutaro Hamagishi
安太郎 浜岸
Toshikazu Oki
俊一 沖
Koji Tomita
康二 冨田
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Original Assignee
Bristol Myers Squibb Co
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    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D255/00—Heterocyclic compounds containing rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D249/00 - C07D253/00
    • C07D255/02—Heterocyclic compounds containing rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D249/00 - C07D253/00 not condensed with other rings
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】微生物由来のものであって、プロリルエンドペ
プチグーゼ阻害活性を有し、健忘症あるいは痴呆症治療
剤として有用な化合物を提供する。 【構成】一般式１の化合物。この化合物であるストレプ
トミセス属に属する微生物の産出するＢＵ−４１６４Ｅ
Ａ及びＢは、プロリルエンドペプチダーゼ阻害作用を有
し、そのものは該物質の産生菌を醗酵して、その培地よ
り採取することにより得られる。 （ＲはＣ１−Ｃ４アルキル基である）

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、インドで採取せしめら
れた土壌サンプルから分離せしめられた菌株Ｎｏ．Ｒ３
５３−２１によって産生され、単離されたＢＵ−４１６
４Ｅ Ａ及びＢＵ−４１６４Ｅ Ｂと名づけられた新規
化合物に関する。その形態学的性状、細胞化学的性状、
培養並びに生理学的性状によれば、その菌株Ｎｏ．Ｒ３
５３−２１は、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ ｓｐ．）のものと同定せしめられる。
【０００２】ＢＵ−４１６４Ｅ Ａ及びＢは、プロリル
エンドペプチダーゼ（ＰＥＤ）インヒビターであり、抗
健忘症作用及び／又は抗痴呆症作用を有している。その
物理化学的性状及び構造を調べると、これらの化合物
は、ＵＶ吸収性のあるクロモホア（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏ
ｒｅ）を有する新規な１３員環のペプチドであることが
示されている。
【０００３】プロリルエンドペプチダーゼ、すなわちセ
リンプロテアーゼは、バソプレシン、オキシトシン、ア
ンギオテンシンＩ及びアンギオテンシンＩＩ、サプスタ
ンスＰ、プラジキニン、ネウロテンシン等の生物学的に
活性なペプチドの分解に重要な役割をはたしている。プ
ロリエルエンドペプチダーゼはこれらのペプチド類を加
水分解し、その生物活性を調節している。これまでに
Ｄ．Ｄｅ Ｗｉｅｄらはバソプレシンが動物の学習並び
に記憶に関与していることを示唆しそして最近いくつか
の証拠を示している（１−４）。更に、日本ロッシュの
グループは、抗健忘症剤アニラセタム（ａｎｉｒａｃｅ
ｔａｍ）がＰＥＤを阻害することを見出している
（５）。Ｔ．ヨシモト（長崎大）は、この酵素の基質の
特異的な性状を基にＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＣＨ２Ｃｌ、
Ｚ−Ｐｒｏ−プロリナール及びＺ−Ｖａｌ−プロリナー
ルといった特異的なＰＥＤ阻害剤を合成し、ラットにお
