JPH08277224A - 抗炎症剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 副作用を殆ど示さず、優れた抗炎症作用を有
する新規な製剤の提供。 【解決手段】 硫酸化酸性ムコ多糖類もしくは硫酸化デ
キストランまたはその生理学的に許容される塩を有効成
分と含んでなる抗炎症剤。このような抗炎症剤はコブラ
毒のラット静脈内投与による好中球依存性および酸素ラ
ジカル介在性で、かつＰ−セレクチン依存性の炎症モデ
ル動物をスクリーニングに使用することによって見い出
された。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規な作用機序を有する
抗炎症剤に関する。より具体的には、新規な作用機序に
基づいてスクリーニングされた硫酸化酸性ムコ多糖類ま
たは硫酸化デキストランの抗炎症剤としての用途に関す
る。

【０００２】

【発明の背景】現在、炎症反応を抑制または遮断し、炎
症による合併症を防ぐ目的でコルチコイドまたは各種の
非ステロイド系抗炎症剤が臨床上広く使用されている。
しかし、コルチコイドは強い抗炎症作用を示すものの感
染症の誘発等の重篤な副作用を伴うので連続投与ができ
ず、また非ステロイド系抗炎症剤は一般的に効力が弱
い。そのため、副作用を殆ど示さず、十分な効能を有す
る抗炎症剤の開発が必要であることに変わりはない。

【０００３】ところで、上記のような抗炎症剤が開発さ
れるに至ったスクリーニング系は、一般的に、抗プロス
タグランジン作用（例えば、フォスフォライペースＡ₂
阻害、サイクロオキシジェネース阻害、リポキシジェネ
ース阻害）を指標としたものである。これに対し、本発
明では、近年明らかになりつつある炎症の誘発に関する
知見を基に構成したスクリーニング系（すなわち、好中
球の浸潤阻害、より具体的には、血管内皮細胞への接着
のセレクチン介在性阻害を指標にしたスクリーニング
系）を利用すれば、まったく新たなタイプの抗炎症剤を
開発できる可能性があるとの観点に立ち、前記課題を解
決しようとするものである。

【０００４】ここで、本発明で用いるスクリーニング系
の意義を明らかにする目的でその背景となる知見を概観
しておく。例えば、炎症の誘発は白血球と血管内皮細胞
間の接着相互作用を促進する分子に起因するものと考え
られており、一定の接着分子が上記接着作用を促進する
上で重要な役割を演じていることも明らかになってき
た。また、白血球と活性化血管内皮細胞（炎症部位の血
管）に接着分子が存在し、それらの接着分子の相互作用
が炎症局所への白血球の浸潤に関する最初の必須段階で
あることも判明している。なお、これらの接着分子は白
血球および血管内皮細胞の双方で発現される分子であ
り、セレクチンフアミリーおよびインテグリンフアミリ
ーが最も重要である。

【０００５】他方、上記相互作用を制御する目的で、モ
ノクローナル抗体（Ｅur．Ｊ．Ｉmmunol．２３，２１８
１−２１８８，１９９３）、ペプチド類を始め、その他
一定のオリゴ糖の使用も報告されている（Ｊ．Ｃell
Ｂiol.，９９，１５３５，１９８４；Ｊ．Ｃell Ｂio
l.，１０４，７１３，１９８７；Ｂlood.，７０，１８
４２，１９８７）。さらに、上記セレクチンの作用を介
してリンパ節内の内皮細胞に白血球が接着するがこの反
応は一定の硫酸基含有化合物によって阻害されることが
明らかにされている（Ｊ．Ｃell Ｂiol.，１１１，１
２２５，１９９０）。またさらに、各種実験動物モデル
において、前記接着相互作用を阻害することにより炎症
反応を抑制できることも報告されている（Ｊ．Ｉmmuno
l.，１５０，２４０７，；Ｊ．Ｉmmunol．１５０，１０
７４，他）しかし、上記のようなモノクローナル抗体、
ペプチド類、オリゴ糖および硫酸基含有化合物が現実に
抗炎症剤として使用できるか否かについては明らかにさ
れていない。

