JPH0827286B2 - ヒト胎盤由来酸性グルタチオンｓ−トランスフェラ−ゼの測定方法及び試薬キット - Google Patents
ヒト胎盤由来酸性グルタチオンｓ−トランスフェラ−ゼの測定方法及び試薬キットInfo
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- JPH0827286B2 JPH0827286B2 JP61-506132A JP50613286A JPH0827286B2 JP H0827286 B2 JPH0827286 B2 JP H0827286B2 JP 50613286 A JP50613286 A JP 50613286A JP H0827286 B2 JPH0827286 B2 JP H0827286B2
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- acidic
- gst
- transferase
- antibody
- monoclonal antibody
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、例えば、肝癌や胃癌等の診断に使用でき
る、ヒト胎盤由来酸性グルタチオンＳ−トランスフェラ
ーゼ（以下GSTと略記する）の測定方法及びそれに使用
する試薬キットに関する。
る、ヒト胎盤由来酸性グルタチオンＳ−トランスフェラ
ーゼ（以下GSTと略記する）の測定方法及びそれに使用
する試薬キットに関する。
背景技術
GSTは、生体に侵入する各種物質あるいは生体内で生
じる類縁物質（以下基質という）と、還元型グルタチオ
ンとの抱合（反応）を接触する解毒酵素として知られて
いる。基質の多くは、生体内の蛋白質や核酸などと反応
して種々の病変（例えば発癌）の原因になるものである
が、これらの基質の反応性はこの抱合により中和され、
より水溶性の生成物となり肝臓などで代謝され、最終的
には対外に排泄される。
じる類縁物質（以下基質という）と、還元型グルタチオ
ンとの抱合（反応）を接触する解毒酵素として知られて
いる。基質の多くは、生体内の蛋白質や核酸などと反応
して種々の病変（例えば発癌）の原因になるものである
が、これらの基質の反応性はこの抱合により中和され、
より水溶性の生成物となり肝臓などで代謝され、最終的
には対外に排泄される。
GSTは哺乳動物を含む多くの生物種に存在しており、
特に肝臓、脾臓、腎臓、肺臓、脳、骨格筋、胎盤、小腸
等に多く含まれており、その他皮膚、赤血球、白血球等
にも微量存在している。一般にGSTは多種の酵素からな
っており、種特異性があるだけでなく、臓器又は組織特
異性も有している。
特に肝臓、脾臓、腎臓、肺臓、脳、骨格筋、胎盤、小腸
等に多く含まれており、その他皮膚、赤血球、白血球等
にも微量存在している。一般にGSTは多種の酵素からな
っており、種特異性があるだけでなく、臓器又は組織特
異性も有している。
ヒトの場合は塩基性GSTと酸性GSTが知られている（例
えばThe Journal of Biological Chemistry Vol.25
9,No.20,pp 12444−12448及びpp 12449−12455（198
4））。塩基性GSTは等電点５（pI）が７〜９で２つのサ
ブユニットから成り、各サブユニットの分子量は約23,0
00である。酸性GSTは等電点（pI）が４〜５で、２つの
サブユニットから成り、各サブユニットの分子量は約2
2,000である。塩基性GSTは健常な成人の肝臓に主として
存在し、その他腎臓、睾丸、小腸、脳、肺臓等にも存在
する。一方、酸性GSTは、健常な成人の肝臓にほとんど
存在せず、新生児の肝臓、胎盤、肝癌細胞、胃癌細胞等
の増殖性細胞や赤血球、白血球等に存在する。そして、
増殖性細胞が産性する酸性GSTは血中に遊離してくるの
で、これは肝癌、胃癌、大腸癌、食道癌、膵癌等の消化
器癌あるいは血液癌、リンパ腫等の血液癌に特異性の高
い腫瘍マーカーとして利用できる可能性がある。
えばThe Journal of Biological Chemistry Vol.25
9,No.20,pp 12444−12448及びpp 12449−12455（198
4））。塩基性GSTは等電点５（pI）が７〜９で２つのサ
ブユニットから成り、各サブユニットの分子量は約23,0
00である。酸性GSTは等電点（pI）が４〜５で、２つの
サブユニットから成り、各サブユニットの分子量は約2
2,000である。塩基性GSTは健常な成人の肝臓に主として
存在し、その他腎臓、睾丸、小腸、脳、肺臓等にも存在
する。一方、酸性GSTは、健常な成人の肝臓にほとんど
存在せず、新生児の肝臓、胎盤、肝癌細胞、胃癌細胞等
の増殖性細胞や赤血球、白血球等に存在する。そして、
増殖性細胞が産性する酸性GSTは血中に遊離してくるの
で、これは肝癌、胃癌、大腸癌、食道癌、膵癌等の消化
器癌あるいは血液癌、リンパ腫等の血液癌に特異性の高
い腫瘍マーカーとして利用できる可能性がある。
発明の開示
本発明者らは、前述の如き腫瘍マーカーを精確に検出
し得るモノクローナル抗体を得るべく鋭意研究を行い、
本発明に到達した。
し得るモノクローナル抗体を得るべく鋭意研究を行い、
本発明に到達した。
本発明は、ヒトの胎盤由来酸性GSTに対するモノクロ
ーナル抗体、特に2H及び／又は6Aを用いるヒト胎盤由来
酸性グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの測定方法で
ある。ヒトの酸性GSTでも、それが産生される臓器又は
組織によって若干の構造の違いがあることが予想される
が、癌の診断のマーカーとして有用なものは、新生児の
肝臓、胎盤、赤血球、肝癌細胞、胃癌細胞等の増殖性細
胞が産生する酸性GSTである。従って、本発明において
は、胎盤由来酸性GSTを共通的に認識する（例えば共通
のサブユニットを認識する）モノクローナル抗体を用い
る。しかもIgG型のマウス抗体が好ましい。また、本発
明のモノクローナル抗体は、ヒトの塩基性GSTとの交差
反応を示さないという特徴も有する。
ーナル抗体、特に2H及び／又は6Aを用いるヒト胎盤由来
酸性グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの測定方法で
ある。ヒトの酸性GSTでも、それが産生される臓器又は
組織によって若干の構造の違いがあることが予想される
が、癌の診断のマーカーとして有用なものは、新生児の
肝臓、胎盤、赤血球、肝癌細胞、胃癌細胞等の増殖性細
胞が産生する酸性GSTである。従って、本発明において
は、胎盤由来酸性GSTを共通的に認識する（例えば共通
のサブユニットを認識する）モノクローナル抗体を用い
る。しかもIgG型のマウス抗体が好ましい。また、本発
明のモノクローナル抗体は、ヒトの塩基性GSTとの交差
反応を示さないという特徴も有する。
本発明は、また、かかるモノクローナル抗体、2H及び