ける抗健忘症活性とＰＥＤ阻害活性との関係を示した
（６）。またＨ．カネト等は、二、三のマウスのモデル
を用いバソプレシン及び上記合成ＰＥＤ阻害剤の抗健忘
症活性を確認している（７）。
【０００４】米国特許明細書第４，８５７，５３７号、
同第４，８５７，５２４号、同第４，８２６，８７０
号、同第４，８１０，７２１号、同第４，７７２，５８
７号、同第４，７５７，０８３号、同第４，７４３，６
１６号、及び第４，７０１，４６５号は、ＰＥＤ阻害剤
である化合物の合成法に関するものである。
【０００５】これらのことからみて、本発明者らの微生
物由来の新規な抗健忘症及び／又は抗痴呆症活性化合物
は、はじめてＰＥＤ阻害活性を調べて見出されたものな
のである。
【０００６】本発明は、式
【化４】 （式中ＲはＣ１−Ｃ４アルキル、好ましくはメチル又は
エチルである）を有する化合物で、ＢＵ−４１６４Ｅ
Ａ及びＢＵ−４１６４Ｅ Ｂと呼ばれる新規なＰＥＤイ
ンヒビター化合物であり、抗健忘症及び／又は抗痴呆症
化合物に関するものである。
【０００７】本発明はまた、ストレプトミセス属（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）に属する菌株、好まし
くは菌株Ｎｏ．Ｒ３５３−２１を培養することからなる
ＢＵ−４１６４Ｅ Ａ及びＢの製造法に関する。
【０００８】本発明はさらに有効量のＢｕ−４１６４Ｅ
ＡまたはＢＵ−４１６４Ｅ Ｂと医薬として許容しう
る担体とからなる哺乳動物の健忘症及び／又は痴呆症の
治療用の医薬組成物に関する。
【０００９】本発明のＢＵ−４１６４Ｅ Ａ及びＢＵ−
４１６４Ｅ Ｂは次なる式
【化５】 （式中、ＲはＣ１−Ｃ４アルキルで、好適にはメチル又
はエチルである）を有るものである。
【００１０】これらの化合物は、ストレプトミセス属
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）に属するＢＵ−
４１６４Ｅ ＡまたはＢ生産菌を醗酵せしめて製造され
る。その活性成分は溶媒抽出により培養液から単離せし
められ、カラムクロマトグラフィーにより精製せしめら
れ、二種の成分、すなわちＢＵ−４１６４Ｅ Ａ及びＢ
Ｕ−４１６４ＥＢが得られる。これらの化合物は、ウサ
ギ脳のＰＥＤ及びフラボバクテリウムメニンゴセブチク
ム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓ
ｅｐｔｉｃｕｍ）のＰＥＤに対し、高い阻害活性を示し
た。フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）のＰＥＤはＩＣ５０：０．００２１−０．００３７
μｇ／ｍｌでもって阻害され、他のプロテアーゼ類は試
験されたが阻害を受けなかった。
【００１１】好ましい産生菌は、公知の属であるストレ
プトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する新
規な菌で、本明細書でストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）株菌Ｎｏ．Ｒ３５３−２１と命
名されたものがあげられる。本菌はインドで採取された
土壌サンプルから分離された。本菌の生物学的に純粋な
培養物は、寄託番号ＡＴＣＣ５５００１のもとアメリカ
ンタイプカルチャーコレクション、ロックビル、メリー
ランド、米国に寄託されている。
【００１２】菌の形態学的性状−基生菌糸及び気菌糸の
双方が形成せしめられる。胞子鎖は単軸型に生じるか、
又はしばしば気菌糸上にふさ状に生じ、不規則な開いた
ら旋状またはループ状または直線状である。その鎖は鎖
あたり１０〜３０またはそれ以上の胞子を含有してい
る。その胞子鎖の形態は、レチナクルムアペルトウム
（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌｕｍ−Ａｐｅｒｔｕｍ）に属する
