JPH0827285B2 - 固定化赤血球を用いた免疫学的測定方法 - Google Patents
固定化赤血球を用いた免疫学的測定方法Info
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- JPH0827285B2 JPH0827285B2 JP2064422A JP6442290A JPH0827285B2 JP H0827285 B2 JPH0827285 B2 JP H0827285B2 JP 2064422 A JP2064422 A JP 2064422A JP 6442290 A JP6442290 A JP 6442290A JP H0827285 B2 JPH0827285 B2 JP H0827285B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、免疫学的凝集反応によってサンプル中に
存在する抗原または抗体を測定するための方法に関す
る。
存在する抗原または抗体を測定するための方法に関す
る。
免疫学的な凝集反応に基づき、サンプル中に存在する
抗原または抗体を検出するための方法として、粒子凝集
法が従来より知られている。この方法においては、被測
定物質と特異的に結合する抗体または抗原が表面に固定
化されている特定のマーカー粒子が用いられる。このマ
ーカー粒子を測定容器内のサンプルと混合して、サンプ
ル中に含まれる抗原または抗体との間で免疫反応を行わ
せた後、測定容器の所定の壁面（例えば底面）に集め
る。こうして容器壁面に集められたマーカー粒子は、サ
ンプル中の被測定物質との間で免疫反応が生じた場合と
生じなかった場合とでは分布パターンが異なる。したが
って、容器壁面に集められたマーカー粒子の分布パター
ンから陽性または陰性を判定することができる。
抗原または抗体を検出するための方法として、粒子凝集
法が従来より知られている。この方法においては、被測
定物質と特異的に結合する抗体または抗原が表面に固定
化されている特定のマーカー粒子が用いられる。このマ
ーカー粒子を測定容器内のサンプルと混合して、サンプ
ル中に含まれる抗原または抗体との間で免疫反応を行わ
せた後、測定容器の所定の壁面（例えば底面）に集め
る。こうして容器壁面に集められたマーカー粒子は、サ
ンプル中の被測定物質との間で免疫反応が生じた場合と
生じなかった場合とでは分布パターンが異なる。したが
って、容器壁面に集められたマーカー粒子の分布パター
ンから陽性または陰性を判定することができる。
これとは別に、Wiener,A.S.およびHerman,M.H.により
混合凝集法が報告されている（J.Immunol.、36、255（1
939））。この方法はその後発展し、血液型の判定が可
能とされるまでに確立されている（Coombs,R.R.A.およ
びBedford,D.、VoxSang、５、111（1955）;Coombs,R.R.
A.ら、Lancet、ｉ、461（1956））。各種血液型の判定
に応用したものとして、例えばUSP 4,608,246号、USP
4,275,053号およびUSP 4,328,183号が挙げられる。
混合凝集法が報告されている（J.Immunol.、36、255（1
939））。この方法はその後発展し、血液型の判定が可
能とされるまでに確立されている（Coombs,R.R.A.およ
びBedford,D.、VoxSang、５、111（1955）;Coombs,R.R.
A.ら、Lancet、ｉ、461（1956））。各種血液型の判定
に応用したものとして、例えばUSP 4,608,246号、USP
4,275,053号およびUSP 4,328,183号が挙げられる。
また、被測定物質と特異的に結合する抗体等を反応容
器の内壁に予め固定しておく方法も知られている（MPHA
法）。この方法においては、被測定物質に特異的に結合
する物質（抗体等）を反応容器の内壁に予め固定化して
おく。そして、この抗体等に被測定物質を特異的に結合
させた後、マーカー粒子を添加する。このマーカー粒子
は、容器内壁に固定化された抗体等に結合した被測定物
質と反応して凝集パターンを形成する。このようなMPHA
法は、例えばUSP 4,297,104号等に記載されている。
器の内壁に予め固定しておく方法も知られている（MPHA
法）。この方法においては、被測定物質に特異的に結合
する物質（抗体等）を反応容器の内壁に予め固定化して
おく。そして、この抗体等に被測定物質を特異的に結合
させた後、マーカー粒子を添加する。このマーカー粒子