6Aを用いるヒト胎盤由来酸性GSTの測定方法に使用する
試薬キットも含むものある。
6Aを用いるヒト胎盤由来酸性GSTの測定方法に使用する
試薬キットも含むものある。
図面の簡単な説明
第１図は、酸性GST濃度と光学密度（420nm）の関係を
示す図である。第２図は、モノクローナル抗体の液相抗
原との免疫反応性を示す図である。
示す図である。第２図は、モノクローナル抗体の液相抗
原との免疫反応性を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
本発明で使用するモノクローナル抗体は、好ましくは
ヒトの胎盤由来酸性GSTで免疫された動物の抗体産生細
胞と、ミエローマ細胞とを融合させることによって、ヒ
トの胎盤由来酸性GSTを認識するモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマを得、次いで、このハイブリド
ーマ及び／又はそれに由来する細胞株を培養し、培養物
からヒトの胎盤由来酸性GSTに対するモノクローナル抗
体を採取することによって得られる。
ヒトの胎盤由来酸性GSTで免疫された動物の抗体産生細
胞と、ミエローマ細胞とを融合させることによって、ヒ
トの胎盤由来酸性GSTを認識するモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマを得、次いで、このハイブリド
ーマ及び／又はそれに由来する細胞株を培養し、培養物
からヒトの胎盤由来酸性GSTに対するモノクローナル抗
体を採取することによって得られる。
本発明におけるヒトの胎盤由来酸性GSTは、分子量が
共に約22,000の２つのサブユニットから構成され、ソジ
ウムドデシルサルフェートポリアクリルアミドゲル電気
泳動（SDS−PAGE）で単一のバンドを示し、等電点（p
I）が４〜５のものである。これらの条件を満足する限
り、種々のアイソザイムが本発明におけるヒトの胎盤由
来酸性GSTに含まれる。
共に約22,000の２つのサブユニットから構成され、ソジ
ウムドデシルサルフェートポリアクリルアミドゲル電気
泳動（SDS−PAGE）で単一のバンドを示し、等電点（p
I）が４〜５のものである。これらの条件を満足する限
り、種々のアイソザイムが本発明におけるヒトの胎盤由
来酸性GSTに含まれる。
ヒトの台盤由来酸性GSTを認識するモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマは、手法それ自体は公知で
ある細胞融合法によって製造することができる。まず、
ヒトの酸性GSTでサル、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウ
サギ、ラット、マウス等の動物を免疫し、次いでこれら
の動物の脾臓やリンパ節等から抗体産生細胞（リンパ
球）を採取し、そして、この細胞をヒト又は動物のミエ
ローマ細胞と融合させる。ミエローマ細胞としては、マ
ウスのミエローマ細胞を用いるのが便利であり、これら
の例としては、BALB/CマウスのP3−X63−Ag8、P3−X63
−Ag8−U1、P3−NS 1/1−Ag4−１、P3−X63−Ag8−6.5.
3、SP 2/0−Ag14、FO、MPC11−45.6TG1.7などがある。
体を産生するハイブリドーマは、手法それ自体は公知で
ある細胞融合法によって製造することができる。まず、
ヒトの酸性GSTでサル、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウ
サギ、ラット、マウス等の動物を免疫し、次いでこれら
の動物の脾臓やリンパ節等から抗体産生細胞（リンパ
球）を採取し、そして、この細胞をヒト又は動物のミエ
ローマ細胞と融合させる。ミエローマ細胞としては、マ
ウスのミエローマ細胞を用いるのが便利であり、これら
の例としては、BALB/CマウスのP3−X63−Ag8、P3−X63
−Ag8−U1、P3−NS 1/1−Ag4−１、P3−X63−Ag8−6.5.
3、SP 2/0−Ag14、FO、MPC11−45.6TG1.7などがある。
細胞融合の条件は、例えば次の通りである。抗体産生
細胞とミエローマ細胞を10:1〜1:10、好ましくは1:1〜
1:3の比率で混合し、適当な細胞融合用溶液、例えば約3
5％ポリエチレングリコール（分子量1,000〜6,000程
度）および約7.5％ジメチルスルホキシドを含むRPMI164
0を加えて、室温〜37℃で１〜数分間撹拌し、その後10
％牛胎児血清加RPMI1640で徐々に希釈し、洗浄の後HAT
（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）選択培
養液にて細胞濃度が１〜５×105個/mlとなるように調整
する。これを0.2mlずつ、例えば96穴プレートに分注
し、５％CO2を含む空気中35〜38℃で２〜３週間培養す
る。HAT培養液中ではハイブリドーマのみが生存し、８
−アザグアニン耐性のミエローマ細胞及びミエローマ同
士の融合細胞は生存し得ない（未融合の抗体産生細胞は
数日で死滅する）。次に、このハイブリドーマ集落か
ら、ヒトの胎盤由来酸性GSTに対し特異的なモノクロー
ナル抗体を分泌するものだけ選別する。この選別工程
（スクリーニング）は、それぞれのハイブリドーマより
産生されたモノクローナル抗体が、目的とする酸性GST
と抗原抗体反応をするか否かを酵素抗体法（ELISA）で
調べることによって行うことができる。目的とするモノ
クローナル抗体を分泌するハイブリドーマは、次にクロ
ーニングによりクローン化細胞にしなくてはならない。
この工程は、具体的には限界希釈法を用いて行うことが
できる。約２〜３週間後、96穴のプレート中で生育した
コロニーを拾い、再びELISAでヒトの胎盤由来酸性GSTに
対する抗体活性を調べ、選別したハイブリドーマを培養
して、所望の酸性GSTに特異的なモノクローナル抗体を
生成させる。
細胞とミエローマ細胞を10:1〜1:10、好ましくは1:1〜
1:3の比率で混合し、適当な細胞融合用溶液、例えば約3
5％ポリエチレングリコール（分子量1,000〜6,000程
度）および約7.5％ジメチルスルホキシドを含むRPMI164
0を加えて、室温〜37℃で１〜数分間撹拌し、その後10
％牛胎児血清加RPMI1640で徐々に希釈し、洗浄の後HAT
（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）選択培
養液にて細胞濃度が１〜５×105個/mlとなるように調整
する。これを0.2mlずつ、例えば96穴プレートに分注
し、５％CO2を含む空気中35〜38℃で２〜３週間培養す
る。HAT培養液中ではハイブリドーマのみが生存し、８
−アザグアニン耐性のミエローマ細胞及びミエローマ同
士の融合細胞は生存し得ない（未融合の抗体産生細胞は
数日で死滅する）。次に、このハイブリドーマ集落か
ら、ヒトの胎盤由来酸性GSTに対し特異的なモノクロー
