JPH08272A - マウスインターロイキン−２をコードする遺伝子を含むｄｎａ断片，該ｄｎａ断片を有する組換えベクターおよび該ベクターを保持する形質転換体 - Google Patents
マウスインターロイキン−２をコードする遺伝子を含むｄｎａ断片，該ｄｎａ断片を有する組換えベクターおよび該ベクターを保持する形質転換体Info
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- JPH08272A JPH08272A JP7180603A JP18060395A JPH08272A JP H08272 A JPH08272 A JP H08272A JP 7180603 A JP7180603 A JP 7180603A JP 18060395 A JP18060395 A JP 18060395A JP H08272 A JPH08272 A JP H08272A
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 マウスインターロイキン−２活性を持ち、配
列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含むポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片が挿入
された原核生物あるいは真核生物細胞を形質転換するた
めの組換えベクター、該組換えベクターを保持する形質
転換体。 【効果】 本発明により、マウスインターロイキン２活
性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片を単離することに成功し、微生物によるマウスイ
ンターロイキン２活性を有するポリペプチド生産の道が
ひらかれる。
列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含むポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片が挿入
された原核生物あるいは真核生物細胞を形質転換するた
めの組換えベクター、該組換えベクターを保持する形質
転換体。 【効果】 本発明により、マウスインターロイキン２活
性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片を単離することに成功し、微生物によるマウスイ
ンターロイキン２活性を有するポリペプチド生産の道が
ひらかれる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、マウスインターロイキ
ン−２をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片，該ＤＮＡ
断片を有する組換えベクターおよび該ベクターを保持す
る形質転換体に関する。
ン−２をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片，該ＤＮＡ
断片を有する組換えベクターおよび該ベクターを保持す
る形質転換体に関する。
【０００２】
【従来の技術】マウスインターロイキン−２（ＭＩＬ−
２）の産生に関しては、マウスリンホーマやハイブリド
ーマがこれを産生することが報告されている（S.Gillis
et al., J. Immunol., 125, 2570(1980), I.Clark-Lew
is et al., 128, 168(1982))。
２）の産生に関しては、マウスリンホーマやハイブリド
ーマがこれを産生することが報告されている（S.Gillis
et al., J. Immunol., 125, 2570(1980), I.Clark-Lew
is et al., 128, 168(1982))。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかるに、これら細胞
によるＭＩＬ−２の生産は微量であり、しかもその生産
には細胞を大量に培養することが必要となり、解決され
なければならない多くの問題がある。
によるＭＩＬ−２の生産は微量であり、しかもその生産
には細胞を大量に培養することが必要となり、解決され
なければならない多くの問題がある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らはＭＩＬ−２
の生産方法について研究を重ねてきたが、ついに、マウ
スインターロイキン−２をコードする遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片を調製することに成功し、更に、このようにして
得たＤＮＡ断片を原核生物又は真核生物細胞内で複製さ
れ得るベクターＤＮＡと接続して組換えベクターを得
た。更に又、得られた組換えベクターにより形質転換さ
せた原核あるいは真核生物細胞を培養することによりマ
ウスインターロイキン−２活性を有するポリペプチドを
製造することに成功した。
の生産方法について研究を重ねてきたが、ついに、マウ
スインターロイキン−２をコードする遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片を調製することに成功し、更に、このようにして
得たＤＮＡ断片を原核生物又は真核生物細胞内で複製さ
れ得るベクターＤＮＡと接続して組換えベクターを得
た。更に又、得られた組換えベクターにより形質転換さ
せた原核あるいは真核生物細胞を培養することによりマ
ウスインターロイキン−２活性を有するポリペプチドを
製造することに成功した。
【０００５】すなわち、本発明は、第１にマウスインタ
ーロイキン−２活性を持ち、配列表の配列番号１に記載
のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ
断片に関し、第２に該ＤＮＡ断片が挿入された原核生物
あるいは真核生物細胞を形質転換するための組換えベク
ターに関し、第３に該組換えベクターを保持する形質転
換体に関する。
ーロイキン−２活性を持ち、配列表の配列番号１に記載
のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ
断片に関し、第２に該ＤＮＡ断片が挿入された原核生物
あるいは真核生物細胞を形質転換するための組換えベク
ターに関し、第３に該組換えベクターを保持する形質転
換体に関する。
【０００６】マウスインターロイキン−２をコードする
遺伝子を含むＤＮＡ断片は、ＭＩＬ−２生産能を有する
マウスリンパ球由来細胞よりメッセンジャーＲＮＡ（ｍ
ＲＮＡ）を分離し、これを鋳型として相補ＤＮＡ（ｃＤ
ＮＡ）を得ることにより、得られる。ＭＩＬ−２に対応
するｍＲＮＡは、蔗糖密度勾配（ＳＤＧ）遠心法、ゲル
濾過法又はアガロースゲル電気泳動法等により、１２Ｓ
画分に相当する画分として得ることができる。ｍＲＮＡ
画分にＭＩＬ−２に対応するｍＲＮＡが含まれているか
どうかを調べるには、ｍＲＮＡ画分を生体内又は生体外
蛋白翻訳系を用いてｍＲＮＡを蛋白に翻訳させることに
より、行うことができる。ｍＲＮＡは、蔗糖密度勾配
（ＳＤＧ）遠心法、ゲル濾過法又はアガロースゲル電気
泳動法等により、１２Ｓ画分に相当する画分として得る
ことができる。
遺伝子を含むＤＮＡ断片は、ＭＩＬ−２生産能を有する
マウスリンパ球由来細胞よりメッセンジャーＲＮＡ（ｍ
ＲＮＡ）を分離し、これを鋳型として相補ＤＮＡ（ｃＤ
ＮＡ）を得ることにより、得られる。ＭＩＬ−２に対応
するｍＲＮＡは、蔗糖密度勾配（ＳＤＧ）遠心法、ゲル
濾過法又はアガロースゲル電気泳動法等により、１２Ｓ
画分に相当する画分として得ることができる。ｍＲＮＡ
画分にＭＩＬ−２に対応するｍＲＮＡが含まれているか
どうかを調べるには、ｍＲＮＡ画分を生体内又は生体外
蛋白翻訳系を用いてｍＲＮＡを蛋白に翻訳させることに
より、行うことができる。ｍＲＮＡは、蔗糖密度勾配
（ＳＤＧ）遠心法、ゲル濾過法又はアガロースゲル電気
泳動法等により、１２Ｓ画分に相当する画分として得る
ことができる。
【０００７】ＭＩＬ−２産生能を有するマウスリンパ球
由来細胞として末梢血、リンパ節、脾臓等より得られる
リンパ球そのものも含まれる。また、これらのリンパ球
をナイロンカラム処理、抗血清と補体処理、密度勾配分
画、酵素（ノイラミニダーゼ，ガラクトースオキシダー
ゼ、トリプシン等）処理、Ｘ線照射など従来知られた方
法で変異処理したものも含まれる。さらに、これらリン
パ球由来細胞を、例えばＴリンパ球をＴ細胞増殖因子等
の存在下にクローン化したように、クローン化したもの
も好ましいリンパ球由来細胞である。また、白血病細胞
およびＴリンパ腫細胞のようなリンパ球悪性化細胞やこ
れらマウスリンパ球悪性化細胞を上記のような前処理も
しくは変異処理したもの、または悪性化細胞をクローン
化したものがより好ましいヒトリンパ球由来細胞として
用いることができる。特にクローン化細胞株は、得られ
るｍＲＮＡが通常多い。さらに、上記のマウスリンパ球
由来細胞とＢＷ５１４７等の腫瘍細胞株とを融合させる
ことにより得られたハイブリドーマも好適なリンパ球由
来細胞として使用できる。
由来細胞として末梢血、リンパ節、脾臓等より得られる
リンパ球そのものも含まれる。また、これらのリンパ球
をナイロンカラム処理、抗血清と補体処理、密度勾配分
画、酵素（ノイラミニダーゼ，ガラクトースオキシダー
ゼ、トリプシン等）処理、Ｘ線照射など従来知られた方
法で変異処理したものも含まれる。さらに、これらリン
パ球由来細胞を、例えばＴリンパ球をＴ細胞増殖因子等
の存在下にクローン化したように、クローン化したもの
も好ましいリンパ球由来細胞である。また、白血病細胞
およびＴリンパ腫細胞のようなリンパ球悪性化細胞やこ
れらマウスリンパ球悪性化細胞を上記のような前処理も
しくは変異処理したもの、または悪性化細胞をクローン
化したものがより好ましいヒトリンパ球由来細胞として
用いることができる。特にクローン化細胞株は、得られ
るｍＲＮＡが通常多い。さらに、上記のマウスリンパ球
由来細胞とＢＷ５１４７等の腫瘍細胞株とを融合させる
ことにより得られたハイブリドーマも好適なリンパ球由
来細胞として使用できる。
【０００８】これらマウスリンパ球由来細胞には、
（１）自発的にＭＩＬ−２を産生するもの、（２）他の
細胞の存在下または非存在下にマイトゲンと接触せしめ
て刺激することによりＭＩＬ−２を産生するものがあ
る。ＭＩＬ−２自発産生株を用いる場合には、これら細
胞を通常の方法で培養すればよい。
（１）自発的にＭＩＬ−２を産生するもの、（２）他の
細胞の存在下または非存在下にマイトゲンと接触せしめ
て刺激することによりＭＩＬ−２を産生するものがあ
る。ＭＩＬ−２自発産生株を用いる場合には、これら細
胞を通常の方法で培養すればよい。
【０００９】マイトゲン刺激によりＭＩＬ−２を産生す
る細胞を用いる場合には、細胞を十分に洗浄後、ローズ
ウェル・パーク・メモリアル・インスティチュート１６
４０培地（以下、ＲＰＭＩ １６４０と略す。）、ダル
ベッコウ変法イーグルス培地（以下、ＤＭＥＭと略
す。）またはクリック培地などの通常の細胞用培地（血
清や血清成分は含有しても含有しなくてもよく、ペニシ
リン，ストレプトマイシン又は他の抗生物質，Ｌ−グル
タミン，ヘペス緩衝液又は炭酸水素ナトリウムのような
添加物を培地に加えても良い。）に0.５〜４×１０6 個
／ｍｌの細胞密度で懸濁し、これにマイトゲン，ノイラ
ミニダーゼ，ガラクトースオキシダーゼ，塩化亜鉛等の
亜鉛化合物，プロテインＡ，ストレプトリシン−Ｏ等の
細菌由来のリンパ球活性化成分，ホルボールミリスチッ
クアシド（ＰＭＡ）やＴＰＡなどのホルボールエステル
類をを添加した後、細胞を洗浄し，刺激剤を除去する。
さらに、マイトゲン刺激の際、マクロファージ又はデン
ドリティック細胞を共存させると、ＭＩＬ−２に対応す
るｍＲＮＡの収量を増大させ得る。
る細胞を用いる場合には、細胞を十分に洗浄後、ローズ
ウェル・パーク・メモリアル・インスティチュート１６
４０培地（以下、ＲＰＭＩ １６４０と略す。）、ダル
ベッコウ変法イーグルス培地（以下、ＤＭＥＭと略
す。）またはクリック培地などの通常の細胞用培地（血
清や血清成分は含有しても含有しなくてもよく、ペニシ
リン，ストレプトマイシン又は他の抗生物質，Ｌ−グル
タミン，ヘペス緩衝液又は炭酸水素ナトリウムのような
添加物を培地に加えても良い。）に0.５〜４×１０6 個
／ｍｌの細胞密度で懸濁し、これにマイトゲン，ノイラ