は、容器内壁に固定化された抗体等に結合した被測定物
質と反応して凝集パターンを形成する。このようなMPHA
法は、例えばUSP 4,297,104号等に記載されている。
ところで、凝集パターンの形成は、その多くがマーカ
ー粒子の自然沈降によるものであり、パターン形成が完
了するまでに多大な時間を要する。この問題点を解決す
るべく、発明者らは、磁性粒子を用いて磁力によって短
時間でパターンの形成を行なう方法を提唱している（特
願平１−184819、未公開）。
ー粒子の自然沈降によるものであり、パターン形成が完
了するまでに多大な時間を要する。この問題点を解決す
るべく、発明者らは、磁性粒子を用いて磁力によって短
時間でパターンの形成を行なう方法を提唱している（特
願平１−184819、未公開）。
上記従来の粒子凝集法および混合凝集法においては、
サンプル中に含まれるマーカー粒子以外の沈降性粒子が
沈降するため、判定精度が低下してしまう。したがっ
て、良好な判定を行なうためには、この目的沈降性粒子
を除去するためにサンプルを洗浄する等の操作を必要と
し、操作が繁雑になっていた。
サンプル中に含まれるマーカー粒子以外の沈降性粒子が
沈降するため、判定精度が低下してしまう。したがっ
て、良好な判定を行なうためには、この目的沈降性粒子
を除去するためにサンプルを洗浄する等の操作を必要と
し、操作が繁雑になっていた。
また、前記MPHA法においては、被測定物質と特異的に
結合する物質を容器内壁に結合させる方法として、物理
吸着によって直接容器内壁に結合させる方法が広く一般
に行われている。
結合する物質を容器内壁に結合させる方法として、物理
吸着によって直接容器内壁に結合させる方法が広く一般
に行われている。
しかしながら、この方法では、正常なパターンが形成
されない場合がある。例えば、容器内壁に直接HBsを物
理吸着させてサンプル中の抗HBs抗体の測定を行なおう
としても、陽性パターンと陰性パターンとを明確に区別
することが困難である。また、前記物質を直接容器内壁
に吸着させる場合には、吸着能の高い容器を選択する必
要がある。さらに、吸着させようとする物質によって吸
着の起こり易さが異なり、物質によって容器の材質を選
択する必要がある。
されない場合がある。例えば、容器内壁に直接HBsを物
理吸着させてサンプル中の抗HBs抗体の測定を行なおう
としても、陽性パターンと陰性パターンとを明確に区別
することが困難である。また、前記物質を直接容器内壁
に吸着させる場合には、吸着能の高い容器を選択する必
要がある。さらに、吸着させようとする物質によって吸
着の起こり易さが異なり、物質によって容器の材質を選
択する必要がある。
一方、化学吸着によって物質を直接容器内壁に結合さ
せる化学的結合法においては、容器内壁に結合させるた
めに、吸着させようとする抗原または抗体の化学結合基
を用いる。したがって、抗原又は抗体の反応性を損なう
ことがあり、どのような物質に対しても行なえるという
ものではない。
せる化学的結合法においては、容器内壁に結合させるた
めに、吸着させようとする抗原または抗体の化学結合基
を用いる。したがって、抗原又は抗体の反応性を損なう
ことがあり、どのような物質に対しても行なえるという
ものではない。
したがって、この発明の第一の課題は、被測定物質以
外の沈降性物質を含むサンプルについても、その影響を
受けずに高精度の測定を迅速に行なうことが可能な免疫
学的測定法を提供することにある。
外の沈降性物質を含むサンプルについても、その影響を
受けずに高精度の測定を迅速に行なうことが可能な免疫
学的測定法を提供することにある。
また、この発明の第二の課題は、被測定物質と特異的
に結合する物質を容器内壁に結合させるMPHA法におい
て、容器内壁の性状を変えず、吸着させようとする物質
の反応性を損なわず、および吸着させようとする物質の
種類によって容器の材質を変更する必要もなく容器内壁
に物質を固相することができる、高感度で安定性の高い
免疫学的測定方法を提供することにある。
に結合する物質を容器内壁に結合させるMPHA法におい
て、容器内壁の性状を変えず、吸着させようとする物質
の反応性を損なわず、および吸着させようとする物質の
種類によって容器の材質を変更する必要もなく容器内壁
に物質を固相することができる、高感度で安定性の高い
免疫学的測定方法を提供することにある。
この発明の免疫学的測定方法は、 被測定物質と特異的に結合する物質を結合した固定化赤
血球を内壁に固相化した粒子凝集判定容器を調製する工
程と、 前記粒子凝集判定容器にサンプル溶液を注入する工程