ナル抗体を分泌するものだけ選別する。この選別工程
（スクリーニング）は、それぞれのハイブリドーマより
産生されたモノクローナル抗体が、目的とする酸性GST
と抗原抗体反応をするか否かを酵素抗体法（ELISA）で
調べることによって行うことができる。目的とするモノ
クローナル抗体を分泌するハイブリドーマは、次にクロ
ーニングによりクローン化細胞にしなくてはならない。
この工程は、具体的には限界希釈法を用いて行うことが
できる。約２〜３週間後、96穴のプレート中で生育した
コロニーを拾い、再びELISAでヒトの胎盤由来酸性GSTに
対する抗体活性を調べ、選別したハイブリドーマを培養
して、所望の酸性GSTに特異的なモノクローナル抗体を
生成させる。
モノクローナル抗体を得るためのもう一つの方法は、
抗体産生細胞にエプスタイン・バー・ウイルス（Epstei
n−Barr Virus、以下Ｅ−Ｂウイルスと略記する）を感
染させて形質転換細胞を作成し、該形質転換細胞及び／
又はそれに由来する細胞株を培養し、培養物からヒトの
胎盤由来酸性GSTに結合する性質を有するモノクローナ
ル抗体を採取する方法である。
抗体産生細胞にエプスタイン・バー・ウイルス（Epstei
n−Barr Virus、以下Ｅ−Ｂウイルスと略記する）を感
染させて形質転換細胞を作成し、該形質転換細胞及び／
又はそれに由来する細胞株を培養し、培養物からヒトの
胎盤由来酸性GSTに結合する性質を有するモノクローナ
ル抗体を採取する方法である。
Ｅ−Ｂウイルスは、バーキットリンパ腫や鼻咽頭ガン
の原因ウイルスとされているが、ヘルペス−ウイルス群
に属するウイルスである。抗体産生細胞をＥ−Ｂウイル
スに感染させ、約２〜３週間、５％CO2インキュベータ
で培養し、多くの異質集落から成る形質転換細胞（トラ
ンスフォームドセル）を形成させる。次に、この形質転
換細胞から、ヒトの胎盤由来酸性GSTに対し特異的なモ
ノクローナル抗体を分泌するものだけを、前記と同様な
方法で選別する。そして、前記と同様にして、クローン
化された形質転換細胞を得ることができる。
の原因ウイルスとされているが、ヘルペス−ウイルス群
に属するウイルスである。抗体産生細胞をＥ−Ｂウイル
スに感染させ、約２〜３週間、５％CO2インキュベータ
で培養し、多くの異質集落から成る形質転換細胞（トラ
ンスフォームドセル）を形成させる。次に、この形質転
換細胞から、ヒトの胎盤由来酸性GSTに対し特異的なモ
ノクローナル抗体を分泌するものだけを、前記と同様な
方法で選別する。そして、前記と同様にして、クローン
化された形質転換細胞を得ることができる。
次に、本発明においては、選別したハイブリドーマ又
は形質転換細胞を培養して、所望の特異的モノクローナ
ル抗体を生成させる。クローニングによって選別され
た、ヒトの胎盤由来酸性GSTを認識する抗体を産生する
ハイブリドーマ又は形質転換細胞は凍結して保存するこ
とができ、これを適当な方法で大量に培養することもで
きる。そして、培養上清からヒトの胎盤由来酸性GSTに
特異的に結合するモノクローナル抗体を得ることができ
る。また、かかる細胞を動物に移植して腫瘍化し、その
腹水や血清から目的とする抗体を得ることもできる。本
発明で用いるモノクローナル抗体の精製は、プロテイン
Ａ等を用いるアフィニテイクロマトグラフィー等の方法
によって行われる。
は形質転換細胞を培養して、所望の特異的モノクローナ
ル抗体を生成させる。クローニングによって選別され
た、ヒトの胎盤由来酸性GSTを認識する抗体を産生する
ハイブリドーマ又は形質転換細胞は凍結して保存するこ
とができ、これを適当な方法で大量に培養することもで
きる。そして、培養上清からヒトの胎盤由来酸性GSTに
特異的に結合するモノクローナル抗体を得ることができ
る。また、かかる細胞を動物に移植して腫瘍化し、その
腹水や血清から目的とする抗体を得ることもできる。本
発明で用いるモノクローナル抗体の精製は、プロテイン
Ａ等を用いるアフィニテイクロマトグラフィー等の方法
によって行われる。
本発明で用いるヒトの胎盤由来酸性GSTに対するモノ
クローナル抗体、2H及び／又は6Aは、消化器癌等の腫瘍
マーカーとしての性質を有する酸性GSTの測定に利用で
きるのを初めとし、癌細胞組織の組織染色、放射性標識
によりイメージングによる癌の体内診断、更には制癌剤
等と結合することにより癌の治療等に利用するこのが可
能である。
クローナル抗体、2H及び／又は6Aは、消化器癌等の腫瘍
マーカーとしての性質を有する酸性GSTの測定に利用で
きるのを初めとし、癌細胞組織の組織染色、放射性標識
によりイメージングによる癌の体内診断、更には制癌剤
等と結合することにより癌の治療等に利用するこのが可
能である。
本発明によるヒトの胎盤由来酸性GSTに対するモノク
ローナル抗体、2H及び／又は6Aを用いヒトの胎盤由来酸
性GSTを測定する方法としては、不溶性担体に結合した
抗体（以下これを“固定化抗体”という）と標識抗体と
によってヒトの胎盤由来酸性GSTを反応させて、生成し
たサンドイッチ錯体を標識物によって検出するサンドイ
ッチ法（Sandwich Method）、また、標識ヒト胎盤由来
酸性GSTと検体中のヒト胎盤由来酸性GSTとを、抗体と競
合的に反応させ、抗体と反応した標識抗原量から検体中
のヒト胎盤由来酸性GSTを測定する競合法（Competitive
Method）等で、検体中のヒト胎盤由来酸性GSTを測定
することができる。
ローナル抗体、2H及び／又は6Aを用いヒトの胎盤由来酸
性GSTを測定する方法としては、不溶性担体に結合した
抗体（以下これを“固定化抗体”という）と標識抗体と
によってヒトの胎盤由来酸性GSTを反応させて、生成し
たサンドイッチ錯体を標識物によって検出するサンドイ
ッチ法（Sandwich Method）、また、標識ヒト胎盤由来
酸性GSTと検体中のヒト胎盤由来酸性GSTとを、抗体と競
合的に反応させ、抗体と反応した標識抗原量から検体中
のヒト胎盤由来酸性GSTを測定する競合法（Competitive
Method）等で、検体中のヒト胎盤由来酸性GSTを測定
することができる。
また、サンドイッチ法によるヒト胎盤由来酸性GSTの
測定においては、先ず、固定化抗体とヒト胎盤由来酸性
GSTとを反応させた後、未反応物を洗浄によって安全に
除去してから、標識抗体を添加して固定化抗体−ヒト胎
盤由来酸性GST−標識抗体の三者からなるサンドイッチ
錯体を形成させる方法（２ステップ法）、或いは固定化
抗体、標識抗体及びヒト胎盤由来酸性GSTを同時に混合
して反応させることにより、一度にサンドイッチ錯体を
形成させる方法（１ステップ法、又はSimultaneous Ass
ay Method）等を用いることができる。
測定においては、先ず、固定化抗体とヒト胎盤由来酸性
GSTとを反応させた後、未反応物を洗浄によって安全に
除去してから、標識抗体を添加して固定化抗体−ヒト胎
盤由来酸性GST−標識抗体の三者からなるサンドイッチ