ものである。走査型電子顕微鏡によれば、胞子は球状な
いし卵型（０．７−１．０×０．７−１．５μｍ）で、
なめらかな表面を有している。
【００１３】培養特性及び生理学的性状−気菌糸の色
は、黄色または褐色またはオリーブ色または緑色のかげ
のあるグレーである。基生菌糸の色は、ＩＳＰ培地Ｎ
ｏ．２、５及び７で暗赤色がかった褐色、ＩＰＳ培地Ｎ
ｏ．３で暗オリーブ色の褐色となる。これらの色素は多
少拡散性を有している。ＩＳＰ Ｎｏ．１プロス及びＩ
ＳＰ Ｎｏ．６寒天においてメラミンを産生する。
【００１４】ゼラチン及びでんぷんを加水分解できる。
スキムミルクを凝固せしめペプトン化する。ツアペック
（Ｃｚａｐｅｋ’ｓ）の硝酸塩プロス中で硝酸塩を亜硝
酸塩に還元するが、ペプトンブロス中ではできない。チ
ロシナーゼを産生する。７％ＮａＣｌ寒天中で生育する
が９％ＮａＣｌ寒天中で生育しない。生育温度の範囲は
１３℃〜５０℃である。１０℃及び５２℃では何らの生
育も観察されない。
【００１５】その培養特性及び糖類の利用性は表１及び
表２にそれぞれ示した。
【０００６】細胞の化学的性状−全細胞加水分解物はＬ
Ｌ−ジアミノピメリン酸を含有している。分類学上の位
置−菌株Ｒ３５３−２１の上記形態学的性状、培養特性
及び生理学的性状そして細胞の化学的性状は、その菌株
がストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏ−ｍｙｃｅｓ）
に属することを示している。
【００１７】Ｐｒｉｄｈａｍ及びＴｒｅｓｎｅｒ
（８）、そしてＳｈｉｒｌｉｎｇ及びＧｏｔｔｌｉｅｂ
（９）の記述に従えば、菌株Ｒ３５３−２１は、この属
の数多くの種に似ており、特にストレプトミセスアムボ
ファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆ
ａｃｉｅｎｓ）、ストレプトミセスユーリセルムス
（Ｓ．ｅｕｒｙｔｈｅｒｍｕｓ）、ストレプトミセスグ
リセオスポレウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｓｐｏｒｅｕ
ｓ）、ストレプトミセスルテオグリセウス（Ｓ．ｌｕｔ
ｅｏｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトミセスミクロフラプ
ス（Ｓ．ｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）、ストレプトミセス
ネヤガワエンシス（Ｓ．ｎｅｙａｇａｗａｅｎｓｉ
ｓ）、ストレプトミセスオリボクロモジェネス（Ｓ．ｏ
ｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトミセス
レシストミシフィクス（Ｓ．ｒｅｓｉｓｔｏｍｙ−ｃｉ
ｆｉｃｕｓ）、及びストレプトミセスヴオラセオクロモ
ジエネス（Ｓ．ｖｉｏｌａｃｅｏｃｈ−ｒｏｍｏｇｅｎ
ｅｓ）に似ている。菌株Ｒ３５３−２１の属する種を決
定するためには更なる比較調査が必要である。現在のと
ころ、菌株Ｒ３５３−２１はストレプセス属に属する新
規株として命名される。
【００１８】
【表１】
【００１９】
【表２】
【００２０】ＢＵ−４１６４Ｅ Ａ及びＢは、ストレプ
トミセス属に属するＢＵ−４１６４Ｅ Ａ及びＢ産生株
のＡＴＣＣ５５００１またはその変異株あるいは変種株
を栄養培地水溶液中深部好気条件下に培養することによ
り製造しうる。該菌は、資化性炭素源、例えば、資化性
炭水化物を含有する栄養培地中で生育せしめられうる。
好適な炭素源の例としては、ラクトース、グリセロー
ル、シュクロース、コーンスターチ、グルコース、アン
ノース、フルクトース、セロビオース、トレハロース、
アンニトール及びキシロースがあげられる。栄養培地は
また資化性の窒素源、例えばフィッシュミール、ペプト
ン、大豆粉、ピーナッツミール、綿実ミール又はコーン