【０００６】

【発明の構成】本発明者らは、最近、Ｍ．Ｓ．Ｍulliga
nら、Ｎature，３６４，１４９−１５１，１９９３によ
り提案されたコブラ毒（Ｃobra venon factor，以下
「ＣＶＦ」と略記する場合もある）のラット静脈内投与
による好中球依存性および酸素ラジカル介在性で、かつ
Ｐ−、Ｌ−またはＥ−セレクチン依存性の炎症モデル
が、抗炎症剤の優れたスクリーニング手段であることを
見い出した。より具体的には、上記実験動物モデルを使
用してスクリーニングした硫酸化ヒアルロン酸等の特定
の多糖類が優れた抗炎症作用を示し、殊に成人性呼吸切
迫症候群（adult respiratory distress syndrome：
ＡＲＤＳ）の予防または治療に使用できることを見い出
した。前記症候群は発病者の５０〜７０％が死亡する重
篤な疾病である（医学のあゆみ、１６８（ｎｏ．６），
６２６−６３１）。また、上記実験動物モデルを用いて
スクリーニングされる物質は、セレクチンが介在する好
中球の血管内皮接着組織浸潤を抑制するので、ＡＲＤＳ
のみならず広く炎症一般に効能を示し、さらには虚血性
心疾患、虚血性脳疾患、慢性関節リューマチ、アトピー
性皮膚炎、臓器移植後の浸潤に対しても効能を示しうる
ことも理解できるであろう。

【０００７】従って、本発明によれば、硫酸化酸性ムコ
多糖類もしくは硫酸化デキストランまたは生理学的に許
容される塩を有効成分として含んでなる抗炎症剤が提供
される。

【０００８】なお、硫酸化ヒアルロン酸を始めようとす
る各種糖類の硫酸化物はヒト免疫不全ウイルス性疾患の
処置に使用しうることが示唆されている（特公平２−７
５７７号公報）が、それらの糖類が抗炎症剤として使用
できることについては従来技術文献に未載である。

【０００９】

【具体的な態様】硫酸化酸性ムコ多糖類とは、ヘキソサ
ミン（多くの場合Ｎ-アセチル化されたグルコサミンま
たはガラクトサミン）とウロン酸（Ｄ-グルクロン酸ま
たはＬ-イズロン酸）よりなる二糖の繰り返し単位をも
つ長鎖多糖類であって、硫酸基を有するものを意味す
る。天然由来の酸性ムコ多糖類には硫酸基をもつものも
あるので、それら自体および必要により、さらに化学的
に硫酸化したものも本発明にいう硫酸化酸性ムコ多糖類
に包含される。また、硫酸基をもたない酸性ムコ多糖類
は、化学的に硫酸基を導入することによって本発明で使
用可能になる。

【００１０】かかる酸性ムコ多糖類の具体例としては、
硫酸基をもつものとして、コンドロイチン４-硫酸およ
び６-硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸（またはヘ
パリチン硫酸とも称されている）、ヘパリン硫酸、なら
びにケラタン硫酸が挙げられ、硫酸基をもたないものと
して、ヒアルロン酸ならびにコンドロイチンが挙げられ
る。

【００１１】本発明では、さらに、硫酸化デキストラン
も使用できる。これらには、ヘパリン様の抗血液凝固作
用を有することが知られていて、臨床的にも使用されて
ている部分的硫酸エステルも包含される。