と、 前記粒子凝集判定容器から未反応の物質を除去する工
程と、 被測定物質と結合する物質を結合した磁性マーカーを
前記粒子凝集判定容器内に注入する工程と、 前記粒子凝集判定容器に磁界を作用させて磁性マーカ
ー粒子の沈降を促進する工程と、 前記粒子凝集判定容器の内壁に沈降した磁性マーカー
粒子の分布状態に基づいて、前記サンプル溶液中に含有
される被測定物質を測定する工程とを具備する。
血球を内壁に固相化した粒子凝集判定容器を調製する工
程と、 前記粒子凝集判定容器にサンプル溶液を注入する工程
と、 前記粒子凝集判定容器から未反応の物質を除去する工
程と、 被測定物質と結合する物質を結合した磁性マーカーを
前記粒子凝集判定容器内に注入する工程と、 前記粒子凝集判定容器に磁界を作用させて磁性マーカ
ー粒子の沈降を促進する工程と、 前記粒子凝集判定容器の内壁に沈降した磁性マーカー
粒子の分布状態に基づいて、前記サンプル溶液中に含有
される被測定物質を測定する工程とを具備する。
以下、この発明の方法を詳細に説明する。
この発明において測定すべき物質は、例えばウイス
ル、細菌もしくは種々のタンパク質等の抗原物質、およ
びこれら抗原物質に対する抗体等である。これら被測定
物質は可溶性物質であってもよく、また不溶性物質であ
ってもよい。
ル、細菌もしくは種々のタンパク質等の抗原物質、およ
びこれら抗原物質に対する抗体等である。これら被測定
物質は可溶性物質であってもよく、また不溶性物質であ
ってもよい。
この発明において用いられる磁性マーカー粒子は、測
定すべき物質に特異的に結合する物質（以下、感作物質
Ｂという）、例えば特定の抗体または抗原を、磁性体を
含有する公知の磁性粒子の表面に固定化することにより
調製することができる。このような磁性粒子としては、
市販の「DYNABEAS M−450」（DYNAL社の商品名）、磁性
ラテックスビーズ「estapor」（RHONE−POULENC社製の
商品名）を用いることができる。また、特開昭59−1951
61号広報に開示された磁性体を含むゼラチン粒子を用い
てもよい。さらに、鉄分等の強磁性体を取り込ませた赤
血球等の細胞を用いてもよい。これら磁性粒子の表面に
前記感作物質Ｂ（特定の抗体または抗原）を固定化する
方法としては、種々の公知の方法を用いることができ
る。
定すべき物質に特異的に結合する物質（以下、感作物質
Ｂという）、例えば特定の抗体または抗原を、磁性体を
含有する公知の磁性粒子の表面に固定化することにより
調製することができる。このような磁性粒子としては、
市販の「DYNABEAS M−450」（DYNAL社の商品名）、磁性
ラテックスビーズ「estapor」（RHONE−POULENC社製の
商品名）を用いることができる。また、特開昭59−1951
61号広報に開示された磁性体を含むゼラチン粒子を用い
てもよい。さらに、鉄分等の強磁性体を取り込ませた赤
血球等の細胞を用いてもよい。これら磁性粒子の表面に
前記感作物質Ｂ（特定の抗体または抗原）を固定化する
方法としては、種々の公知の方法を用いることができ
る。
この発明において用いられる粒子凝集判定容器は、沈
降性粒子が容器壁面に沿って所定方向に移動するとき、
この沈降性粒子を所定の領域に収束させるような傾斜壁
面、例えば半球状または円錐状の壁面を有するものが好
ましい。このような傾斜は、容器の側面にあってもよい
が、底面にあることが好ましい。好ましい粒子凝集判定
容器としては、例えば半球状または円錐状の底面を有す
る試験管またはマイクロプレートを挙げることができ
る。
降性粒子が容器壁面に沿って所定方向に移動するとき、
この沈降性粒子を所定の領域に収束させるような傾斜壁
面、例えば半球状または円錐状の壁面を有するものが好
ましい。このような傾斜は、容器の側面にあってもよい
が、底面にあることが好ましい。好ましい粒子凝集判定
容器としては、例えば半球状または円錐状の底面を有す
る試験管またはマイクロプレートを挙げることができ
る。
次に、被測定物質と特異的に結合する物質（以下感作
物質Ａという）を結合した固定化赤血球を内壁に固相化
した粒子凝集判定容器の作成例を図面を参照して説明す
る。
物質Ａという）を結合した固定化赤血球を内壁に固相化
した粒子凝集判定容器の作成例を図面を参照して説明す
る。
第1a図ないし第1c図は、粒子凝集判定容器の作成方法
を模式的に示す図である。
を模式的に示す図である。
まず、第1a図に示すように、粒子凝集判定容器１の内
面に、ヒト、ヒツジ、ニワトリ等の赤血球を特異的もし
くは非特異的に結合し得る物質２を固相化する。このよ
