JPH0827277B2 - 試薬組成物及びその全血中の網状赤血球の同定と特性表示のための使用 - Google Patents
試薬組成物及びその全血中の網状赤血球の同定と特性表示のための使用Info
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Description
【０００１】
【発明の技術分野】本発明は試薬組成物と、全血試料中
の細胞の同定（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ）と特性表示
（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ）とにおけるその利
用、更に特別には、試薬組成物と、光散乱と螢光との流
通式細胞測定（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）技術に
よる、全血試料中の（ｉ）網状赤血球の同定ならびに
（ｉｉ）多数の個別の網状赤血球および赤血球の体積と
ヘモグロビン濃度とヘモグロビン含有量との同時測定と
におけるその利用に関する。
の細胞の同定（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ）と特性表示
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用、更に特別には、試薬組成物と、光散乱と螢光との流
通式細胞測定（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）技術に
よる、全血試料中の（ｉ）網状赤血球の同定ならびに
（ｉｉ）多数の個別の網状赤血球および赤血球の体積と
ヘモグロビン濃度とヘモグロビン含有量との同時測定と
におけるその利用に関する。
【０００２】
【先行技術の説明】凡ての高等哺乳動物においては血液
は、種種な小体、赤色血液細胞（赤血球）と白色血液細
胞（白血球）と血小板とが懸濁している水性流体部分
（血漿）より成る。血漿は大約９０％の水と９％の蛋白
質と０．９％の塩と痕跡の他の材料例えば糖、尿素、尿
酸などを包含する組成を持っている。
は、種種な小体、赤色血液細胞（赤血球）と白色血液細
胞（白血球）と血小板とが懸濁している水性流体部分
（血漿）より成る。血漿は大約９０％の水と９％の蛋白
質と０．９％の塩と痕跡の他の材料例えば糖、尿素、尿
酸などを包含する組成を持っている。
【０００３】末梢血液（即ち、骨髄外の血液）の細胞即
ち小体は２つの主要な群、即ち酸素を輸送することが第
１目的である赤血球と、免疫システムおよび体に異質な
材料の破壊とが第１機能である白血球とに分けられる。
この２つの主要な群に加え、血液は、止血において重要
な所謂血小板を含有している。
ち小体は２つの主要な群、即ち酸素を輸送することが第
１目的である赤血球と、免疫システムおよび体に異質な
材料の破壊とが第１機能である白血球とに分けられる。
この２つの主要な群に加え、血液は、止血において重要
な所謂血小板を含有している。
【０００４】赤血球成熟の最終段階は骨髄から放出され
た後、これらの細胞が末梢血液中を循環している間に起
る。これらの若い赤色細胞即ち“網状赤血球”（以下、
網赤血球とも言う）は核そしてそれ故分裂またはリボ核
酸（ＲＮＡ）を合成する能力を失う。これらの機能は終
止してしまうが網赤血球は尚代謝的には活性であり、蛋
白質を合成し、ヘム合成のため鉄を取込み、そしてエネ
ルギー豊な状態を維持するために要する必要な代謝反応
を行うことができる。これらの細胞は、網赤血球中の陰
イオン性のＲＮＡと反応し、網赤血球にその名を与えて
いる網赤血球中の細いまたは粗い染色した細網中に沈澱
するカチオン染料の溶液に曝すことによって、普通非常
に容易に成熟赤血球とは区別される。
た後、これらの細胞が末梢血液中を循環している間に起
る。これらの若い赤色細胞即ち“網状赤血球”（以下、
網赤血球とも言う）は核そしてそれ故分裂またはリボ核
酸（ＲＮＡ）を合成する能力を失う。これらの機能は終
止してしまうが網赤血球は尚代謝的には活性であり、蛋
白質を合成し、ヘム合成のため鉄を取込み、そしてエネ
ルギー豊な状態を維持するために要する必要な代謝反応
を行うことができる。これらの細胞は、網赤血球中の陰
イオン性のＲＮＡと反応し、網赤血球にその名を与えて
いる網赤血球中の細いまたは粗い染色した細網中に沈澱
するカチオン染料の溶液に曝すことによって、普通非常
に容易に成熟赤血球とは区別される。
【０００５】網赤血球は正常では全赤色血液細胞個体群
の約０．５〜２％を成しているが、この百分率は異常状
態では劇的に変化し得る。例えば、網赤血球数は長年血
液疾患の研究において診断の助けとして、出血につづく
赤色血液細胞再生の指針として、並に或る種の悪性疾病
の化学療法における初期の毒性の監視のために用いられ
て来た。
の約０．５〜２％を成しているが、この百分率は異常状
態では劇的に変化し得る。例えば、網赤血球数は長年血
液疾患の研究において診断の助けとして、出血につづく
赤色血液細胞再生の指針として、並に或る種の悪性疾病
の化学療法における初期の毒性の監視のために用いられ
て来た。
【０００６】核酸（ＲＮＡとＤＮＡ）は実際上どんなカ
チオン染料ででも染色できるポリアニオンである。網赤
血球中のＲＮＡはほんの数種のカチオン染料｛ブリリア
ントクレジルブルー（ＢＣＧ）とニューメチレンブルー
（ＮＭＢ）とオーラミンＯ（ＡｕＯ）とアクリジンオレ
ンジ（ＡＯ）とチアゾールオレンジ（ＴＯ）とピロニン
Ｙ（ＰＹ）とを含む｝でしか染色できない。これらの染
料の中、唯一つの部分集合のみが速に細胞に透過（そし
て従って染色）し得る。網赤血球染色の速さとその染色
の程度は染料の細胞外濃度と、網赤血球膜を通してのそ
の染料の透過速度と、その染料と網赤血球ＲＮＡとの間
の特定の結合恒数とに左右される。後の２つの性質は異
っていて各染料に対し容易には予言できず、従って有用
な網赤血球染色を発見するため試行錯誤が必要である。
凡てのカチオン物質が元の赤色細胞（および網赤血球）
膜を透過できるわけではなく、必然的にカチオンを伴う
アニオンの本性は、そのカチオン物質が速やかに、遅く
透過あるいは全く透過するかしないかに影響し得る。疎
水性分子は一般に親水性分子より速かに赤色細胞膜を透
過し、小さい分子は大きい分子より速かに膜を透過す
る。網赤血球を染色できるこれらカチオン染料と混合し
た塩または緩衝剤の部分集合のみが速かな染色を可能す
る。即ち“誤った”緩衝剤とでは“正しい”染料でも網
赤血球を染色するのに“永久の”時間がかかる。再び、
網赤血球染色混合物の有用な処方発見のため試行錯誤が
必要である。それ故指針として用いることができる種種
な“法則”にも拘らず、直感的に、どんなカチオン染料
が、どんな条件下で速かに透過し、網赤血球を染色する
かを予言することは未だ不可能である。
チオン染料ででも染色できるポリアニオンである。網赤
血球中のＲＮＡはほんの数種のカチオン染料｛ブリリア
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ンジ（ＡＯ）とチアゾールオレンジ（ＴＯ）とピロニン
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料の中、唯一つの部分集合のみが速に細胞に透過（そし
て従って染色）し得る。網赤血球染色の速さとその染色
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の染料の透過速度と、その染料と網赤血球ＲＮＡとの間
の特定の結合恒数とに左右される。後の２つの性質は異
っていて各染料に対し容易には予言できず、従って有用
な網赤血球染色を発見するため試行錯誤が必要である。
凡てのカチオン物質が元の赤色細胞（および網赤血球）
膜を透過できるわけではなく、必然的にカチオンを伴う
アニオンの本性は、そのカチオン物質が速やかに、遅く
透過あるいは全く透過するかしないかに影響し得る。疎
水性分子は一般に親水性分子より速かに赤色細胞膜を透
過し、小さい分子は大きい分子より速かに膜を透過す
る。網赤血球を染色できるこれらカチオン染料と混合し
た塩または緩衝剤の部分集合のみが速かな染色を可能す
る。即ち“誤った”緩衝剤とでは“正しい”染料でも網
赤血球を染色するのに“永久の”時間がかかる。再び、
網赤血球染色混合物の有用な処方発見のため試行錯誤が
必要である。それ故指針として用いることができる種種
な“法則”にも拘らず、直感的に、どんなカチオン染料
が、どんな条件下で速かに透過し、網赤血球を染色する
かを予言することは未だ不可能である。
【０００７】流通式細胞測定法の基本的考えは、本質的
には特定なセンシング領域を通じて１時に１つの細胞を
通過させることにある。典型的には水力学的集束によっ
て、単一細胞を、集束された光源と、散乱、吸収または
螢光光測定のための検出システムより成るセンシング域
を通過させる。１つの粒子がそれが横切る光に対して持
つ影響は多くの方法で検出できる。一般に粒子は、それ
が懸濁されている媒質の屈折率とは異る屈折率を持つ。
それ故、それが照明されている光を、ある範囲の角度を
通して、屈折率差と粒子寸法とその形と屈折率と構造と
の内部的変化と、並に照明している光の波長とによって
左右される種種な強度をもって散乱する。（均一な球に
ついてはＭｉｅの散乱理論が散乱光の分布と強度との完
全な説明を与える。）また粒子は入射光の幾らかを吸収
してもよい。後の場合においては、吸収した光の或る割
合を、典型的には吸収した光の波長より長い波長で、螢
光として再放射してもよい。
には特定なセンシング領域を通じて１時に１つの細胞を
通過させることにある。典型的には水力学的集束によっ
て、単一細胞を、集束された光源と、散乱、吸収または
螢光光測定のための検出システムより成るセンシング域
を通過させる。１つの粒子がそれが横切る光に対して持
つ影響は多くの方法で検出できる。一般に粒子は、それ
が懸濁されている媒質の屈折率とは異る屈折率を持つ。
それ故、それが照明されている光を、ある範囲の角度を
通して、屈折率差と粒子寸法とその形と屈折率と構造と
の内部的変化と、並に照明している光の波長とによって
左右される種種な強度をもって散乱する。（均一な球に
ついてはＭｉｅの散乱理論が散乱光の分布と強度との完
全な説明を与える。）また粒子は入射光の幾らかを吸収
してもよい。後の場合においては、吸収した光の或る割
合を、典型的には吸収した光の波長より長い波長で、螢
光として再放射してもよい。
【０００８】これらおよび他の影響は散乱光、非散乱光
並に螢光の種種な角度間隔を測定するために備えられた
光検出器を用いて測定できる。
並に螢光の種種な角度間隔を測定するために備えられた
光検出器を用いて測定できる。
【０００９】粒子が細胞ほど、典型的には直径１５μｍ
以下ほど小さい場合、高速度でそれが通過することによ
り（典型的には広く間隔をあけた細胞毎秒数百乃至数
千）影響され、そして懸濁液流の照明されている部分に
落ちる毎秒当りの光子数に比較して、｛そして、吸収検
出器（そして螢光検出器）のバックグラウンド照明に比
較して｝照明ビーム中の光子数は非常に少数であり得
る。それ故、粒子間の小さい特別な差異の検出感度の限
界は、決定的には光子流束（少くとも光源の本来の“輝
度”に左右される）と、粒子間の他の大小の差異により
生じる光子流束の攝動がどの位大きいかに左右される。
以下ほど小さい場合、高速度でそれが通過することによ
り（典型的には広く間隔をあけた細胞毎秒数百乃至数
千）影響され、そして懸濁液流の照明されている部分に
落ちる毎秒当りの光子数に比較して、｛そして、吸収検
出器（そして螢光検出器）のバックグラウンド照明に比
較して｝照明ビーム中の光子数は非常に少数であり得
る。それ故、粒子間の小さい特別な差異の検出感度の限
界は、決定的には光子流束（少くとも光源の本来の“輝
度”に左右される）と、粒子間の他の大小の差異により
生じる光子流束の攝動がどの位大きいかに左右される。
【００１０】吸収、散乱並に螢光流通式細胞測定信号に
おける妨害雑音の主要な源は各信号の種類について全く
異る。第１近似で、染色または未染色の細胞からの螢光
信号の大きさは信号を生じさせる細胞の形まだは方向に
より殆んど影響されないが、散乱並に吸収信号は形と方
向とにより非常に強く影響される。極端な例として、人
赤血球の生来の両凹形はそれが発生させる吸収および散
乱信号に深く影響し、典型的な、古典的に染色された網
赤血球の小さい吸収信号より大きい影響を持っている。
このことが、別の特許出願の主題となっている本発明者
の発明が成される以前には、網赤血球計数または一般に
は細胞中の吸収分子の低濃度の測定について吸収流通式
細胞測定法が有用でなかった理由である。他方、細胞中
または（例えば結合してない螢光染料）周囲の媒質中の
弱い螢光材料は吸収または散乱信号に対しては実質的に
は影響はない。
おける妨害雑音の主要な源は各信号の種類について全く
異る。第１近似で、染色または未染色の細胞からの螢光
信号の大きさは信号を生じさせる細胞の形まだは方向に
より殆んど影響されないが、散乱並に吸収信号は形と方
向とにより非常に強く影響される。極端な例として、人
赤血球の生来の両凹形はそれが発生させる吸収および散
乱信号に深く影響し、典型的な、古典的に染色された網
赤血球の小さい吸収信号より大きい影響を持っている。
このことが、別の特許出願の主題となっている本発明者
の発明が成される以前には、網赤血球計数または一般に
は細胞中の吸収分子の低濃度の測定について吸収流通式
細胞測定法が有用でなかった理由である。他方、細胞中
または（例えば結合してない螢光染料）周囲の媒質中の
弱い螢光材料は吸収または散乱信号に対しては実質的に
は影響はない。
【００１１】しかし、螢光流通式細胞測定法において
は、光源が充分強く、迷光およびシステムの螢光が最低
にされている場合、選択的に染色された細胞の未染色細
胞からの区別の感度限界は、未染色細胞内の成分からの
見掛けの“バックグラウンド螢光”の相対的な大きさと
（または）染色および未染色細胞を囲む試料流中の媒質
の螢光水準とにより決められる。網赤血球染色に伴い、
細胞を囲む、試料流中には常に幾らかの溶解している染
料平衡濃度が存在する。細胞ＲＮＡへの与えられた結合
水準に関して、外部染料対細網結合染料の比は、その染
料のＲＮＡへの比結合恒数の増大につれて、減少する。
従って、その結合恒数が高ければ高い程、必要な外部染
料濃度は低く、“バックグラウンド”信号は低く、Ｓ／
Ｎ比は高い。また、若し、未結合染料の螢光効率が細網