【００１２】以上の各種硫酸化糖類のうち、特に硫酸化
ヒアルロン酸が、原料の入手容易性および効能の観点か
ら好ましい。かかる硫酸化ヒアルロン酸は、広範な天然
起源、例えば哺乳動物の結合組織、ニワトリのとさか、
カイコの胃腔膜、連鎖球菌の莢膜などに由来するヒアル
ロン酸（β-Ｄ-Ｎ-アセチルグルコサミンとβ-Ｄ-グル
クロン酸が交互に結合してできた直鎖状の高分子多糖）
を硫酸化することにより得られる化合物である。一般
に、ヒアルロン酸は起源の種類によって分子量の分散性
が存在するものの構造上の不均一性は知られていないの
で、いずれの起源のものも使用できる。しかし、入手の
容易性を考慮すると、限定されるものでないが、連鎖球
菌に由来するものを都合よく使用することができる。そ
の具体的なものとしては、特開昭５８−２６６９２号公
報に記載されるような方法に従って調製したヒアルロン
酸が挙げられる。このものは、一般に、分子量約２，０
００ｋＤａをもつ。ヒアルロン酸は必要により部分加水
分解等により分子量を調整し、最終製品の速効性を期待
する場合には、低分子のもの（以下、ＬＭＷＨＡと略記
する）を、持続性を期待する場合には高分子のもの（以
下、ＨＭＷＨＡと略記する）を使用して硫酸化処理に付
する。ヒアルロン酸の硫酸化は、それ自体既知の方法で
行うことができるが、硫酸化剤として硫酸・トリメチル
アミン複合体を使用するものが好ましい。ヒアルロン酸
と硫酸化剤の使用割合は、目的とする硫酸化ヒアルロン
酸の硫酸化率（または硫黄含有率）および反応条件に従
って任意に選ぶことができる。一般に、温度５０〜６０
℃で数１０時間から数日間にわたって反応させる場合に
は、ヒアルロン酸重量の約２倍重量となるように硫酸化
剤の量を選ぶ。こうして達成される硫酸化率は、ヒアル
ロン酸の総水酸基当り約５０〜６０％のものが一般的で
ある。

【００１３】得られる硫酸化ヒアルロン酸は、各種修飾
多糖類で常用されている精製操作によって精製すること
ができる。具体的な精製操作には、反応混合物を減圧濃
縮後、蒸留水に対して透析して脱塩し、トリフルオロ酢
酸処理によりトリメチルアミンを除去し、次いで凍結乾
燥する工程が含まれる。

【００１４】他の酸性ムコ多糖類も、上記ヒアルロン酸
の硫酸化処理に準じて、対応する硫酸化酸性ムコ多糖類
へ転化できる。分子量および硫酸化率は、糖の種類によ
り最適値が変動するが、当業者であればこれらの最適値
は、後述の薬効試験等を通じて容易に選ぶことができる
であろう。

【００１５】硫酸化酸性ムコ多糖類または硫酸化デキス
トランは、必要により、アルカリ金属の水酸化物もしく
は炭酸塩、またはアミン類などを用いる造塩反応にかけ
た生理学的に許容される塩形態として使用することもで
きる。

【００１６】上記の硫酸化酸性ムコ多糖類もしくは硫酸
化デキストランまたはその生理学的に許容される塩は、
通常の医薬製剤の調製に使用される希釈剤または賦形剤
と混合し、液剤および懸濁剤、静脈内、動脈内または腹
腔内へ非経口的に投与できる。液剤で通常使用する希釈
剤または賦形剤としては、例えば、水、エチルアルコー
ルおよびプロピレングリコールなどが挙げられ、懸濁剤
用としては、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソ
ルビタンエステル類が挙げられる。

【００１７】希釈剤または賦形剤と硫酸化酸性多糖類も
しくは硫酸化デキストランの混合割合は、剤型によって
最適割合が変動するので限定されないが、硫酸化ヒアル
ロン酸を注射剤として調製する場合には、生理的食塩水
中硫酸化ヒアルロン酸０．０１〜１０（重量／容量）
％、好ましくは０．０５〜１（重量／容量）％に調製す
るのが患者の処置上都合がよい。もちろん、濃厚製剤と
して使用直前に上記ような注射液に調製してもよい。