うな物質としては、例えば、静電気結合することができ
るポリ−Ｌ−リジン、ポリアルギニン、ポリエチレンイ
ミン、各種レクチン、抗赤血球抗体等が挙げられる。
面に、ヒト、ヒツジ、ニワトリ等の赤血球を特異的もし
くは非特異的に結合し得る物質２を固相化する。このよ
うな物質としては、例えば、静電気結合することができ
るポリ−Ｌ−リジン、ポリアルギニン、ポリエチレンイ
ミン、各種レクチン、抗赤血球抗体等が挙げられる。
その後、第1b図に示すように、この容器中に赤血球３
の浮遊液を加えて容器内面に赤血球３を固相化する。赤
血球３の固相化は、赤血球浮遊液を添加後静置すること
により充分行なわれるが、弱い遠心をかけることにより
さらに時間を短縮することが可能である。
の浮遊液を加えて容器内面に赤血球３を固相化する。赤
血球３の固相化は、赤血球浮遊液を添加後静置すること
により充分行なわれるが、弱い遠心をかけることにより
さらに時間を短縮することが可能である。
次に、容器内壁に固相化された赤血球３を固定化試薬
を用いて固定する。固定化試薬としては、従来細胞の固
定に用いられている試薬を利用することができ、特に、
グルタルアルデヒド、ホルマリン等を好ましく利用する
ことができる。
を用いて固定する。固定化試薬としては、従来細胞の固
定に用いられている試薬を利用することができ、特に、
グルタルアルデヒド、ホルマリン等を好ましく利用する
ことができる。
次いで、この固定化赤血球の表面を従来行われている
方法でタンニン酸処理し、タンパク質と結合し易くす
る。その後、感作物質Ａ ４を含有する溶液を容器内に
入れ、感作物質Ａ ４を固定化赤血球表面に結合させ
る。
方法でタンニン酸処理し、タンパク質と結合し易くす
る。その後、感作物質Ａ ４を含有する溶液を容器内に
入れ、感作物質Ａ ４を固定化赤血球表面に結合させ
る。
また、最初に、感作物質Ａを固定化赤血球に結合さ
せ、その後、この固定化赤血球を容器内壁に固相化する
方法によっても調製することが可能である。この場合に
は、まず、赤血球を固定し、表面にタンニン酸処理を施
した後、感作物質Ａを含有する溶液と混合して感作物質
Ａを赤血球表面に結合させる。これとは別に、固定化赤
血球捕捉物質を容器内壁に固相化しておく。最後に、こ
の容器内に前記固定化赤血球を加えることにより固定化
赤血球を容器内壁に固相化する。
せ、その後、この固定化赤血球を容器内壁に固相化する
方法によっても調製することが可能である。この場合に
は、まず、赤血球を固定し、表面にタンニン酸処理を施
した後、感作物質Ａを含有する溶液と混合して感作物質
Ａを赤血球表面に結合させる。これとは別に、固定化赤
血球捕捉物質を容器内壁に固相化しておく。最後に、こ
の容器内に前記固定化赤血球を加えることにより固定化
赤血球を容器内壁に固相化する。
容器内壁に予め固相化される固定化赤血球捕捉物質
は、感作物質Ａ以外の部位で固定化赤血球と結合するこ
とが可能なものである。第２図に示すように、固定化赤
血球５が感作物質Ａ ４で容器内壁に結合した場合に
は、この赤血球は、被測定物質に対すする反応性が損な
われてしまう。また、固定化赤血球と固定化赤血球捕捉
物質との結合は、特異的な結合であっても、非特異的な
結合であってもよい。特異的な結合を形成する物質とし
ては、感作物質Ａとは反応せず、固定化赤血球と特異的
に反応する抗原もしくは抗体、レクチン等を挙げること
ができる。また、非特異的な結合を形成する物質として
は、静電結合によって固定化赤血球を結合するポリエチ
レンイミン、ポリ−Ｌ−リジン等を挙げることができ
る。
は、感作物質Ａ以外の部位で固定化赤血球と結合するこ
とが可能なものである。第２図に示すように、固定化赤
血球５が感作物質Ａ ４で容器内壁に結合した場合に
は、この赤血球は、被測定物質に対すする反応性が損な
われてしまう。また、固定化赤血球と固定化赤血球捕捉
物質との結合は、特異的な結合であっても、非特異的な
結合であってもよい。特異的な結合を形成する物質とし
ては、感作物質Ａとは反応せず、固定化赤血球と特異的
に反応する抗原もしくは抗体、レクチン等を挙げること
ができる。また、非特異的な結合を形成する物質として
は、静電結合によって固定化赤血球を結合するポリエチ
レンイミン、ポリ−Ｌ−リジン等を挙げることができ
る。
感作物質Ａを結合した固定化赤血球を粒子凝集判定容
器内に固相化した後、この容器にサンプル溶液を注入す
る。第3a図に示すように、サンプル溶液中に被測定物質
６が含まれる場合には、固定化赤血球３の表面に結合し
た感作物質Ａ ４と被測定物質６とが結合する。