錯体を形成させる方法（２ステップ法）、或いは固定化
抗体、標識抗体及びヒト胎盤由来酸性GSTを同時に混合
して反応させることにより、一度にサンドイッチ錯体を
形成させる方法（１ステップ法、又はSimultaneous Ass
ay Method）等を用いることができる。
本発明の測定方法に使用される不溶性担体としては、
例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、
ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリル酸エステ
ル、ナイロン、ポリアセタール、弗素樹脂等の合成樹
脂、セルロース、アガロース等の多糖類、ガラス、金属
等が挙げられる。
例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、
ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリル酸エステ
ル、ナイロン、ポリアセタール、弗素樹脂等の合成樹
脂、セルロース、アガロース等の多糖類、ガラス、金属
等が挙げられる。
不溶性の担体の形状としては、例えばトレイ状、球
状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、試験管などの
種々の形状を用いることができる。
状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、試験管などの
種々の形状を用いることができる。
標識物質としては、酵素、蛍光物質、発光物質及び放
射性物質等を使用するのが有利である。酵素としては、
ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ
−ガラクトシダーゼ、蛍光物質としてはフルオレッセイ
ンイソチオシアネート、フィコビリプロテイン等、発光
物質としてはイソルシノール、ルシゲニン等、そして放
射性物質としては125I、131I、14C、3H等を用いること
ができるが、これらは例示したものに限らず、免疫学的
測定法に使用し得るものであれば、他のものでも使用で
きる。
射性物質等を使用するのが有利である。酵素としては、
ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ
−ガラクトシダーゼ、蛍光物質としてはフルオレッセイ
ンイソチオシアネート、フィコビリプロテイン等、発光
物質としてはイソルシノール、ルシゲニン等、そして放
射性物質としては125I、131I、14C、3H等を用いること
ができるが、これらは例示したものに限らず、免疫学的
測定法に使用し得るものであれば、他のものでも使用で
きる。
標識剤が酵素である場合には、その活性を測定するた
めに、基質、必要により発色剤が用いられる。
めに、基質、必要により発色剤が用いられる。
酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、基質
としてH2O2を用い、発色剤として2,2′−アジノジ−
〔３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸〕アンモニウ
ム塩（ABTS）、５−アミノサリチル酸、ｏ−フェニレン
ジアミン、４−アミノアンチピリン、3,3′,5,5′−テ
トラメチルベンジジン等、酵素にアルカリフォスファタ
ーゼを用いる場合は基質としてｏ−ニトロフェニルフォ
スフェート等、酵素にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを用い
る場合は基質としてフルオレセイン−ジ−（β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド）、４−メチルウンベリフェリル−β
−Ｄ−ガラクトピラノシド等を用いることができる。
としてH2O2を用い、発色剤として2,2′−アジノジ−
〔３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸〕アンモニウ
ム塩（ABTS）、５−アミノサリチル酸、ｏ−フェニレン
ジアミン、４−アミノアンチピリン、3,3′,5,5′−テ
トラメチルベンジジン等、酵素にアルカリフォスファタ
ーゼを用いる場合は基質としてｏ−ニトロフェニルフォ
スフェート等、酵素にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを用い
る場合は基質としてフルオレセイン−ジ−（β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド）、４−メチルウンベリフェリル−β
−Ｄ−ガラクトピラノシド等を用いることができる。
本発明は、また、前述したような抗体及び試薬類のキ
ット化したものも、その範囲に含むものである。本発明
は、ヒト胎盤由来酸性GSTを認識する２種類のモノクロ
ーナル抗体2Hと6Aを使用した、免疫学的方法により検体
中のヒト胎盤由来酸性GSTを測定するためのキットであ
って、担体に固定された一方のモノクローナル抗体
と、標識化された他方のモノクローナル抗体と、必
要により、該標識化抗体の検出試薬を主要構成成分と
し、更に測定に必要であれば、これらの試薬以外にも溶
解剤、洗浄剤、反応停止剤等の公知の試薬を構成成分と
する、免疫学的方法により血清等の体液中に存在するヒ
ト胎盤由来酸性GSTを測定するための試薬キットであ
る。
ット化したものも、その範囲に含むものである。本発明
は、ヒト胎盤由来酸性GSTを認識する２種類のモノクロ
ーナル抗体2Hと6Aを使用した、免疫学的方法により検体
中のヒト胎盤由来酸性GSTを測定するためのキットであ
って、担体に固定された一方のモノクローナル抗体
と、標識化された他方のモノクローナル抗体と、必
要により、該標識化抗体の検出試薬を主要構成成分と
し、更に測定に必要であれば、これらの試薬以外にも溶
解剤、洗浄剤、反応停止剤等の公知の試薬を構成成分と
する、免疫学的方法により血清等の体液中に存在するヒ
ト胎盤由来酸性GSTを測定するための試薬キットであ
る。
以下、実施例により本発明を詳述する。
実施例１
（１） 酸性GSTの分離精製
ヒト胎盤を0.25Mシュークロース、10mMリン酸緩衝液
（pH7.4）中で細切りした後、ホモジナイザーでホモジ
ナイズした。得られたホモジネートを、10.000×Ｇで４
℃において30分間遠心分離し、上清を採取した。次い
で、この上清を、更に100,000×Ｇで４℃において１時
間遠心分離を行って、上清を採取した。この上清を10mM
リン酸緩衝液（pH6.8）を用いて透析した後、透析内液
をこの緩衝液で平衡化したCMセルロース充填カラムに通
じて、非吸着分画を採取した。次に、この分画を還元型
グルタチオン固定セファロースを充填したカラムに通じ
て、酸性GSTを吸着させた後、10mMリン酸緩衝液（pH7.