ミニダーゼ，ガラクトースオキシダーゼ，塩化亜鉛等の
亜鉛化合物，プロテインＡ，ストレプトリシン−Ｏ等の
細菌由来のリンパ球活性化成分，ホルボールミリスチッ
クアシド（ＰＭＡ）やＴＰＡなどのホルボールエステル
類をを添加した後、細胞を洗浄し，刺激剤を除去する。
さらに、マイトゲン刺激の際、マクロファージ又はデン
ドリティック細胞を共存させると、ＭＩＬ−２に対応す
るｍＲＮＡの収量を増大させ得る。
【００１０】ＩＬ−２産生能を有するリンパ球由来細胞
は、通常の条件で試験管内もしくは動物種中で継代，増
殖させることができる。ｍＲＮＡの供給源を調製するた
めに試験管内にて継代培養する場合には、従来のＴ細胞
の生育を促進することが知られている培地であれば、ど
れを用いても行なうことが可能であり、これら培地に
は、哺乳動物由来の血清，血清成分、又は血清アルブミ
ンを添加してもよい。
は、通常の条件で試験管内もしくは動物種中で継代，増
殖させることができる。ｍＲＮＡの供給源を調製するた
めに試験管内にて継代培養する場合には、従来のＴ細胞
の生育を促進することが知られている培地であれば、ど
れを用いても行なうことが可能であり、これら培地に
は、哺乳動物由来の血清，血清成分、又は血清アルブミ
ンを添加してもよい。
【００１１】リンパ球由来細胞の培養時間は、リンパ球
が活性化され、ＭＩＬ−２に対応するｍＲＮＡが生成さ
れる時間であり、この時間は、細胞の培養上清にＩＬ−
２が産生され始めた頃に相当する。好ましい時間は、マ
イトゲン等の刺激剤を添加してから３〜１２時間であ
る。培養時間が長すぎる場合には、生成したＭＩＬ−２
に対応するｍＲＮＡが分解されることがある。培養時の
ｐＨは７．０〜７．４の範囲、温度は３２〜３８℃の範
囲の飽和水蒸気の環境下で行なうのが望ましい。
が活性化され、ＭＩＬ−２に対応するｍＲＮＡが生成さ
れる時間であり、この時間は、細胞の培養上清にＩＬ−
２が産生され始めた頃に相当する。好ましい時間は、マ
イトゲン等の刺激剤を添加してから３〜１２時間であ
る。培養時間が長すぎる場合には、生成したＭＩＬ−２
に対応するｍＲＮＡが分解されることがある。培養時の
ｐＨは７．０〜７．４の範囲、温度は３２〜３８℃の範
囲の飽和水蒸気の環境下で行なうのが望ましい。
【００１２】ＭＩＬ−２産生能を有するリンパ球由来細
胞よりＩＬ−２に対応するｍＲＮＡを抽出するには、細
胞の種類を問わず常法によって行なえばよい。例えばＮ
Ｐ−４０，ＳＤＳ，ＴｒｉｔｏｎＸ１００，デオキシコ
ール酸などの界面活性剤を使用するか、ホモゲナイザー
や凍結融解などの物理的方法を用いて、細胞を部分的あ
るいは完全に破壊した後、ｍＲＮＡを分離する。抽出の
際にＲＮＡ分解酵素によるＲＮＡの分解を防ぐために、
抽出液中にＲＮＡ分解酵素阻害物質、例えばヘパリン，
ポリビニル硫酸，ベントナイト，マカロイド，ジエチル
ピロカーボネイト，バナジウム複合体などを添加してお
くのが好ましい。また、場合によっては、ＭＩＬ−２に
対応する抗体を用いてＭＩＬ−２合成途上のポリゾーム
を沈降せしめ、これよりｍＲＮＡを界面活性剤などで抽
出する方法も行なうことができる。
胞よりＩＬ−２に対応するｍＲＮＡを抽出するには、細
胞の種類を問わず常法によって行なえばよい。例えばＮ
Ｐ−４０，ＳＤＳ，ＴｒｉｔｏｎＸ１００，デオキシコ
ール酸などの界面活性剤を使用するか、ホモゲナイザー
や凍結融解などの物理的方法を用いて、細胞を部分的あ
るいは完全に破壊した後、ｍＲＮＡを分離する。抽出の
際にＲＮＡ分解酵素によるＲＮＡの分解を防ぐために、
抽出液中にＲＮＡ分解酵素阻害物質、例えばヘパリン，
ポリビニル硫酸，ベントナイト，マカロイド，ジエチル
ピロカーボネイト，バナジウム複合体などを添加してお
くのが好ましい。また、場合によっては、ＭＩＬ−２に
対応する抗体を用いてＭＩＬ−２合成途上のポリゾーム
を沈降せしめ、これよりｍＲＮＡを界面活性剤などで抽
出する方法も行なうことができる。
【００１３】また、ｐｏｌｙＡを含むｍＲＮＡの精製に
ついては、オリゴｄＴ−セルロース，セファロース２Ｂ
を担体とするポリＵ−セファロースなどのアフィニティ
・カラム・クロマトグラフィーあるいはバッチ法による
精製法、ＳＤＧ遠心法による分画、アガロースゲル電気
泳動法等によって行なうことができる。
ついては、オリゴｄＴ−セルロース，セファロース２Ｂ
を担体とするポリＵ−セファロースなどのアフィニティ
・カラム・クロマトグラフィーあるいはバッチ法による
精製法、ＳＤＧ遠心法による分画、アガロースゲル電気
泳動法等によって行なうことができる。
【００１４】ｍＲＮＡを蛋白に翻訳するのによく用いら
れる系は、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａ
ｅｖｉｓ）の卵母細胞にｍＲＮＡを注入して翻訳させる
方法（Gurdon et al.,Nature, 233, 177 (`72)) 、ある
いはウサギ網状赤血球ライゼート，小麦胚芽などの無細
胞系で蛋白に翻訳させる方法が行なわれている。また、
同一ポリペプチドをコードする遺伝子においては、種間
でホモロジイがあることから、例えば、ヒトポリペプチ
ドをコードするｍＲＮＡに対するｃＤＮＡあるいは染色
体ＤＮＡをプローブとして、マウス遺伝子を選択する等
の方法が行なわれ得る（Higashi,Y. et al., J.Biol.Ch
em., 258, 9522 (1983), Gray,P.W.et al., Proc.Natl.
Sci.U.S.A., 80, 5842 (1983) 等）。
れる系は、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａ
ｅｖｉｓ）の卵母細胞にｍＲＮＡを注入して翻訳させる
方法（Gurdon et al.,Nature, 233, 177 (`72)) 、ある
いはウサギ網状赤血球ライゼート，小麦胚芽などの無細
胞系で蛋白に翻訳させる方法が行なわれている。また、
同一ポリペプチドをコードする遺伝子においては、種間
でホモロジイがあることから、例えば、ヒトポリペプチ
ドをコードするｍＲＮＡに対するｃＤＮＡあるいは染色
体ＤＮＡをプローブとして、マウス遺伝子を選択する等
の方法が行なわれ得る（Higashi,Y. et al., J.Biol.Ch
em., 258, 9522 (1983), Gray,P.W.et al., Proc.Natl.
Sci.U.S.A., 80, 5842 (1983) 等）。
【００１５】かくして得られたＭＩＬ−２に対応するｍ
ＲＮＡを含む画分より試験管内でｃＤＮＡを合成する。
得られたｃＤＮＡがＭＩＬ−２をコードするかどうかを
調べるには、ｃＤＮＡに例えばエシェリヒア・コリの細
胞又はＣＯＳ細胞内で複製し得るベクターＤＮＡに接続
して、その宿主細胞に導入することによって行なうこと
ができる。
ＲＮＡを含む画分より試験管内でｃＤＮＡを合成する。
得られたｃＤＮＡがＭＩＬ−２をコードするかどうかを
調べるには、ｃＤＮＡに例えばエシェリヒア・コリの細
胞又はＣＯＳ細胞内で複製し得るベクターＤＮＡに接続
して、その宿主細胞に導入することによって行なうこと
ができる。
【００１６】ｃＤＮＡを合成するには、先ず、ｍＲＮＡ
を鋳型とし、オリゴｄＴをプライマーとして、ｄＡＴ
Ｐ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰの存在下で逆転写酵
素によりｍＲＮＡと相補的なｓｓ−ｃＤＮＡを合成し、
アルカリ処理で鋳型ｍＲＮＡを分解、除去した後、今度
は単鎖ｃＤＮＡを鋳型にして逆転写酵素あるいはＤＮＡ
ポリメラーゼを用いてｄｓ−ｃＤＮＡを合成する。
を鋳型とし、オリゴｄＴをプライマーとして、ｄＡＴ
Ｐ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰの存在下で逆転写酵
素によりｍＲＮＡと相補的なｓｓ−ｃＤＮＡを合成し、
アルカリ処理で鋳型ｍＲＮＡを分解、除去した後、今度
は単鎖ｃＤＮＡを鋳型にして逆転写酵素あるいはＤＮＡ
ポリメラーゼを用いてｄｓ−ｃＤＮＡを合成する。
【００１７】このようにして得られたｄｓ−ｃＤＮＡと
真核生物あるいは原核生物で複製できるレプリコンを含
むベクターＤＮＡから組換えベクターが作られる。この
ｄｓ−ｃＤＮＡ及び真核生物あるいは原核生物で増殖し
得るベクターＤＮＡは、これらを結合させる前にエキソ
ヌクレアーゼ処理、化学合成ＤＮＡ断片の追加、ｄｓ−
ｃＤＮＡやベクターＤＮＡの末端に連結可能な端末をつ
けるためにＧ，Ｃ−鎖を伸ばすなど各種処理によって修
飾される。これらの連結可能なＤＮＡは、例えばＡＴＰ
共存下にＴ４ファージのＤＮＡライゲースによってつぎ
合わせることができる。得られたｃＤＮＡがＭＩＬ−２
をコードするものであることが確認できたら、これをベ
クターＤＮＡの宿主細胞によりその遺伝情報が発現され
るように加工してベクターＤＮＡと接続し、宿主細胞に
導入される。
真核生物あるいは原核生物で複製できるレプリコンを含
むベクターＤＮＡから組換えベクターが作られる。この
ｄｓ−ｃＤＮＡ及び真核生物あるいは原核生物で増殖し
得るベクターＤＮＡは、これらを結合させる前にエキソ
ヌクレアーゼ処理、化学合成ＤＮＡ断片の追加、ｄｓ−
ｃＤＮＡやベクターＤＮＡの末端に連結可能な端末をつ
けるためにＧ，Ｃ−鎖を伸ばすなど各種処理によって修
飾される。これらの連結可能なＤＮＡは、例えばＡＴＰ
共存下にＴ４ファージのＤＮＡライゲースによってつぎ
合わせることができる。得られたｃＤＮＡがＭＩＬ−２
をコードするものであることが確認できたら、これをベ
クターＤＮＡの宿主細胞によりその遺伝情報が発現され
るように加工してベクターＤＮＡと接続し、宿主細胞に
導入される。
【００１８】マウスインターロイキン−２活性を有する
ポリペプチド生産のための適当な宿主細胞としては、脊
椎動物，酵母などの真核生物細胞がある。例えば、サル
細胞であるＣＶ−１細胞が用いられるが、本細胞はＳＶ
−４０のオリジン（ｏｒｉｇｉｎ）欠損変異株で形質転
換され、ＳＶ−４０大型Ｔ抗原を表現している（ＣＯＳ
細胞）（Gluzman: Cell, 23, 175〜182 (1981)) 。ま
た、大野，谷口（Nucleic acid Research 10, 967 〜97
7 (1982)) らによって検討されたマウス由来細胞、さら
には、Hitzemanら(Nature 293, 717〜722 (1981)) によ
って検討されたＩＦＮ遺伝子発現用に応用されている酵
母の宿主ベクター系が用いられる。適当な原核生物宿主
としてはエシェリヒア・コリ，バチルス・ズブチリスな
どが含まれる。宿主細胞中でのＤＮＡ増幅のためにはエ
シェリヒア・コリを宿主とすることができるが、その他
の宿主細胞とすることもできる。
ポリペプチド生産のための適当な宿主細胞としては、脊
椎動物，酵母などの真核生物細胞がある。例えば、サル
細胞であるＣＶ−１細胞が用いられるが、本細胞はＳＶ
−４０のオリジン（ｏｒｉｇｉｎ）欠損変異株で形質転
換され、ＳＶ−４０大型Ｔ抗原を表現している（ＣＯＳ
細胞）（Gluzman: Cell, 23, 175〜182 (1981)) 。ま
た、大野，谷口（Nucleic acid Research 10, 967 〜97
7 (1982)) らによって検討されたマウス由来細胞、さら
には、Hitzemanら(Nature 293, 717〜722 (1981)) によ
って検討されたＩＦＮ遺伝子発現用に応用されている酵
母の宿主ベクター系が用いられる。適当な原核生物宿主
としてはエシェリヒア・コリ，バチルス・ズブチリスな
どが含まれる。宿主細胞中でのＤＮＡ増幅のためにはエ
シェリヒア・コリを宿主とすることができるが、その他
の宿主細胞とすることもできる。
【００１９】ＭＩＬ−２をコードする遺伝子が宿主細胞
内で発現されるように加工するには、ベクターＤＮＡと
接続されたときにプロモーター等の制御ＤＮＡがＭＩＬ
−２遺伝子が発現されるように、ＭＩＬ−２遺伝子の上
流の適当な位置にＭＩＬ−２遺伝子を配置すればよい。
更に、使用する宿主細胞のシグナルペプチド塩基配列を
ＭＩＬ−２遺伝子の５’−末端に直接接続することによ
り、宿主細胞外又はそのペリプラズムにマウスインター
ロイキン−２活性を有するポリペプチドを分泌せしめる
ことができる。
内で発現されるように加工するには、ベクターＤＮＡと
接続されたときにプロモーター等の制御ＤＮＡがＭＩＬ