器内に固相化した後、この容器にサンプル溶液を注入す
る。第3a図に示すように、サンプル溶液中に被測定物質
６が含まれる場合には、固定化赤血球３の表面に結合し
た感作物質Ａ ４と被測定物質６とが結合する。
感作物質Ａと被測定物質とを反応させた後、未反応物
質を容器１から除去する。これは、通常、容器１を洗浄
することにより行われる。
質を容器１から除去する。これは、通常、容器１を洗浄
することにより行われる。
容器１から未反応物質を除去した後、第3b図に示すよ
うに、前記磁性マーカー粒子７を容器中に注入し、磁石
９が形成する磁界を作用させて磁性マーカー粒子７の沈
降を促進する。前述のように、この磁性マーカー粒子７
には、被測定物質と特異的に反応する感作物質B8が結合
している。したがって、沈降した磁性マーカー粒子７
は、第3c図に示すように、固定化赤血球を介して容器内
壁に固定されている被測定物質６に結合する。すなわ
ち、固定化赤血球が固相化されている容器内壁にほぼ一
様に分布する。この結果、磁性マーカー粒子が示す分布
パターンは第4a図に示すように、容器内壁に広く拡がっ
たものとなる。
うに、前記磁性マーカー粒子７を容器中に注入し、磁石
９が形成する磁界を作用させて磁性マーカー粒子７の沈
降を促進する。前述のように、この磁性マーカー粒子７
には、被測定物質と特異的に反応する感作物質B8が結合
している。したがって、沈降した磁性マーカー粒子７
は、第3c図に示すように、固定化赤血球を介して容器内
壁に固定されている被測定物質６に結合する。すなわ
ち、固定化赤血球が固相化されている容器内壁にほぼ一
様に分布する。この結果、磁性マーカー粒子が示す分布
パターンは第4a図に示すように、容器内壁に広く拡がっ
たものとなる。
サンプル溶液中に被測定物質が含まれていない場合に
は、第3d図に示すように、続いて添加された磁性マーカ
ー粒子と反応する物質は容器内には存在しない。したが
って、磁性マーカー粒子は反応することなく容器の内壁
を転がり落ち、第3e図に示すように、容器の最低部に集
まる。この結果、磁性マーカー粒子が示す分布パターン
は、第4b図に示すように、容器の中心に粒子が集まった
ものとなる。
は、第3d図に示すように、続いて添加された磁性マーカ
ー粒子と反応する物質は容器内には存在しない。したが
って、磁性マーカー粒子は反応することなく容器の内壁
を転がり落ち、第3e図に示すように、容器の最低部に集
まる。この結果、磁性マーカー粒子が示す分布パターン
は、第4b図に示すように、容器の中心に粒子が集まった
ものとなる。
上述のように、この発明の方法においては、磁性マー
カー粒子の沈降を磁石等の磁界の作用により促進させて
いる。このため、測定時間を大幅に短縮することが可能
である。ここで用いられる磁石は特に限定されるもので
はなく、永久磁石であっても電磁石であってもよい。ま
た、磁石の強さは、被測定物質等に応じて適宜選択する
ことができる。
カー粒子の沈降を磁石等の磁界の作用により促進させて
いる。このため、測定時間を大幅に短縮することが可能
である。ここで用いられる磁石は特に限定されるもので
はなく、永久磁石であっても電磁石であってもよい。ま
た、磁石の強さは、被測定物質等に応じて適宜選択する
ことができる。
実施例１ 血清中の抗 HBs抗体の検出 A.固定血球プレートの作成 小麦胚芽レクチン（WGA）をリン酸緩衝液（PBS）に溶
解して100μg/mlの濃度にした溶液を、Ｕ底プレート（N
unc.Maxisorp）に分注し、WGAをプレートの内壁に吸着
させた。次いで、ウシ血清アルブミン（BSA）を用いて
ブロッキングを行ないWGA吸着プレートを作成した。次
に、Ｏ型血球サージスクリーン（Ortho社製）の0.7％ P
BS浮遊液を調製し、上記WGA吸着プレートに分注した。
室温で10分間静置して血球をプレートのウェル内壁に結
合させた後、PBSで３回洗浄した。次いで、この血球結
合プレートに、グルタルアルデヒド（Sigma社製）の2.5
％ PBS溶液を分注し、室温で１時間静置して血球を固定
した。その後、ウェルをPBSで洗浄することにより、グ
ルタルアルデヒドを除去した。最後に、タンニン製（半
井テスク社製）をPBSに溶解して10μg/mlとした溶液を
各ウェルに50μづつ分注し、室温で１時間インキュベ
ートして固定化赤血球のタンニン酸処理を行なった。
解して100μg/mlの濃度にした溶液を、Ｕ底プレート（N
unc.Maxisorp）に分注し、WGAをプレートの内壁に吸着
させた。次いで、ウシ血清アルブミン（BSA）を用いて