結合染料の螢光効率より低ければ、Ｓ／Ｎ比が改善され
る。事実、ＡｕＯとＴＯとチオフラビンＴとを利用する
方法は結合並に未結合螢光効率の差に左右される。しか
し、以下説明する好ましい方法は、高いＳ／Ｎ比達成の
ための高い特異的結合恒数と、１つの場合、長波長（赤
色）における未染色細胞のより低い非特異的螢光とに依
っている。
は、光源が充分強く、迷光およびシステムの螢光が最低
にされている場合、選択的に染色された細胞の未染色細
胞からの区別の感度限界は、未染色細胞内の成分からの
見掛けの“バックグラウンド螢光”の相対的な大きさと
（または）染色および未染色細胞を囲む試料流中の媒質
の螢光水準とにより決められる。網赤血球染色に伴い、
細胞を囲む、試料流中には常に幾らかの溶解している染
料平衡濃度が存在する。細胞ＲＮＡへの与えられた結合
水準に関して、外部染料対細網結合染料の比は、その染
料のＲＮＡへの比結合恒数の増大につれて、減少する。
従って、その結合恒数が高ければ高い程、必要な外部染
料濃度は低く、“バックグラウンド”信号は低く、Ｓ／
Ｎ比は高い。また、若し、未結合染料の螢光効率が細網
結合染料の螢光効率より低ければ、Ｓ／Ｎ比が改善され
る。事実、ＡｕＯとＴＯとチオフラビンＴとを利用する
方法は結合並に未結合螢光効率の差に左右される。しか
し、以下説明する好ましい方法は、高いＳ／Ｎ比達成の
ための高い特異的結合恒数と、１つの場合、長波長（赤
色）における未染色細胞のより低い非特異的螢光とに依
っている。
【００１２】全血の抗凝固性にされている試料中の網赤
血球百分率の計数に用いることができる幾つかの半自働
化方法が用いられている。現在の各方法においては、網
赤血球中のＲＮＡを染色するために、有機カチオン染料
例えばＡＯ、ＡｕＯまたはＴＯを含有する希釈剤を用い
ている。その染料は細胞膜を透過し、ＲＮＡに結合し、
通常、各網赤血球中の“細網”を沈澱する。染色したＲ
ＮＡからの信号量は大約ＲＮＡ含有量に比例する。適当
に染色後、溶出液中の網赤血球百分率測定のため、適当
な励起光源（典型的には４８８ｎｍで放射するアルゴン
イオンレーザー）と発光検出システムとを備えた螢光流
通式細胞測定器を用いることができる。
血球百分率の計数に用いることができる幾つかの半自働
化方法が用いられている。現在の各方法においては、網
赤血球中のＲＮＡを染色するために、有機カチオン染料
例えばＡＯ、ＡｕＯまたはＴＯを含有する希釈剤を用い
ている。その染料は細胞膜を透過し、ＲＮＡに結合し、
通常、各網赤血球中の“細網”を沈澱する。染色したＲ
ＮＡからの信号量は大約ＲＮＡ含有量に比例する。適当
に染色後、溶出液中の網赤血球百分率測定のため、適当
な励起光源（典型的には４８８ｎｍで放射するアルゴン
イオンレーザー）と発光検出システムとを備えた螢光流
通式細胞測定器を用いることができる。
【００１３】螢光染料と流通式細胞測定法とを用いる、
全血試料中の網赤血球弁別のための実例となる方法が特
許文献中に公開されている。
全血試料中の網赤血球弁別のための実例となる方法が特
許文献中に公開されている。
【００１４】例えばＡｄａｍｓとＫａｍｅｎｔｓｋｙと
の米国特許第３，６８４，３７７号はＡＯの水性溶液を
含み、ｐＨ因子と浸透性とが人血に関する正常な生理学
的範囲にある、弁別血液分析のための染料組成物を公開
している。その染料組成物は、赤血球散乱信号と共に、
螢光信号の有無を測定して網赤血球を計数するために用
いることが出来る。
の米国特許第３，６８４，３７７号はＡＯの水性溶液を
含み、ｐＨ因子と浸透性とが人血に関する正常な生理学
的範囲にある、弁別血液分析のための染料組成物を公開
している。その染料組成物は、赤血球散乱信号と共に、
螢光信号の有無を測定して網赤血球を計数するために用
いることが出来る。
【００１５】Ａｄａｍｓの米国特許第３，８８３，２４
７号は１０-6〜１０-5ｇ／ｍｌの濃度のＡＯを含む染料
組成物を用いる、ＡｄａｍｓとＫａｍｅｎｔｓｋｙの特
許と同様な方法を公開している。
７号は１０-6〜１０-5ｇ／ｍｌの濃度のＡＯを含む染料
組成物を用いる、ＡｄａｍｓとＫａｍｅｎｔｓｋｙの特
許と同様な方法を公開している。
【００１６】Ｎａｔａｌｅの米国特許第４，３３６，０
２９号はｐＨ７．４並に等張浸透性で、染料ＡＯとクエ
ン酸イオンとパラホルムアルデヒドとの水性溶液を含む
試薬組成物を公開している。その種種な成分の濃度は、
網赤血球と血小板との染料取込みを最大にし、血液試料
と試薬組成物との混合後２〜５分以内に染料の取込みが
達成するように選択される。Ｎａｔａｌｅ試薬を用いる
血小板と網赤血球との検出の自働化された方法がＧｅｒ
ｓｈｍａｎの米国特許第４，３２５，７０６号に公開さ
れている。
２９号はｐＨ７．４並に等張浸透性で、染料ＡＯとクエ
ン酸イオンとパラホルムアルデヒドとの水性溶液を含む
試薬組成物を公開している。その種種な成分の濃度は、
網赤血球と血小板との染料取込みを最大にし、血液試料
と試薬組成物との混合後２〜５分以内に染料の取込みが
達成するように選択される。Ｎａｔａｌｅ試薬を用いる
血小板と網赤血球との検出の自働化された方法がＧｅｒ
ｓｈｍａｎの米国特許第４，３２５，７０６号に公開さ
れている。
【００１７】Ｓａｇｅ，Ｊｒ．の米国特許第４，７０
７，４５１号に公開されている試薬においては、網赤血
球はチオフラビンＴまたはクリスアニリンで染色され
る。全血試料中は等張食塩溶液中の染料（０．２ｍｇ／
ｍｌ）アリコート２５μｌと抗凝固性にされた全血１０
μｌとを混合し、約７分間培養して効果的に染色される
ことが見出されている。
７，４５１号に公開されている試薬においては、網赤血
球はチオフラビンＴまたはクリスアニリンで染色され
る。全血試料中は等張食塩溶液中の染料（０．２ｍｇ／
ｍｌ）アリコート２５μｌと抗凝固性にされた全血１０
μｌとを混合し、約７分間培養して効果的に染色される
ことが見出されている。
【００１８】Ｌｅｅ等の米国特許第４，８８３，８６７
号はＲＮＡまたはＤＮＡを染色する染料組成物を公開し
ている。その染色組成物は好ましい染料化合物としてＴ
Ｏを含んでいる。網赤血球は最低３０分で染色される。
号はＲＮＡまたはＤＮＡを染色する染料組成物を公開し
ている。その染色組成物は好ましい染料化合物としてＴ
Ｏを含んでいる。網赤血球は最低３０分で染色される。
【００１９】流通式細胞測定技術の、網赤血球計数用試
薬がＫｕｒｏｄａの米国特許第４，９７１，９１７号に
記載されていて、それは、螢光流通式細胞測定法により
分析する場合、成熟赤血球を誤って網赤血球として計数
することがないよう染料例えばＡｕＯによる成熟赤血球
の非特異的染色を減少するのに炭酸塩を含有する。
薬がＫｕｒｏｄａの米国特許第４，９７１，９１７号に
記載されていて、それは、螢光流通式細胞測定法により
分析する場合、成熟赤血球を誤って網赤血球として計数
することがないよう染料例えばＡｕＯによる成熟赤血球
の非特異的染色を減少するのに炭酸塩を含有する。
【００２０】米国特許第４，９８１，８０３号は２つの
溶液、即ち、非水性溶剤中に染料ＡｕＯが溶解されてい
る染色用の原液と、最適染色条件を満たす緩衝剤溶液と
を含む、網赤血球計数用試薬を記載している。
溶液、即ち、非水性溶剤中に染料ＡｕＯが溶解されてい
る染色用の原液と、最適染色条件を満たす緩衝剤溶液と
を含む、網赤血球計数用試薬を記載している。
【００２１】ＡｕＯを含有する、螢光流通式細胞測定技
術用の他の網赤血球染色試薬がＫｕｒｏｄａ等の米国特
許第４，９８５，１７６号に公開されている。この文献
は３０秒と２０分間との間のどんな時間でもよい試薬と
試料との培養時間を教えている。
術用の他の網赤血球染色試薬がＫｕｒｏｄａ等の米国特
許第４，９８５，１７６号に公開されている。この文献
は３０秒と２０分間との間のどんな時間でもよい試薬と
試料との培養時間を教えている。
【００２２】上記の如く、カチオン染料の僅に小部分集
団のみが選択的に網赤血球を染色し、この中の更に小さ
い部分集団のみが速かに網赤血球を透過する。本発明の
カチオン染料化合物は網赤血球を５分間以内に染色し、
それ故血液試料と試薬組成物とを一緒に混合した後、流
通式細胞測定による網赤血球分析が短時間に行うことが
でき、それ故本発明は自働化された方法に容易に適合で
きる。
団のみが選択的に網赤血球を染色し、この中の更に小さ
い部分集団のみが速かに網赤血球を透過する。本発明の
カチオン染料化合物は網赤血球を５分間以内に染色し、
それ故血液試料と試薬組成物とを一緒に混合した後、流
通式細胞測定による網赤血球分析が短時間に行うことが
でき、それ故本発明は自働化された方法に容易に適合で
きる。
【００２３】網赤血球定量用の４級化ＡＯ誘導体が、文
献でここに取入れられている、“化合物と試薬組成物と
全血中の網赤血球定量測定へのその利用”と題する、１
９８９年１月１２日ＦａｎとＦｉｓｈｅｒとにより出願
された同時係属米国出願第０７／４４４，２５５号に記
載されている。Ｆａｎ等の試薬はパラホルムアルデヒド
と蓚酸カリウムとを含む緩衝溶液中にＡＯ誘導体１０-6
ｇ／ｍｌ含有する。この試薬組成物は全血試料中の網赤
血球の定量的螢光流通式細胞測定分析を可能にするよう
に網赤血球を染色する。この試薬も前記のどの試薬も以
下で論ずるような方向雑音問題を防止するための球形化
剤を含有していないし、細胞１つずつに基いて、網赤血
球と赤血球との他の診断学的パラメーター例えば体積や
ヘモグロビン濃度の同時測定を許していない。
献でここに取入れられている、“化合物と試薬組成物と
全血中の網赤血球定量測定へのその利用”と題する、１
９８９年１月１２日ＦａｎとＦｉｓｈｅｒとにより出願
された同時係属米国出願第０７／４４４，２５５号に記
載されている。Ｆａｎ等の試薬はパラホルムアルデヒド
と蓚酸カリウムとを含む緩衝溶液中にＡＯ誘導体１０-6
ｇ／ｍｌ含有する。この試薬組成物は全血試料中の網赤
血球の定量的螢光流通式細胞測定分析を可能にするよう
に網赤血球を染色する。この試薬も前記のどの試薬も以
下で論ずるような方向雑音問題を防止するための球形化
剤を含有していないし、細胞１つずつに基いて、網赤血
球と赤血球との他の診断学的パラメーター例えば体積や
ヘモグロビン濃度の同時測定を許していない。
【００２４】ＳｈａｐｉｒｏとＳｔｅｖｅｎｓとはＦｌ
ｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｏｆＤＮＡ Ｃｏｎｔｅｎ
ｔ Ｕｓｉｎｇ Ｏｘａｚｉｎｅ７５０ｏｒ Ｒｅｌａ
ｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｙｅｓ Ｗｉｔｈ ６３３ｎｍ
Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，第７
巻、１０７−１１０頁（１９８６）中で、流通式細胞測
定によるＤＮＡ含有量測定のためのオキサジン７５０の
使用を公開している。細胞はオキサジン７５０の１０〜
３０μＭにより染色され、ＤＮＡ測定のためにエタノー
ルの添加により固定される。ＳｈａｐｉｒｏとＳｔｅｖ
ｅｎｓとはオキサジン７５０は細胞内のＲＮＡを染色す
るようには見えないと主張している。さらに、オキサジ
ン７５０を用いるその様な実験案は網赤血球計数あるい
は、細胞１つずつに基いた、他の診断学的に重要な赤色
血液細胞パラメーター例えば体積やヘモグロビン濃度の
同時測定を可能にしていない。
ｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｏｆＤＮＡ Ｃｏｎｔｅｎ
ｔ Ｕｓｉｎｇ Ｏｘａｚｉｎｅ７５０ｏｒ Ｒｅｌａ
ｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｙｅｓ Ｗｉｔｈ ６３３ｎｍ
Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，第７
巻、１０７−１１０頁（１９８６）中で、流通式細胞測
定によるＤＮＡ含有量測定のためのオキサジン７５０の
使用を公開している。細胞はオキサジン７５０の１０〜
３０μＭにより染色され、ＤＮＡ測定のためにエタノー
ルの添加により固定される。ＳｈａｐｉｒｏとＳｔｅｖ
ｅｎｓとはオキサジン７５０は細胞内のＲＮＡを染色す
るようには見えないと主張している。さらに、オキサジ
ン７５０を用いるその様な実験案は網赤血球計数あるい
は、細胞１つずつに基いた、他の診断学的に重要な赤色
血液細胞パラメーター例えば体積やヘモグロビン濃度の
同時測定を可能にしていない。
【００２５】前記の如く、人および多くの哺乳類赤色血
液細胞は両凹ディスク形をもっている。そのような非対
称赤色血液細胞により散乱される光の量はその細胞の方
向に従って変る。従って、２つの同じ赤色血液細胞、そ
れがセンシング域を通過する時、その領域におけるその
方向が同一でない限り非常に異なる散乱光信号を生むこ
とになる。１つには染色された細網が少量存在している
のを除いて、同一な２つの赤色血液細胞はその方向が異
る故に、一般に散乱光に大きな信号差異を生じさせる。
液細胞は両凹ディスク形をもっている。そのような非対
称赤色血液細胞により散乱される光の量はその細胞の方
向に従って変る。従って、２つの同じ赤色血液細胞、そ
れがセンシング域を通過する時、その領域におけるその
方向が同一でない限り非常に異なる散乱光信号を生むこ
とになる。１つには染色された細網が少量存在している
のを除いて、同一な２つの赤色血液細胞はその方向が異
る故に、一般に散乱光に大きな信号差異を生じさせる。
【００２６】ＫｉｍとＯｒｎｓｔｅｉｎとの米国特許第
４，５７５，４９０と４，４１２，００４号とは流通式
細胞測定器中での赤色血液細胞の体積の測定における方
向雑音の除去法を教えている。彼等の方法は細胞体積よ
り一層精密で正確な測定を可能にするため、細胞間のど
んな方向差も除去するための未染色赤色血液細胞の等積
的球形化を包含している。各赤色血液細胞は界面活性剤
球形化剤により両凹形から完全な球形に変換される。
“緩衝”蛋白質および（または）アルデヒド固定剤が赤
血球の溶血防止のため、球形化剤と共に用いられる。Ｋ
ｉｍとＯｒｎｓｔｅｉｎとにより記載されたアニオン界
面活性剤は、細網を染色し、沈澱させるために用いるカ
チオン染料と速かに反応し、それを沈澱させることが見
出されている故に、それは網赤血球染色と共には用いる
ことができない。
４，５７５，４９０と４，４１２，００４号とは流通式
細胞測定器中での赤色血液細胞の体積の測定における方
向雑音の除去法を教えている。彼等の方法は細胞体積よ
り一層精密で正確な測定を可能にするため、細胞間のど