【００１８】有効成分としての硫酸化ヒアルロン酸の投
与量は、患者の年齢、疾病の種類および程度、ならびに
剤型および投与様式により最適量は変動するが、静脈内
注射剤の場合には０．０１〜１０００mg／kg、好ましく
は０．１〜１０mg／kgで投与できる。なお、硫酸化ヒア
ルロン酸を始めその他の硫酸化酸性ムコ多糖類および硫
酸化デキストランは、２０００mg／kg以上の投与量にお
いても急性毒性を示さないので、上記用量を超えて使用
してもよい。

【００１９】以上のような本発明の抗炎症剤は、コブラ
毒の投与により惹起される実験動物モデルの血管透過
性、炎症に伴う出血およびミエロパーオキシデース（Ｍ
ＰＯ）活性を有意に抑制することから抗炎症剤として、
特に、ＡＲＤＳ、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、慢性関
節リューマチ、アトピー性皮膚炎および臓器移植後の浸
潤の予防または治療剤として利用できる。

【００２０】

【実施例】以下、具体例を示して本発明をさらに詳細に
説明するが、これらにより本発明が限定されるものでな
い。

【００２１】製造例１ 高分子ヒアルロン酸（ＨＭＷＨＡ、分子量１，３００ｋ
Ｄａ）の２００mgと硫酸・トリメチルアミン複合体（Ａ
ldrich）４００mgをジメチルホルムアミド６mＬに溶解
し、油浴中５０〜６０℃にて１週間撹拌した。反応液を
真空ポンプにて減圧濃縮した後、残渣を水に溶解し、脱
イオン水に対して１夜透析し、次いで凍結乾燥した。得
られた乾固物を水２mＬに溶解し、トリフルオロ酢酸
（ＨＭＷＨＡの水酸基総数の１.５倍モル相当量）を加
え、室温にて１時間撹拌した。反応液を透析後、凍結乾
燥して硫酸化率約６０％の硫酸化ヒアルロン酸を２００
mg得た。

【００２２】製造例２ 高分子ヒアルロン酸に代え低分子量（ＬＭＷＨＡ、分子
量４０ｋＤａ）を用いたこと以外、製造例１と同様の操
作を繰り返した。こうして約５０〜６０％の硫酸化率を
もつ硫酸化低分子量ヒアルロン酸を得た。

【００２３】抗炎症作用の評価試験 （１）炎症モデル動物の作製および炎症の評価法 特定の病原体に感染していない成体の雄ロング-エバン
ス（Ｌong-Ｅvans）ラット（２５０〜３５０g）を使用
した。コブラ毒（ＣＶＦ）はコブラ（Ｎaja naja）粗
製毒からＴillら、Ｊ．Ｃlin．Ｉnvest.，６９，１１２
６〜１１３５，１９８２に記載の方法で単離した。体重
１kg当り２０ＵのＣＶＦを¹²⁵Ｉ-ＢＳＡ（０.５μＣi）
および⁵¹Ｃr-ラット赤血球（ＲＢＣ）の一定量の共ラッ
トの静脈内に注入した。

【００２４】動物を塩酸ケタミン（１００mg／kg）（Ｐ
arke Ｄavis and Ｃo.）で麻酔し、ＣＶＦ注入後３
０分目に背部大静脈から採血した。陰性対照動物は、Ｃ
ＶＦの代わりにリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ，pＨ７.４）を
使用したことを除き、上記と同様に処置した。３０分間
隔で、肺の血管系をＰＢＳ１０mＬを用いて右心室を介
して灌流した。次に肺を摘出し、滅菌生理食塩水１０m
Ｌで上記血管系を灌流し、次いで組織内に残存する放射
能量をガンマシンチレーションカウンターで測定した。
なお陽性対照は被検物質を投与しなかった場合の測定値
である。