−２遺伝子が発現されるように、ＭＩＬ−２遺伝子の上
流の適当な位置にＭＩＬ−２遺伝子を配置すればよい。
更に、使用する宿主細胞のシグナルペプチド塩基配列を
ＭＩＬ−２遺伝子の５’−末端に直接接続することによ
り、宿主細胞外又はそのペリプラズムにマウスインター
ロイキン−２活性を有するポリペプチドを分泌せしめる
ことができる。
【００２０】適当なエシェリヒア・コリ用ベクターとし
ては、ＥＫ型プラスミドベクター（ストリンゼント型）
としてｐＳＣ１０１，ｐＲＫ３５３，ｐＲＫ６４６，ｐ
ＲＫ２４８，ｐＤＦ４１など、ＥＫタイププラスミドベ
クター（リラックスド型）：Ｃｏ１Ｅ１，ｐＶＨ５１，
ｐＡＣ１０５，ＲＳＦ２１２４，ｐＣＲ１，ｐＭＢ９，
ｐＢＲ３１３，ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２４，ｐＢＲ３
２５，ｐＢＲ３２７，ｐＢＲ３２８，ｐＫＹ２２８９，
ｐＫＹ２７００，ｐＫＮ８０，ｐＫＣ７，ｐＫＢ１５
８，ｐＭＫ２００４，ｐＡＣＹＣ１，ｐＡＣＹＣ１８
４，ｄｕｌ等，λｇｔ系ファージベクター：λｇｔ・λ
ｃ，λｇｔ・λＢ，λＷＥＳ・λＣ，λＷＥＳ・λＢ，
λＺＪｖｉｒ．，λＢ’，λＡＬＯ，λＢ，λＷＥＳ．
Ｔｓ６２２，λＤａｍ等が含まれている。一般にｐＢＲ
３２２はエシェリヒア・コリ用ベクターとしてしばしば
利用されてきたが、この場合最も良いクローニング部位
はＰｓｔＩならびにＥｃｏＲＩ部位である。
ては、ＥＫ型プラスミドベクター（ストリンゼント型）
としてｐＳＣ１０１，ｐＲＫ３５３，ｐＲＫ６４６，ｐ
ＲＫ２４８，ｐＤＦ４１など、ＥＫタイププラスミドベ
クター（リラックスド型）：Ｃｏ１Ｅ１，ｐＶＨ５１，
ｐＡＣ１０５，ＲＳＦ２１２４，ｐＣＲ１，ｐＭＢ９，
ｐＢＲ３１３，ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２４，ｐＢＲ３
２５，ｐＢＲ３２７，ｐＢＲ３２８，ｐＫＹ２２８９，
ｐＫＹ２７００，ｐＫＮ８０，ｐＫＣ７，ｐＫＢ１５
８，ｐＭＫ２００４，ｐＡＣＹＣ１，ｐＡＣＹＣ１８
４，ｄｕｌ等，λｇｔ系ファージベクター：λｇｔ・λ
ｃ，λｇｔ・λＢ，λＷＥＳ・λＣ，λＷＥＳ・λＢ，
λＺＪｖｉｒ．，λＢ’，λＡＬＯ，λＢ，λＷＥＳ．
Ｔｓ６２２，λＤａｍ等が含まれている。一般にｐＢＲ
３２２はエシェリヒア・コリ用ベクターとしてしばしば
利用されてきたが、この場合最も良いクローニング部位
はＰｓｔＩならびにＥｃｏＲＩ部位である。
【００２１】組換えＤＮＡを用いた宿主細胞の形質転換
には、通常よく用いられる次の方法がある。エシェリヒ
ア・コリの如き原核生物が宿主の場合、このＤＮＡを取
り込むことのできるコンピテント細胞は対数増殖期にお
ける細胞を回収後、良く知られているＣａＣｌ2 法によ
って形質転換できる。形質転換反応液中にＭｇＣｌ2又
はＲｂＣｌを共存させれば形質転換効率は向上する。ま
た、宿主細胞のプロトプラスト調製後、形質転換させる
ことも可能である。
には、通常よく用いられる次の方法がある。エシェリヒ
ア・コリの如き原核生物が宿主の場合、このＤＮＡを取
り込むことのできるコンピテント細胞は対数増殖期にお
ける細胞を回収後、良く知られているＣａＣｌ2 法によ
って形質転換できる。形質転換反応液中にＭｇＣｌ2又
はＲｂＣｌを共存させれば形質転換効率は向上する。ま
た、宿主細胞のプロトプラスト調製後、形質転換させる
ことも可能である。
【００２２】用いる宿主細胞が真核生物の場合、ＤＮＡ
をリン酸カルシウム沈澱として感染させる方法、マイク
ロインジェクション法；赤血球細胞あるいはリポソーム
にプラスミドを包括して挿入する方法、リゾフォスファ
チジルコリンのような試薬による細胞の処理法、あるい
はウイルスベクターを用いる方法など通常の方法によっ
て感染させることができる。
をリン酸カルシウム沈澱として感染させる方法、マイク
ロインジェクション法；赤血球細胞あるいはリポソーム
にプラスミドを包括して挿入する方法、リゾフォスファ
チジルコリンのような試薬による細胞の処理法、あるい
はウイルスベクターを用いる方法など通常の方法によっ
て感染させることができる。
【００２３】ＩＬ−２遺伝子を保有する細胞は、ベクタ
ーＤＮＡが有しているマーカーとしての形質及びＭＩＬ
−２産生能を有する株を分離することにより、得られ
る。また、既にＭＩＬ−２遺伝子がヒトＩＬ−２遺伝子
と相補性を有することがわかっているので、ヒトＩＬ−
２遺伝子とハイブリダイズするＤＮＡを有する細胞を選
別することにより、マウスインターロイキン−２をコー
ドする遺伝子を含むＤＮＡ断片を有する細胞を得ること
ができる。
ーＤＮＡが有しているマーカーとしての形質及びＭＩＬ
−２産生能を有する株を分離することにより、得られ
る。また、既にＭＩＬ−２遺伝子がヒトＩＬ−２遺伝子
と相補性を有することがわかっているので、ヒトＩＬ−
２遺伝子とハイブリダイズするＤＮＡを有する細胞を選
別することにより、マウスインターロイキン−２をコー
ドする遺伝子を含むＤＮＡ断片を有する細胞を得ること
ができる。
【００２４】本発明において単離されたマウスインター
ロイキン−２をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片の全
ヌクレオチド配列は、Maxam and Gilbert 法(Meth. Enz
ym.65, 499,(1980)及びＭ１３ファージ(J.Messing et a
l.,Gene, 19, 269(1982))を使ったジデオキシヌクレオ
チド鎖終結法(F.Sanger, et al., Proc. Natl. Acad.Sc
i. U.S.A., 74, 5463 (1979))にて決定された。ｃＤＮ
Ａインサートの制限酵素エンドヌクレアーゼによる切断
図を第１図に示す。第１図に示す如く、このｃＤＮＡは
それぞれＰｓｔＩ，ＰｖｕII, ＨｉｎｄIII ，Ｔａｑ
Ｉ，ＲｓａＩによる切断個所がこの順序で配置されてい
る。このｃＤＮＡインサートの全ＤＮＡ配列は配列表の
配列番号３に記載した通りである。
ロイキン−２をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片の全
ヌクレオチド配列は、Maxam and Gilbert 法(Meth. Enz
ym.65, 499,(1980)及びＭ１３ファージ(J.Messing et a
l.,Gene, 19, 269(1982))を使ったジデオキシヌクレオ
チド鎖終結法(F.Sanger, et al., Proc. Natl. Acad.Sc
i. U.S.A., 74, 5463 (1979))にて決定された。ｃＤＮ
Ａインサートの制限酵素エンドヌクレアーゼによる切断
図を第１図に示す。第１図に示す如く、このｃＤＮＡは
それぞれＰｓｔＩ，ＰｖｕII, ＨｉｎｄIII ，Ｔａｑ
Ｉ，ＲｓａＩによる切断個所がこの順序で配置されてい
る。このｃＤＮＡインサートの全ＤＮＡ配列は配列表の
配列番号３に記載した通りである。
【００２５】上記のように、マウスインターロイキン−
２をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片は、一つの大き
なオープンリーディングフレームを有するものである。
該オープンリーディングフレームは、上記のｃＤＮＡ塩
基配列のうち、イニシエーションコドンと考えられる
５’−末端から数えて４８番目から５０番目のＡＴＧ配
列より２１番目のコドンであるAla コドンより１６９番
目のコドンであるGln コドン迄の配列に相当すると考え
られる。したがって、ＭＩＬ−２ポリペプチドはAla を
Ｎ−末端とし、Gln をＣ−末端とする１４９個のアミノ
酸から成ると考えられ、分子量は１７２３３．５ダルト
ンと計算される。なお、ＩＬ−２活性を有するポリペプ
チドはAla の次のPro をＮ−末端とする場合もある。ま
た、上記のAla から始まるアミノ酸配列のうちのいくつ
かのアミノ酸が他のアミノ酸に置換したり、又は欠落し
ても、ＩＬ−２活性を有することがある。更に、上記Ｍ
ＩＬ−２をコードする遺伝子において、アミノ酸コドン
が同一アミノ酸の他のトリプレットに置換しても上記塩
基配列と同様の作用を有することがある。
２をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片は、一つの大き
なオープンリーディングフレームを有するものである。
該オープンリーディングフレームは、上記のｃＤＮＡ塩
基配列のうち、イニシエーションコドンと考えられる
５’−末端から数えて４８番目から５０番目のＡＴＧ配
列より２１番目のコドンであるAla コドンより１６９番
目のコドンであるGln コドン迄の配列に相当すると考え
られる。したがって、ＭＩＬ−２ポリペプチドはAla を
Ｎ−末端とし、Gln をＣ−末端とする１４９個のアミノ
酸から成ると考えられ、分子量は１７２３３．５ダルト
ンと計算される。なお、ＩＬ−２活性を有するポリペプ
チドはAla の次のPro をＮ−末端とする場合もある。ま
た、上記のAla から始まるアミノ酸配列のうちのいくつ
かのアミノ酸が他のアミノ酸に置換したり、又は欠落し
ても、ＩＬ−２活性を有することがある。更に、上記Ｍ
ＩＬ−２をコードする遺伝子において、アミノ酸コドン
が同一アミノ酸の他のトリプレットに置換しても上記塩
基配列と同様の作用を有することがある。
【００２６】組換えベクターを挿入した細胞を培養して
組換えベクターを増幅し、又はマウスインターロイキン
−２活性を有するポリペプチドを生産する。この培養は
通常の方法で行なわれる。例えば、感染した酵母を炭素
源，窒素源，無機塩類、必要あれば、ビタミン，アミノ
酸の如き有機栄養源を含有する培地で２７℃ないし３７
℃の範囲、ｐＨ４〜７にて好気的条件下で行う。エシェ
リヒア・コリ又はバチルス・ズブチリスの如き形質転換
された原核生物も通常の方法で培養することができる。
組換えベクターを増幅し、又はマウスインターロイキン
−２活性を有するポリペプチドを生産する。この培養は
通常の方法で行なわれる。例えば、感染した酵母を炭素
源，窒素源，無機塩類、必要あれば、ビタミン，アミノ
酸の如き有機栄養源を含有する培地で２７℃ないし３７
℃の範囲、ｐＨ４〜７にて好気的条件下で行う。エシェ
リヒア・コリ又はバチルス・ズブチリスの如き形質転換
された原核生物も通常の方法で培養することができる。
【００２７】細胞内または細胞外に生産されたマウスイ
ンターロイキン−２活性を有するポリペプチドは硫安沈
澱，塩類除去のための透析（常圧または減圧下），ゲル
濾過，クロマトグラフィー，等電点平板上濃縮，ゲル電
気泳動，高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣ
と略記），（イオン交換，ゲル濾過並びに逆相クロマト
グラフィー），及び色素結合担体，ＭＩＬ−２に対する
モノクローナル抗体を結合した活性化セファロース４Ｂ
又はレクチン結合セファロース４Ｂ等によるアフィニテ
ィクロマトグラフィー等、公知の方法によって回収する
ことができる。ＭＩＬ−２の単離精製法はGillisら(Imm
unol.Rev. 63, 167(1982)), Watsonら(J.Immunol.,122,
1633(1979), Clark-Lewisら(J.Immunol.,128, 168(198
2), J.Immunol.,128, 175(1982)), Mochizuki ら(J.Imm
unol.,125, 2579(1980) によって報告されている。かく
して得られたポリペプチドは、抗原刺激によって哺乳動
物細胞から作られるＩＬ−２について知られているもの
と同一の生化学的並びに生物学的挙動を示し、ＩＬ−２
活性を有する。
ンターロイキン−２活性を有するポリペプチドは硫安沈
澱，塩類除去のための透析（常圧または減圧下），ゲル
濾過，クロマトグラフィー，等電点平板上濃縮，ゲル電
気泳動，高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣ
と略記），（イオン交換，ゲル濾過並びに逆相クロマト
グラフィー），及び色素結合担体，ＭＩＬ−２に対する
モノクローナル抗体を結合した活性化セファロース４Ｂ
又はレクチン結合セファロース４Ｂ等によるアフィニテ
ィクロマトグラフィー等、公知の方法によって回収する
ことができる。ＭＩＬ−２の単離精製法はGillisら(Imm