んな方向差も除去するための未染色赤色血液細胞の等積
的球形化を包含している。各赤色血液細胞は界面活性剤
球形化剤により両凹形から完全な球形に変換される。
“緩衝”蛋白質および（または）アルデヒド固定剤が赤
血球の溶血防止のため、球形化剤と共に用いられる。Ｋ
ｉｍとＯｒｎｓｔｅｉｎとにより記載されたアニオン界
面活性剤は、細網を染色し、沈澱させるために用いるカ
チオン染料と速かに反応し、それを沈澱させることが見
出されている故に、それは網赤血球染色と共には用いる
ことができない。
【００２７】Ｔｙｃｋｏの米国特許第４，７３５，５０
４号はＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１システム、即ち、抗
凝固性にされている全血試料中の、個別の平均赤血球体
積（ＭＣＶ）と、赤血球の個別の平均小体ヘモグロビン
濃度（ＭＣＨＣ）との測定のための完全に自働化された
方法と手段とを提供する流通式細胞測定器の赤色血液細
胞チャネルを公開している。この方法では、まず全血試
料中の２つのマイクロリットル（μｌ）アリコート中の
赤色細胞を希釈し、それから、今記載したＫｉｍとＯｒ
ｎｓｔｅｉｎとの方法を用いて等容積的に球形にする。
２０秒培養後、これらの細胞を、本質的に１度に１つ、
分析器の赤色細胞チャネル内の照明されている測定領域
を通過させる。２つの離れた角度間隔中に、これらの細
胞により散乱される光の大きさを測定する。この適用に
おいて、光源と検出角度の選択が決定的である。光源が
６３３ｎｍで放射されているヘリウムネオンレーザーで
ある場合、２つの散乱光集光角度間隔は２〜３度（２〜
３°）と５〜１５度（５〜１５°）とである。ある細胞
に就いて１度、各間隔における散乱光水準が知ると、そ
の細胞の体積とヘモグロビン濃度とはＭｉｅ散乱理論に
よる予言値と比較して決定される。各細胞の体積（Ｖ）
とヘモグロビン濃度（ＨＣ）とはメモリーに記憶され、
Ｔｙｃｋｏにおいて論ぜられているように、この技術で
知られる技術により、試料測定サイクル終了時に計算さ
れる。ＶとＨＣとの分布サイトグラムと、ＶとＨＣとの
ヒストグラムとはこの計算を用いて作製される。
４号はＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１システム、即ち、抗
凝固性にされている全血試料中の、個別の平均赤血球体
積（ＭＣＶ）と、赤血球の個別の平均小体ヘモグロビン
濃度（ＭＣＨＣ）との測定のための完全に自働化された
方法と手段とを提供する流通式細胞測定器の赤色血液細
胞チャネルを公開している。この方法では、まず全血試
料中の２つのマイクロリットル（μｌ）アリコート中の
赤色細胞を希釈し、それから、今記載したＫｉｍとＯｒ
ｎｓｔｅｉｎとの方法を用いて等容積的に球形にする。
２０秒培養後、これらの細胞を、本質的に１度に１つ、
分析器の赤色細胞チャネル内の照明されている測定領域
を通過させる。２つの離れた角度間隔中に、これらの細
胞により散乱される光の大きさを測定する。この適用に
おいて、光源と検出角度の選択が決定的である。光源が
６３３ｎｍで放射されているヘリウムネオンレーザーで
ある場合、２つの散乱光集光角度間隔は２〜３度（２〜
３°）と５〜１５度（５〜１５°）とである。ある細胞
に就いて１度、各間隔における散乱光水準が知ると、そ
の細胞の体積とヘモグロビン濃度とはＭｉｅ散乱理論に
よる予言値と比較して決定される。各細胞の体積（Ｖ）
とヘモグロビン濃度（ＨＣ）とはメモリーに記憶され、
Ｔｙｃｋｏにおいて論ぜられているように、この技術で
知られる技術により、試料測定サイクル終了時に計算さ
れる。ＶとＨＣとの分布サイトグラムと、ＶとＨＣとの
ヒストグラムとはこの計算を用いて作製される。
【００２８】前記の方法の何れも網赤血球と非網赤血球
との間を区別しないし、前に記載し、実施されている方
法は細胞１つずつに基き網赤血球と赤血球との診断学的
に重要なパラメーター例えば体積とヘモグロビン濃度と
を個別に測定するには用いることが出来ない。
との間を区別しないし、前に記載し、実施されている方
法は細胞１つずつに基き網赤血球と赤血球との診断学的
に重要なパラメーター例えば体積とヘモグロビン濃度と
を個別に測定するには用いることが出来ない。
【００２９】流通式細胞測定器を用いる網赤血球監視に
おける他の困難性は、網赤血球検出信号と成熟赤色血液
細胞信号とシステム雑音との間の弁別の困難性である。
ＲＮＡの染色されている糸状体は若い網赤血球中に多数
あり、流通式細胞測定器により検出する場合相対的に大
きい信号を発生させる。しかし、より成熟した細胞はそ
れより少い染色された糸状体を含有し、流通式細胞測定
器システムの雑音により遮蔽されてもよい、より小さい
信号を発生する。
おける他の困難性は、網赤血球検出信号と成熟赤色血液
細胞信号とシステム雑音との間の弁別の困難性である。
ＲＮＡの染色されている糸状体は若い網赤血球中に多数
あり、流通式細胞測定器により検出する場合相対的に大
きい信号を発生させる。しかし、より成熟した細胞はそ
れより少い染色された糸状体を含有し、流通式細胞測定
器システムの雑音により遮蔽されてもよい、より小さい
信号を発生する。
【００３０】光の散乱と吸収または螢光の流通式細胞測
定技術により、網赤血球を同定し、全血試料中の網赤血
球と赤血球との体積とヘモグロビン濃度とヘモグロビン
含有量とを個別に同時に測定するのに有用な方法と試薬
との必要性が存在している。
定技術により、網赤血球を同定し、全血試料中の網赤血
球と赤血球との体積とヘモグロビン濃度とヘモグロビン
含有量とを個別に同時に測定するのに有用な方法と試薬
との必要性が存在している。
【００３１】我我は細網を染色するため、周知の技術の
変形の中でカチオン染料を用いたいと云う前提で出発し
た。我我は網赤血球を検出するのに螢光を利用すること
が出来る流通式細胞測定法を開発することに関心を持っ
ていた。また、我我は等容積的球形化とＴｙｃｋｏの前
記の方法とを用い、螢光法のために、網赤血球を選択的
に染色する試薬を用いて細胞１つずつに基き、網赤血球
と成熟赤色細胞との体積とヘモグロビンを同時に測定で
きることを希望した。（若し球形化が完全で、等容積的
ではないが等張性に関する或る既知係数Ｘであるなら
ば、体積には１／Ｘによる補正、蛋白質例えばヘモグロ
ビン濃度にはＸによる補正を用いるＴｙｃｋｏ法を用い
て元の値を計算出来ることに注意。）
変形の中でカチオン染料を用いたいと云う前提で出発し
た。我我は網赤血球を検出するのに螢光を利用すること
が出来る流通式細胞測定法を開発することに関心を持っ
ていた。また、我我は等容積的球形化とＴｙｃｋｏの前
記の方法とを用い、螢光法のために、網赤血球を選択的
に染色する試薬を用いて細胞１つずつに基き、網赤血球
と成熟赤色細胞との体積とヘモグロビンを同時に測定で
きることを希望した。（若し球形化が完全で、等容積的
ではないが等張性に関する或る既知係数Ｘであるなら
ば、体積には１／Ｘによる補正、蛋白質例えばヘモグロ
ビン濃度にはＸによる補正を用いるＴｙｃｋｏ法を用い
て元の値を計算出来ることに注意。）
【００３２】Ｔｙｃｋｏの方法を利用するためには、ヘ
モグロビンが非常に透明な領域で、単色光を放射する光
源、典型的には赤色ヘリウムネオン（ＨｅＮｅ）レーザ
ーまたは更に長波長のレーザーのような光源が必要であ
る。このことは、若しその波長が吸収測定にも用いられ
るならば染料は赤色光の強い吸収をもつ青色染料でなけ
ればならないことを意味する。
モグロビンが非常に透明な領域で、単色光を放射する光
源、典型的には赤色ヘリウムネオン（ＨｅＮｅ）レーザ
ーまたは更に長波長のレーザーのような光源が必要であ
る。このことは、若しその波長が吸収測定にも用いられ
るならば染料は赤色光の強い吸収をもつ青色染料でなけ
ればならないことを意味する。
【００３３】若し同じ染料が螢光にも用いられるなら
ば、流れの螢光が螢光信号対雑音比を受け入れ難い程下
げないように、低い充分な濃度で用いることができる様
その染料は適度に高い量子効率とストークスシフト並に
高い結合恒数とを持っていなければならない。オキサジ
ン７５０が吸収／散乱法に関しての要件を満足させるの
みならず、細胞１つずつに基き、網赤血球ＲＮＡ濃度と
細胞数と成熟並に網赤血球細胞体積とヘモグロビン含有
量との測定のための螢光／散乱法に関する要件も満足す
ることが発見された。逆に、非常に低い螢光効率をもつ
ＮＭＢはその様な螢光／散乱法には充分でない。
ば、流れの螢光が螢光信号対雑音比を受け入れ難い程下
げないように、低い充分な濃度で用いることができる様
その染料は適度に高い量子効率とストークスシフト並に
高い結合恒数とを持っていなければならない。オキサジ
ン７５０が吸収／散乱法に関しての要件を満足させるの
みならず、細胞１つずつに基き、網赤血球ＲＮＡ濃度と
細胞数と成熟並に網赤血球細胞体積とヘモグロビン含有
量との測定のための螢光／散乱法に関する要件も満足す
ることが発見された。逆に、非常に低い螢光効率をもつ
ＮＭＢはその様な螢光／散乱法には充分でない。
【００３４】代りに、４８８ｎｍまたは４４１ｎｍの輝
線をもつアルゴンイオンまたはＨｅＣｄレーザーを加え
ることにより青色光で励起し、赤色レーザーで同軸的に
流通セルを照明するのに用いる場合、緑色乃至赤色に螢
光を発する、網赤血球染色のための染料例えばＡＯ，Ａ
ＯＥＯＨ，ＴＯ，ＡｕＯを用い、細胞１つずつに基き、
網赤血球ＲＮＡ濃度と細胞数と、成熟並に網赤血球細胞
体積とヘモグロビン含有量との同時測定も可能にする方
法が費用と複雑さとを増して実行されている。
線をもつアルゴンイオンまたはＨｅＣｄレーザーを加え
ることにより青色光で励起し、赤色レーザーで同軸的に
流通セルを照明するのに用いる場合、緑色乃至赤色に螢
光を発する、網赤血球染色のための染料例えばＡＯ，Ａ
ＯＥＯＨ，ＴＯ，ＡｕＯを用い、細胞１つずつに基き、
網赤血球ＲＮＡ濃度と細胞数と、成熟並に網赤血球細胞
体積とヘモグロビン含有量との同時測定も可能にする方
法が費用と複雑さとを増して実行されている。
【００３５】我我はカチオン染料との両立性のため、そ
してＫｉｍとＯｒｎｓｔｅｉｎとの教えにより示唆され
ているような赤色細胞球形化剤として非イオン、カチオ
ン並に双性イオン界面活性剤を探究した。ＫｉｍとＯｒ
ｓｔｅｉｎとの方法とにおける如く、我我は赤色細胞溶
血を遅くするため界面活性剤濃度を“緩衝”するのに蛋
白質（典型的には牛血清アルブミン）を用いた。多くの
そのような界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００
とラウリルプロピルアミドベタイン）は充分に働いた。
それからラウリルプロピルアミドベタインと他の幾つか
の双性イオン界面活性剤（例えばＤＡＰＳとＴＤＡＰ
Ｓ）とは赤色細胞溶血遅延のため緩衝する蛋白質を必要
とせず、ＫｉｍとＯｒｎｓｔｅｉｎとの方法に関し、凡
ての種類の血液細胞についての理想的な代りの球形化剤
であることを見出した。それは蛋白質緩衝を必要としな
い故に安定で簡単な試薬の製造を可能にする。（Ｋｉｍ
とＯｒｎｓｔｅｉｎの固定段階は最早絶対的なものでは
なく、代りに蛋白質含有試薬中での細菌増殖の問題も回
避される。）この発明は別の特許出願の主題となってい
る。
してＫｉｍとＯｒｎｓｔｅｉｎとの教えにより示唆され
ているような赤色細胞球形化剤として非イオン、カチオ
ン並に双性イオン界面活性剤を探究した。ＫｉｍとＯｒ
ｓｔｅｉｎとの方法とにおける如く、我我は赤色細胞溶
血を遅くするため界面活性剤濃度を“緩衝”するのに蛋
白質（典型的には牛血清アルブミン）を用いた。多くの
そのような界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００
とラウリルプロピルアミドベタイン）は充分に働いた。
それからラウリルプロピルアミドベタインと他の幾つか
の双性イオン界面活性剤（例えばＤＡＰＳとＴＤＡＰ
Ｓ）とは赤色細胞溶血遅延のため緩衝する蛋白質を必要
とせず、ＫｉｍとＯｒｎｓｔｅｉｎとの方法に関し、凡
ての種類の血液細胞についての理想的な代りの球形化剤
であることを見出した。それは蛋白質緩衝を必要としな
い故に安定で簡単な試薬の製造を可能にする。（Ｋｉｍ
とＯｒｎｓｔｅｉｎの固定段階は最早絶対的なものでは
なく、代りに蛋白質含有試薬中での細菌増殖の問題も回
避される。）この発明は別の特許出願の主題となってい
る。
【００３６】
【本発明の要約】従って、螢光流通式細胞測定による、
血液試料中の網赤血球を他の細胞から弁別するための改
善された試薬組成物と方法とを提供するのが本発明の主
な目的である。
血液試料中の網赤血球を他の細胞から弁別するための改
善された試薬組成物と方法とを提供するのが本発明の主
な目的である。
【００３７】本発明の他の目的は螢光流通式細胞測定法
による、全血試料中の網赤血球を計数するための上記の
ような試薬組成物と方法とを提供することである。
による、全血試料中の網赤血球を計数するための上記の
ような試薬組成物と方法とを提供することである。
【００３８】本発明のその上の目的は赤色血液細胞と網
赤血球とを同時に球形化し、網赤血球を染色するため
の、前記のような試薬組成物と方法とを提供することで
ある。
赤血球とを同時に球形化し、網赤血球を染色するため
の、前記のような試薬組成物と方法とを提供することで
ある。
【００３９】本発明の尚その上の目的は螢光並に散乱光
流通式細胞測定法により、全血試料中の網赤血球と赤血
球との体積とヘモグロビン濃度とヘモグロビン含有量と
を同時に測定するための、前記のような試薬組成物と方
法とを提供することである。
流通式細胞測定法により、全血試料中の網赤血球と赤血
球との体積とヘモグロビン濃度とヘモグロビン含有量と
を同時に測定するための、前記のような試薬組成物と方
法とを提供することである。
【００４０】本発明の更に尚その上の目的は血液試料中
の各血液細胞と網赤血球とを同時に区別し、計数するた
めの、そして細胞１つずつに基いての測定から決定され
た各細胞型の体積とヘモグロビン含有量とヘモグロビン
濃度と平均赤血球体積と平均小体ヘモグロビン濃度とを
測定するための、上記のような試薬組成物と方法と提供
することである。
の各血液細胞と網赤血球とを同時に区別し、計数するた
めの、そして細胞１つずつに基いての測定から決定され
た各細胞型の体積とヘモグロビン含有量とヘモグロビン
濃度と平均赤血球体積と平均小体ヘモグロビン濃度とを
測定するための、上記のような試薬組成物と方法と提供
することである。
【００４１】本発明の尚他の目的は血液試料中の各赤色