スティープリカーなどが含まれるべきである。栄養無機
塩もまた加えられ、そのような塩としては、ナトリウ
ム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、リン酸塩、
硫酸塩、塩化物、臭化物、硝酸塩、炭酸塩等のイオンを
与えることのできる通常の塩のうちのいずれのものをも
あげることができる。
【００２１】ＢＵ−４１６４Ｅ Ａ及びＢの化合物の製
造は、該菌が満足しうる生育度を示すようないかなる温
度、例えば約１４−４４℃で行なえ、通常約２８℃で行
なわれる。通常、最適な生産性は、約３−６日間培養し
た後得られる。醗酵は、フラスコ中であるいは実験室レ
ベルまたは工業的なファーメンターの各種の容量のもの
を用いて行なわれる。タンク醗酵を行なう場合には、該
微生物の斜面培養物または土壌培養物または凍結した培
養物を液体プロスに接種し栄養プロス中に生育期にある
接種物を形成せしめることが望ましい。その生育期にあ
る接種物を産生するための培地は、本発明の新規化合物
を製造する場合のタンクにおいて用いられる培地と、そ
の微生物が良好に生育せしめられれば同一であっても異
なっていてもよい。
【００２２】ＢＵ−４１６４Ｅ Ａ及びＢが産生されて
いるか否かは、本発明の化合物に感受性であることが知
られた微生物に対する活性について培地ブロスのサンプ
ルあるいは固体菌糸の抽出液を用い醗酵の途中で調べた
り、インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）の細胞毒アッセイ、
例えば、ウサギ脳ＰＥＤ及び／又はフラボバクテリウム
メニンゴセブチクム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）のＰＥＤを用いてア
ッセイすることにより調べて確かめられる。
【００２３】醗酵工程が終った後、ＢＵ−４１６４Ｅ
Ａ及びＢは、醗酵ブロスから回収され、適当な有機溶媒
で抽出されて次に一連のカラムクロマトグラフィーによ
って分離せしめられる。下記実施例１及び２においては
実質的に純粋なＢＵ−４１６４Ｅ Ａ及びＢを得るため
の具体的な方法が示されてある。
【００２４】その他の微生物に関し、本発明の新しいＢ
Ｕ−４１６４Ｅ Ａ又はＢ産生株すなわちストレプトミ
セス属ＡＴＣＣ５５００１株の特徴は変わっていても
い。そのＡＴＣＣ５５００１株の組換え体、変種体ある
いは変異体は各種の公知の変異誘発法、例えば紫外線、
Ｘ−線、高い振動数の波、放射線又は化学薬品で処理し
て得られる。天然あるいは誘導されたストレプトミセス
属ＡＴＣＣ５５００１株の変種体、変異体あるいは組換
え体で、ＢＵ−４１６４Ｅ Ａ又はＢを産生するという
特徴を保持しているものも、本発明の範囲内のものであ
る。
【００２５】ＢＵ−４１６４Ｅ Ａ及びＢの物理化学的
性状 ＢＵ−４１６４Ｅ Ａ及びＢは、白色無定形粉末として
得られる。それらの物理化学的性状は表３にまとめて示
してあるように互いに非常に似ている。それらはジメチ
ルスルホキシドに可溶性であるが、実質上その他の有機
溶媒及び水には不溶性である。ＢＵ−４１６４Ｅ Ａ及
びＢは、ニンヒドリン、トルンス（Ｔｏｌｌｅｎｓ）及
び坂口反応に陰性である。ＢＵ−４１６４Ｅ Ａ及びＢ
（それぞれ図１及び図２参照）のＩＲスペクトルは、１
６６０ｃｍ−１及び１５２０−１５４０ｃｍ−１に強い
吸収を有しており、それはペプチドグループ抗生物質に
属することを示唆している。ＵＶスペクトルにおいて
は、ＢＵ−４１６４Ｅ Ａ及びＢは２１２ｎｍ及び２１
３ｎｍにそれぞれ吸収の極大を有している。ＢＵ−４１
６４Ｅ Ａ及びＢの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル及び１３Ｃ
−ＮＭＲスペクトルは、それぞれ図３及び図４、そして
図５及び図６に示してある。これらの成分の双方は、そ