ブロッキングを行ないWGA吸着プレートを作成した。次
に、Ｏ型血球サージスクリーン（Ortho社製）の0.7％ P
BS浮遊液を調製し、上記WGA吸着プレートに分注した。
室温で10分間静置して血球をプレートのウェル内壁に結
合させた後、PBSで３回洗浄した。次いで、この血球結
合プレートに、グルタルアルデヒド（Sigma社製）の2.5
％ PBS溶液を分注し、室温で１時間静置して血球を固定
した。その後、ウェルをPBSで洗浄することにより、グ
ルタルアルデヒドを除去した。最後に、タンニン製（半
井テスク社製）をPBSに溶解して10μg/mlとした溶液を
各ウェルに50μづつ分注し、室温で１時間インキュベ
ートして固定化赤血球のタンニン酸処理を行なった。
B.抗原の感作 まず、酵母組換えHBs抗原（yHBs）をPBSで10μg/mlに
希釈した。この希釈液をタンニン酸処理を施した上記固
定血球プレートに各ウェル当り25μづつ分注し、室温
で１時間インキュベートしてyHBsの感作を行なった。ウ
ェルを洗浄した後、0.3％ BSA/PBS溶液を分注してブロ
ッキングした。さらにウェルを洗浄した後、水をきり、
風乾してyHBs感作プレートとした。
希釈した。この希釈液をタンニン酸処理を施した上記固
定血球プレートに各ウェル当り25μづつ分注し、室温
で１時間インキュベートしてyHBsの感作を行なった。ウ
ェルを洗浄した後、0.3％ BSA/PBS溶液を分注してブロ
ッキングした。さらにウェルを洗浄した後、水をきり、
風乾してyHBs感作プレートとした。
C.抗ヒトIgG感作磁性粒子の調製 ５μg/mlの抗ヒトIgG（Cappel社製、ポリクローナル
抗体）を用いて、粒径約６μｍの磁性対封入ゼラチン粒
子に抗ヒトIgGを感作した。その後、BSAでブロッキング
して抗ヒトIgG感作磁性粒子とした。
抗体）を用いて、粒径約６μｍの磁性対封入ゼラチン粒
子に抗ヒトIgGを感作した。その後、BSAでブロッキング
して抗ヒトIgG感作磁性粒子とした。
D.血清中のHBs抗体の検出 0.3％ BSA含有PBSを用いて、HBs抗体陽性サンプルお
よび陰性サンプルの希釈系列をそれぞれ調製した。これ
らの希釈液をyHBs感作プレートに分注し、37℃で10分間
インキュベートした後、PBSで６回洗浄した。次いで、
上記抗ヒトIgG感作磁性粒子を各ウェルに25μづつ分
注し、３分間磁石で吸引してパターン形成した。
よび陰性サンプルの希釈系列をそれぞれ調製した。これ
らの希釈液をyHBs感作プレートに分注し、37℃で10分間
インキュベートした後、PBSで６回洗浄した。次いで、
上記抗ヒトIgG感作磁性粒子を各ウェルに25μづつ分
注し、３分間磁石で吸引してパターン形成した。
得られた結果を第4a図および第4b図に示す。第4a図は
陽性サンプルから得られたパターン、第4b図は陰性サン
プルから得られたパターンであり、希釈倍率が2-6まで
はほぼ同様のパターンを示した。図に示すように、短時
間で、HBs抗体の存在を明確に判定することができる。
陽性サンプルから得られたパターン、第4b図は陰性サン
プルから得られたパターンであり、希釈倍率が2-6まで
はほぼ同様のパターンを示した。図に示すように、短時
間で、HBs抗体の存在を明確に判定することができる。
実施例２ 血清中のIgGの検出 抗ヒトIgG（Cappel社製）をPBSで希釈して10μg/mlの
濃度の希釈液を調製し、この希釈液を、実施例１と同様
の方法で作成したタンニン酸処理済みの固定血球プレー
トに各ウェル当り25μづつ分注した。これを室温で１
時間インキュベートすることにより抗ヒトIgGの感作を
行なった。抗ヒトIgGを感作した後、ウェルを洗浄し、
0.3％BSA/PBS溶液を分注してブロッキングした。その
後、さらにウェルを洗浄して風乾し、抗ヒトIgG感作プ
レートとした。
濃度の希釈液を調製し、この希釈液を、実施例１と同様
の方法で作成したタンニン酸処理済みの固定血球プレー
トに各ウェル当り25μづつ分注した。これを室温で１
時間インキュベートすることにより抗ヒトIgGの感作を
行なった。抗ヒトIgGを感作した後、ウェルを洗浄し、
0.3％BSA/PBS溶液を分注してブロッキングした。その
後、さらにウェルを洗浄して風乾し、抗ヒトIgG感作プ
レートとした。
0.3％ BSA含有PBSで市販プール血清（商品名「スイト
ロールＮ」、日水製薬社製）の希釈系列を調製し、上記
抗ヒトIgG感作プレートに分注した。分注後、37℃で10
分間インキュベートし、PBSで６回洗浄した。その後、