血液細胞と網赤血球とを同時に区別し、計数するため
の、そして単一赤色光レーザー源を用い、細胞１つずつ
に基き測定から決定された各細胞型の体積とヘモグロビ
ン含有量とヘモグロビン濃度と平均赤血球体積と平均小
体ヘモグロビン濃度とを測定するための上記のような試
薬組成物と方法とを提供することである。
血液細胞と網赤血球とを同時に区別し、計数するため
の、そして単一赤色光レーザー源を用い、細胞１つずつ
に基き測定から決定された各細胞型の体積とヘモグロビ
ン含有量とヘモグロビン濃度と平均赤血球体積と平均小
体ヘモグロビン濃度とを測定するための上記のような試
薬組成物と方法とを提供することである。
【００４２】本発明の１つの態様に従えば、試薬組成物
は網赤血球染色のための有機カチオン染料と約６〜９の
ｐＨを維持するための緩衝剤溶液を含む。その染料は構
造式
は網赤血球染色のための有機カチオン染料と約６〜９の
ｐＨを維持するための緩衝剤溶液を含む。その染料は構
造式
【化８】 を持つ励起し得る螢光染料オキサジン７５０または構造
式
式
【化９】 （この式で、Ｙはアニオンであり、Ｒは独立してメチル
基またはエチル基であり、Ｘはヒドロキシエチル基、ま
たはオルソ位をＲ1で、そして／またはパラ位をＲ2で置
換されているベンジル基であり、Ｒ1は水素原子または
弗素原子であり、Ｒ2は水素原子、弗素原子、またはト
リフルオロメチル基である）を持つ、ＡＯおよび４級化
されているＡＯの誘導体である青色励起可能な螢光染料
であってもよい。
基またはエチル基であり、Ｘはヒドロキシエチル基、ま
たはオルソ位をＲ1で、そして／またはパラ位をＲ2で置
換されているベンジル基であり、Ｒ1は水素原子または
弗素原子であり、Ｒ2は水素原子、弗素原子、またはト
リフルオロメチル基である）を持つ、ＡＯおよび４級化
されているＡＯの誘導体である青色励起可能な螢光染料
であってもよい。
【００４３】好ましくはＹはアニオンであり、Ｒはメチ
ル基であり、Ｘはヒドロキシメチル基またはパラ位置換
ベンジル基である。最も好ましくは、Ｙは臭素原子また
は沃素原子であり、Ｘはヒドロキシエチル基である。
ル基であり、Ｘはヒドロキシメチル基またはパラ位置換
ベンジル基である。最も好ましくは、Ｙは臭素原子また
は沃素原子であり、Ｘはヒドロキシエチル基である。
【００４４】ＡＯの４級化されている誘導体製造の合成
段階は前記のＦａｎ等の米国特許出願第０７／４４４，
２５５号に記載されている。オキサジン７５０はＤａｙ
ｔｏｎ，ＯｈｉｏのＥｘｃｉｔｏｎ社から入手できる。
本発明の好ましい青色励起可能の染料化合物は臭化３，
６−ビス（ジメチルアミノ）１０−ベンジルアクリジニ
ウムと臭化３，６−ビス（ジメチルアミノ）１０−（２
−フルオロ）−ベンジルアクリジニウムと臭化３，６−
ビス（ジメチルアミノ）１０−（４−トリフルオロメチ
ル）−ベンジルアクリジニウムと沃化３，６−ビス（ジ
メチルアミノ）−１０−２−ヒドロキシエチルアクリジ
ニウムである。最も好ましい青色励起可能な染料化合物
は、水酸基の親水性の故に、沃化３，６−ビス（ジメチ
ルアミノ）−１０−２−ヒドロキシエチルアクリジニウ
ムである。
段階は前記のＦａｎ等の米国特許出願第０７／４４４，
２５５号に記載されている。オキサジン７５０はＤａｙ
ｔｏｎ，ＯｈｉｏのＥｘｃｉｔｏｎ社から入手できる。
本発明の好ましい青色励起可能の染料化合物は臭化３，
６−ビス（ジメチルアミノ）１０−ベンジルアクリジニ
ウムと臭化３，６−ビス（ジメチルアミノ）１０−（２
−フルオロ）−ベンジルアクリジニウムと臭化３，６−
ビス（ジメチルアミノ）１０−（４−トリフルオロメチ
ル）−ベンジルアクリジニウムと沃化３，６−ビス（ジ
メチルアミノ）−１０−２−ヒドロキシエチルアクリジ
ニウムである。最も好ましい青色励起可能な染料化合物
は、水酸基の親水性の故に、沃化３，６−ビス（ジメチ
ルアミノ）−１０−２−ヒドロキシエチルアクリジニウ
ムである。
【００４５】本発明の試薬組成物は青色染料化合物約３
〜１２μｇ／ｍｌ（青色励起可能螢光染色のための４級
化されているＡＯ誘導体）あるいはオキサジン７５０約
０．２〜１．２μｇ／ｍｌ（赤色励起可能螢光染色用）
を含む。好ましくは染料化合物は約６〜９μｇ／ｍｌ
（ＡＯＥＯＨの）または約０．４〜０．６μｇ／ｍｌ
（オキサジン７５０）存在する。
〜１２μｇ／ｍｌ（青色励起可能螢光染色のための４級
化されているＡＯ誘導体）あるいはオキサジン７５０約
０．２〜１．２μｇ／ｍｌ（赤色励起可能螢光染色用）
を含む。好ましくは染料化合物は約６〜９μｇ／ｍｌ
（ＡＯＥＯＨの）または約０．４〜０．６μｇ／ｍｌ
（オキサジン７５０）存在する。
【００４６】試薬組成物の緩衝システムはその試薬組成
物のｐＨを約６〜９に維持するのに適当な緩衝剤を含ん
でいる。その溶液は次の成分の１つまたはそれ以上を記
載の濃度で含み、その最終浸透性はＫＣｌまたはＮａＣ
ｌで約２５０〜３３０ｍ０ｓｍに調節されている。 成 分 濃 度 Ｋ／ＮａＨＣＯ3 ５− ５０ ＭｇＣｌ2 ０− ８８ ＫＣｌ ４−１０４ Ｎａ3ＰＯ4 ０− １．５ ＣａＣｌ2 ０− ０．４
物のｐＨを約６〜９に維持するのに適当な緩衝剤を含ん
でいる。その溶液は次の成分の１つまたはそれ以上を記
載の濃度で含み、その最終浸透性はＫＣｌまたはＮａＣ
ｌで約２５０〜３３０ｍ０ｓｍに調節されている。 成 分 濃 度 Ｋ／ＮａＨＣＯ3 ５− ５０ ＭｇＣｌ2 ０− ８８ ＫＣｌ ４−１０４ Ｎａ3ＰＯ4 ０− １．５ ＣａＣｌ2 ０− ０．４
【００４７】好ましくは溶液は試薬組成物のｐＨを約７
〜８に維持するように処方され、次の成分を与えられた
濃度範囲で含んでいてもよく、約２８０〜３００ ｍ
０ｓｍの浸透性を維持する。 成 分 濃 度 Ｔｒｉｓ ０−１５０ Ｋ2Ｏｘ ０−１２１ バルビタール ０−１５５
〜８に維持するように処方され、次の成分を与えられた
濃度範囲で含んでいてもよく、約２８０〜３００ ｍ
０ｓｍの浸透性を維持する。 成 分 濃 度 Ｔｒｉｓ ０−１５０ Ｋ2Ｏｘ ０−１２１ バルビタール ０−１５５
【００４８】試薬組成物は赤色細胞膜を通しての染料透
過を容易にするために或る種のアニオンおよびカチオン
を含有すべきであることは見出されていた。そのような
アニオンには重炭酸イオン、塩素イオン、硝酸イオン、
バルビタール、蓚酸（ＯＸ）イオンまたはエチレンジア
ミンテトラ酢酸（ＥＡＴＡ）が含まれてもよい。しかし
凡てのアニオンが細胞膜を通る染料透過を促進するのに
効果を見出すわけではなかった。例えば、次のアニオ
ン、即ちリンゴ酸イオン、酒石酸イオン、リン酸イオン
の１つまたはそれ以上が唯一つの主要なアニオンとして
試薬組成物中に含まれている場合、若しあってもほんの
僅しか、網赤血球と赤血球との間の区別が出来なかっ
た。可能なカチオンにはカリウムイオン、ナトリウムイ
オン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉ
ｓ）またはトリエタノールアミン（ＴＥＡ）が含まれ
る。
過を容易にするために或る種のアニオンおよびカチオン
を含有すべきであることは見出されていた。そのような
アニオンには重炭酸イオン、塩素イオン、硝酸イオン、
バルビタール、蓚酸（ＯＸ）イオンまたはエチレンジア
ミンテトラ酢酸（ＥＡＴＡ）が含まれてもよい。しかし
凡てのアニオンが細胞膜を通る染料透過を促進するのに
効果を見出すわけではなかった。例えば、次のアニオ
ン、即ちリンゴ酸イオン、酒石酸イオン、リン酸イオン
の１つまたはそれ以上が唯一つの主要なアニオンとして
試薬組成物中に含まれている場合、若しあってもほんの
僅しか、網赤血球と赤血球との間の区別が出来なかっ
た。可能なカチオンにはカリウムイオン、ナトリウムイ
オン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉ
ｓ）またはトリエタノールアミン（ＴＥＡ）が含まれ
る。
【００４９】試薬組成物は散乱／螢光流通式細胞測定法
を用いる、全血試料中の網赤血球の同定に用いてもよ
い。最も広い適用におけるその方法は全血アリコートと
前記の試薬組成物の１つとを混合することを含む。適当
な培養期間の後試料／試薬混合物を流通式細胞測定器の
特定のセンシング領域を通じ、１度に細胞１個で通過さ
せる。水力学的集束の方法により単一の細胞が適当な照
明波長を持った集光された光源によって照明されて、セ
ンシング領域を通過する。少くとも１つの散乱光信号と
少くとも１つの螢光信号とがその細胞に関し細胞１つず
つに基いて測定される。これらの測定から網赤血球が赤
血球から区別できる。
を用いる、全血試料中の網赤血球の同定に用いてもよ
い。最も広い適用におけるその方法は全血アリコートと
前記の試薬組成物の１つとを混合することを含む。適当
な培養期間の後試料／試薬混合物を流通式細胞測定器の
特定のセンシング領域を通じ、１度に細胞１個で通過さ
せる。水力学的集束の方法により単一の細胞が適当な照
明波長を持った集光された光源によって照明されて、セ
ンシング領域を通過する。少くとも１つの散乱光信号と
少くとも１つの螢光信号とがその細胞に関し細胞１つず
つに基いて測定される。これらの測定から網赤血球が赤
血球から区別できる。
【００５０】本発明の好ましい態様に従えば、前記の試
薬組成物はその上に、赤色血液細胞と網赤血球とを等積
的に球形化するために、双性イオン界面活性剤を含む。
その双性イオン球形化剤は好ましくはアルキルアミドベ
タインまたはアルキルベタイン例えばラウラミドプロピ
ルベタイン（ＬＡＢ）である。
薬組成物はその上に、赤色血液細胞と網赤血球とを等積
的に球形化するために、双性イオン界面活性剤を含む。
その双性イオン球形化剤は好ましくはアルキルアミドベ
タインまたはアルキルベタイン例えばラウラミドプロピ
ルベタイン（ＬＡＢ）である。
【００５１】血液試料中の網赤血球と赤色血液細胞とを
等積的に球形化するためには、試薬組成物中の球形化剤
濃度はＬＡＢ約１２〜８７．５μｇ／ｍｌである。
等積的に球形化するためには、試薬組成物中の球形化剤
濃度はＬＡＢ約１２〜８７．５μｇ／ｍｌである。
【００５２】全血／試薬組成物混合物が流通式細胞測定
器のセンシング領域を通過する場合、各細胞による、２
つの角度間隔を通じて散乱される光と螢光を発した光と
が測定され、赤血球は網赤血球と区別でき、各網赤血球
または赤血球の体積とヘモグロビン濃度とが決定でき
る。網赤血球と赤血球との数および網赤血球または赤血
球のヘモグロビン含有量と平均細胞体積と平均小体ヘモ
グロビン濃度と平均細胞ヘモグロビンとは測定された細
胞１つずつの体積とヘモグロビン濃度とから計算でき
る。
器のセンシング領域を通過する場合、各細胞による、２
つの角度間隔を通じて散乱される光と螢光を発した光と
が測定され、赤血球は網赤血球と区別でき、各網赤血球
または赤血球の体積とヘモグロビン濃度とが決定でき
る。網赤血球と赤血球との数および網赤血球または赤血
球のヘモグロビン含有量と平均細胞体積と平均小体ヘモ
グロビン濃度と平均細胞ヘモグロビンとは測定された細
胞１つずつの体積とヘモグロビン濃度とから計算でき
る。
【００５３】我我は前記の緩衝システムの存在の下で
は、ＲＮＡ染色のために要する、試薬組成物中のオキサ
ジン７５０またはＡＯＥＯＨの濃度は低く、即ちオキサ
ジン７５０では約０．２〜１．２μｇ／ｍｌの範囲、Ａ
ＯＥＯＨでは約３．０〜１２μｇ／ｍｌであり、緩衝剤
増強透過性はその染料が網赤血球中のＲＮＡを５分間以
内に染色させる結果となることを見出した。そのような
染料の低濃度であることは成熟の非網赤血球染色と流れ
の螢光とを最小にし、それは雑音バックグラウンドから
の信号の良好な分離をもたらす。そのような迅速な染色
はこの試薬組成物を自働化された方法に非常に適合させ
ることになる。
は、ＲＮＡ染色のために要する、試薬組成物中のオキサ
ジン７５０またはＡＯＥＯＨの濃度は低く、即ちオキサ
ジン７５０では約０．２〜１．２μｇ／ｍｌの範囲、Ａ
ＯＥＯＨでは約３．０〜１２μｇ／ｍｌであり、緩衝剤
増強透過性はその染料が網赤血球中のＲＮＡを５分間以
内に染色させる結果となることを見出した。そのような
染料の低濃度であることは成熟の非網赤血球染色と流れ
の螢光とを最小にし、それは雑音バックグラウンドから
の信号の良好な分離をもたらす。そのような迅速な染色
はこの試薬組成物を自働化された方法に非常に適合させ
ることになる。
【００５４】従って、発明はここに記載の組成物と方法
とを含み、本発明の範囲は特許請求に示されている。
とを含み、本発明の範囲は特許請求に示されている。
【００５５】
【好ましい態様の説明】図１〜図５を参照すると、本発
明の原理を実施するのに利用してもよい流通式細胞測定
装置の部分の様式化された、機能と構造との描写を示し
ている。事実、装置は、出願人により販売されている、
商標ＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１の下に市場で入手でき
るシステムの変形である特別なシステムを描いている。
明の原理を実施するのに利用してもよい流通式細胞測定
装置の部分の様式化された、機能と構造との描写を示し
ている。事実、装置は、出願人により販売されている、
商標ＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１の下に市場で入手でき
るシステムの変形である特別なシステムを描いている。
【００５６】装置は細胞分析用の流通式細胞測定法の原
理を具体化していて、特定の型の照明に対する、細胞の
光散乱と螢光との応答を知覚する能力を含んでいる。本
発明に関し、主要な関心のある構成要素のみが示されて
いる。それ故、装置の種種な構成要素を動かし、制御す
るのに要する機械的および電気的構成要素、即ち、モー
ター、ソレノイド、ポンプ、弁、センサーの凡てを説明
はしていない。これら構成要素の凡てはどんな既知の在
来の型を持っていてもよく、それは、意図する方法で試
料を処理するための、本発明に従う流通式細胞測定装置
中の種種な構成要素の所望の型の操作に関し、以後与え
られる情報の知識を持つ、この技術において正常な熟達
さの人により容易に実現できるものである。
理を具体化していて、特定の型の照明に対する、細胞の
光散乱と螢光との応答を知覚する能力を含んでいる。本
発明に関し、主要な関心のある構成要素のみが示されて
いる。それ故、装置の種種な構成要素を動かし、制御す
るのに要する機械的および電気的構成要素、即ち、モー
ター、ソレノイド、ポンプ、弁、センサーの凡てを説明
はしていない。これら構成要素の凡てはどんな既知の在
来の型を持っていてもよく、それは、意図する方法で試