れを完全に酸で加水分解すると、同じニンヒドリン陽性
生成物を与え、それらはアミノ酸分析でオルニチンとロ
イシンであると同定された。
【００２６】
【表３】
【００２７】本発明はまた有効量のＢＵ−４１６４Ｅ
ＡまたはＢＵ−４１６４Ｅ Ｂあるいはそれらの配合物
を動物に投与して健忘症及び／又は痴呆症になっている
者を治療するための治療法に関する。
【００２８】本発明はさらに有効量のＢＵ−４１６４Ｅ
ＡまたはＢＵ−４１６４Ｅ Ｂあるいはそれらの配合
物と、医薬として許容しうる担体または希釈剤とを含有
する医薬組成物にも関する。これらの組成物は所望の投
与ルートに適した医薬のいずれの形態にもすることがで
きる。
【００２９】本発明の医薬組成物は、他の活性成分、例
えば、他の抗健忘症剤及び／又は抗痴呆症剤を含むこと
ができ、所望の投与ルートに適したいずれの形態にもす
ることができる。このような組成物の例としては、経口
投与用の固体組成物、例えば、カプセル剤、錠剤、丸
剤、粉末剤または顆粒剤、経口投与用の液体組成物、例
えば、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤またはエリキシル
剤、非経口投与用の製剤、例えば、無菌溶液剤、懸濁剤
またはエマルジョン剤があげられる。それらはまたその
使用の直前に無菌水、生理的食塩水またはその他の注射
可能な媒質に溶解することのできる無菌固体組成物の形
態に製造されていてもよい。
【００３０】その投与量は一般的には約５０−２００ｍ
ｇの範囲であるが、実際の量は、その使用する化合物、
製剤化された組成物として何を使うか、投与方法及び投
与形態、治療を受ける動物、症状、疾患に応じて変えら
れる。当業者は、年令、体重、性別、食事、投与時間、
投与ルート、排泄速度、患者の状態、薬物の組み合わ
せ、感受性、病気の重傷度等を考慮して薬剤の作用を修
飾することなどをする。ある条件のもとでの最適な投与
量は実験動物などを用いて得られた値をもとにし、通常
の投与量決定法を用いて当業者に確認される。
【００３１】本発明は特定の実施例あるいは具体例にも
とづいて説明されているが本発明はそれらに限定される
ものではない。
【００３２】
【実施例】
実施例１ （醗酵）ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ ｓｐ．）のＮｏ．Ｒ３５３−２１株の修飾ベネット
（Ｂｅｎｎｅｔｔ，ｓ）培地で成熟化した斜面培養物で
ループに富んだものを、１００ｍｌの生育培地：可溶性
デンプン（ニチデン化学）３％、バクトーリバー（Ｂａ
ｃｔｏ−ｌｉｖｅｒ）（Ｄｉｆｃｏ）１％、ポリペプト
ン（Ｄａｉｇｏ Ｅｉｙｏ化学）０．５％、ＮａＣｌ
０．３％、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．１％及びＣａＣＯ
２ ０．６％、オートクレープに かける前にｐＨを
７．０に合わせる を含有する５００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中に
接種した。培養物をロータリーシェーカー（２００ｒｐ
ｍ）上で２８℃または約２８℃で３日間培養し、その生
育物の５ｍｌを上記生育培地と同じ組成の産生培地１０
０ｍｌを入れた５００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ
に移した。ロータリーシェーカー（２００ｒｐｍ）上で
２８℃または約２８℃で４日間醗酵させた。醗酵ブロス
中の抗生物質の産生性はプロリルエンドペプチダーゼ阻
害アッセイ法でモニターした。三日間の培養後その醗酵
ブロスは×６４０希釈でＩＣ５０でみて最大の阻害活性
が得られた。
【００３３】大量に製造するため、タンク醗酵を行なっ
た。フラスコ醗酵により製造した種菌培養物２ｌを上記
した組成と同じ組成の産生培地１２０ｌを含有する２０