4）でカラムを洗浄し、流出液の紫外吸収スペクトルに
おける280nmの吸収強度が0.02以下になった時点で、還
元型グルタチオン含有トリス緩衝液（pH8.0）をカラム
に通液して、吸着物を溶出させた。この溶出液を限外濾
過した後、10mMリン酸緩衝生理的食塩水（PBS）（pH7.
4）を用いて、セファデックスＧ−100（ファルマシア
社）カラムによりゲル濾過することによって、酸性GST
を含有する画分を得た。この画分を、再度限外濾過によ
り濃縮した後、等電点電気泳動カラム（LKB社製）を用
い、濃度勾配作成にシュークロース、pH勾配作成にアン
フォライン（ファルマシア社製:pH3.5〜10）を使用して
カラム等電点電気泳動（pH3.5〜10）を行い、精製した
酸性GSTを含有する画分を得た。
（pH7.4）中で細切りした後、ホモジナイザーでホモジ
ナイズした。得られたホモジネートを、10.000×Ｇで４
℃において30分間遠心分離し、上清を採取した。次い
で、この上清を、更に100,000×Ｇで４℃において１時
間遠心分離を行って、上清を採取した。この上清を10mM
リン酸緩衝液（pH6.8）を用いて透析した後、透析内液
をこの緩衝液で平衡化したCMセルロース充填カラムに通
じて、非吸着分画を採取した。次に、この分画を還元型
グルタチオン固定セファロースを充填したカラムに通じ
て、酸性GSTを吸着させた後、10mMリン酸緩衝液（pH7.
4）でカラムを洗浄し、流出液の紫外吸収スペクトルに
おける280nmの吸収強度が0.02以下になった時点で、還
元型グルタチオン含有トリス緩衝液（pH8.0）をカラム
に通液して、吸着物を溶出させた。この溶出液を限外濾
過した後、10mMリン酸緩衝生理的食塩水（PBS）（pH7.
4）を用いて、セファデックスＧ−100（ファルマシア
社）カラムによりゲル濾過することによって、酸性GST
を含有する画分を得た。この画分を、再度限外濾過によ
り濃縮した後、等電点電気泳動カラム（LKB社製）を用
い、濃度勾配作成にシュークロース、pH勾配作成にアン
フォライン（ファルマシア社製:pH3.5〜10）を使用して
カラム等電点電気泳動（pH3.5〜10）を行い、精製した
酸性GSTを含有する画分を得た。
（２） 抗体の作製
前記の如くしてヒト胎盤から抽出、採取した酸性GST
を、フロイント完全アジュバンドに乳化し、７週齢のBA
LB/Cマウスの腹腔に100mg/匹の量を投与した。そして、
15日後に、マウスに追加免疫を初回と同様の方法で行っ
た。次に、10日後に血中に抗体量が増大したことを確認
して、更に７日後に抗原を100mg/匹の量で静注により投
与した。
を、フロイント完全アジュバンドに乳化し、７週齢のBA
LB/Cマウスの腹腔に100mg/匹の量を投与した。そして、
15日後に、マウスに追加免疫を初回と同様の方法で行っ
た。次に、10日後に血中に抗体量が増大したことを確認
して、更に７日後に抗原を100mg/匹の量で静注により投
与した。
一方、15％の牛胎児血清を添加したRPMI1640（ギブコ
社製）で、ミエローマ細胞P3−X63−Ag8−U1を維持培養
しておいた。最終免疫の３日後、マウスから採取した脾
臓細胞とP3U1を、Oi等の方法（Selective methods in
cellular immunology,1980,351〜372参照）によりポリ
エチレングリコール4000を用い細胞融合させ、96穴マイ
クロプレートにまいた。細胞融合後、培地を100μＭヒ
ポキサンチン、0.4μＭアミノプテリン、16μＭチミジ
ンを添加したRPMI培地（HAT培地）に置き換えた。HAT培
地で培養中２〜３週間で脾臓細胞とミエローマ細胞のハ
イブリドーマのみが生育した。ハイブリドーマの培養液
中の抗体活性を、以下に述べるELISAで調べた。
社製）で、ミエローマ細胞P3−X63−Ag8−U1を維持培養
しておいた。最終免疫の３日後、マウスから採取した脾
臓細胞とP3U1を、Oi等の方法（Selective methods in
cellular immunology,1980,351〜372参照）によりポリ
エチレングリコール4000を用い細胞融合させ、96穴マイ
クロプレートにまいた。細胞融合後、培地を100μＭヒ
ポキサンチン、0.4μＭアミノプテリン、16μＭチミジ
ンを添加したRPMI培地（HAT培地）に置き換えた。HAT培
地で培養中２〜３週間で脾臓細胞とミエローマ細胞のハ
イブリドーマのみが生育した。ハイブリドーマの培養液
中の抗体活性を、以下に述べるELISAで調べた。
（３） 抗体のスクリーニング
酸性GSTをELISA用のプレートに付着させ、10mMリン酸
生理食塩液（pH7.4）に３％（W/V）の牛血清アルブミン
（BSA）を添加した液でブロッキングを行なった。ブロ
ッキング後、ハイブリドーマ培養液50mlをELISAプレー
トに添加し、室温で２時間放置した。その後、ハイブリ
ドーマ培養液を除去して洗浄した後、ペルオキシダーゼ
標識山羊抗マウスIgG−Fc特異抗体（2mg/ml）100mlを添
加し、３℃で1.5時間反応させた。更に、この酵素標識
抗体溶液を除去した後、洗浄し、0.05％2,2′−アジノ
ジ−〔３−エチルベンツチアゾリンスルフォネート
（６）〕（ABTS）、0.0034％H2O2、0.1Mクエン酸緩衝液
（pH4.6）を200ml添加して発色させることにより検出し
た。
生理食塩液（pH7.4）に３％（W/V）の牛血清アルブミン
（BSA）を添加した液でブロッキングを行なった。ブロ
ッキング後、ハイブリドーマ培養液50mlをELISAプレー
トに添加し、室温で２時間放置した。その後、ハイブリ
ドーマ培養液を除去して洗浄した後、ペルオキシダーゼ
標識山羊抗マウスIgG−Fc特異抗体（2mg/ml）100mlを添
加し、３℃で1.5時間反応させた。更に、この酵素標識
抗体溶液を除去した後、洗浄し、0.05％2,2′−アジノ
ジ−〔３−エチルベンツチアゾリンスルフォネート
（６）〕（ABTS）、0.0034％H2O2、0.1Mクエン酸緩衝液
（pH4.6）を200ml添加して発色させることにより検出し
た。
（４） クローニング及びモノクローナル抗体の作製
酸性GSTに対する抗体を酸性するハイブリドーマ培養
液を選別し、更に限界希釈法によるクローニングを行な
い、最終的に単一クローンのハイブリドーマ４種、すな
わちハイブリドーマ2F、5F、2H、6Aを得た。これらのハ
イブリドーマを、夫々、プリスタン投与BALB/Cマウスの
腹腔に投与して増殖させ、モノクローナル抗体を含む腹
水を得た。得られた腹水に50％飽和硫安を加え、抗体を
沈澱させ、この沈澱物を0.1Mリン酸生理食塩液（pH8.