unol.Rev. 63, 167(1982)), Watsonら(J.Immunol.,122,
1633(1979), Clark-Lewisら(J.Immunol.,128, 168(198
2), J.Immunol.,128, 175(1982)), Mochizuki ら(J.Imm
unol.,125, 2579(1980) によって報告されている。かく
して得られたポリペプチドは、抗原刺激によって哺乳動
物細胞から作られるＩＬ−２について知られているもの
と同一の生化学的並びに生物学的挙動を示し、ＩＬ−２
活性を有する。
【００２８】
【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。 実施例１ （１）Ｂ１０・ＢＲマウスの脾細胞をＸ線照射して得ら
れたリンホーマＬＢＲＭ−３３細胞（S.Gillis et al.,
J.Immunol.,125, 2570('80)) を、４×１０4 個／ｍｌ
の細胞密度で５容量／容量％の牛胎児血清（ＦＢＳ）を
含有するＲＰＭＩ１６４０培地５０ｍｌに懸濁し、ファ
ルコン社製シャーレ１０５８に入れ、３７℃で４日間培
養し、遠沈操作により細胞を集めた。この細胞を、２×
１０6 個／ｍｌの細胞密度にて上述の培地中に懸濁し、
ここにＰＨＡ１％を添加し、上記ファルコン社製シャー
レ１０５８に７５ｍｌで張り込み、３７℃で６時間静置
培養した。
る。 実施例１ （１）Ｂ１０・ＢＲマウスの脾細胞をＸ線照射して得ら
れたリンホーマＬＢＲＭ−３３細胞（S.Gillis et al.,
J.Immunol.,125, 2570('80)) を、４×１０4 個／ｍｌ
の細胞密度で５容量／容量％の牛胎児血清（ＦＢＳ）を
含有するＲＰＭＩ１６４０培地５０ｍｌに懸濁し、ファ
ルコン社製シャーレ１０５８に入れ、３７℃で４日間培
養し、遠沈操作により細胞を集めた。この細胞を、２×
１０6 個／ｍｌの細胞密度にて上述の培地中に懸濁し、
ここにＰＨＡ１％を添加し、上記ファルコン社製シャー
レ１０５８に７５ｍｌで張り込み、３７℃で６時間静置
培養した。
【００２９】（２）このようにして得たＰＨＡ１％で６
時間誘導したＬＢＲＭ−３３細胞（１．８×１０9 細
胞）をＰＢＳ溶液８００ｍｌに懸濁し、細胞を遠心によ
って２度洗浄してから、ヌクレアーゼ阻害剤であるRibo
nucleosides-Vanadyl complex （１０ｍＭ）を含んだＲ
ＳＢ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，
１０ｍＭ ＮａＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2)８００ｍ
ｌに懸濁した。次いで、ＮＰ−４０を0.０５％になるよ
うに加えた後、ゆるやかに攪拌したのち、３０００ｒｐ
ｍで５分遠心して核を除去し、その上清液にＳＤＳ（0.
５％）とＥＤＴＡ（５ｍＭ）を加えた後、直ちにフェノ
ールを等量加え、細胞質ＲＮＡを抽出した。合計３回フ
ェノール抽出を繰り返してから、２容のエタノールでＲ
ＮＡを沈澱し、遠心でこの沈澱を集め、１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５で溶解した。このようにして
ＬＢＲＭ−３３細胞から得られたＲＮＡ量は３０ｍｇで
あった。
時間誘導したＬＢＲＭ−３３細胞（１．８×１０9 細
胞）をＰＢＳ溶液８００ｍｌに懸濁し、細胞を遠心によ
って２度洗浄してから、ヌクレアーゼ阻害剤であるRibo
nucleosides-Vanadyl complex （１０ｍＭ）を含んだＲ
ＳＢ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，
１０ｍＭ ＮａＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2)８００ｍ
ｌに懸濁した。次いで、ＮＰ−４０を0.０５％になるよ
うに加えた後、ゆるやかに攪拌したのち、３０００ｒｐ
ｍで５分遠心して核を除去し、その上清液にＳＤＳ（0.
５％）とＥＤＴＡ（５ｍＭ）を加えた後、直ちにフェノ
ールを等量加え、細胞質ＲＮＡを抽出した。合計３回フ
ェノール抽出を繰り返してから、２容のエタノールでＲ
ＮＡを沈澱し、遠心でこの沈澱を集め、１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５で溶解した。このようにして
ＬＢＲＭ−３３細胞から得られたＲＮＡ量は３０ｍｇで
あった。
【００３０】次に、このＲＮＡからｍＲＮＡを取得する
ために、オリゴ（ｄＴ）−セルロース（P. L. Biochemi
cals, Type 7) を用い、カラムクロマトグラフィーを行
なった。吸着は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．
５，0.５Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，0.５％ Ｓ
ＤＳ溶液にＲＮＡを溶解して行ない、溶出は緩衝液（２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，0.５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄後、水と１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で交互にｍＲＮＡを溶出
することにより行なった。この結果、溶出されたｍＲＮ
Ａ量は５７６μｇであった。
ために、オリゴ（ｄＴ）−セルロース（P. L. Biochemi
cals, Type 7) を用い、カラムクロマトグラフィーを行
なった。吸着は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．
５，0.５Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，0.５％ Ｓ
ＤＳ溶液にＲＮＡを溶解して行ない、溶出は緩衝液（２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，0.５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄後、水と１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で交互にｍＲＮＡを溶出
することにより行なった。この結果、溶出されたｍＲＮ
Ａ量は５７６μｇであった。
【００３１】さらに、このｍＲＮＡをＳＤＧ遠心（５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ，0.２Ｍ ＮａＣｌを含む５〜２５％ショ糖密度勾
配、日立ＲＰＳ２８ローターで２７，０００ｒｐｍ，１
８時間，４℃）して１３画分に分画した。
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ，0.２Ｍ ＮａＣｌを含む５〜２５％ショ糖密度勾
配、日立ＲＰＳ２８ローターで２７，０００ｒｐｍ，１
８時間，４℃）して１３画分に分画した。
【００３２】（３）ここに得られた分画番号３から１０
のｍＲＮＡ画分各々１μｇから、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５），３０ｍＭ ＮａＣｌ，６
ｍＭＭｇＣｌ2 ，５ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴ
Ｔ），0.５ｍＭの各ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄ
ＴＴＰ（ｄＣＴＰは32Ｐラベルしたものを含む），0.１
μｇオリゴ（ｄＴ)10 及び１６ユニットＡＭＶ逆転写酵
素（J. W. Beard)を混ぜ、４１℃に９０分間保ち、一本
鎖ｃＤＮＡを合成した。反応終了後、フェノールにて蛋
白を除いた後、エタノール沈澱としてＤＮＡを回収し
た。得られたＤＮＡを蒸留水に溶解し、この溶液からｍ
ＲＮＡを除くためＮａＯＨ溶液を加えて0.３３Ｎ Ｎａ
ＯＨとして３７℃にて２時間置き、次いで溶液を等モル
の塩酸で中和した。
のｍＲＮＡ画分各々１μｇから、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５），３０ｍＭ ＮａＣｌ，６
ｍＭＭｇＣｌ2 ，５ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴ
Ｔ），0.５ｍＭの各ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄ
ＴＴＰ（ｄＣＴＰは32Ｐラベルしたものを含む），0.１
μｇオリゴ（ｄＴ)10 及び１６ユニットＡＭＶ逆転写酵
素（J. W. Beard)を混ぜ、４１℃に９０分間保ち、一本
鎖ｃＤＮＡを合成した。反応終了後、フェノールにて蛋
白を除いた後、エタノール沈澱としてＤＮＡを回収し
た。得られたＤＮＡを蒸留水に溶解し、この溶液からｍ
ＲＮＡを除くためＮａＯＨ溶液を加えて0.３３Ｎ Ｎａ
ＯＨとして３７℃にて２時間置き、次いで溶液を等モル
の塩酸で中和した。
【００３３】得られた一本鎖のｃＤＮＡ溶液を用いて、
１％アガロースゲル電気泳動を行ない、常法により、サ
ザンブロッティングによりｃＤＮＡをニトロセルロース
フィルターに移し、これと、ヒトＩＬ−２ｃＤＮＡ（Ta
niguchi,T et al.,Nature,302, 5906('83)) の制限酵素
ＨｉｎｆＩ（米国 New England Bio.Lab.)による分解物
（４５０塩基対）をプローブとして、ハイブリダイズさ
せた。すなわち、ヒトＩＬ−２ｃＤＮＡのＨｉｎｆＩ分
解物（４５０塩基対）を、ニックトランスレーション法
により32Ｐを導入し、これをプローブとして、６５℃に
て一昼夜ハイブリダイズさせた。
１％アガロースゲル電気泳動を行ない、常法により、サ
ザンブロッティングによりｃＤＮＡをニトロセルロース
フィルターに移し、これと、ヒトＩＬ−２ｃＤＮＡ（Ta
niguchi,T et al.,Nature,302, 5906('83)) の制限酵素
ＨｉｎｆＩ（米国 New England Bio.Lab.)による分解物
（４５０塩基対）をプローブとして、ハイブリダイズさ
せた。すなわち、ヒトＩＬ−２ｃＤＮＡのＨｉｎｆＩ分
解物（４５０塩基対）を、ニックトランスレーション法
により32Ｐを導入し、これをプローブとして、６５℃に
て一昼夜ハイブリダイズさせた。
【００３４】次いで、このニトロセルロースフィルター
を、３×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは１５０ｍＭ ＮａＣｌ及
び１５ｍＭ クエン酸ナトリウムを含む水溶液）に浸漬
後、0.１％ＳＤＳを含有する３×ＳＳＣにて、６５℃に
て３０分間２回洗浄し、３×ＳＳＣに浸漬し、風乾し
た。これをオートラジオグラフィーに一昼夜かけた。
を、３×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは１５０ｍＭ ＮａＣｌ及
び１５ｍＭ クエン酸ナトリウムを含む水溶液）に浸漬
後、0.１％ＳＤＳを含有する３×ＳＳＣにて、６５℃に
て３０分間２回洗浄し、３×ＳＳＣに浸漬し、風乾し
た。これをオートラジオグラフィーに一昼夜かけた。
【００３５】（４）ヒトＩＬ−２ｃＤＮＡとハイブリダ
イズしたｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡ画分よりｃＤＮＡ
を大量に合成し、プラスミドベクターｐＢＲ３２２と組
換えベクターを作り、これをエシェリヒア・コリに導入
してＭＩＬ−２ｃＤＮＡクローンを持つ菌体を、以下の
ように選択した。 （４−１）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，
３０ｍＭ ＮａＣｌ，６ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，５ｍＭ ジ
チオスレイトール（ＤＴＴ），0.５ｍＭの各ｄＡＴＰ，
ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ（ｄＣＴＰは32Ｐラベル
したものを含む），0.７μｇオリゴ（ｄＴ）10，１３μ
ｇ ｍＲＮＡ及び１６ユニット ＡＭＶ逆転写酵素（J.