０ｌタンクファーメンターに移した。２５０ｒｐｍで撹
拌し、１２０ｌ／分の速度で空気を入れ、２８℃または
約２８℃で３日間醗酵させた。
【００３４】実施例２ （抽出及び精製）実施例１の一般的方法で得られたブロ
ス（６０ｌ）を約１時間ｎ−ブタノール（３２ｌ）と共
に激しく攪拌した。有機相（２５ｌ）をＳｈａｒｐｌｅ
ｓ遠心機（Ｋｏｋｕｓａｎ Ｎｏ．４Ａ）を用いて分離
し、減圧下蒸発乾固した。残留物を水（２．３ｌ）と酢
酸エチル（２．５ｌ）との混合物と共に握り混ぜた。酢
酸エチル相をアルカリ性の水（ｐＨ９．０、２．５ｌ）
で、次に酸性の水（ｐＨ２．０、２．５ｌ）で洗い、減
圧下濃縮乾固して、褐色油状物（２０．１ｇ、ＩＣ５０
ｖｓ Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＰＥＤ；１．
２５μｇ／ｍｌ）を得た。油状物をダイアイオン（Ｄｉ
ａｉｏｎ）ＨＰ−２０（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅ
ｍ．Ｉｎｄ．Ｔｏｋｙｏ、８００ｍｌ）のカラムにかけ
た。そのカラムを水（２ｌ）、５０％メタノール（２
ｌ）、６０％メタノール（２ｌ）、７０％メタノール
（１．５ｌ）及び８０％メタノール（２ｌ）で順次溶出
した。７０％メタノール溶出後の溶出液を１５ｍｌづつ
の分画で集め、各分画のＰＥＤ活性を測定した。活性の
ある分画を一緒にし（Ｎｏ．９７−１７０）、減圧下濃
縮し、２．１５ｇの褐色粉末（ＩＣ５０：０．１３μｇ
／ｍｌ）を得た。
【００３５】このサンプルを逆相シリカゲルカラム（Ｙ
ＭＣ−ＯＤＳ、８００、２５ｍｌ）のクロマトグラフィ
ーにかけ３０％アセトニトリルの０．１５Ｍリン酸緩衝
液ｐＨ３．５（１５ｍｌカット、分画Ｎｏ．１−５
０）、同３５％（Ｎｏ．５１−１００）、同４０％（Ｎ
ｏ．１０１−１５０）そして同４５％（Ｎｏ．１５１
−）で溶出した。ＰＥＤに活性な分画（Ｎｏ．６３−１
５５）を集め、濃縮した。次にその濃縮物をｎ−ブタノ
ールで抽出し、減圧下その抽出液の溶媒を除去し、ＢＵ
−４１６４Ｅ Ａ及びＢを含有する粗製固体（１７１ｍ
ｇ、ＩＣ５０：０．０１５μｇ／ｍｌ）を得た。その混
合物を、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｙ
ＭＣ−ＯＤＳ、１５０ｍｌ）により精製した。カラムを
３０％アセトニトリルの０．１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０、５００ｍｌ）で洗い、次に３５％アセトニトリ
ルの溶液（１５ｍｌづつ分画）で展開した。分画Ｎｏ．
１０−１５を一緒にし、濃縮し、ｎ−ブタノールで抽出
した。抽出物を減圧下蒸発乾固した。残留物をｅｐｈａ
ｄｅｘ ＬＨ−２０（φ１×３５ｃｍ）のクロマトグラ
フィーにかけジクロロメタン−メタノール（１：２）で
溶出し、１４ｍｇのＢＵ−４１６４Ｅ Ａを得た。上記
逆相シリカゲルクロマトグラフィーでの分画Ｎｏ．２６
−３３を同様に処理し、９ｍｇのＢＵ−４１６４Ｅ Ｂ
を得た。
【００３６】実施例３ （ＢＵ−４１６４Ｅ Ａ及びＢの生物活性；プロリルエ
ンドペプチダーゼの阻害） ２種の酵素が用いられた：スクリーニング及び単離法調
査に際してはフラボバクテリウムの酵素を、そしてイン
ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｏｒｏ）評価には部分的に精製し
たウサギの脳の酵素。１０μｌのフラボバクテリウムメ
ニンゴセブチクム（１０、１１）（Ｆｌａｂｖｏｂａ−
ｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）Ｐ
ＥＤ（生化学工業（株）、０．５ｕｎｉｔ／ｍｌ）ある
いは脳全体のホモジュネートから部分的に精製されたウ
サギ脳のＰＥＤ（１２）、１３．５μｌの試験用サンプ