0）に溶解させた。そして透析後、プロテインＡ−セフ
ァロースCL4Bカラム（ファルマシア社製）にかけ、抗体
を0.2Mグリシン−塩酸緩衝液（pH3.0）で溶出し、中和
して精製した。
液を選別し、更に限界希釈法によるクローニングを行な
い、最終的に単一クローンのハイブリドーマ４種、すな
わちハイブリドーマ2F、5F、2H、6Aを得た。これらのハ
イブリドーマを、夫々、プリスタン投与BALB/Cマウスの
腹腔に投与して増殖させ、モノクローナル抗体を含む腹
水を得た。得られた腹水に50％飽和硫安を加え、抗体を
沈澱させ、この沈澱物を0.1Mリン酸生理食塩液（pH8.
0）に溶解させた。そして透析後、プロテインＡ−セフ
ァロースCL4Bカラム（ファルマシア社製）にかけ、抗体
を0.2Mグリシン−塩酸緩衝液（pH3.0）で溶出し、中和
して精製した。
４種類のハイブリドーマから得られたモノクローナル
抗体を、夫々2F、5F、2H、6Aと命名した。
抗体を、夫々2F、5F、2H、6Aと命名した。
ハイブリドーマ2H及び6Aは、平成２年７月18日に、6
A;3023、2H;3024として微生物工業技術研究所に寄託さ
れている。
A;3023、2H;3024として微生物工業技術研究所に寄託さ
れている。
（５） モノクローナル抗体の性質
後述の如きウエスタンブロッテイング（Western−blo
tting）法で４種のモノクローナル抗体は、ヒト胎盤由
来GSTを認識した。また、ELISA用プレート固定した酸性
GSTに対して、ビオチン化した第一の抗体と非標識の第
二の抗体を共存させて反応させるインヒビション・アッ
セイ（Inhibition assay）法により、いずれの２つの組
み合わせにおいてもビオチ化抗体の反応量に変化がない
ことより、４種のモノクローナル抗体はいずれも互いに
異なるエピトープ（抗原部位）を認識することが示され
た。
tting）法で４種のモノクローナル抗体は、ヒト胎盤由
来GSTを認識した。また、ELISA用プレート固定した酸性
GSTに対して、ビオチン化した第一の抗体と非標識の第
二の抗体を共存させて反応させるインヒビション・アッ
セイ（Inhibition assay）法により、いずれの２つの組
み合わせにおいてもビオチ化抗体の反応量に変化がない
ことより、４種のモノクローナル抗体はいずれも互いに
異なるエピトープ（抗原部位）を認識することが示され
た。
これらの抗体は、ヒトの塩基性GSTとは反応せず、ま
た健常人の血清とも反応しなかった。
た健常人の血清とも反応しなかった。
これらのモノクローナル抗体の液相反応性をインヒビ
ションテストを行なうことによって調べた。
ションテストを行なうことによって調べた。
すなわち、GST−πを固定化したもの（固相抗原）に
４種のモノクローナル抗体の溶液を各々加え、これに固
相抗原の１、2.5、5.0倍量のBSA−PBS溶液中に遊離して
いるGST−π（液相抗原）を添加して１時間室温で競合
反応させた。洗浄後、抗マウスIgG−HRP複合体希釈液を
加え、テトラメチルベンジミンにて発色させ、吸光度を
測定した。結果は第２図に示すとおりであった。
４種のモノクローナル抗体の溶液を各々加え、これに固
相抗原の１、2.5、5.0倍量のBSA−PBS溶液中に遊離して
いるGST−π（液相抗原）を添加して１時間室温で競合
反応させた。洗浄後、抗マウスIgG−HRP複合体希釈液を
加え、テトラメチルベンジミンにて発色させ、吸光度を
測定した。結果は第２図に示すとおりであった。
この結果から、遊離のGST−πの割合が増加するに伴
い競合反応によりインヒビションを受け、固相抗原との
結合量が減少している、すなわち、液相抗原に反応性を
示す2H、6Aと、競合反応によっても固相抗原との結合量
に変化のない、すなわち液相抗原に反応性を示さない2
F、5Fの２つの異なる反応性を有するモノクローナル抗
体に分類されることが判明した。すなわち、2H、6Aは液
相反応性を有し、2F、5Fは液相反応性を示さないことが
わかる。
い競合反応によりインヒビションを受け、固相抗原との
結合量が減少している、すなわち、液相抗原に反応性を
示す2H、6Aと、競合反応によっても固相抗原との結合量
に変化のない、すなわち液相抗原に反応性を示さない2
F、5Fの２つの異なる反応性を有するモノクローナル抗
体に分類されることが判明した。すなわち、2H、6Aは液
相反応性を有し、2F、5Fは液相反応性を示さないことが
わかる。
（６） ウエスタンブロッテイング法
モノクローナル抗体に特異的な抗原を、Towbing等の
方法（Pro.N.A.S.76,4350〜4354）によるウエスタンブ
ロッテイング法を用いて固定した。
方法（Pro.N.A.S.76,4350〜4354）によるウエスタンブ
ロッテイング法を用いて固定した。
最初にヒト胎児由来酸性GSTを、SDS−PAGEにかけた。
SDS−PAGE後電解液バッファーを25mMグリシン、20％（V
/V）メタノールを用い、電圧傾斜が7V/cm、２時間の条
件でスラブ（Slab）ゲルからニトロセルロースシートへ
蛋白を移した。ニトロセルロースシートの各レーンを切
り離し、片一方のシートをアミドブラックで蛋白染色を
行ない、他方は次の様な酵素免疫アッセイを行なった。
SDS−PAGE後電解液バッファーを25mMグリシン、20％（V
/V）メタノールを用い、電圧傾斜が7V/cm、２時間の条
件でスラブ（Slab）ゲルからニトロセルロースシートへ
蛋白を移した。ニトロセルロースシートの各レーンを切
り離し、片一方のシートをアミドブラックで蛋白染色を
行ない、他方は次の様な酵素免疫アッセイを行なった。
３％（W/V）BSA/PBSでブロッキング後、１次抗体とし
てモノクローナル抗体（2F又は5F）を加えた。２次抗体
としてペルオキシダーゼ標識山羊抗マウスIgG−Fc特異
抗体を加えた後、洗浄、0.04％3,3′−ジアミノベンジ
ジン、0.0034％H2O2、0.01MPBSからなる基質溶液を加え
て発色させることにより検出し固定した。
てモノクローナル抗体（2F又は5F）を加えた。２次抗体
としてペルオキシダーゼ標識山羊抗マウスIgG−Fc特異
抗体を加えた後、洗浄、0.04％3,3′−ジアミノベンジ
ジン、0.0034％H2O2、0.01MPBSからなる基質溶液を加え
て発色させることにより検出し固定した。
実施例２ 酸性GSTの測定法
（１） モノクローナル抗体固定化ビーズの調製
ポリスチレン製ビーズ（直径6mm）をよく洗浄してか
ら、モノクローナル抗体2Hの20μg/mlの濃度を有するPB
S（pH7.4）溶液中に４℃の温度で１昼夜放置した後、PB
Sで洗浄し、0.5％BSA水溶液中に４℃の温度で１昼夜放
置してポストコーテイング処理を実施して、モノクロー
ナル抗体固定化ビーズを得た。
ら、モノクローナル抗体2Hの20μg/mlの濃度を有するPB
S（pH7.4）溶液中に４℃の温度で１昼夜放置した後、PB
Sで洗浄し、0.5％BSA水溶液中に４℃の温度で１昼夜放
置してポストコーテイング処理を実施して、モノクロー
ナル抗体固定化ビーズを得た。
（２） ホースラデッシュ・ペルオキシダーゼ標識モノ
クローナル抗体の調製 モノクローナル抗体6Aの1.0mg/mlのPBS溶液に、Ｎ−
（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎ−サクシンイミドエス
テル（MBS）の10mg/mlの濃度のジメチルホルミアミド溶
液50mlを添加し、25℃の温度で30分間反応させた。次い
でセファデックスＧ−25を充填したカラムを用い、0.1M
リン酸緩衝液（pH6.0）でゲル濾過を行ない、マレイミ
ド化モノクローナル抗体と未反応MBSとを分離した。
クローナル抗体の調製 モノクローナル抗体6Aの1.0mg/mlのPBS溶液に、Ｎ−
（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎ−サクシンイミドエス
テル（MBS）の10mg/mlの濃度のジメチルホルミアミド溶
液50mlを添加し、25℃の温度で30分間反応させた。次い
でセファデックスＧ−25を充填したカラムを用い、0.1M
リン酸緩衝液（pH6.0）でゲル濾過を行ない、マレイミ
ド化モノクローナル抗体と未反応MBSとを分離した。
一方、ホースラデッシュ・ペルオキシダーゼ（HRP）
の1.0mg/mlのPBS溶液に、Ｎ−サクシンイミジル−３−
（２−ピリジルチオ）プロピオネート（SPDP）の10mg/m
lの濃度のエタノール溶液を添加し、25℃で30分間反応
させた。次いで、セファデックスＧ−25を充填したカラ
ムを用い、0.01M酢酸緩衝液（pH4.5）でゲル濾過して精
製し、ピリジルジスルフィド化HRPを含有する画分を採
集し、これをコロジオンバック中において氷冷下に約10
倍に濃縮した。次に、これに0.85％NaClと0.1Mジチオス
レイトールとを含有する0.1M酢酸緩衝液（pH4.5）1mlを
添加して、25℃で30分間撹拌してHRP分子中に導入した
ピリキルジスルフィド基を還元した後、セファデックス
Ｇ−25カラムにかけてゲル濾過し、チオール化HRPを含
有する画分を得た。
の1.0mg/mlのPBS溶液に、Ｎ−サクシンイミジル−３−
（２−ピリジルチオ）プロピオネート（SPDP）の10mg/m
lの濃度のエタノール溶液を添加し、25℃で30分間反応
させた。次いで、セファデックスＧ−25を充填したカラ
ムを用い、0.01M酢酸緩衝液（pH4.5）でゲル濾過して精
製し、ピリジルジスルフィド化HRPを含有する画分を採
集し、これをコロジオンバック中において氷冷下に約10
倍に濃縮した。次に、これに0.85％NaClと0.1Mジチオス
レイトールとを含有する0.1M酢酸緩衝液（pH4.5）1mlを
添加して、25℃で30分間撹拌してHRP分子中に導入した
ピリキルジスルフィド基を還元した後、セファデックス
Ｇ−25カラムにかけてゲル濾過し、チオール化HRPを含
有する画分を得た。
次に、マレイミド化モノクローナル抗体とチオール化
HRPとを混合し、コロジオンバックを用いて氷冷下に4mg
/mlの蛋白質濃度まで濃縮し、４℃で１昼夜放置した。
その後、ウルトロゲルAcA44（LKB社）を充填したカラム
でゲル濾過し、HRP標識モノクローナル抗体を得た。
HRPとを混合し、コロジオンバックを用いて氷冷下に4mg
/mlの蛋白質濃度まで濃縮し、４℃で１昼夜放置した。
その後、ウルトロゲルAcA44（LKB社）を充填したカラム
でゲル濾過し、HRP標識モノクローナル抗体を得た。
（３） 同時サンドイッチ酵素免疫測定法による酸性GS
Tの測定法 モノクローナル抗体2Hを固定化したビーズ各１個と、
精製した酸性GST（標準物質）を0.1mg/ml〜100mg/mlの
範囲で含有する0.5％BSA含有PBS溶液（pH7.4）200μｌ
とHRP標識モノクローナル抗体6Aを含有する0.5％BSA含
有PBS溶液（pH7.4）20μｌとを、それぞれ試験管に添加
して37℃の温度で４時間インキュベートした。次に、試
験管内の溶液を吸引除去した後、PBSで洗浄してから、
2,2′−アジノジ−〔３−エチルベンズチアゾリンスル
ホン酸〕アンモニウム塩（ABTS）0.05％、過酸化水素0.