W. Beard)を混ぜ、４１℃に９０分間保った。次いで、
反応液よりフェノールにて蛋白を除去し、それよりエタ
ノール沈澱としてＤＮＡを回収し、得られたＤＮＡを２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５溶液
に溶解した。このＤＮＡ溶液からｍＲＮＡを除くため
に、この溶液にＮａＯＨ溶液を加えて0.３３Ｎ ＮａＯ
Ｈとし、この溶液を室温にて１５時間置いた。次に、こ
の溶液を１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）の等量
で中和し、「セファデックスＧ−５０カラム」に通し
た。これにより５μｇの一本鎖ｃＤＮＡを回収した。
イズしたｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡ画分よりｃＤＮＡ
を大量に合成し、プラスミドベクターｐＢＲ３２２と組
換えベクターを作り、これをエシェリヒア・コリに導入
してＭＩＬ−２ｃＤＮＡクローンを持つ菌体を、以下の
ように選択した。 （４−１）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，
３０ｍＭ ＮａＣｌ，６ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，５ｍＭ ジ
チオスレイトール（ＤＴＴ），0.５ｍＭの各ｄＡＴＰ，
ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ（ｄＣＴＰは32Ｐラベル
したものを含む），0.７μｇオリゴ（ｄＴ）10，１３μ
ｇ ｍＲＮＡ及び１６ユニット ＡＭＶ逆転写酵素（J.
W. Beard)を混ぜ、４１℃に９０分間保った。次いで、
反応液よりフェノールにて蛋白を除去し、それよりエタ
ノール沈澱としてＤＮＡを回収し、得られたＤＮＡを２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５溶液
に溶解した。このＤＮＡ溶液からｍＲＮＡを除くため
に、この溶液にＮａＯＨ溶液を加えて0.３３Ｎ ＮａＯ
Ｈとし、この溶液を室温にて１５時間置いた。次に、こ
の溶液を１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）の等量
で中和し、「セファデックスＧ−５０カラム」に通し
た。これにより５μｇの一本鎖ｃＤＮＡを回収した。
【００３６】（４−２）このようにして作成した一本鎖
ｃＤＮＡからLandらの方法(Nucleic Acids Res., 9, 25
51('81))により二重鎖ｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡ混合
物を蔗糖密度勾配遠心法にて分画した。これにより、５
００塩基対以上の二重鎖ｃＤＮＡが１．５μｇ得られ
た。
ｃＤＮＡからLandらの方法(Nucleic Acids Res., 9, 25
51('81))により二重鎖ｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡ混合
物を蔗糖密度勾配遠心法にて分画した。これにより、５
００塩基対以上の二重鎖ｃＤＮＡが１．５μｇ得られ
た。
【００３７】（４−３）0.１４Ｍ カコジル酸カリウ
ム，３０ｍＭ トリス塩基，0.１ｍＭＤＴＴ，１ｍＭ
ＣｏＣｌ2 ，0.６４ｍＭ 32Ｐ−ｄＣＴＰ（比活性２．
７×１０6 ｃｐｍ／ｎｍｏｌ），１．５μｇ二重鎖ｃＤ
ＮＡおよび５ユニットのターミナルトランスフェラーゼ
（Bethesda Reserch Laboratories ）を混ぜ、３７℃で
７分間保ち、この反応液よりフェノール法にて蛋白を除
いた。これを、「セファデックスＧ−５０」カラムに通
し、溶出液よりエタノール沈澱としてＤＮＡを回収した
ところ、得られたｃＤＮＡには約５０個のｄＣＭＰがそ
の両３’末端に付加されていた。
ム，３０ｍＭ トリス塩基，0.１ｍＭＤＴＴ，１ｍＭ
ＣｏＣｌ2 ，0.６４ｍＭ 32Ｐ−ｄＣＴＰ（比活性２．
７×１０6 ｃｐｍ／ｎｍｏｌ），１．５μｇ二重鎖ｃＤ
ＮＡおよび５ユニットのターミナルトランスフェラーゼ
（Bethesda Reserch Laboratories ）を混ぜ、３７℃で
７分間保ち、この反応液よりフェノール法にて蛋白を除
いた。これを、「セファデックスＧ−５０」カラムに通
し、溶出液よりエタノール沈澱としてＤＮＡを回収した
ところ、得られたｃＤＮＡには約５０個のｄＣＭＰがそ
の両３’末端に付加されていた。
【００３８】（４−４）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５），0.１Ｍ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ，0.１０μｇのｄＧＭＰが付加されたｐＢＲ３２２を
制限酵素ＰｓｔＩで切断されたもの（ＢＲＬ）及び0.０
２μｇのｄＣＭＰが付加されたｃＤＮＡを含む水溶液
を、まず６５℃に２分間、次いで４５℃に６０分間、さ
らに３７℃に６０分間、そして室温に６０分間保持し
た。
（ｐＨ７．５），0.１Ｍ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ，0.１０μｇのｄＧＭＰが付加されたｐＢＲ３２２を
制限酵素ＰｓｔＩで切断されたもの（ＢＲＬ）及び0.０
２μｇのｄＣＭＰが付加されたｃＤＮＡを含む水溶液
を、まず６５℃に２分間、次いで４５℃に６０分間、さ
らに３７℃に６０分間、そして室温に６０分間保持し
た。
【００３９】一方、エシェリヒア・コリＨＢ１０１を５
０ｍｌのトリプトン培地（１％ トリプトン，0.５％
酵母エキス及び0.５％ ＮａＣｌを含む）に接種し、培
養液の６５０ｍμにおける吸光度がおよそ0.６〜0.７に
なるまで３１℃で振盪培養した。培養終了後、培養液を
０℃にて２０分間放置し、次に菌体を遠心分離により集
め、５０ｍＭ ＣａＣｌ2 溶液２５ｍｌに懸濁し、０℃
に１時間放置後、遠心分離により菌体を集め、５０ｍＭ
ＣａＣｌ2 、２０％グリセロール溶液５ｍｌに菌体を
再び懸濁し、得られた菌体懸濁液を0.５ｍｌずつエッペ
ンドルフチューブに入れ、−７０℃にて凍結保存した。
０ｍｌのトリプトン培地（１％ トリプトン，0.５％
酵母エキス及び0.５％ ＮａＣｌを含む）に接種し、培
養液の６５０ｍμにおける吸光度がおよそ0.６〜0.７に
なるまで３１℃で振盪培養した。培養終了後、培養液を
０℃にて２０分間放置し、次に菌体を遠心分離により集
め、５０ｍＭ ＣａＣｌ2 溶液２５ｍｌに懸濁し、０℃
に１時間放置後、遠心分離により菌体を集め、５０ｍＭ
ＣａＣｌ2 、２０％グリセロール溶液５ｍｌに菌体を
再び懸濁し、得られた菌体懸濁液を0.５ｍｌずつエッペ
ンドルフチューブに入れ、−７０℃にて凍結保存した。
【００４０】凍結された菌体の懸濁液0.１ｍｌに上記組
換えＤＮＡを入れ、０℃で２０分間置いた。更に、４２
℃で１分間保った後、２０℃に１０分間置き、これにＬ
培地（１％「バクトペプトン」、0.５％ 酵母エキス，
0.５％ ＮａＣｌ及び0.１％グルコースを含む）１ｍｌ
を加えて、３７℃で１時間振盪培養した。この培養液１
５０〜２００μｌを２５μｇ／ｍｌ ストレプトマイシ
ン及び１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むＬ培地の
１．５％寒天培地上に一面に塗抹し、３７℃にて１日間
保った。
換えＤＮＡを入れ、０℃で２０分間置いた。更に、４２
℃で１分間保った後、２０℃に１０分間置き、これにＬ
培地（１％「バクトペプトン」、0.５％ 酵母エキス，
0.５％ ＮａＣｌ及び0.１％グルコースを含む）１ｍｌ
を加えて、３７℃で１時間振盪培養した。この培養液１
５０〜２００μｌを２５μｇ／ｍｌ ストレプトマイシ
ン及び１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むＬ培地の
１．５％寒天培地上に一面に塗抹し、３７℃にて１日間
保った。
【００４１】（４−５）上記において出現したコロニー
約１５，８００につき32ＰでラベルしたヒトＩＬ−２ｃ
ＤＮＡのＨｉｎｆＩ分解物（４５０塩基対）をプローブ
としてGrunsteiu-Hogness の方法（Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A., 70, 2330(1975))によりコロニーハイブリダ
イゼーションを行ない、約９００塩基対のｃＤＮＡイン
サートを持つプラスミドｐＭＩＬ−２−１４を含有する
転換株を得た。そこで、この塩基配列をMaxam and Gilb
ert の化学法(Meth. Enzym.,65, 499,(1980)) 及びＭ１
３ファージ(J.Messing et al.,Gene, 19, 269(1982))を
使ったジデオキシヌクレオチド鎖終結法(F.Sanger, et
al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 74, 5463 (1979))
の方法により決定したところ、ヒトＩＬ−２ｃＤＮＡ及
び分泌蛋白をコードする遺伝子との比較から、５’−上
流部位にイニシエイションコドンＡＴＧ、これに続く疎
水性に富むシグナルペプチドをコードする塩基配列は見
出されなかった。即ち、このｃＤＮＡは約１２ＳのＩＬ
−２ｍＲＮＡの一部に対応するものとわかった。
約１５，８００につき32ＰでラベルしたヒトＩＬ−２ｃ
ＤＮＡのＨｉｎｆＩ分解物（４５０塩基対）をプローブ
としてGrunsteiu-Hogness の方法（Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A., 70, 2330(1975))によりコロニーハイブリダ
イゼーションを行ない、約９００塩基対のｃＤＮＡイン
サートを持つプラスミドｐＭＩＬ−２−１４を含有する
転換株を得た。そこで、この塩基配列をMaxam and Gilb
ert の化学法(Meth. Enzym.,65, 499,(1980)) 及びＭ１
３ファージ(J.Messing et al.,Gene, 19, 269(1982))を
使ったジデオキシヌクレオチド鎖終結法(F.Sanger, et
al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 74, 5463 (1979))
の方法により決定したところ、ヒトＩＬ−２ｃＤＮＡ及
び分泌蛋白をコードする遺伝子との比較から、５’−上
流部位にイニシエイションコドンＡＴＧ、これに続く疎
水性に富むシグナルペプチドをコードする塩基配列は見
出されなかった。即ち、このｃＤＮＡは約１２ＳのＩＬ
−２ｍＲＮＡの一部に対応するものとわかった。
【００４２】そこで、再び前述と同様の方法にて全ｍＲ
ＮＡを蔗糖密度勾配遠心によりサイズ分画し、５００塩
基対以上のものからｃＤＮＡを合成し、プラスミドｐＢ
Ｒ３２２に挿入した。このプラスミドを用いてＥ．Ｃｏ
ｌＨＢ１０１を形質転換させ、約１０，５００個転換株
の中からプラスミドｐＭＩＬ−２−１４と同じ配列を持
つｃＤＮＡクローンを32ＰでラベルしたｐＭＩＬ−２−
１４のインサートの制限酵素ＰｖｕII及びＡｃｃＩ（宝
酒造（株）製）分解物（５８５塩基対）をプローブとし
て、上記コロニーハイブリダイゼーション法により選別
し、約１，０００塩基対のｃＤＮＡインサートを持つプ
ラスミドｐＭＩＬ−２−４５を含有する転換株エシェリ
ヒア・コリＨＢ１０１／ＭＩＬ２−４５ ＡＪ１２１５
５（ＦＥＲＭ−Ｐ７７５８）を得た。
ＮＡを蔗糖密度勾配遠心によりサイズ分画し、５００塩
基対以上のものからｃＤＮＡを合成し、プラスミドｐＢ
Ｒ３２２に挿入した。このプラスミドを用いてＥ．Ｃｏ
ｌＨＢ１０１を形質転換させ、約１０，５００個転換株
の中からプラスミドｐＭＩＬ−２−１４と同じ配列を持
つｃＤＮＡクローンを32ＰでラベルしたｐＭＩＬ−２−
１４のインサートの制限酵素ＰｖｕII及びＡｃｃＩ（宝
酒造（株）製）分解物（５８５塩基対）をプローブとし
て、上記コロニーハイブリダイゼーション法により選別
し、約１，０００塩基対のｃＤＮＡインサートを持つプ
ラスミドｐＭＩＬ−２−４５を含有する転換株エシェリ
ヒア・コリＨＢ１０１／ＭＩＬ２−４５ ＡＪ１２１５
５（ＦＥＲＭ−Ｐ７７５８）を得た。
【００４３】得られたｃＤＮＡの塩基配列は前記Maxam
and Gilbert の化学法及びジデオキシヌクレオチド鎖終
結法に準じて調べたところ、上述の塩基配列を有するこ
とがわかった。また、このｃＤＮＡの制限酵素切断地図
を第１図に示す。
and Gilbert の化学法及びジデオキシヌクレオチド鎖終
結法に準じて調べたところ、上述の塩基配列を有するこ
とがわかった。また、このｃＤＮＡの制限酵素切断地図
を第１図に示す。
【００４４】一方、ｐＢＲ３２８プラスミドベクターに
ｐＫＣＲベクター（Proc. Natl. Aca. Sci. U.S.A., 7
8, 1527, ('81))のＳＶ４０ウィルスの初期遺伝子のプ