ル及び８６．５μｌの１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）を９６穴のマイクロプレートのウエル中で混合
し、約３０分間約３０℃でブレインキュベーションし
た。４０％ジオキサン−１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ
７．０中の２ｍＭカルボベンジロキシグリシル−ブロリ
ル−ｐ−ニトロアニリン（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮ
Ａ）液２５μｌを加えて反応を開始した。
【００３７】約３０℃で約５分間インキュベーションし
た後、遊離されてくるｐ−ニトロアニリンの量を、４１
４ｎｍでマイクロプレートオートリーダー（Ｔｉｔｅｒ
ｔｅｋ Ｍｕｌｔｉ−ｓｋａｎＲ ＭＭＣ）でもって比
色定量して測定した。コントロールとしては、試験用サ
ンプルの代わりに反応用緩衝液を反応混合物中に加え
た。次なる式に従って阻害率を計算した。
【数１】
【００３８】表４にＢＵ−４１６４Ｅ Ａ及びＢ、参考
化合物、Ｚ−Ｖａｌ−プロリナールの活性をまとめて示
す。
【表４】
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１はＢＵ−４１６４Ｅ ＡのＩＲスペクトル
を示す。
【図２】図２はＢＵ−４１６４Ｅ ＢのＩＲスペクトル
を示す。
【図３】図３はＢＵ−４１６４Ｅ Ａの１Ｈ−ＮＭＲス
ペクトルを示す。
【図４】図４はＢＵ−４１６４Ｅ Ｂの１Ｈ−ＮＭＲス
ペクトルを示す。
【図５】図５はＢＵ−４１６４Ｅ Ａの１３Ｃ−ＮＭＲ
スペクトルを示す。
【図６】図６はＢＵ−４１６４Ｅ Ｂの１３Ｃ−ＮＭＲ
スペクトルを示す。
【００４０】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 沖 俊一 日本国神奈川県横浜市栄区庄戸４−20−10 (72)発明者 冨田 康二 日本国東京都世田谷区上用賀５−２−３

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 次式 【化１】 （式中ＲはＣ１−Ｃ４アルキル基である）の化合物。
  2. 【請求項２】 Ｒがメチル又はエチルである請求項１記
    載の化合物。
  3. 【請求項３】 ストレプトミセス属に属するＢＵ−４１
    ６４Ｅ ＡまたはＢ産生菌を培養し、培地よりＢＵ−４
    １６４Ｅ ＡまたはＢを単離することを特徴とする、次
    式 【化２】 （式中ＲはＣ１−Ｃ４アルキル基である）の化合物の製
    造法。
  4. 【請求項４】 ストレプトミセス属に属するＢＵ−４１
    ６４Ｅ ＡまたはＢ産生菌を炭素及び窒素の資化源を含
    有する栄養培地水溶液中で深部通気条件下に培養して、
    実質的な量のＢＵ−４１６４Ｅ ＡまたはＢを産生せし
    め、次に培地よりそのＢＵ−４１６４Ｅ ＡまたはＢを
    単離するものである請求項３記載の方法
  5. 【請求項５】 使用菌がストレプトミセス属に属するＢ
    Ｕ−４１６４Ｅ ＡまたはＢ産生菌またはそれらの突然
    変異株あるいは変種株である請求項３記載の方法。
  6. 【請求項６】 栄養培地水溶液中で培養すると、抗生物
    質ＢＵ−４１６４ＥＡまたはＢを産生することのできる
    ストレプトミセス属に属する菌株、ＡＴＣＣ５５００
    １、またはその突然変異株あるいは変種株。
  7. 【請求項７】 次式 【化３】 （式中ＲはＣ１−Ｃ４アルキル基である）の化合物を有
    効成分として含有する健忘症または痴呆症治療用医薬組
    成物。
  8. 【請求項８】 不活性な医薬として許容しうる担体また
    は希釈剤の配合されている請求項７記載の医薬組成物。
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