抗ヒトIgG感作磁性体封入粒子を各ウェルに25μづつ
分注し、３分間磁石で吸引してパターンを形成した。
ロールＮ」、日水製薬社製）の希釈系列を調製し、上記
抗ヒトIgG感作プレートに分注した。分注後、37℃で10
分間インキュベートし、PBSで６回洗浄した。その後、
抗ヒトIgG感作磁性体封入粒子を各ウェルに25μづつ
分注し、３分間磁石で吸引してパターンを形成した。
得られた結果を下記第１表および第5a図ないし第5c図
に示す。第5a図はスイトロールの希釈倍率が2-1の場
合、第5b図は2-16の場合、および第5c図はスイトロール
を添加しない場合のパターンをそれぞれ示す。
に示す。第5a図はスイトロールの希釈倍率が2-1の場
合、第5b図は2-16の場合、および第5c図はスイトロール
を添加しない場合のパターンをそれぞれ示す。
これらの表および図から明らかなように、スイトロー
ルの希釈倍率に応じて形成されるパターンの形状が異な
り、血清中のIgGを短時間で検出することができた。
ルの希釈倍率に応じて形成されるパターンの形状が異な
り、血清中のIgGを短時間で検出することができた。
比較例 血清中の抗 HBs抗体の検出 実施例１と同様の抗HBs抗体の検出を、抗原を直接マ
イロプレートに結合させる従来の方法で行なった。
イロプレートに結合させる従来の方法で行なった。
酵母組換え、HBs抗原（yHBs）をPBSで10μg/mlに希釈
してＵ底プレート（Nunc社製Maxisorp）に各ウェル当り
25μづつ分注し、室温で１時間インキュベートしてyH
Bsをウェル内壁に吸着させた。次いで、ウェルを洗浄し
た後、0.3％ BSA/PBS溶液を分注してブロッキングを行
なった。ブロッキングの後、ウェルを洗浄して水を切
り、風乾してyHBsプレートとした。
してＵ底プレート（Nunc社製Maxisorp）に各ウェル当り
25μづつ分注し、室温で１時間インキュベートしてyH
Bsをウェル内壁に吸着させた。次いで、ウェルを洗浄し
た後、0.3％ BSA/PBS溶液を分注してブロッキングを行
なった。ブロッキングの後、ウェルを洗浄して水を切
り、風乾してyHBsプレートとした。
次いで、0.3％ BSA含有PBSを用いて、HBs抗体陽性サ
ンプルおよび陰性サンプルの希釈系列を調製した。それ
ぞれの希釈液を上記yHBsプレートに分注し、30℃で10分
間インキュベートした。その後、PBSで６回洗浄した。
ンプルおよび陰性サンプルの希釈系列を調製した。それ
ぞれの希釈液を上記yHBsプレートに分注し、30℃で10分
間インキュベートした。その後、PBSで６回洗浄した。
次に、粒径約６μｍの磁性体封入ゼラチンビースを５
μg/mlの抗ヒト1gGを用いて感作し、抗ヒトIgG感作磁性
粒子を調製した。この感作磁性粒子を上記プレートに各
ウェル当り25μづつ分注し、磁石で３分間吸引した。
μg/mlの抗ヒト1gGを用いて感作し、抗ヒトIgG感作磁性
粒子を調製した。この感作磁性粒子を上記プレートに各
ウェル当り25μづつ分注し、磁石で３分間吸引した。
しかしなら、この場合には、陽性および陰性を明確に
区別し得るパターンは形成されなかった。
区別し得るパターンは形成されなかった。
以上のように、この発明の免疫学的測定方法において
は、磁性マーカー粒子を用い、かつ磁界を作用させて磁
性マーカー粒子の沈降を促進しているので、従来の粒子
凝集法に比較して非常に短時間でマーカー粒子の分布パ
ターンを形成することができる。すなわち、判定に要す
る時間を大幅に短縮することが可能である。また、沈降
が促進されるのが磁性マーカー粒子のみであるため、他
の沈降性粒子が沈殿する前に磁性マーカー粒子のパター
ンを形成することができる。したがって、被測定物質以
外の自然沈降性物質を予め除去することなく高感度かつ
高精度の測定を行うことが可能である。
は、磁性マーカー粒子を用い、かつ磁界を作用させて磁
性マーカー粒子の沈降を促進しているので、従来の粒子
凝集法に比較して非常に短時間でマーカー粒子の分布パ
ターンを形成することができる。すなわち、判定に要す
る時間を大幅に短縮することが可能である。また、沈降
が促進されるのが磁性マーカー粒子のみであるため、他
の沈降性粒子が沈殿する前に磁性マーカー粒子のパター
ンを形成することができる。したがって、被測定物質以
外の自然沈降性物質を予め除去することなく高感度かつ
高精度の測定を行うことが可能である。
さらに、この発明の免疫学的測定方法においては、ま
ず、容器内壁に固定化赤血球を固相化し、次いで、この
赤血球表面に被測定物質と特異的に反応する物質を結合