【００２５】肺の損傷を、肺血管透過性の増大（死亡時
に得た静脈の血液１mＬ中に存在する放射能量に対する
肺組織内に存在する¹²⁵Ｉ-ＢＳＡ放射能量の比を求める
ことによる）と同様に血液の放射能に対する比率として
定量した出血（⁵¹Ｃr-ＲＢＣの放射能量に基づく）によ
って特定した。肺損傷の防護は下記式により算出した。

【００２６】防護（％）＝１００×［被検物質値−陰性
対照（ＰＢＳ）値／陽性対照値−陰性対照（ＰＢＳ）
値］ （２）組織ミエロパーオキシデース（ＭＰＯ）活性 好中球浸潤の指標として、組織のＭＰＯ活性を測定し
た。グリコゲン刺激ラットの一定数の腹腔内好中球を正
常なラットの肺に加え、組織をホモジナイズし、次いで
抽出した後、標準曲線を作成した（Ｗarrenら、Ｊ．Ｃl
in．Ｉnvest.，８４、１８７３−１８８２、１９８９参
照）。

【００２７】肺サンプルを、緩衝液（５０mＭリン酸
塩、pＨ６.０）６mＬを用いホモジナイザー（Ｐolytro
n：Ｔekmar Ｃo.，）を４に設定し、４×１０秒ホモジ
ナイズし、次いで４℃で遠心（３,０００g、３０分）し
た。上澄液中のＭＰＯ活性を、ｏ-ジアニシジンの存在
下でＨ₂Ｏ₂の消費からもたらされる吸収度（４６０nm）
の変化を測定することによって評価した。

【００２８】（３）結果 各種の被検物質を、上記（１）のＣＶＦを投与する直前
にそれぞれ１mg／kg静脈内投与した場合の結果を下記表
に示す。 試験 被検物質 肺損傷の低減率(％) Ｎo 静 注 量 透過性 出血 ＭＰＯ １．硫酸化ＨＭＷＨＡ １mg ８４ ６３ ６０(.００１) ２．硫酸化ＬＭＷＨＡ １mg ６２ ３１ 未測定 ３．ヘパリン硫酸* １mg ４３ −６ 未測定 ４．硫酸化デキストラン** １mg ８ −３１ 未測定 ５．ＨＭＷＨＡ(対照) １mg ４ ０ ０ ６．Sialyl-Lews Ｘ（比較）*** １mg ３５ ６ 未測定 * 和光純薬社製 ** コーワ社製 *** Ｍ．Ｓ．Ｍulligan ら、Ｎatuer, Vol. 364(1993) pp. 149-150 参照 以上に示すように、本発明の硫酸化多糖類はコブラ毒
（ＣＶＦ）の投与により惹起される肺損傷を有意に防護
することができる。

【００２９】製剤例 組成 硫酸化ＨＭＷＨＡ １ｇ 等張化リン酸緩衝液（ＰＢＳ） １Ｌ調整 滅菌したＰＢＳに硫酸化ＨＭＷＨＡを溶解させる。

【００３０】

【発明の効果】本発明によれば、従来の抗炎症剤と異な
る作用機序をもつ抗炎症剤が提供される。本発明の抗炎
症剤は硫酸化酸性ムコ多糖類または硫酸化デキストラン
を有効成分として使用することにより、強い抗炎症作用
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 鈴木 康夫 静岡県静岡市瀬名200−16

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 硫酸化酸性ムコ多糖類もしくは硫酸化デ
   キストランまたはその生理学的に許容される塩を有効成
   分として含んでなる抗炎症剤。
2. 【請求項２】 硫酸化酸性ムコ多糖類が硫酸化ヒアルロ
   ン酸である請求項１記載の抗炎症剤。
3. 【請求項３】 硫酸化ヒアルロン酸を有効成分として含
   んでなる成人性吸収切迫症候群、慢性関節リューマチ、
   アトピー性皮膚炎および臓器移植後の浸潤からなる群よ
   り選ばれる疾患の治療または予防用薬剤。