料を処理するための、本発明に従う流通式細胞測定装置
中の種種な構成要素の所望の型の操作に関し、以後与え
られる情報の知識を持つ、この技術において正常な熟達
さの人により容易に実現できるものである。
【００５７】最も一般的な言葉で言えば、シース流れ流
通セル（Ｓｈｅａｔｈ−Ｓｔｒｅａｍ ｆｌｏｗｃｅｌ
ｌ）これを支持する水力学手段とにより、調製された細
胞を測定点まで運ぶ。その細胞は流通セルの正方形断面
流通チャネルに対し中心にある円筒状体積に局限されて
いる。流通セル構造は１つのことを除き、ＴＥＣＨＮＩ
ＣＯＮ Ｈ’１システムに用いられているものと同一で
ある。流通セル本体は流通セルそれ自体からのバックグ
ウランド螢光を最小にするため合成熔解シリカ（ガラス
よりむしろ）で製作される。水力学的システムは全く簡
単で、唯２つの蠕動ポンプとそれに連結されている管よ
り成る。シースポンプ（Ｓｈｅａｔｈｐｕｍｐ）と管と
は速度１．６×１０-7ｍ3／ｓｅｃでシース（さや）を
送り、試料は速度３．５×１０-10ｍ3／ｓｅｃで送ら
れ、流通セル内の流通チャネルは２５０μｍ×２５０μ
ｍである。得られる円筒状試料流れは直径７μｍで、速
度２．５ｍ／ｓを持つ。
通セル（Ｓｈｅａｔｈ−Ｓｔｒｅａｍ ｆｌｏｗｃｅｌ
ｌ）これを支持する水力学手段とにより、調製された細
胞を測定点まで運ぶ。その細胞は流通セルの正方形断面
流通チャネルに対し中心にある円筒状体積に局限されて
いる。流通セル構造は１つのことを除き、ＴＥＣＨＮＩ
ＣＯＮ Ｈ’１システムに用いられているものと同一で
ある。流通セル本体は流通セルそれ自体からのバックグ
ウランド螢光を最小にするため合成熔解シリカ（ガラス
よりむしろ）で製作される。水力学的システムは全く簡
単で、唯２つの蠕動ポンプとそれに連結されている管よ
り成る。シースポンプ（Ｓｈｅａｔｈｐｕｍｐ）と管と
は速度１．６×１０-7ｍ3／ｓｅｃでシース（さや）を
送り、試料は速度３．５×１０-10ｍ3／ｓｅｃで送ら
れ、流通セル内の流通チャネルは２５０μｍ×２５０μ
ｍである。得られる円筒状試料流れは直径７μｍで、速
度２．５ｍ／ｓを持つ。
【００５８】第１の目標は赤色細胞分析用のＴＥＣＨＮ
ＩＣＯＮ Ｈ’１システムにより要求される２つの赤色
細胞散乱チャネルのほかに、最低単色螢光測定を支える
光学システムを提供することである。これらか議論する
ように、用いる光学システムは細胞を染色するのに用い
られる特別な染料即ち青色励起可能または赤色励起可能
な染料左右されることになる。散乱／螢光流通式細胞測
定器の光学システムは一般に２つの副次システム（ａ）
照明光学系（図１または図４）および（ｂ）集光光学系
（図２または図５）に分割できる。
ＩＣＯＮ Ｈ’１システムにより要求される２つの赤色
細胞散乱チャネルのほかに、最低単色螢光測定を支える
光学システムを提供することである。これらか議論する
ように、用いる光学システムは細胞を染色するのに用い
られる特別な染料即ち青色励起可能または赤色励起可能
な染料左右されることになる。散乱／螢光流通式細胞測
定器の光学システムは一般に２つの副次システム（ａ）
照明光学系（図１または図４）および（ｂ）集光光学系
（図２または図５）に分割できる。
【００５９】第１に図１を参照すると、青色励起可能染
料に対する照明光学系は一般に数字１０で示され、２つ
の光源を組込んでいる。
料に対する照明光学系は一般に数字１０で示され、２つ
の光源を組込んでいる。
【００６０】ヘリウム−ネオン（ＨｅＮｅ）レーザー１
２は体積とヘモグロビン濃度との決定のための赤色細胞
散乱測定に必要な、６３３ｎｍ、２ｍＷで光を放射す
る。４８８ｎｍ、２０ｍＷで光を放射するアルゴンイオ
ンレーザー１４はフルオロホール（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏ
ｒｅ）励起のために必要である。３つのリレーミラー１
６ａと１６ｂと１６ｃおよび二色性ビームスプリッター
１８とは照明システムの厳密な軸合せに必要である。レ
ーザーからのビームはビームスプリッター１８で同一直
線にされ、そのビームスプリッターはアルゴンイオンレ
ーザー１４からの青色光は透過し、ＨｅＮｅレーザー１
２からの赤色光は反射する。それから、得られたビーム
は一対の交差された、円柱レンズ２２により矩形孔口
（Ａ−１）２０で楕円形にされる。Ａ−１孔口に最も近
い円柱レンズ２２ａの焦点距離は１５０ｍｍである。こ
のレンズの中心軸はその孔口の長い長さに平行してい
る。第２の円柱レンズ２２ｂは３００ｍｍの焦点距離を
もつ。高さ８９μｍ、幅６５３μｍであるその矩形孔口
は測定体積を限定するために、回折が制限されている色
消しレンズ２６を用いて流通セル２４中に像を結ばれ
る。総括的倍率は約０．２５である。孔口は長い方の寸
法では不足で、短い方の寸法では過剰である。ここでの
目標は細胞から細胞への強度変化による誤差を最小にす
るため、照明強度を最大にし、像の短い方の寸法におけ
る均一な強度分布を維持することでった。測定体積は本
質的に楕円形であり、１／ｅ2点で高さ２０μｍ、幅６
５μｍである。この楕円の短軸は流れの方向に平行であ
り、流れは水平に対して垂直である。
２は体積とヘモグロビン濃度との決定のための赤色細胞
散乱測定に必要な、６３３ｎｍ、２ｍＷで光を放射す
る。４８８ｎｍ、２０ｍＷで光を放射するアルゴンイオ
ンレーザー１４はフルオロホール（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏ
ｒｅ）励起のために必要である。３つのリレーミラー１
６ａと１６ｂと１６ｃおよび二色性ビームスプリッター
１８とは照明システムの厳密な軸合せに必要である。レ
ーザーからのビームはビームスプリッター１８で同一直
線にされ、そのビームスプリッターはアルゴンイオンレ
ーザー１４からの青色光は透過し、ＨｅＮｅレーザー１
２からの赤色光は反射する。それから、得られたビーム
は一対の交差された、円柱レンズ２２により矩形孔口
（Ａ−１）２０で楕円形にされる。Ａ−１孔口に最も近
い円柱レンズ２２ａの焦点距離は１５０ｍｍである。こ
のレンズの中心軸はその孔口の長い長さに平行してい
る。第２の円柱レンズ２２ｂは３００ｍｍの焦点距離を
もつ。高さ８９μｍ、幅６５３μｍであるその矩形孔口
は測定体積を限定するために、回折が制限されている色
消しレンズ２６を用いて流通セル２４中に像を結ばれ
る。総括的倍率は約０．２５である。孔口は長い方の寸
法では不足で、短い方の寸法では過剰である。ここでの
目標は細胞から細胞への強度変化による誤差を最小にす
るため、照明強度を最大にし、像の短い方の寸法におけ
る均一な強度分布を維持することでった。測定体積は本
質的に楕円形であり、１／ｅ2点で高さ２０μｍ、幅６
５μｍである。この楕円の短軸は流れの方向に平行であ
り、流れは水平に対して垂直である。
【００６１】測定体積を通過する細胞は入射放射線を散
乱する。また染色された細胞は入射放射線を吸収する。
染色された細胞はまた、吸収した周波数より低い周波数
のエネルギーを放射して螢光を発する。これらの光学的
信号は図２に説明されている捕獲光学系で捕獲され、検
出される。
乱する。また染色された細胞は入射放射線を吸収する。
染色された細胞はまた、吸収した周波数より低い周波数
のエネルギーを放射して螢光を発する。これらの光学的
信号は図２に説明されている捕獲光学系で捕獲され、検
出される。
【００６２】測定体積を横切る細胞により散乱され、螢
光を発せられた光は集光レンズ２８により平行にされ、
それから４つのチャネルに分けられる。集光レンズの開
口数は０．３４である。ビームスプリッター３０で、５
００ｎｍ以下の波長の光は反射される。この光は４８８
ｎｍ狭帯域干渉フィルター３２を用い再び濾光される。
環状暗視野絞り３４は５〜１５度の角度間隔に散乱され
る青色光のみを透過するのに用いられる。それからその
散乱光は検出レンズ３６によりシリコンフォトダイオー
ド３８に焦点を結ばれ、そこで電子的信号を発生する。
光を発せられた光は集光レンズ２８により平行にされ、
それから４つのチャネルに分けられる。集光レンズの開
口数は０．３４である。ビームスプリッター３０で、５
００ｎｍ以下の波長の光は反射される。この光は４８８
ｎｍ狭帯域干渉フィルター３２を用い再び濾光される。
環状暗視野絞り３４は５〜１５度の角度間隔に散乱され
る青色光のみを透過するのに用いられる。それからその
散乱光は検出レンズ３６によりシリコンフォトダイオー
ド３８に焦点を結ばれ、そこで電子的信号を発生する。
【００６３】残りの光はビームスプリッター４０で２つ
のビームに等しく分けられる。そのエネルギーの半分は
赤色散乱チャネルへ反射され、半分は赤色螢光チャネル
へ透過される。（このビームスプリッター４０は螢光チ
ャネル中のＳ／Ｎ比を改善するため適当な２色ビームス
プリッターで置換えてもよい。）赤色散乱チャネルに反
射された光は６３３ｎｍ狭帯域干渉フィルター４２を用
いて濾光し、それから５０／５０（５０％反射、５０％
透過）ビームスプリッター４４により２つのビームに分
けられる。絞り４６と４８とは細胞ＶとＨＣとを決定す
るのに必要な２つの角度間隔に光を集めるために、これ
ら２つの赤色散乱チャネルで用いる。各チャネルにおけ
る散乱光はそれぞれ検出レンズ５４と５６とにより２つ
のシリコンフォトダイオード５０と５２とにおのおの焦
点を結ばれ、そこで電気信号を発生する。濃度フィルタ
ー５８と５９と６０とは前置増幅器回路を変更すること
なく、簡単に信号の動的領域を調節するため青色と赤色
との各散乱チャネルに用いられる。
のビームに等しく分けられる。そのエネルギーの半分は
赤色散乱チャネルへ反射され、半分は赤色螢光チャネル
へ透過される。（このビームスプリッター４０は螢光チ
ャネル中のＳ／Ｎ比を改善するため適当な２色ビームス
プリッターで置換えてもよい。）赤色散乱チャネルに反
射された光は６３３ｎｍ狭帯域干渉フィルター４２を用
いて濾光し、それから５０／５０（５０％反射、５０％
透過）ビームスプリッター４４により２つのビームに分
けられる。絞り４６と４８とは細胞ＶとＨＣとを決定す
るのに必要な２つの角度間隔に光を集めるために、これ
ら２つの赤色散乱チャネルで用いる。各チャネルにおけ
る散乱光はそれぞれ検出レンズ５４と５６とにより２つ
のシリコンフォトダイオード５０と５２とにおのおの焦
点を結ばれ、そこで電気信号を発生する。濃度フィルタ
ー５８と５９と６０とは前置増幅器回路を変更すること
なく、簡単に信号の動的領域を調節するため青色と赤色
との各散乱チャネルに用いられる。
【００６４】ビームスプリッター４０で透過された光は
螢光エネルギーだけが通過できるように６２で濾光さ
れ、それから検出レンズ６４により直径１ｍｍのピンホ
ールを通じ、光電子増倍管６６上に焦点を結ばれ、そこ
で入射エネルギーの大きさに比例した電気信号を発生さ
せる。ピンホールの存在は外部光により生ずるショット
雑音を最低にする。検出レンズの前に置かれている２ｍ
ｍ幅のブロッキングバーは主要ビームをさえぎり、更に
バックグラウンド光雑音を減少させる。このチャンネル
には４つのフィルターのサンドウィッチ状物６８があ
り、それは６３３切欠フィルター（Ｘ２）６８ａとＳｃ
ｈｏｔｔ ＯＧ５１５Ｃｏｌｏｒ Ｇｌａｓｓ６８とＳ
ｃｈｏｔｔ ＯＧ５３０ Ｃｏｌｏｒ Ｇｌａｓｓ ６８
ｃとＳｃｈｏｔｔ ＲＧ６４５ Ｃｏｌｏｒ Ｇｌａｓ
ｓ ６８ｄとからなっている。
螢光エネルギーだけが通過できるように６２で濾光さ
れ、それから検出レンズ６４により直径１ｍｍのピンホ
ールを通じ、光電子増倍管６６上に焦点を結ばれ、そこ
で入射エネルギーの大きさに比例した電気信号を発生さ
せる。ピンホールの存在は外部光により生ずるショット
雑音を最低にする。検出レンズの前に置かれている２ｍ
ｍ幅のブロッキングバーは主要ビームをさえぎり、更に
バックグラウンド光雑音を減少させる。このチャンネル
には４つのフィルターのサンドウィッチ状物６８があ
り、それは６３３切欠フィルター（Ｘ２）６８ａとＳｃ
ｈｏｔｔ ＯＧ５１５Ｃｏｌｏｒ Ｇｌａｓｓ６８とＳ
ｃｈｏｔｔ ＯＧ５３０ Ｃｏｌｏｒ Ｇｌａｓｓ ６８
ｃとＳｃｈｏｔｔ ＲＧ６４５ Ｃｏｌｏｒ Ｇｌａｓ
ｓ ６８ｄとからなっている。
【００６５】このフィルター組合せ物の正味の効果は６
４５ｎｍ以下の凡ての光の阻止にある。切欠およびＯＧ
フィルター６８ａと６８ｂと６８ｃとは、ＲＧ６４５フ
ィルター６８ｄが６３３ｎｍと４８８ｎｍとの散乱光を
完全に阻止するには充分有効でない故に、必要である。
４５ｎｍ以下の凡ての光の阻止にある。切欠およびＯＧ
フィルター６８ａと６８ｂと６８ｃとは、ＲＧ６４５フ
ィルター６８ｄが６３３ｎｍと４８８ｎｍとの散乱光を
完全に阻止するには充分有効でない故に、必要である。
【００６６】前置増幅器回路の利得および濃度フィルタ
ーの光学密度は、Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ（ＴＣＮ）光学検
査材料（ＯＴＭ ＴＣＨ ＴＯ３−１７０４）を検定す
る場合に、各チャネルの出力で約２ボルトの平均パルス
信号水準を生ずるように選ぶ。ＯＴＭは球形化され、そ
して堅く固定された赤色血液細胞より成る。この材料は
出願人から市場で入手でき、ＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’
１システムに使用するのに適合している。そしてこれは
ポスト−信号−検出−処理−ハードウエア（ｐｏｓｔ−
ｓｉｇｎａｌ−ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ−ｐｒｏｃｅｓｓｉ
ｎｇ−ｈａｒｄｗａｒｅ）で利得可変増幅器を用い、各
チャネルの総括利得を細く調節することを可能にする。
螢光チャネルの総括利得は光電子増倍管に送り込まれる
高い電圧を調節することにより制御する。
ーの光学密度は、Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ（ＴＣＮ）光学検
査材料（ＯＴＭ ＴＣＨ ＴＯ３−１７０４）を検定す
る場合に、各チャネルの出力で約２ボルトの平均パルス
信号水準を生ずるように選ぶ。ＯＴＭは球形化され、そ
して堅く固定された赤色血液細胞より成る。この材料は
出願人から市場で入手でき、ＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’
１システムに使用するのに適合している。そしてこれは
ポスト−信号−検出−処理−ハードウエア（ｐｏｓｔ−