003％を含有する0.1Mリン酸−クエン酸緩衝液（pH4.5）
を0.5mlずつ各試験管に加え、37℃の温度で30分間イン
キュベートした後、反応停止剤として0.2Mシュウ酸水溶
液を1mlずつ加えて酵素反応を停止させた。
Tの測定法 モノクローナル抗体2Hを固定化したビーズ各１個と、
精製した酸性GST（標準物質）を0.1mg/ml〜100mg/mlの
範囲で含有する0.5％BSA含有PBS溶液（pH7.4）200μｌ
とHRP標識モノクローナル抗体6Aを含有する0.5％BSA含
有PBS溶液（pH7.4）20μｌとを、それぞれ試験管に添加
して37℃の温度で４時間インキュベートした。次に、試
験管内の溶液を吸引除去した後、PBSで洗浄してから、
2,2′−アジノジ−〔３−エチルベンズチアゾリンスル
ホン酸〕アンモニウム塩（ABTS）0.05％、過酸化水素0.
003％を含有する0.1Mリン酸−クエン酸緩衝液（pH4.5）
を0.5mlずつ各試験管に加え、37℃の温度で30分間イン
キュベートした後、反応停止剤として0.2Mシュウ酸水溶
液を1mlずつ加えて酵素反応を停止させた。
次いで、この溶液を分光光度計を用いて、420nmの波
長の吸収強度を測定し、これを標準物質濃度に対してプ
ロットすることにより濃度依存性の良い検量線を得た。
結果は第１図に示した。
長の吸収強度を測定し、これを標準物質濃度に対してプ
ロットすることにより濃度依存性の良い検量線を得た。
結果は第１図に示した。
一方、2Hに替えて2Fを、6Aに替えて5Fを用いて同様に
測定を行った。液相反応性の低い2F−5F系では、第１図
に示すとおり、測定に使用できる検量線は得られなかっ
た。
測定を行った。液相反応性の低い2F−5F系では、第１図
に示すとおり、測定に使用できる検量線は得られなかっ
た。
（４） 臨床検体中の酸性GSTの測定
健常人及び大腸癌患者の血清を採取し、この血清各50
μｌを試験管に添加し、0.5％BSA含有PBS溶液（pH7.4）
150μｌを加えて希釈した後、これにモノクローナル抗
体2Hを固定化したビーズ各１個と、HRP標識モノクロー
ナル抗体6Aを含有する0.5％BSA含有PBS溶液（pH7.4）20
0μｌとを、それぞれ試験管に添加して37℃の温度で４
時間インキュベートした。次に、前述の検量線を作成す
るのと全く同じ操作により、洗浄、酵素反応及び反応停
止を行なった後、分光光度計を用いて420nmの波長の吸
収強度を測定し、検量線より濃度を求めた。その結果、
健常人血清中の酸性GST濃度は0.7ng/mlであり、大腸癌
患者血清中の酸性GST濃度は35.0ng/mlであった。
μｌを試験管に添加し、0.5％BSA含有PBS溶液（pH7.4）
150μｌを加えて希釈した後、これにモノクローナル抗
体2Hを固定化したビーズ各１個と、HRP標識モノクロー
ナル抗体6Aを含有する0.5％BSA含有PBS溶液（pH7.4）20
0μｌとを、それぞれ試験管に添加して37℃の温度で４
時間インキュベートした。次に、前述の検量線を作成す
るのと全く同じ操作により、洗浄、酵素反応及び反応停
止を行なった後、分光光度計を用いて420nmの波長の吸
収強度を測定し、検量線より濃度を求めた。その結果、
健常人血清中の酸性GST濃度は0.7ng/mlであり、大腸癌
患者血清中の酸性GST濃度は35.0ng/mlであった。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 鈴木 英明
東京都小金井市桜町２丁目７番18号
(72)発明者 細田 健治
埼玉県川越市旭町３丁目３番12号
(72)発明者 本田 仁美
東京都日野市多摩平３丁目18番４号
(72)発明者 増保 安彦
東京都日野市多摩平５丁目20番２号
(56)参考文献 特開 昭60−199384（ＪＰ，Ａ)
Ｎａｔｕｒｅ，256，Ｐ．495−497
（1975)
ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯ
ＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ,
260〔16〕Ｐ．9191−9196（1985 Ａｕｇ
ｕｓｔ５)
Ｂｉｏ ｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏ
ｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，661，Ｐ．255
−260（1981)
Claims (4)
- 【請求項１】免疫学的方法により検体中のヒト胎盤由来
酸性グルタチオンＳ−トランスフェラーゼを測定する方
法において、ヒト胎盤由来酸性グルタチオンＳ−トラン
スフェラーゼを認識するモノクローナル抗体2H及び／又
はモノクローナル抗体6Aを使用することを特徴とする、
検体中のヒト胎盤由来酸性グルタチオンＳ−トランスフ
ェラーゼの測定方法。 - 【請求項２】ヒト胎盤由来酸性グルタチオンＳ−トラン
スフェラーゼを認識する２種類のモノクローナル抗体2H
と6Aを使用し、一方のモノクローナル抗体が担体に固定
されており、他方のモノクローナル抗体が標識化されて
いることを特徴とする請求の範囲第１項記載のヒト胎盤
由来酸性グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの測定方
法。 - 【請求項３】標識化されているモノクローナル抗体の標
識物が、酸素、蛍光物質、発光物質及び放射性物質のい
ずれかである請求の範囲第２項記載の検体中のヒト胎盤
由来酸性グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの測定方
法。 - 【請求項４】ヒト胎盤由来酸性グルタチオンＳ−トラン
スフェラーゼを認識する２種類のモノクローナル抗体2H
と6Aを使用した、免疫学的方法により検体中のヒト胎盤
由来酸性グルタチオンＳ−トランスフェラーゼを測定す
るための試薬キットであって、担体に固定された一方
のモノクローナル抗体と、標識化された他方のモノク
ローナル抗体と、必要により、該標識化抗体の検出試
薬を主要構成成分とする、検体中のヒト胎盤由来酸性グ
ルタチオンＳ−トランスフェラーゼを測定するための試
薬キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61-506132A JPH0827286B2 (ja) | 1985-11-21 | 1986-11-19 | ヒト胎盤由来酸性グルタチオンｓ−トランスフェラ−ゼの測定方法及び試薬キット |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25985885 | 1985-11-21 | ||
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