ロモーターを含む領域を組み込んだｐＣＥ−１ベクター
を造成した（欧州特許出願公開Ｎｏ．９１５３９号参
照）。そして、プラスミドｐＭＩＬ２−４５クローンよ
り制限酵素ＰｓｔＩでｃＤＮＡを切り出し、ｐＣＥ−１
ベクターのＰｓｔＩサイトに挿入した（プラスミドｐＣ
ＥＭＩＬ−２−４５）。
ｐＫＣＲベクター（Proc. Natl. Aca. Sci. U.S.A., 7
8, 1527, ('81))のＳＶ４０ウィルスの初期遺伝子のプ
ロモーターを含む領域を組み込んだｐＣＥ−１ベクター
を造成した（欧州特許出願公開Ｎｏ．９１５３９号参
照）。そして、プラスミドｐＭＩＬ２−４５クローンよ
り制限酵素ＰｓｔＩでｃＤＮＡを切り出し、ｐＣＥ−１
ベクターのＰｓｔＩサイトに挿入した（プラスミドｐＣ
ＥＭＩＬ−２−４５）。
【００４５】このベクターをサル培養細胞のＣＯＳ−７
細胞（Gluzman, Y. Cell,23, 175(1981)) に感染せしめ
た (McCutchan et al J, Natl. Cancer Inst.,41, 351
(1968))。すなわち、ＣＯＳ−７細胞６×１０4 個／ｍ
ｌを５％のＦＢＳを含むＤＭＥＭに懸濁し、この0.５ｍ
ｌを２４穴のヌンク培養プレートにまき、３７℃で４時
間培養したのち、0.１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５ １７．６μｌ、２Ｍ Ｃ
ａＣｌ2 液 ２．４μｌ及び２倍濃縮ハンクス・バラン
スド生理食塩水（２×ＨＢＳ）（５０ｍＭ ピペス，２
８０ｍＭ ＮａＣｌ，１．５ｍＭ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１
２Ｈ2 Ｏを含む。ｐＨ７．１２）２０μｌの混合液（４
０μｌ）に上記プラスミドｐＣＥＭＩＬ−２−４５ １
μｇを溶解したものを添加した。この混合液を３７℃に
４時間静置し、得られた培養液より水を吸引除去して得
た細胞をＰＢＳ１ｍｌで洗浄し、更に２０％のグリセロ
ールを含むＰＢＳ0.5 ｍｌをプレートに添加し、このプ
レートを3 分間室温に放置したのち、水を吸引除去し
た。細胞を更に１ｍｌのＰＢＳで洗浄し、５％のＦＢＳ
を含むＤＭＥＭ１ｍｌ中にて３７℃で培養を続け、２４
時間目に培地を吸引除去したのち、２〜１０％のＦＢＳ
を含むＤＭＥＭ0.５ｍｌを加え、２日間培養した。
細胞（Gluzman, Y. Cell,23, 175(1981)) に感染せしめ
た (McCutchan et al J, Natl. Cancer Inst.,41, 351
(1968))。すなわち、ＣＯＳ−７細胞６×１０4 個／ｍ
ｌを５％のＦＢＳを含むＤＭＥＭに懸濁し、この0.５ｍ
ｌを２４穴のヌンク培養プレートにまき、３７℃で４時
間培養したのち、0.１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５ １７．６μｌ、２Ｍ Ｃ
ａＣｌ2 液 ２．４μｌ及び２倍濃縮ハンクス・バラン
スド生理食塩水（２×ＨＢＳ）（５０ｍＭ ピペス，２
８０ｍＭ ＮａＣｌ，１．５ｍＭ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１
２Ｈ2 Ｏを含む。ｐＨ７．１２）２０μｌの混合液（４
０μｌ）に上記プラスミドｐＣＥＭＩＬ−２−４５ １
μｇを溶解したものを添加した。この混合液を３７℃に
４時間静置し、得られた培養液より水を吸引除去して得
た細胞をＰＢＳ１ｍｌで洗浄し、更に２０％のグリセロ
ールを含むＰＢＳ0.5 ｍｌをプレートに添加し、このプ
レートを3 分間室温に放置したのち、水を吸引除去し
た。細胞を更に１ｍｌのＰＢＳで洗浄し、５％のＦＢＳ
を含むＤＭＥＭ１ｍｌ中にて３７℃で培養を続け、２４
時間目に培地を吸引除去したのち、２〜１０％のＦＢＳ
を含むＤＭＥＭ0.５ｍｌを加え、２日間培養した。
【００４６】このようにして得られた培養上清中のＩＬ
−２活性を Gillis らの方法(J.Immunol.,120, 2027('7
8)) に従い測定した。対照としてベクタープラスミドｐ
ＣＥ−１を用いて同様の方法で実験を行ない、ＩＬ−２
活性を調べた。第１表に示す結果から、ｃＤＮＡインサ
ートは、マウスインターロイキン−２をコードする遺伝
子を含むＤＮＡ断片であることが照明された。ｐＣＥＭ
ＩＬ２−４５（ＡＪ １２１５６）を有するエシェリヒ
ア・コリＨＢ１０１は、ＦＥＲＭ−Ｐ７７５９として寄
託されている。
−２活性を Gillis らの方法(J.Immunol.,120, 2027('7
8)) に従い測定した。対照としてベクタープラスミドｐ
ＣＥ−１を用いて同様の方法で実験を行ない、ＩＬ−２
活性を調べた。第１表に示す結果から、ｃＤＮＡインサ
ートは、マウスインターロイキン−２をコードする遺伝
子を含むＤＮＡ断片であることが照明された。ｐＣＥＭ
ＩＬ２−４５（ＡＪ １２１５６）を有するエシェリヒ
ア・コリＨＢ１０１は、ＦＥＲＭ−Ｐ７７５９として寄
託されている。
【００４７】
【表１】
【００４８】実施例２ （１）ＭＩＬ−２遺伝子を発現させるために使用した組
換えベクターを以下のように構築した（第３図）。以下
に示すフラグメントの合成は固相改良トリエステル法に
よって行なった。第２図に示すように、Ｐ−１およびＰ
−１２以外は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼとＡＴＰ
を用いて５’−末端をリン酸化しておいた。次に、Ｐ−
１，Ｐ−２，Ｐ−３，Ｐ−４，Ｐ−５を混合し、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを用い二本鎖ＤＮＡとし、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行ない、精製した。同様にＰ−
６，Ｐ−７，Ｐ−８，Ｐ−９，Ｐ−１０，Ｐ−１１，Ｐ
−１２より二本鎖ＤＮＡを形成させた。更に、両者をＴ
４ ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、Ｐ−１〜Ｐ−１
２が、第２図に示すように、正しく配列した二本鎖合成
ＤＮＡ（Ａ）を単離した。
換えベクターを以下のように構築した（第３図）。以下
に示すフラグメントの合成は固相改良トリエステル法に
よって行なった。第２図に示すように、Ｐ−１およびＰ
−１２以外は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼとＡＴＰ
を用いて５’−末端をリン酸化しておいた。次に、Ｐ−
１，Ｐ−２，Ｐ−３，Ｐ−４，Ｐ−５を混合し、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを用い二本鎖ＤＮＡとし、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行ない、精製した。同様にＰ−
６，Ｐ−７，Ｐ−８，Ｐ−９，Ｐ−１０，Ｐ−１１，Ｐ
−１２より二本鎖ＤＮＡを形成させた。更に、両者をＴ
４ ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、Ｐ−１〜Ｐ−１
２が、第２図に示すように、正しく配列した二本鎖合成
ＤＮＡ（Ａ）を単離した。
【００４９】一方、ｐＢＲ３２２を制限酵素ＥｃｏＲＩ
及びＢａｍＨＩで切断し大きなＤＮＡ断片（４．０Ｋ
ｂ）を分離した。次に、得られたｐＢＲ３２２断片と合
成ＤＮＡ（Ａ）（第２図）及び合成ＤＮＡ（Ｂ）（配列
表の配列番号４記載）の三種のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ
４ ＤＮＡリガーゼを使って結合させた。得られた組換
えベクターを、エシェリヒア・コリＨＢ１０１株へ導入
し、アンピシリン抵抗性を有する株を選択した。分離し
た株から、プラスミドＤＮＡを得て制限酵素による切断
試験を行なうことにより、ｐＡＪ−２を保持する菌を選
択した。
及びＢａｍＨＩで切断し大きなＤＮＡ断片（４．０Ｋ
ｂ）を分離した。次に、得られたｐＢＲ３２２断片と合
成ＤＮＡ（Ａ）（第２図）及び合成ＤＮＡ（Ｂ）（配列
表の配列番号４記載）の三種のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ
４ ＤＮＡリガーゼを使って結合させた。得られた組換
えベクターを、エシェリヒア・コリＨＢ１０１株へ導入
し、アンピシリン抵抗性を有する株を選択した。分離し
た株から、プラスミドＤＮＡを得て制限酵素による切断
試験を行なうことにより、ｐＡＪ−２を保持する菌を選
択した。
【００５０】５０μｇのｐＡＪ−２を、制限酵素Ｂｇｔ
II及びＸｈｏＩで切断し、−３５領域を有する断片を常
法に従って、アガロースゲル電気泳動により単離精製
し、２μｇを得た。次に、この断片0.５μｇ及び配列表
の配列番号５および６に記載の合成オリゴヌクレオチド
（Ｃ）各々２０ｐｍｏｌ（これは、Ｐｒｉｂｎｏｗ ｂ
ｏｘ配列及びｌａｃオペレーター配列を含む。）は、両
方とも５’−末端でリン酸化されているが、これ等を
６．６ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ＡＴＰ及び１０ｍＭ
ＤＴＴを含む６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）中で、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ0.８単位と共に混合
し、混合物を４℃で一昼夜反応させ、ｐＡＪ２０を得
た。なお、第２図におけるＰ−１〜Ｐ−１２はそれぞれ
配列表の配列番号７，８，９，１０，１１，１２，１
３，１４，１５，１６，１７，１８で表される。
II及びＸｈｏＩで切断し、−３５領域を有する断片を常
法に従って、アガロースゲル電気泳動により単離精製
し、２μｇを得た。次に、この断片0.５μｇ及び配列表
の配列番号５および６に記載の合成オリゴヌクレオチド
（Ｃ）各々２０ｐｍｏｌ（これは、Ｐｒｉｂｎｏｗ ｂ
ｏｘ配列及びｌａｃオペレーター配列を含む。）は、両
方とも５’−末端でリン酸化されているが、これ等を
６．６ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ＡＴＰ及び１０ｍＭ
ＤＴＴを含む６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）中で、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ0.８単位と共に混合
し、混合物を４℃で一昼夜反応させ、ｐＡＪ２０を得
た。なお、第２図におけるＰ−１〜Ｐ−１２はそれぞれ
配列表の配列番号７，８，９，１０，１１，１２，１
３，１４，１５，１６，１７，１８で表される。
【００５１】（２）得られたプラスミドｐＡＪ２０を用
いてＭＩＬ−２を発現する組換えベクターを以下のよう
に構築した（第４図）。プラスミドｐＡＪ２０（１０μ
ｇ）を制限酵素ＸｈｏＩ及びＰｖｕIIで切断し、アガロ
ースゲル電気泳動により大きい法の断片を単離精製し、
ＤＮＡ３μｇを得た。他方、実施例１に示した方法によ
り得られたｐＭＩＬ２−４５のＰｓｔＩ切断により得ら
れるｃＤＮＡインサート９μｇが制限酵素ＨｈａＩで切
断され、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理され、最も大きい
断片５μｇがアガロースゲル電気泳動により単離精製さ
れた。
いてＭＩＬ−２を発現する組換えベクターを以下のよう
に構築した（第４図）。プラスミドｐＡＪ２０（１０μ
ｇ）を制限酵素ＸｈｏＩ及びＰｖｕIIで切断し、アガロ
ースゲル電気泳動により大きい法の断片を単離精製し、
ＤＮＡ３μｇを得た。他方、実施例１に示した方法によ
り得られたｐＭＩＬ２−４５のＰｓｔＩ切断により得ら
れるｃＤＮＡインサート９μｇが制限酵素ＨｈａＩで切
断され、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理され、最も大きい
断片５μｇがアガロースゲル電気泳動により単離精製さ
れた。
【００５２】次に、誘導型合成プロモーター（上記）を
含む断片0.４５μｇ、ＩＬ−２ｃＤＮＡを含む上記Ｈｈ
ａＩ断片0.５μｇ及び以下に示す合成ＤＮＡ（Ｄ）（配
列表の配列番号１９および２０参照）各々２０ｐｍｏｌ
は、両方とも５’−末端でリン酸化されているが、これ
等を６．６ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ＡＴＰ及び１ｍ
Ｍ ＤＴＴを含むｐＨ７．５の６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ中で、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ0.８単位と共に混合
し、混合物を４℃に一夜保った。
含む断片0.４５μｇ、ＩＬ−２ｃＤＮＡを含む上記Ｈｈ
ａＩ断片0.５μｇ及び以下に示す合成ＤＮＡ（Ｄ）（配