ｓｉｇｎａｌ−ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ−ｐｒｏｃｅｓｓｉ
ｎｇ−ｈａｒｄｗａｒｅ）で利得可変増幅器を用い、各
チャネルの総括利得を細く調節することを可能にする。
螢光チャネルの総括利得は光電子増倍管に送り込まれる
高い電圧を調節することにより制御する。
【００６７】ポスト−検出信号処理システムの機能ブロ
ック図を図３に示す。このシステムは前置増幅器６７と
利得可変増幅器６８とパルス高さ分析器７０とアナログ
−デジタル変換器７２とデータ取得ハードウエア（コン
ピューター）７４とソフトウエアとを含む。
ック図を図３に示す。このシステムは前置増幅器６７と
利得可変増幅器６８とパルス高さ分析器７０とアナログ
−デジタル変換器７２とデータ取得ハードウエア（コン
ピューター）７４とソフトウエアとを含む。
【００６８】パルス高さ分析器７０とアナログ−デジタ
ル変換器７２とデータ取得ソフトウエアとはＨｏｗａｒ
ｄ Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｍ．Ｄ．，Ｐ．Ｃ．ｏｆ Ｃａｍ
ｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．から購入した４Ｃｙｔｅシス
テムの凡ての構成要素である。パルス高さ分析器は４Ｃ
ｙｔｅ Ｍｏｄｅｌ ＦＥ Ｆｒｏｎｔ Ｅｎｄであ
る。この構成要素は４つまでの入力信号について、パル
ス高さを表わす保持パルスを生じさせ、“妥当な”パル
ス高さしきい水準を定めることを可能にする。４Ｃｙｔ
ｅ Ｍｏｄｅｌ Ｉインターフェィスカードは４つまで
の入力信号のアナログ−デジタル変換のためと、ホスト
コンピューターのＲＡＭメモリーへのこれらの値の捕捉
のため、４Ｃｙｔｅソフトウエアと一緒に用いられる。
デジタル化された信号は一覧表形式に記憶される。各細
胞に関して測定された４つの各パラメーターとフラッギ
ング（ｆｌａｇｇｉｎｇ）についてとの５つの８ビット
バイトの情報がある。これらの実験についてのホストコ
ンピューターはカラーモニターとマッチ副処理器（ｍａ
ｔｃｈ ｃｏ−ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）とを装備したＩＢ
Ｍ ＰＣ／ＸＴクローンであった。データ整理はＩＢＭ
に相応するどんなコンピューターでも行える。
ル変換器７２とデータ取得ソフトウエアとはＨｏｗａｒ
ｄ Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｍ．Ｄ．，Ｐ．Ｃ．ｏｆ Ｃａｍ
ｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．から購入した４Ｃｙｔｅシス
テムの凡ての構成要素である。パルス高さ分析器は４Ｃ
ｙｔｅ Ｍｏｄｅｌ ＦＥ Ｆｒｏｎｔ Ｅｎｄであ
る。この構成要素は４つまでの入力信号について、パル
ス高さを表わす保持パルスを生じさせ、“妥当な”パル
ス高さしきい水準を定めることを可能にする。４Ｃｙｔ
ｅ Ｍｏｄｅｌ Ｉインターフェィスカードは４つまで
の入力信号のアナログ−デジタル変換のためと、ホスト
コンピューターのＲＡＭメモリーへのこれらの値の捕捉
のため、４Ｃｙｔｅソフトウエアと一緒に用いられる。
デジタル化された信号は一覧表形式に記憶される。各細
胞に関して測定された４つの各パラメーターとフラッギ
ング（ｆｌａｇｇｉｎｇ）についてとの５つの８ビット
バイトの情報がある。これらの実験についてのホストコ
ンピューターはカラーモニターとマッチ副処理器（ｍａ
ｔｃｈ ｃｏ−ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）とを装備したＩＢ
Ｍ ＰＣ／ＸＴクローンであった。データ整理はＩＢＭ
に相応するどんなコンピューターでも行える。
【００６９】図４に移って、赤色励起染料用の照明光学
システムが一般的に参照番号１１０で示されていて、そ
れは６３３ｎｍの光の２ｍＷビームを放射するヘリウム
−ネオンレーザー１１２を組込んでいる。そのビームは
レーザービームの位置の調節をする２つの反射鏡１１４
と１１６とにより折りまげられる。その調節はビーム軸
を、照明光学系の物理的光学軸と一致させることが可能
である。それからそのビームは円柱レンズ１１８と１２
０とにより１９２×７７μｍの楕円形（１／ｅ2におい
て）ビームに形成される。１９２μｍの長さは１５０ｍ
ｍ焦点距離の円柱レンズ１１８により形づくられ、それ
はＡ−１孔口１２２の長軸（図４の頁面に平行）を照明
する。７７μｍの長さは６０ｍｍ焦点距離の円柱レンズ
１２０により形づくられ、それはＡ−１孔口の短軸を照
明する。Ａ−１孔口は６５３×８９μｍである。照明二
重レンズ１２３は流通セルに、３７．４×１２．６μｍ
の楕円に形づくられたガラス強度分布を作る。その楕円
の短軸は垂直である流れの方向に対し平行、即ち矢印１
２６の方向にある。
システムが一般的に参照番号１１０で示されていて、そ
れは６３３ｎｍの光の２ｍＷビームを放射するヘリウム
−ネオンレーザー１１２を組込んでいる。そのビームは
レーザービームの位置の調節をする２つの反射鏡１１４
と１１６とにより折りまげられる。その調節はビーム軸
を、照明光学系の物理的光学軸と一致させることが可能
である。それからそのビームは円柱レンズ１１８と１２
０とにより１９２×７７μｍの楕円形（１／ｅ2におい
て）ビームに形成される。１９２μｍの長さは１５０ｍ
ｍ焦点距離の円柱レンズ１１８により形づくられ、それ
はＡ−１孔口１２２の長軸（図４の頁面に平行）を照明
する。７７μｍの長さは６０ｍｍ焦点距離の円柱レンズ
１２０により形づくられ、それはＡ−１孔口の短軸を照
明する。Ａ−１孔口は６５３×８９μｍである。照明二
重レンズ１２３は流通セルに、３７．４×１２．６μｍ
の楕円に形づくられたガラス強度分布を作る。その楕円
の短軸は垂直である流れの方向に対し平行、即ち矢印１
２６の方向にある。
【００７０】測定体積を通過する凡ての細胞は入射放射
線を散乱および吸収する。散乱および吸収された光は図
５で示されている検出光学系中に捕捉され、測定され
る。散乱されそして螢光を発した光は高開口数（Ｈｉ−
ＮＡ）レンズ１２８で集められ、平行にされる。集光レ
ンズの開口数は０．３４ｎｍである。このビームは、６
７０ｎｍ以下の波長の光は通過させることができる２色
ビームスプリッター１３０により２つの部分に分割され
る。ビーム１３２は濾光後光電子増倍管に反射され、螢
光測定に用いられ、一方透過されたビーム１３４は更
に、２つの散乱チャネルを作るため、５０／５０（５０
％反射、５０％透過）ビームスプリッター１３６で分け
られる。反射された散乱チャネル１３８は５−１５°絞
り１４０を持ち、透過チャネル１４２は２−３°絞り１
４４を持つ。各絞り１４０，１４４を通った光はそれぞ
れ、レンズ１４６と１４８とを通り、フォトダイオード
１５０と１５２とに焦点を結ぶ。濃度フィルター１５４
と１５６とは各フォトダイオードにおける光の水準を標
準検出器と前置増幅器とに適当な水準に低下させるのに
用いられる。
線を散乱および吸収する。散乱および吸収された光は図
５で示されている検出光学系中に捕捉され、測定され
る。散乱されそして螢光を発した光は高開口数（Ｈｉ−
ＮＡ）レンズ１２８で集められ、平行にされる。集光レ
ンズの開口数は０．３４ｎｍである。このビームは、６
７０ｎｍ以下の波長の光は通過させることができる２色
ビームスプリッター１３０により２つの部分に分割され
る。ビーム１３２は濾光後光電子増倍管に反射され、螢
光測定に用いられ、一方透過されたビーム１３４は更
に、２つの散乱チャネルを作るため、５０／５０（５０
％反射、５０％透過）ビームスプリッター１３６で分け
られる。反射された散乱チャネル１３８は５−１５°絞
り１４０を持ち、透過チャネル１４２は２−３°絞り１
４４を持つ。各絞り１４０，１４４を通った光はそれぞ
れ、レンズ１４６と１４８とを通り、フォトダイオード
１５０と１５２とに焦点を結ぶ。濃度フィルター１５４
と１５６とは各フォトダイオードにおける光の水準を標
準検出器と前置増幅器とに適当な水準に低下させるのに
用いられる。
【００７１】ビームスプリッター１３０で反射された光
は狭帯域（６９０ｎｍ）フィルター１５９、直径１ｍｍ
ピンホールを通りレンズ１５８で光電子増倍管１６０上
に焦点が結ばれ、そこで入射エネルギーの大きさに比例
する電気信号を発生する。検出レンズ１５８の前に置か
れた２ｍｍ幅のブロッキングバー１５７はバックグラウ
ンド光雑音を低下させる主ビームを遮断する。フォトダ
イオード１５０，１５２および光電子増倍管１６０によ
り発生された信号は図３で示したものと同様なポスト検
出信号処理システムで処理される。しかし、この場合３
つだけの信号、即ち赤色低角度散乱と高角度散乱と赤色
螢光とが処理される（図３について議論した４つの信号
ではない）。
は狭帯域（６９０ｎｍ）フィルター１５９、直径１ｍｍ
ピンホールを通りレンズ１５８で光電子増倍管１６０上
に焦点が結ばれ、そこで入射エネルギーの大きさに比例
する電気信号を発生する。検出レンズ１５８の前に置か
れた２ｍｍ幅のブロッキングバー１５７はバックグラウ
ンド光雑音を低下させる主ビームを遮断する。フォトダ
イオード１５０，１５２および光電子増倍管１６０によ
り発生された信号は図３で示したものと同様なポスト検
出信号処理システムで処理される。しかし、この場合３
つだけの信号、即ち赤色低角度散乱と高角度散乱と赤色
螢光とが処理される（図３について議論した４つの信号
ではない）。
【００７２】次の実施例は試薬組成物と、螢光流通式細
胞測定技術を用いる、網赤血球の同定と網赤血球並に赤
色血液細胞の特性表示のための、同じ試薬組成物を組込
んだ方とを説明する。可能な場合は何時でも、標準的
な、市販で入手できる試薬級材料を用いる。次の処方と
操作とは唯説明の目的だけに提供されること、他の成分
と割合と操作とが本発明の開示に従って、採用できるこ
とが理解されよう。
胞測定技術を用いる、網赤血球の同定と網赤血球並に赤
色血液細胞の特性表示のための、同じ試薬組成物を組込
んだ方とを説明する。可能な場合は何時でも、標準的
な、市販で入手できる試薬級材料を用いる。次の処方と
操作とは唯説明の目的だけに提供されること、他の成分
と割合と操作とが本発明の開示に従って、採用できるこ
とが理解されよう。
【００７３】
【実施例１】双性イオン界面活性剤を含有する試薬組成
物を用いる、血液試料中の網赤血球と赤血球との区別の
ための散乱並に螢光測定 染料沃化３，６−ビス（ジメチルアミノ）−１０−２−
ヒドロキシエチルアクリジニウム（ＡＯＥＯＨ）を１ｍ
ｇＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド／ｍｌ原溶液中に貯蔵
する。作業試薬はこの染料原液を加え、染料の最終濃度
６〜１２μｇ／ｍｌとする。ラウラミドプロピルベタイ
ンの最終濃度は１２〜８７．５μｇ／ｍｌである。緩衝
溶液は次の成分を記載の濃度で含有する。 塩化カルシウム ０．４ｍＭ 塩化カリウム ４．０ｍＭ 塩化マグネシウム ４０．０ｍＭ リン酸ナトリウム（三塩基） ０．５ｍＭ 重炭酸ナトリウム ２０．０ｍＭ
物を用いる、血液試料中の網赤血球と赤血球との区別の
ための散乱並に螢光測定 染料沃化３，６−ビス（ジメチルアミノ）−１０−２−
ヒドロキシエチルアクリジニウム（ＡＯＥＯＨ）を１ｍ
ｇＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド／ｍｌ原溶液中に貯蔵
する。作業試薬はこの染料原液を加え、染料の最終濃度
６〜１２μｇ／ｍｌとする。ラウラミドプロピルベタイ
ンの最終濃度は１２〜８７．５μｇ／ｍｌである。緩衝
溶液は次の成分を記載の濃度で含有する。 塩化カルシウム ０．４ｍＭ 塩化カリウム ４．０ｍＭ 塩化マグネシウム ４０．０ｍＭ リン酸ナトリウム（三塩基） ０．５ｍＭ 重炭酸ナトリウム ２０．０ｍＭ
【００７４】この研究に使用した作業試薬の最終浸透性
とｐＨとはそれぞれ２７２ｍｍｄ／ｋｇと８．１とであ
った。
とｐＨとはそれぞれ２７２ｍｍｄ／ｋｇと８．１とであ
った。
【００７５】試料は自働化されたＴＥＣＨＮＩＣＯＮ
Ｈ’１赤色細胞試料処理概要をまねた方法で手で混合し
た。ガラス試験管を作業試薬５ｍｌで満す。それから血
液試料５μｌを、試薬を渦流混合機で撹拌しながら試薬
上にピペットで加える。その血液に１：１０００希釈液
を直に、前記の図１及び図２の流通式細胞測定装置と光
学システムの試料線に供給する。約２分間の中に、試料
は流通セルを通過し、赤色細胞と網赤血球との分析用ア
ルゴン−イオンレーザーに曝される。各試料は、若し試
料体積が許せば２回測定される。
Ｈ’１赤色細胞試料処理概要をまねた方法で手で混合し
た。ガラス試験管を作業試薬５ｍｌで満す。それから血
液試料５μｌを、試薬を渦流混合機で撹拌しながら試薬
上にピペットで加える。その血液に１：１０００希釈液
を直に、前記の図１及び図２の流通式細胞測定装置と光
学システムの試料線に供給する。約２分間の中に、試料
は流通セルを通過し、赤色細胞と網赤血球との分析用ア
ルゴン−イオンレーザーに曝される。各試料は、若し試
料体積が許せば２回測定される。
【００７６】顕微鏡を通して見ると、調製された試料中
の成熟赤色細胞と網赤血球とは球形化され、青色光で励
起すると赤色に螢光を発する網赤血球が見出された。
の成熟赤色細胞と網赤血球とは球形化され、青色光で励
起すると赤色に螢光を発する網赤血球が見出された。
【００７７】分析が終了すると、粗データは、縦座標が
前方散乱された光の相対強度、横座標が赤色螢光の相対
強度を表わしている青色散乱対赤色螢光サイトグラム、
図６の（１）、の形で表示される。サイトグラムに示さ
れる各点は１つの細胞を表わす。明白な細胞個体群はそ
れの特別な散乱および螢光信号に基き、明らかに観察さ
れる。成熟赤血球個体群は縦座標軸と垂直線Ｘとの間の
領域Ａ中に来る。これらの細胞は高い散乱信号と低い細
胞螢光信号とを示す。網赤血球個体群はＸの右の領域、
領域Ｂ、内に来る。これらの細胞はＡＯＥＯＨ染色ＲＮ
Ａからの高い螢光信号に依り、成熟赤血球とから区別で
きる。血小板個体群は線Ｙの下の領域Ｃ内に来る。血小
板は網赤血球に比較して、比較的低い散乱信号を持つ。
前方散乱された光の相対強度、横座標が赤色螢光の相対
強度を表わしている青色散乱対赤色螢光サイトグラム、
図６の（１）、の形で表示される。サイトグラムに示さ
れる各点は１つの細胞を表わす。明白な細胞個体群はそ
れの特別な散乱および螢光信号に基き、明らかに観察さ
れる。成熟赤血球個体群は縦座標軸と垂直線Ｘとの間の
領域Ａ中に来る。これらの細胞は高い散乱信号と低い細
胞螢光信号とを示す。網赤血球個体群はＸの右の領域、
領域Ｂ、内に来る。これらの細胞はＡＯＥＯＨ染色ＲＮ
Ａからの高い螢光信号に依り、成熟赤血球とから区別で
きる。血小板個体群は線Ｙの下の領域Ｃ内に来る。血小
板は網赤血球に比較して、比較的低い散乱信号を持つ。
【００７８】成熟赤血球と網赤血球との間の螢光分離に
基き、患者試料の網赤血球計数を、網赤血球と成熟赤血
球とを同定する、散乱並に螢光の領域を限定する電子工
学的“窓”を作ることにより測定してもよい。その
“窓”内に来る網赤血球と赤血球との数を測定し、それ
で全細胞個体群中に存在する網赤血球と赤血球との百分
率が知られる。図６の（１）においては網赤血球“窓”
は領域Ｂで、成熟赤血球“窓”は領域Ａで決められる。
図６の（２）の中および次の凡ての散乱／散乱サイトグ
ラム中、非線形のグリッド重複はＴｙｃｋｏの前記の方
法に従う、完全な球についての一定体積と一定屈折率と
の場所を示していることに注意。
基き、患者試料の網赤血球計数を、網赤血球と成熟赤血
球とを同定する、散乱並に螢光の領域を限定する電子工
学的“窓”を作ることにより測定してもよい。その
“窓”内に来る網赤血球と赤血球との数を測定し、それ
で全細胞個体群中に存在する網赤血球と赤血球との百分
率が知られる。図６の（１）においては網赤血球“窓”
は領域Ｂで、成熟赤血球“窓”は領域Ａで決められる。
図６の（２）の中および次の凡ての散乱／散乱サイトグ
ラム中、非線形のグリッド重複はＴｙｃｋｏの前記の方
法に従う、完全な球についての一定体積と一定屈折率と
の場所を示していることに注意。
【００７９】各試料中の網赤血球の参照百分率はＮａｔ
ｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃ
ａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｎ
ＣＣＬＳ）により推薦されている手動顕微鏡手順を用い
て決定される。この手順において、小体積の試料はニュ
ーメチレンブルーにより非常によく染色される。それか
ら通常の乾燥したウエッジスミア（Ｗｅｄｇｅ Ｓｍｅ
ａｒ）を調製し、試料中の網赤血球の百分率を顕微鏡に
より数える。顕微鏡は１００×油浸対物レンズと１０×
接眼レンズとを備えている。各試料について最低１００
０個の細胞を数える。計数の精密さを改善するため顕微
鏡の接眼レンズにＭｉｌｌｅｒディスクを挿入する。染
色後青色材料の２またはそれ以上の粒子を含有するどの
赤色細胞も網赤血球と分類した。
ｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃ
ａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｎ
ＣＣＬＳ）により推薦されている手動顕微鏡手順を用い
て決定される。この手順において、小体積の試料はニュ
ーメチレンブルーにより非常によく染色される。それか
ら通常の乾燥したウエッジスミア（Ｗｅｄｇｅ Ｓｍｅ
ａｒ）を調製し、試料中の網赤血球の百分率を顕微鏡に
より数える。顕微鏡は１００×油浸対物レンズと１０×
接眼レンズとを備えている。各試料について最低１００
０個の細胞を数える。計数の精密さを改善するため顕微
鏡の接眼レンズにＭｉｌｌｅｒディスクを挿入する。染
色後青色材料の２またはそれ以上の粒子を含有するどの
赤色細胞も網赤血球と分類した。
【００８０】患者試料の網赤血球数はこの流通式細胞測
定技術により１．７％と測定された。同じ血液試料はま
たＮＣＣＬＳ法により分析された。その結果、網赤血球
数は１．７％であった。
定技術により１．７％と測定された。同じ血液試料はま
たＮＣＣＬＳ法により分析された。その結果、網赤血球
数は１．７％であった。
【００８１】細胞をオキサジン７５０で染色し、図４及
び図５の、前記の螢光流通式細胞測定器と光学システム
とで測定した場合の、網赤血球と赤血球との個体群間の
高い識別を説明するために、第２の実験を行った。オキ
サジン７５０染料は１ｍｇＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド／ｍｌ原溶液中に貯蔵した。作業試薬はこの染料原液
を最終濃度０．２〜１．２μｇ／ｍｌになるように、球
形化剤および前記の緩衝剤溶液に加えて作った。
び図５の、前記の螢光流通式細胞測定器と光学システム
とで測定した場合の、網赤血球と赤血球との個体群間の
高い識別を説明するために、第２の実験を行った。オキ
サジン７５０染料は１ｍｇＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド／ｍｌ原溶液中に貯蔵した。作業試薬はこの染料原液
を最終濃度０．２〜１．２μｇ／ｍｌになるように、球
形化剤および前記の緩衝剤溶液に加えて作った。
【００８２】前記の試料調製案に従った。図７の（１）
はオキサジン７５０含有試薬で染色された正常人血液試
料の螢光対低角度散乱サイトグラムを示している。赤血
球と網赤血球との間の螢光分離に基いて、試料の網赤血
球は数は２．１％と測定された。ＮＣＣＬＳ法により分
析すると２．１％の網赤血球数が得られた。図８は図６
及び図７と同じデータから得られた成熟赤血球に重ね
た、“十”として網赤血球を示す。
はオキサジン７５０含有試薬で染色された正常人血液試
料の螢光対低角度散乱サイトグラムを示している。赤血
球と網赤血球との間の螢光分離に基いて、試料の網赤血
球は数は２．１％と測定された。ＮＣＣＬＳ法により分
析すると２．１％の網赤血球数が得られた。図８は図６
及び図７と同じデータから得られた成熟赤血球に重ね
た、“十”として網赤血球を示す。
【００８３】
【実施例２】本発明の試薬組成物と方法及びＮＣＣＬＳ
法を用いる相関研究 前記の螢光流通式細胞測定器と図１と図２の光学システ
ム並にＮＣＣＬＳ法とにおいて、ＡＯＥＯＨを試薬組成
物中に用いた場合のＡＯＥＯＨの性能を比較するため研
究を行った。血液試料は３９人のＴｅｃｈｎｉｃｏｎ作
業員と２３人の病院の患者とから得た。病院患者には３
つの鎌状赤血球と１つの地中海貧血と１０の新生児との
血液試料が含まれる。６２の血液試料を実施例１に記載
の試薬組成物で染色し、その網赤血球含有量を検定し
た。血液試料の同じセット中の網赤血球をＮＣＣＬＳ法
を用いても計数した。
法を用いる相関研究 前記の螢光流通式細胞測定器と図１と図２の光学システ
ム並にＮＣＣＬＳ法とにおいて、ＡＯＥＯＨを試薬組成
物中に用いた場合のＡＯＥＯＨの性能を比較するため研
究を行った。血液試料は３９人のＴｅｃｈｎｉｃｏｎ作
業員と２３人の病院の患者とから得た。病院患者には３
つの鎌状赤血球と１つの地中海貧血と１０の新生児との
血液試料が含まれる。６２の血液試料を実施例１に記載
の試薬組成物で染色し、その網赤血球含有量を検定し
た。血液試料の同じセット中の網赤血球をＮＣＣＬＳ法
を用いても計数した。
【００８４】実施例１に関し上記した試料調製オキサジ
ン分析案に従った。
ン分析案に従った。
【００８５】これらの２つの方法から得られた百分率網
赤血球数を図９で比較する。試薬組成物中ＡＯＥＯＨ６
μｇ／ｍｌの濃度で、この試薬組成物と、前記の螢光流
通式細胞測定器および図１と図２の光学システムを用い
て得られる測定と、ＮＣＣＬＳ法により得られる測定と
の間に密接な相関が存在することが示された。測定値に
関する相関係数は０．９５であった。
赤血球数を図９で比較する。試薬組成物中ＡＯＥＯＨ６
μｇ／ｍｌの濃度で、この試薬組成物と、前記の螢光流
通式細胞測定器および図１と図２の光学システムを用い
て得られる測定と、ＮＣＣＬＳ法により得られる測定と
の間に密接な相関が存在することが示された。測定値に
関する相関係数は０．９５であった。
【００８６】オキサジン７５０試薬を前記の螢光流通式
細胞測定器と図４と図５の光学システム並にＮＣＣＬＳ
法中に用いた場合のオキサジン７５０試薬の性能を比較
するため第２の実験を行った。実施例１の試料調製と分
析案とに従っった。血液試料はその試薬組成物で染色
し、その網赤血球含有量を検定した。同じ血液試料セッ
ト中の網赤血球はまたＮＣＣＬＳ法を用いても計数し
た。これら２つの方法から得られた百分率網赤血球数を
図１０で比較している。測定値の相関係数は０．９３で
あった。
細胞測定器と図４と図５の光学システム並にＮＣＣＬＳ
法中に用いた場合のオキサジン７５０試薬の性能を比較
するため第２の実験を行った。実施例１の試料調製と分
析案とに従っった。血液試料はその試薬組成物で染色
し、その網赤血球含有量を検定した。同じ血液試料セッ
ト中の網赤血球はまたＮＣＣＬＳ法を用いても計数し
た。これら２つの方法から得られた百分率網赤血球数を
図１０で比較している。測定値の相関係数は０．９３で
あった。
【００８７】
【実施例３】本発明の、ＡＯＥＯＨ含有試薬組成物とＴ
ＥＣＨＮＩＣＯＮＨ’１Ｊｒ参照法とを用いた相関研究 実施例２における試料と同じセットを、赤色細胞指数の
ためのＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１Ｊｒシステムを用い
ても測定した。ＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１Ｊｒ自働化
システムは個別の、等容積的に球形化された赤色血液細
胞の細胞体積とヘモグロビン濃度とを同時に測定する流
通式細胞測定器である。
ＥＣＨＮＩＣＯＮＨ’１Ｊｒ参照法とを用いた相関研究 実施例２における試料と同じセットを、赤色細胞指数の
ためのＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１Ｊｒシステムを用い
ても測定した。ＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１Ｊｒ自働化
システムは個別の、等容積的に球形化された赤色血液細
胞の細胞体積とヘモグロビン濃度とを同時に測定する流
通式細胞測定器である。
【００８８】指数、ＭＣＶとＭＣＨＣとは別別にＴＥＣ
ＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１Ｊｒ分析器で決定され、本発明の
ＡＯＥＯＨ含有試薬組成物を用いて得られた値と比較し
た。図１１と図１２はそれぞれ全赤色血液細胞指数、Ｍ
ＣＶとＭＣＨＣとに関する相関を示している。測定値に
対する相関係数はそれぞれ０．９１と０．９７とであっ
た。
ＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１Ｊｒ分析器で決定され、本発明の
ＡＯＥＯＨ含有試薬組成物を用いて得られた値と比較し
た。図１１と図１２はそれぞれ全赤色血液細胞指数、Ｍ
ＣＶとＭＣＨＣとに関する相関を示している。測定値に
対する相関係数はそれぞれ０．９１と０．９７とであっ
た。
【００８９】
【実施例４】本発明のオキサジン７５０含有試薬組成物
とＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１参照法とを用いた相関研
究 赤血球と網赤血球との指数、ＭＣＶとＭＣＨＣとを本発
明のオキサジン７５０試薬組成物を用い、個別に決定
し、得られた値と比較した。図１３と図１４とはそれぞ
れ全赤色血液細胞のＭＣＶとＭＣＨＣとに関する相関デ
ータを示す。
とＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１参照法とを用いた相関研
究 赤血球と網赤血球との指数、ＭＣＶとＭＣＨＣとを本発
明のオキサジン７５０試薬組成物を用い、個別に決定
し、得られた値と比較した。図１３と図１４とはそれぞ
れ全赤色血液細胞のＭＣＶとＭＣＨＣとに関する相関デ
ータを示す。
【００９０】測定値に対する相関係数はそれぞれ０．９
３と０．９２とであった。
３と０．９２とであった。
【００９１】
【実施例５】血液中の網赤血球を区別できないＡＯＥＯ
Ｈと緩衝剤とを含有する実施例２の試薬組成物を用い
る、血液試料中の網赤血球と赤血球とを区別するための
散乱と螢光測定。凡ての緩衝剤が同時に網赤血球を染色
し、球形化するのに用いることが出来るわけではない。
本実施例は、ｐＨ８．０、浸透性２９０ｍ０ｓｍで、Ａ
ＯＥＯＨ染色染料とリン酸塩緩衝剤とを用いた場合の、
網赤血球と赤血球との間の良好でない区別を示している
（図１５を見よ）。それに比較して、バルビタール緩衝
剤をｐＨ８．０、浸透性２９０ｍ０ｓｍで用いた場合、
網赤血球と赤血球との間の良好な分離が見られる（図１
６を見よ）。
Ｈと緩衝剤とを含有する実施例２の試薬組成物を用い
る、血液試料中の網赤血球と赤血球とを区別するための
散乱と螢光測定。凡ての緩衝剤が同時に網赤血球を染色
し、球形化するのに用いることが出来るわけではない。
本実施例は、ｐＨ８．０、浸透性２９０ｍ０ｓｍで、Ａ
ＯＥＯＨ染色染料とリン酸塩緩衝剤とを用いた場合の、
網赤血球と赤血球との間の良好でない区別を示している
（図１５を見よ）。それに比較して、バルビタール緩衝
剤をｐＨ８．０、浸透性２９０ｍ０ｓｍで用いた場合、
網赤血球と赤血球との間の良好な分離が見られる（図１
６を見よ）。
【００９２】前記の説明から明らかな本発明の幾つかの
有利さには、螢光流通式細胞測定技術による全血試料中
の網赤血球の同定および網赤血球と赤血球との体積とヘ
モグロビン含有量とヘモグロビン濃度との同時定量のた
めの試薬組成物と方法とが含まれる。
有利さには、螢光流通式細胞測定技術による全血試料中
の網赤血球の同定および網赤血球と赤血球との体積とヘ
モグロビン含有量とヘモグロビン濃度との同時定量のた
めの試薬組成物と方法とが含まれる。
【００９３】前記から見れば、本発明の幾つかの目的が
達成され、他の有利な結果が得られることが判るであろ
う。
達成され、他の有利な結果が得られることが判るであろ
う。
【００９４】本発明の範囲を逸脱することなく前記の構
成と方法とに種種な変更がなされ得るので、前記説明中
に含まれ、または随伴した図面に示された凡ての件は説
明であって限定の意味ではないと解釈されるべきであ
る。例えば、血液の画分試料は同様に処理できる。
成と方法とに種種な変更がなされ得るので、前記説明中
に含まれ、または随伴した図面に示された凡ての件は説
明であって限定の意味ではないと解釈されるべきであ
る。例えば、血液の画分試料は同様に処理できる。
【図１】本発明の原理を実行するための散乱／螢光流通
式細胞測定器の照明光学系の説明図である。
式細胞測定器の照明光学系の説明図である。
【図２】本発明の原理を実行するための散乱／螢光流通
式細胞測定器の検出光学系の説明図である。
式細胞測定器の検出光学系の説明図である。
【図３】本発明の原理を実行するための散乱／螢光流通
式細胞測定器の検出信号処理システムの機能ブロック図
である。
式細胞測定器の検出信号処理システムの機能ブロック図
である。
【図４】本発明の原理を実行するための散乱／螢光流通
式細胞測定器の照明光学系の説明図である。
式細胞測定器の照明光学系の説明図である。
【図５】本発明の原理を実行するための散乱／螢光流通
式細胞測定器の検出光学系の説明図である。
式細胞測定器の検出光学系の説明図である。
【図６】実施例１に従いＡＯＥＯＨで染色された網赤血
球を含有する全血試料に関するサイトグラムである。
（１）は光散乱対螢光のサイトグラムであり、（２）は
赤色光低角度散乱対赤色光高角度散乱のサイトグラムで
ある。
球を含有する全血試料に関するサイトグラムである。
（１）は光散乱対螢光のサイトグラムであり、（２）は
赤色光低角度散乱対赤色光高角度散乱のサイトグラムで
ある。
【図７】実施例１に従いオキサジン７５０で染色された
網赤血球を含有する全血試料に関するサイトグラムであ
る。（１）は光散乱対螢光のサイトグラムであり、
（２）は赤色光低角度散乱対赤色光高角度散乱のサイト
グラムである。
網赤血球を含有する全血試料に関するサイトグラムであ
る。（１）は光散乱対螢光のサイトグラムであり、
（２）は赤色光低角度散乱対赤色光高角度散乱のサイト
グラムである。
【図８】図６及び図７と同じデータから得られた網赤血
球（十字で示した）と赤色細胞（黒塗正方形で示した）
とに関するＨＣ対Ｖのサイトグラムである。
球（十字で示した）と赤色細胞（黒塗正方形で示した）
とに関するＨＣ対Ｖのサイトグラムである。
【図９】実施例２に従いＡＯＥＯＨ並にＮＣＣＬＳ参照
方法とを用いる、全血試料中に検出される網赤血球百分
率の比較を示す。
方法とを用いる、全血試料中に検出される網赤血球百分
率の比較を示す。
【図１０】実施例２に従いオキサジン７５０試薬並にＮ
ＣＣＬＳ参照方法とを用いる、全血試料中に検出される
網赤血球百分率の比較を示す。
ＣＣＬＳ参照方法とを用いる、全血試料中に検出される
網赤血球百分率の比較を示す。
【図１１】実施例３に従う、ＡＯＥＯＨ含有試薬とＴＥ
ＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１Ｊｒ参照方法とを用いた、染色
された網赤血球のＭＣＶのデータの相関を示す相関図で
ある。
ＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１Ｊｒ参照方法とを用いた、染色
された網赤血球のＭＣＶのデータの相関を示す相関図で
ある。
【図１２】実施例３に従う、ＡＯＥＯＨ含有試薬とＴＥ
ＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１Ｊｒ参照方法とを用いた、染色
された網赤血球のＭＣＨＣのデータの相関を示す相関図
である。
ＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１Ｊｒ参照方法とを用いた、染色
された網赤血球のＭＣＨＣのデータの相関を示す相関図
である。
【図１３】実施例４に従う、オキサジン７５０含有試薬
とＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１Ｊｒ参照方法とを用い
た、染色された網赤血球のＭＣＶのデータの相関を示す
相関図である。
とＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１Ｊｒ参照方法とを用い
た、染色された網赤血球のＭＣＶのデータの相関を示す
相関図である。
【図１４】実施例４に従う、オキサジン７５０含有試薬
とＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１Ｊｒ参照方法とを用い
た、染色された網赤血球のＭＣＨＣのデータの相関を示
す相関図である。
とＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１Ｊｒ参照方法とを用い
た、染色された網赤血球のＭＣＨＣのデータの相関を示
す相関図である。
【図１５】実施例５で得られたデータを示すサイトグラ
ムである。
ムである。
【図１６】実施例５で得られたデータを示すサイトグラ
ムである。
ムである。
１０ 照明光学系 １２ Ｈｅ−Ｎｅレーザー １４ アルゴンイオンレーザー １６ａ，１６ｂ，１６ｃ リレーミラー １８ 二色性ビームスプリッタ ２０ 孔口 ２２ 円柱レンズ ２４ 流通セル ２６ 色消しレンズ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/72 Ａ (72)発明者 ダニュアル、ベン・デイヴィド アメリカ合衆国ニューヨーク州10588、シ ュラブ・オゥク、アスペン・ロゥド 1335 番 (72)発明者 グレガリ、エム、コゥレラ アメリカ合衆国ニュージャーズィ州07003、 ブルームフィールド、ニューエル・ドライ ヴ 61番 (72)発明者 アルバト、キューポ アメリカ合衆国ニューヨーク州10583、ス カースデイル、ウインディング・レイン 11番 (72)発明者 ジェナ、フィシァ アメリカ合衆国ニュージャーズィ州07640、 ハリングタン・パーク、ノーマ・ロゥド 144番 (72)発明者 レナド、オーンスタイン アメリカ合衆国ニューヨーク州10607、ホ ワイト・プレインズ、ビルタム・ロゥド ５番 (56)参考文献 特開 昭61−79163（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−6468（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−210765（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−66851（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−182562（ＪＰ，Ａ)
Claims (34)
- 【請求項１】 （ａ）関心ある亜綱の細胞中のリボ核酸
を染色する有機カチオン染料化合物と、約６〜９のｐＨ
を維持するための緩衝剤と双性イオン界面活性剤であり
前記染料を沈でんさせない球形化剤とを包含する水性試
薬組成物に血液試料のアリコートを混合して懸濁液を形
成する工程、 （ｂ）上記工程（ａ）の懸濁液を、一時に実質的に細胞
１つずつ、集束されている光学的照明領域を通す工程、 （ｃ）各細胞により散乱された光および螢光を発した光
を検出する工程、及び （ｄ）前記の散乱および螢光を発した光に少くとも部分
的に基いて、関心ある前記亜綱の細胞を識別する工程、 を含んで成る、流通式細胞測定法による、血液試料中の
関心ある細胞の亜綱を識別する方法。 - 【請求項２】 細胞の亜綱が網状赤血球である、請求項
１に記載の方法。 - 【請求項３】 工程（ｂ）の光学的照明がスペクトルの
赤色領域での励起波長を持つ、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 工程（ｂ）の光学的照明がスペクトルの
青色領域での励起波長を持つ、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 染料化合物が構造式 【化１】 で表わされるオキソジン７５０である、請求項１に記載
の方法。 - 【請求項６】 試薬組成物が染料オキサジン７５０を濃
度約０．２〜１．２μｇ／ｍｌで含有する、請求項１に
記載の方法。 - 【請求項７】 試薬組成物が染料オキサジン７５０を濃
度約０．４〜０．６μｇ／ｍｌで含有する、請求項１に
記載の方法。 - 【請求項８】 界面活性剤がアルキルアミドベタインま
たはアルキルベタインである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 界面活性剤がラウラミドプロピルベタイ
ンである、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 界面活性剤が約１２〜８７．５μｇ／
ｍｌの量で存在する、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１１】 緩衝剤溶液が濃度約５〜５０ｍＭのＫ
／ＮａＨＣＯ３３、濃度約０〜８８ｍＭのＭｇＣｌ２、
濃度約４〜１０４ｍＭのＫＣｌ、濃度約０〜１．５ｍＭ
のＮａ３ＰＯ４および濃度約０〜０．４ｍＭのＣａＣｌ
２の１つまたはそれ以上を包含し、その試薬組成物の最
終浸透圧モル濃度が約２５０〜３３０ｍ０ｓｍである、
請求項１に記載の方法。 - 【請求項１２】 緩衝剤溶液が濃度約０〜１５０ｍＭの
Ｔｒｉｓと濃度約０〜１２１ｍＭのＫ２Ｏｘ／ＥＤＴＡ
と濃度約０〜１５５ｍＭのバルビタールとの１つまたは
それ以上を包含し、試薬組成物の最終浸透圧モル濃度が
約２８０〜３００ ｍ０ｓｍである、請求項１に記載の
方法。 - 【請求項１３】 （ａ）網状赤血球のリボ核酸を染色す
る有機カチオン染料化合物と双性イオン界面活性剤であ
り前記染料を沈でんさせない球形化剤と緩衝剤溶液とを
包含する試薬組成物と全血試料のアリコートを混合して
懸濁液を形成する工程、 （ｂ）上記工程（ａ）の懸濁液を、１度に実質的に細胞
１つずつ、集束された光学的照明領域を通す工程、 （ｃ）各細胞により散乱された光と螢光を発した光とを
検出する工程、 （ｄ）その散乱された光と螢光を発した光とに基き、染
色された細胞と未染色の細胞とを識別する工程、及び （ｅ）前記散乱および螢光を発した光とに基き、網状赤
血球または赤血球の数と体積とヘモグロビン濃度とＲＮ
Ａ濃度とを測定する工程、 を含んで成る、流通式細胞測定法による、全血試料中の
網状赤血球及び赤血球の識別方法。 - 【請求項１４】 試薬組成物が染料オキサジン７５０を
濃度約０．２〜１．２μｇ／ｍｌで含有する、請求項１
３に記載の方法。 - 【請求項１５】 試薬組成物のｐＨが約６〜９である、
請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１６】 緩衝剤溶液が濃度約５〜５０ｍＭのＫ
／ＮａＨＣＯ３、濃度約０〜８８ｍＭのＭｇＣｌ２２、
濃度約４〜１０４ｍＭのＫＣｌ、濃度約０〜１．５ｍＭ
のＮａ３ＰＯ４および濃度約０〜０．４ｍＭのＣａＣｌ
２の１つまたはそれ以上を包含し、その試薬組成物の最
終浸透圧モル濃度が約２５０〜３３０ｍ０ｓｍである、
請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１７】 緩衝剤溶液が濃度約０〜１５０ｍＭの
Ｔｒｉｓと濃度約０〜１２１ｍＭのＫ２Ｏｘ／ＥＤＴＡ
と濃度約０〜１５５ｍＭのバルビタールとの１つまたは
それ以上を包含し、試薬組成物の最終浸透圧力モル濃度
約２８０〜３００ ｍ０ｓｍである、請求項１３に記載
の方法。 - 【請求項１８】 界面活性剤がアルキルアミドベタイン
またはアルキルベタインである、請求項１３に記載の方
法。 - 【請求項１９】 界面活性剤がラウラミドプロピルベタ
インである、請求項１８に記載の方法。 - 【請求項２０】 界面活性剤が約１２〜８７．５μｇ／
ｍｌの量で存在する、請求項１３に記載の方法。 - 【請求項２１】 試薬組成物が染料オキサジン７５０を
濃度約０．４〜０．６μｇ／ｍｌで含有する、請求項１
３に記載の方法。 - 【請求項２２】 工程（ｂ）において赤色領域の分光に
励起波長を有する光学的照明領域を通す請求項１３に記
載の方法。 - 【請求項２３】 工程（ｂ）において青色領域の分光に
励起波長を有する光学的照明領域を通す請求項１３に記
載の方法。 - 【請求項２４】 網状赤血球と赤血球とを含んで成る全
血試料中の網状赤血球を識別するための組成物であっ
て、網状赤血球中のリボ核酸を染色するために充分な量
の赤色励起可能な蛍光有機カチオン染料化合物と網状赤
血球および赤血球の等容積的球形化を果し前記染料は沈
でんさせない量の双性イオン界面活性剤と、約６〜９の
組成物ｐＨを維持するための緩衝剤溶液とを含む、流通
式細胞測定法による全血試料中の網状赤血球の識別のた
めの試薬組成物。 - 【請求項２５】 染料化合物として構造式 【化６】 で表わされるオキサジン７５０を含む、請求項２４に記
載の組成物。 - 【請求項２６】 緩衝剤溶液が濃度約５〜５０ｍＭのＫ
／ＮａＨＣＯ３と濃度約０〜８８ｍＭのＭｇＣｌ２と濃
度約４〜１０４ｍＭのＫＣｌと濃度約０〜１．５ｍＭの
Ｎａ３ＰＯ４と濃度約０〜０．４ｍＭのＣａＣｌ２との
１つまたはそれ以上を含み、試薬組成物の最終浸透圧モ
ル濃度が約２７０〜３１０ｍ．０ｓｍである、請求項２
４または２５に記載の試薬組成物。 - 【請求項２７】 緩衝剤溶液が濃度約０〜１５０ｍＭの
Ｔｒｉｓと濃度約０〜１２１ｍＭのＫ２Ｏｘ／ＥＤＴＡ
と濃度約０〜１５５ｍＭのバルビタールとの１つまたは
それ以上を含み、試薬組成物の最終浸透圧モル濃度が約
２８０〜３００ ｍ ０ｓｍである、請求項２４または
２５に記載の試薬組成物。 - 【請求項２８】 ｐＨが約７〜８である請求項２４また
は２５に記載の組成物。 - 【請求項２９】 濃度約０．２〜１．２μｇ／ｍｌの染
料化合物を含有する、請求項２４または２５に記載の組
成物。 - 【請求項３０】 濃度約０．４〜０．６μｇ／ｍｌの染
料オキサジン７５０を含有する、請求項２４または２５
に記載の組成物。 - 【請求項３１】 双性イオン界面活性剤を濃度約１２〜
８７．５μｇ／ｍｌで含有する、請求項２４または２５
に記載の試薬組成物。 - 【請求項３２】 界面活性剤がアルキルアミドベタイン
またはアルキルベタインである、請求項２４または２５
に記載の試薬組成物。 - 【請求項３３】 界面活性剤がラウラミドプロピルベタ
インである、請求項３２に記載の試薬組成物。 - 【請求項３４】 重炭酸イオン、塩素イオン、ほう酸イ
オン、バルビタール、しゅう酸イオンおよびエチレンジ
アミンテトラ酢酸からなる群から選んだ１種またはそれ
以上のアニオンまたはカリウムイオン、ナトリウムイオ
ン、トリスヒドロキシメチルアミノメタンおよびトリエ
タノールアミンからなる群から選んだ１種またはそれ以
上のカチオン、またはそれらの混合物をさらに含む、請
求項２４または２５に記載の組成物。
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