しており、被測定物質と特異的に反応する物質は直接容
器内壁には結合していない。このため、容器内壁の性状
を変えることがなく、被測定物質と特異的に反応する物
質の反応性を損なうことがなく、かつこの物質の種類に
応じて容器の材質を変更する必要がない。
ず、容器内壁に固定化赤血球を固相化し、次いで、この
赤血球表面に被測定物質と特異的に反応する物質を結合
しており、被測定物質と特異的に反応する物質は直接容
器内壁には結合していない。このため、容器内壁の性状
を変えることがなく、被測定物質と特異的に反応する物
質の反応性を損なうことがなく、かつこの物質の種類に
応じて容器の材質を変更する必要がない。
【図面の簡単な説明】 第1a図ないし第1c図は、この発明の免疫学的測定方法に
用いられる粒子凝集判定容器の作成方法を模式的に示す
図、 第２図は、この発明の免疫学的測定方法に用いられる粒
子凝集判定容器の作成時において、反応性が損なわれる
場合を模式的に示す図、 第3a図ないし第3e図は、この発明の免疫学的測定方法に
おける工程を模式的に示す図、 第4a図および第4b図は、この発明の一実施例における結
果を示す図、 第5a図ないし第5c図は、この発明の他の実施例における
結果を示す図である。
用いられる粒子凝集判定容器の作成方法を模式的に示す
図、 第２図は、この発明の免疫学的測定方法に用いられる粒
子凝集判定容器の作成時において、反応性が損なわれる
場合を模式的に示す図、 第3a図ないし第3e図は、この発明の免疫学的測定方法に
おける工程を模式的に示す図、 第4a図および第4b図は、この発明の一実施例における結
果を示す図、 第5a図ないし第5c図は、この発明の他の実施例における
結果を示す図である。
Claims (1)
- 【請求項１】被測定物質と特異的に結合する物質を結合
した固定化赤血球を内壁に固相化した粒子凝集判定容器
を調製する工程と、 前記粒子凝集判定容器にサンプル溶液を注入する工程
と、 前記粒子凝集判定容器から未反応の物質を除去する工程
と、 被測定物質と結合する物質を結合した磁性マーカーを前
記粒子凝集判定容器内に注入する工程と、 前記粒子凝集判定容器に磁界を作用させて磁性マーカー
粒子の沈降を促進する工程と、 前記粒子凝集判定容器の内壁に沈降した磁性マーカー粒
子の分布状態に基づいて、前記サンプル溶液中に含有さ
れる被測定物質を測定する工程とを具備する固定化赤血
球上における免疫学的測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2064422A JPH0827285B2 (ja) | 1990-03-16 | 1990-03-16 | 固定化赤血球を用いた免疫学的測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2064422A JPH0827285B2 (ja) | 1990-03-16 | 1990-03-16 | 固定化赤血球を用いた免疫学的測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03267759A JPH03267759A (ja) | 1991-11-28 |
| JPH0827285B2 true JPH0827285B2 (ja) | 1996-03-21 |
Family
ID=13257826
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2064422A Expired - Lifetime JPH0827285B2 (ja) | 1990-03-16 | 1990-03-16 | 固定化赤血球を用いた免疫学的測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0827285B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05297001A (ja) * | 1992-04-15 | 1993-11-12 | Fujirebio Inc | 磁性粒子を用いた自動免疫測定方法及び装置 |
-
1990
- 1990-03-16 JP JP2064422A patent/JPH0827285B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03267759A (ja) | 1991-11-28 |
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