列表の配列番号１９および２０参照）各々２０ｐｍｏｌ
は、両方とも５’−末端でリン酸化されているが、これ
等を６．６ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ＡＴＰ及び１ｍ
Ｍ ＤＴＴを含むｐＨ７．５の６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ中で、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ0.８単位と共に混合
し、混合物を４℃に一夜保った。
【００５３】得られたプラスミドを、常法に従い、エシ
ェリヒア・コリＨＢ１０１株へ導入し、アンピシリンを
含むＬ培地寒天プレート上にコロニーを形成した株を分
離した。得られた株より、コロニーハイブリダイゼーシ
ョン法によりＨｈａＩ断片とハイブリダイズする組換え
ベクターを有する株を選択した。こうして選択したコロ
ニーをＬ培地を用いて再び培養（１０ｍｌ）し、得られ
た細胞をリゾチーム処理及び凍結、融解処理して、プラ
スミドＤＮＡを得た。このプラスミドＤＮＡを、Ｂｇｌ
Ｉで切断し、それによる生成物をアガロースゲル電気泳
動にかけ、ｃＤＮＡが誘導型プロモーターＡＴＧ配列の
後に正しい方向で連結しているｐＡＪＭＩＬ２−２１を
得た。
ェリヒア・コリＨＢ１０１株へ導入し、アンピシリンを
含むＬ培地寒天プレート上にコロニーを形成した株を分
離した。得られた株より、コロニーハイブリダイゼーシ
ョン法によりＨｈａＩ断片とハイブリダイズする組換え
ベクターを有する株を選択した。こうして選択したコロ
ニーをＬ培地を用いて再び培養（１０ｍｌ）し、得られ
た細胞をリゾチーム処理及び凍結、融解処理して、プラ
スミドＤＮＡを得た。このプラスミドＤＮＡを、Ｂｇｌ
Ｉで切断し、それによる生成物をアガロースゲル電気泳
動にかけ、ｃＤＮＡが誘導型プロモーターＡＴＧ配列の
後に正しい方向で連結しているｐＡＪＭＩＬ２−２１を
得た。
【００５４】参考例 ｐＡＪＭＩＬ２−２１を含むエシェリヒア・コリＨＢ１
０１を微生物の増殖のために知られている通常の方法で
培養した。細胞は、２５μｇ／ｍｌ ストレプトマイシ
ン及び２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むχ培地
（２．５％「バクトトリプトン」、１％酵母エキス、0.
１％グルコース、２０ｍＭ ＭｇＳＯ4 、５０ｍＭ ト
リス塩酸緩衝液、ｐＨ７．５）１０ｍｌ中で３７℃一夜
生育させた。次いで、培養懸濁液１ｍｌを同じχ培地
（１００ｍｌ）へ接種し、３７℃で培養した。培養液の
６５０ｎｍにおける吸光度がおよそ0.５に達した時点
で、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノサイド
（ＩＰＴＧ）１ｍＭを培地に加えた。ＩＰＴＧの添加後
１時間後に細胞を集め、得られた細胞を２０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５、３０ｍＭ ＮａＣｌ
を含む）で洗浄し、同じ緩衝液８ｍｌに再び懸濁した。
０１を微生物の増殖のために知られている通常の方法で
培養した。細胞は、２５μｇ／ｍｌ ストレプトマイシ
ン及び２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むχ培地
（２．５％「バクトトリプトン」、１％酵母エキス、0.
１％グルコース、２０ｍＭ ＭｇＳＯ4 、５０ｍＭ ト
リス塩酸緩衝液、ｐＨ７．５）１０ｍｌ中で３７℃一夜
生育させた。次いで、培養懸濁液１ｍｌを同じχ培地
（１００ｍｌ）へ接種し、３７℃で培養した。培養液の
６５０ｎｍにおける吸光度がおよそ0.５に達した時点
で、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノサイド
（ＩＰＴＧ）１ｍＭを培地に加えた。ＩＰＴＧの添加後
１時間後に細胞を集め、得られた細胞を２０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５、３０ｍＭ ＮａＣｌ
を含む）で洗浄し、同じ緩衝液８ｍｌに再び懸濁した。
【００５５】かくして細菌細胞中に産生された蛋白質を
ソニック処理（０℃、３０秒）及びリゾチーム（８μ
ｇ）消化（０℃、２０分間）に引き続き、凍結融解を３
回行なうことにより抽出した。このようにして得られた
抽出液のＩＬ−２活性を Gillis らの方法(J.Immunol.,
120, 2027('78)) に従い測定した。対照としてベクター
プラスミドｐＡＪ２０を用いて同様の方法で実験を行な
い、ＩＬ−２活性を調べた（第２表）。ｐＡＪＭＩＬ２
−２１を有するエシェリヒア・コリＨＢ１０１（ＡＪ
１２１６２）は、ＦＥＲＭ Ｐ−７８２１として寄託さ
れている。
ソニック処理（０℃、３０秒）及びリゾチーム（８μ
ｇ）消化（０℃、２０分間）に引き続き、凍結融解を３
回行なうことにより抽出した。このようにして得られた
抽出液のＩＬ−２活性を Gillis らの方法(J.Immunol.,
120, 2027('78)) に従い測定した。対照としてベクター
プラスミドｐＡＪ２０を用いて同様の方法で実験を行な
い、ＩＬ−２活性を調べた（第２表）。ｐＡＪＭＩＬ２
−２１を有するエシェリヒア・コリＨＢ１０１（ＡＪ
１２１６２）は、ＦＥＲＭ Ｐ−７８２１として寄託さ
れている。
【００５６】
【表２】
【００５７】上記の参考例で用いられた宿主、エシェリ
ヒア・コリＨＢ１０１（Boyer, H.W. et al., Mol.Bio
l.,41, 459(1969))は容易に入手可能である。更につけ
加えれば、ｐＭＩＬ２−４５中の組換えＤＮＡを遊離さ
せるためにＬ培地で３７℃でｐＭＩＬ２−４５を培養
し、テトラサイクリン及びアンピシリンに感受性となっ
た菌株を分離すれば、寄託されているｐＭＩＬ２−４５
から容易にＨＢ１０１は得られる。プラスミドベクター
ｐＢＲ３２２（例えば、ベセスダリサーチラボラトリー
から購入可能）、ｐＣＥ−１は既に知られていて容易に
入手可能である。
ヒア・コリＨＢ１０１（Boyer, H.W. et al., Mol.Bio
l.,41, 459(1969))は容易に入手可能である。更につけ
加えれば、ｐＭＩＬ２−４５中の組換えＤＮＡを遊離さ
せるためにＬ培地で３７℃でｐＭＩＬ２−４５を培養
し、テトラサイクリン及びアンピシリンに感受性となっ
た菌株を分離すれば、寄託されているｐＭＩＬ２−４５
から容易にＨＢ１０１は得られる。プラスミドベクター
ｐＢＲ３２２（例えば、ベセスダリサーチラボラトリー
から購入可能）、ｐＣＥ−１は既に知られていて容易に
入手可能である。
【００５８】
【発明の効果】本発明により、マウスインターロイキン
２活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む
ＤＮＡ断片を単離することに成功し、微生物によるマウ
スインターロイキン２活性を有するポリペプチド生産の
道をひらいた。
２活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む
ＤＮＡ断片を単離することに成功し、微生物によるマウ
スインターロイキン２活性を有するポリペプチド生産の
道をひらいた。
【００５９】
【００６０】配列番号：1 配列の長さ： 148 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリペプチド 起源 生物名：マウス 株名：リンホーマＬＢＲＭ−３３ 配列 Pro Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Thr Ala Glu Ala Gln Gln Gln 5 10 15 Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Leu Glu Gln Leu Leu Met 20 25 30 Asp Leu Gln Glu Leu Leu Ser Arg Met Glu Asn Tyr Arg Asn Leu Lys 35 40 45 Leu Pro Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Leu Pro Lys Gln Ala Thr 50 55 60 Glu Leu Lys Asp Leu Gln Cys Leu Glu Asp Glu Leu Gly Pro Leu Arg 65 70 75 80 His Val Leu Asp Leu Thr Gln Ser Lys Ser Phe Gln Leu Glu Asp Ala 85 90 95 Glu Asn Phe Ile Ser Asn Ile Arg Val Thr Val Val Lys Leu Lys Gly 100 105 110 Ser Asp Asn Thr Phe Glu Cys Gln Phe Asp Asp Glu Ser Ala Thr Val 115 120 125 Val Asp Phe Leu Arg Arg Trp Ile Ala Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser 130 135 140 Thr Ser Pro Gln 145
【００６１】配列番号：２ 配列の長さ： 444 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：マウス 株名：リンホーマＬＢＲＭ−３３ 配列 CCC ACT TCA AGC TCC ACT TCA AGC TCT ACA GCG GAA GCA CAG CAG CAG 48 CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAC CTG GAG CAG CTG TTG ATG 96 GAC CTA CAG GAG CTC CTG AGC AGG ATG GAG AAT TAC AGG AAC CTG AAA 144 CTC CCC AGG ATG CTC ACC TTC AAA TTT TAC TTG CCC AAG CAG GCC ACA 192 GAA TTG AAA GAT CTT CAG TGC CTA GAA GAT GAA CTT GGA CCT CTG CGG 240 CAT GTT CTG GAT TTG ACT CAA AGC AAA AGC TTT CAA TTG GAA GAT GCT 288 GAG AAT TTC ATC AGC AAT ATC AGA GTA ACT GTT GTA AAA CTA AAG GGC 336 TCT GAC AAC ACA TTT GAG TGC CAA TTC GAT GAT GAG TCA GCA ACT GTG 384 GTG GAC TTT CTG AGG AGA TGG ATA GCC TTC TGT CAA AGC ATC ATC TCA 432 ACA AGC CCT CAA 444
【００６２】配列番号：３ 配列の長さ：1039 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：マウス 株名：リンホーマＬＢＲＭ−３３ 配列の特徴： 特徴を表す記号： CDS 存在位置： 48..554 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号： sig peptide 存在位置： 48..111 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号： mat peptide 存在位置： 112..554 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ATCACCCTTG CTAATCACTC CTCACAGTGA CCTCAAGTCC TGCAGGC ATG TAC AGC 56 Met Tyr Ser 1 ATG CAG CTC GCA TCC TGT GTC ACA TTG ACA CTT GTG CTC CTT GTC AAC 104 Met Gln Leu Ala Ser Cys Val Thr Leu Thr Leu Val Leu Leu Val Asn 5 10 15 AGC GCA CCC ACT TCA AGC TCC ACT TCA AGC TCT ACA GCG GAA GCA CAG 152 Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Thr Ala Glu Ala Gln 20 25 30 35 CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAC CTG GAG CAG CTG 200 Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Leu Glu Gln Leu 40 45 50 TTG ATG GAC CTA CAG GAG CTC CTG AGC AGG ATG GAG AAT TAC AGG AAC 248 Leu Met Asp Leu Gln Glu Leu Leu Ser Arg Met Glu Asn Tyr Arg Asn 55 60 65 CTG AAA CTC CCC AGG ATG CTC ACC TTC AAA TTT TAC TTG CCC AAG CAG 296 Leu Lys Leu Pro Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Leu Pro Lys Gln 70 75 80 GCC ACA GAA TTG AAA GAT CTT CAG TGC CTA GAA GAT GAA CTT GGA CCT 344 Ala Thr Glu Leu Lys Asp Leu Gln Cys Leu Glu Asp Glu Leu Gly Pro 85 90 95 CTG CGG CAT GTT CTG GAT TTG ACT CAA AGC AAA AGC TTT CAA TTG GAA 392 Leu Arg His Val Leu Asp Leu Thr Gln Ser Lys Ser Phe Gln Leu Glu 100 105 110 115 GAT GCT GAG AAT TTC ATC AGC AAT ATC AGA GTA ACT GTT GTA AAA CTA 440 Asp Ala Glu Asn Phe Ile Ser Asn Ile Arg Val Thr Val Val Lys Leu 120 125 130 AAG GGC TCT GAC AAC ACA TTT GAG TGC CAA TTC GAT GAT GAG TCA GCA 488 Lys Gly Ser Asp Asn Thr Phe Glu Cys Gln Phe Asp Asp Glu Ser Ala 135 140 145 ACT GTG GTG GAC TTT CTG AGG AGA TGG ATA GCC TTC TGT CAA AGC ATC 536 Thr Val Val Asp Phe Leu Arg Arg Trp Ile Ala Phe Cys Gln Ser Ile 150 155 160 ATC TCA ACA AGC CCT CAA TAACTATGTA CCTCCTGCTT ACAACACATA 584 Ile Ser Thr Ser Pro Gln 165 AGGCTCTCTA TTTATTTAAA TATTTAACTT TAATTTATTT TTGGATGTAT TGTTTACTAT 744 CTTTTGTAAC TACTAGTCTT CAGATGATAA ATATGGATCT TTAAAGATTC TTTTTGTAAG 804 CCCCAAGGGC TCAAAAATGT TTTAAACTAT TTATCTGAAA TTATTTATTA TATTGAATTG 864 TTAAATATCA TGTGTAGGTA GACTCATTAA TAAAAGTATT TAGATGATTC AAATATAAAT 924 AAGCTCAGAT GTCTGTCATT TTTAGGACAG CACAAAGTAA GCGCTAAAAT AACTTCTCAG 984 TTATTCCTGT GAACTCTATG TTAATCAGTG TTTTCAAGAA ATAAAGCTCT CCTCT-polyA 1039
【００６３】配列番号：４ 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成オリゴヌクレオチド 配列 AATTCTTGCGG GAACGCCAATG 22
【００６４】配列番号：５ 配列の長さ：49 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成オリゴヌクレオチド 配列 GATCTATAAA TTTGTTATAA TGTGTGGAAT TGTGAGCGGA TAACAATTC 49
【００６５】配列番号：６ 配列の長さ：49 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成オリゴヌクレオチド 配列 ATATTTAAAC AATATTACAC ACCTTAACAC TCGCCTATTG TTAAGAGCT 49
【００６６】配列番号：７ 配列の長さ：15 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成オリゴヌクレオチド 配列 GTTACCTGCCGTGAG 15
【００６７】配列番号：８ 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成オリゴヌクレオチド 配列 TAAGTTACTCACGGCAG 17
【００６８】配列番号：９ 配列の長さ：15 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成オリゴヌクレオチド 配列 TAACTTAATTTTTGT 15
【００６９】配列番号：１０ 配列の長さ：16 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成オリゴヌクレオチド 配列 CTATGTCAACAAAAAT 16
【００７０】配列番号：１１ 配列の長さ：15 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成オリゴヌクレオチド 配列 TGACATAGATCTCTA 15
【００７１】配列番号：１２ 配列の長さ：15 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成オリゴヌクレオチド 配列 AACAAATTTAGAGAT 15
【００７２】配列番号：１３ 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成オリゴヌクレオチド 配列 AATTTGTTATAATATAG 17
【００７３】配列番号：１４ 配列の長さ：16 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成オリゴヌクレオチド 配列 GAGATGCCTATATTAT 14
【００７４】配列番号：１５ 配列の長さ：16 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成オリゴヌクレオチド 配列 GCATCTCGAGTAGGAG 16
【００７５】配列番号：１６ 配列の長さ：15 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成オリゴヌクレオチド 配列 TGTTACCTCCTACTC 15
【００７６】配列番号：１７ 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成オリゴヌクレオチド 配列 GTAACAATTTGACCATG 17
【００７７】配列番号：１８ 配列の長さ：15 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成オリゴヌクレオチド 配列 GATCCATGGTCAAAT 18
【００７８】配列番号：１９ 配列の長さ：45 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成オリゴヌクレオチド 配列 AACTAGTACG CAAGTTCACG TAAAAAGGGT ATCGACAGCT GATGG 45
【００７９】配列番号：２０ 配列の長さ：45 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成オリゴヌクレオチド 配列 TTGATCATGC GTTCAAGTGC ATTTTTCCCA TAGCTGTCGA CTACC 45
【図１】 マウスインターロイキン−２をコードする遺
伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵素切断地図である。
伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵素切断地図である。
【図２】 プラスミドベクターｐＡＪ−２の造成経過の
説明図である。
説明図である。
【図３】 プラスミドベクターｐＡＪ２０の造成経過の
説明図である。
説明図である。
【図４】 ｐＡＪＭＩＬ２−２１の造成経過の説明図で
ある。
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｋ 9282−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 35/12 7431−4Ｃ 35/74 Ｇ 7431−4Ｃ 38/00 Ｃ０７Ｋ 14/55 8318−4Ｈ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 菅野 晴夫 東京都杉並区南荻窪４−８−13
Claims (6)
- 【請求項１】 マウスインターロイキン−２活性を持
ち、配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含
むポリペプチドをコードするＤＮＡ断片。 - 【請求項２】 ＤＮＡ断片の塩基配列が、配列表の配列
番号２に記載される塩基配列を含むものである請求項１
記載のＤＮＡ断片。 - 【請求項３】 マウスインターロイキン−２活性を持
ち、配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含
むポリペプチドをコードするＤＮＡ断片が挿入された原
核生物あるいは真核生物細胞を形質転換するための組換
えベクター。 - 【請求項４】 挿入されるＤＮＡ断片の塩基配列が、配
列表の配列番号２に記載される塩基配列を含むものであ
る請求項３記載の原核生物あるいは真核生物細胞を形質
転換するための組換えベクター。 - 【請求項５】 マウスインターロイキン−２活性を持
ち、配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含
むポリペプチドをコードするＤＮＡ断片が挿入された原
核生物あるいは真核生物細胞を形質転換するための組換
えベクターを保持する形質転換体。 - 【請求項６】 原核生物あるいは真核生物細胞を形質転
換するための組換えベクターに挿入されるＤＮＡ断片の
塩基配列が、配列表の配列番号２に記載される塩基配列
を含むものである請求項５記載の形質転換体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7180603A JP2579603B2 (ja) | 1995-06-26 | 1995-06-26 | マウスインターロイキン−２をコードする遺伝子を含むｄｎａ断片，該ｄｎａ断片を有する組換えベクターおよび該ベクターを保持する形質転換体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7180603A JP2579603B2 (ja) | 1995-06-26 | 1995-06-26 | マウスインターロイキン−２をコードする遺伝子を含むｄｎａ断片，該ｄｎａ断片を有する組換えベクターおよび該ベクターを保持する形質転換体 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59181594A Division JP2587609B2 (ja) | 1984-08-30 | 1984-08-30 | マウスインターロイキン―２活性を有するポリペプチド及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08272A true JPH08272A (ja) | 1996-01-09 |
| JP2579603B2 JP2579603B2 (ja) | 1997-02-05 |
Family
ID=16086146
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7180603A Expired - Lifetime JP2579603B2 (ja) | 1995-06-26 | 1995-06-26 | マウスインターロイキン−２をコードする遺伝子を含むｄｎａ断片，該ｄｎａ断片を有する組換えベクターおよび該ベクターを保持する形質転換体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2579603B2 (ja) |
-
1995
- 1995-06-26 JP JP7180603A patent/JP2579603B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2579603B2 (ja) | 1997-02-05 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |