JPH082780B2 - リポソームの製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］ 本発明は、医薬品あるいはその担体として利用される
リポソームの製造方法に関する。 さらに詳しくは、本発明は、薬剤を内包するリポソー
ムの懸濁液を無菌的に製造する方法に関する。 ［従来の技術および課題］ リポソームを水溶性の薬剤の担体として利用する試み
が広く行われている。（Gregoriadis et al.,Ann.N.Y.A
cad.Sci.,446,319（1985））。 また、リポソームの内水相に酸素運搬体であるヘモグ
ロビンを内包させ、リポソームを人工の赤血球として利
用する試みも行われている（特開昭62−178521号公
報）。これらの試みにおいて、リポソームを薬剤の担体
として使用するにあたり、薬剤を内包するリポソームの
懸濁液を無菌的に製造することは必須の用件である。 リポソーム懸濁液を製造するにあたっては、リポソー
ムを形成する脂質を均一に混合する工程、および得られ
た脂質混合物を水和させる工程を必要とするが、従来、
これらの操作は全て開放系で行われていたため、菌の混
入が避けられないものであった。このため、リポソーム
懸濁液を滅菌することを目的として、薬剤に多量の抗生
物質を添加したり、リポソーム懸濁液をフィルター（0,
2μｍ程度）を用いて濾過滅菌する方法等がとられてい
た。しかしながら、薬剤に抗生物質を多量に添加する方
法においては、リポソーム懸濁液への抗生物質の残留、
あるいはこのようなリポソームを生体に投与した際の生
体に対する悪影響等が危惧されるものであった。また、
リポソーム懸濁液をフィルターを用いて濾過滅菌する方
法では、リポソームがフィルターを通過できるようにリ
ポソームの内径を非常に小さくしなければならず、この
ため薬剤のカプセル化効率（リポソームに内包された薬
剤重量に対するリポソーム形成脂質重量の割合で、この
カプセル効率が低いと、単位重量あたりの薬剤を投与す
るのに必要な脂質量が増加し、リポソーム懸濁液の粘性
が上昇するため、安全性において不利である。）が低く
なってしまうという問題があった。また、濾過滅菌によ
る方法においては、リポソームと同等またはそれ以下の
径を有する菌は除去できないという問題があり、安全性
の面から好ましい方法であるとはいえなかった。さらに
は、濾過滅菌による方法は、リポソーム懸濁液を無菌的
に製造するものではなく、あくまで製造されたリポソー
ム懸濁液から除菌するものであるから、リポソームの製
造工程初期に菌が混入した場合には、菌の代謝産物が原
因となる発熱性物質の現出が避けられない等の問題を有
するものであった。 また、開放系においてリポソーム形成脂質混合物を水
和させる方法では、処理温度を高温に維持することが難
しいため、水和が不十分であり、このため得られたリポ
ソームが不均一になってしまうという問題があった。 ［発明が解決しようとする課題］ 本発明に係るリポソームの製法は、上記の課題を解決
するもので、リポソームを形成する脂質混合物を十分に
水和させることができ、しかも生体に対して危険性を有
する物質を使用することなくリポソーム懸濁液を無菌的
に製造することを目的とする。 ［課題を解決するための手段］ 上記の課題を解決するため、本発明に係るリポソーム
の製法は以下の点を特徴とするものである。 （１）密閉系を維持可能な容器内にリポソーム形成脂質
と水とを投入して高圧蒸気滅菌する工程を含むこと特徴
とするリポソームの製法。 （２）リポソーム形成脂質に対する水の添加比率が、1:
0.2〜５重量部である前記（１）記載のリポソームの製
法。 （３）前記高圧蒸気滅菌の処理条件は、処理温度115℃
〜126℃、処理時間が15分〜30分である前記（１）また
は（２）に記載のリポソームの製法。 （４）密閉系を維持可能な攪拌容器内にリポソーム形成
脂質と水とを投入して高圧蒸気滅菌し、滅菌された脂質
に薬剤を添加し、次いで当該攪拌容器を用いて内容物を
高速攪拌することにより懸濁処理を行うものである前記
（１）ないし（３）のいずれかに記載のリポソームの製
法。 （５）前記薬剤がヘモグロビンである前記（４）記載の
リポソームの製法。 本発明において、リポソームに内包される薬剤は、水
溶性のものであれば特に制限はないが、in vitroまたは
in vivoで不安定なもの、体内で徐々に放出され、ある
いは特定の臓器に速やかに分布することが所望されてい
るものが好適に使用されうる。具体的な例としては、ヘ
モグロビン、インシュリン、ヘパリン、ウロキナーゼ、
ユビデカノン、メトトレキセートン、ネオマイシン、プ
レオマイシン、テトラサイクリン、チトクロムＣ、アス
パラギナーゼ、シチシンアラビノシド、β−グルクロン
ダーゼ、ヘキソサミンダーゼ、アミノグルコシダーゼ等
があげられる。 特に薬剤がヘモグロビンである場合には、赤血球を常
法に従い無菌的に洗浄・溶血し、ストローマを除去した
後、分画分子量５万の膜を使用した限外濾過により濃縮
したものが使用され、その濃度は25％〜50％が好まし
い。より好ましくは、40％〜50％である。 また、このような薬剤のリポソーム懸濁液中の濃度
は、リポソームの用途に応じて適宜決定すればよい。 本発明におけるリポソーム形成脂質は特に制限はな
く、リポソームを形成するものであれば天然または合成
の脂質が使用可能である。特にリン脂質が好適に使用さ
れ、その例としては、レシチン、ホスファチジルエタノ
ールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリ
ン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトー
ル、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリ
ン、カルジオリピンおよびこれらを常法に従って水素添
加したものがあげられ、これらを組み合わせて用いるこ
ともできる。 さらにリポソーム形成脂質には、所望により、添加剤
として、ステロール等の膜構造強化剤、電荷付与物質
（例えば、ホスファチジン酸、ジセチルホスフェートま
たはステアリン酸、オレイン酸、ミリスチン酸、リノー
ル酸、リノレン酸等の高級脂肪酸等）、さらにはビタミ
ンＥ等の抗酸化剤を添加することができる。 以下、本発明のリポソームの製造方法を説明する。 すなわち、リポソーム形成脂質に所望により前述のよ
うな添加剤を添加した粉末状のリポソーム形成脂質混合
物と水とを、密閉系を維持可能な容器内に投入し、加圧
加熱（オートクレーブ）滅菌処理を施すことにより、脂
質混合物の滅菌を行う。このオートクレーブ滅菌処理
は、115〜126℃で15〜30分程度行うことが好ましい。こ
の加圧加熱滅菌処理を施すことによって、脂質混合物と
水とが115〜126℃の高温下に保たれるために、該脂質混
合物を十分に水和させることが可能になるものである。
ここで、リポソーム形成脂質混合物に対する水の添加比
率は、リポソーム形成脂質混合物を十分に滅菌・水和さ
せることが可能ならば特に限定されるものではないが、
1:0.2〜５重量部が好適である。 リポソーム形成脂質混合物に滅菌・水和処理を施した
後は、滅菌された脂質混合物に薬剤を添加し、続いて、
超音波照射法、フレンチプレス法、高速攪拌法等の公知
の懸濁処理を施すことにより、薬剤の内包されたリポソ
ーム懸濁液を製造することができる。なお、薬剤とし
て、熱により変成しやすい物質を使用する場合には、オ
ートクレーブ滅菌された脂質を室温程度まで冷却した後
に、当該脂質に薬剤を添加することが望ましい。 ここで、リポソーム懸濁液の無菌状態を確実に維持す
るためには、リポソーム形成脂質混合物の滅菌・水和処
理を行った密閉容器を用いて、当該容器内に薬剤を投入
し、密閉系を維持したまま懸濁処理を行うことが最も望
ましい。従って、最も好ましい態様は、密閉系を維持可
能な攪拌容器を用いて、該容器内に脂質混合物と水とを
投入してオートクレーブ滅菌処理し、滅菌された脂質に
薬剤を添加し、密閉系を維持したまま内容物を攪拌する
ことにより、リポソーム懸濁液を形成することである。 このような攪拌容器としては、一般には攪拌型細胞破
砕機として知られる、密閉容器内で高速に（10,000r.p.
m以上）カッター様の攪拌羽を回転させることで当該密
閉容器内の細胞浮遊液を攪拌し、細胞を破壊する目的に
使用される機械を用いることができる。この攪拌型細胞
破砕機としては、例えば、ワーリング社製：商品名ワー
リングブレンダーをあげることができる。 また、この攪拌処理は、5,000〜30,000r.p.mで、１〜
10分間程度の処理を、５〜20回程度繰り返して行うこと
が好ましい。 しかしながら、リポソーム形成脂質混合物の無菌状態
を維持したまま懸濁処理を行えるものであれば、他の方
法によってもリポソーム懸濁液を形成することができ
る。 かくして得られるリポソーム懸濁液は、常法に従って
洗浄され、例えば５〜10万Ｇ程度の超遠心処理等によっ
て精製・採取される。 次に実施例および比較例を示して本発明をさらに詳細
に説明する。

【実施例】

水素添加大豆レシチン20g、コレステロール10g、ミリ
スチン酸2.5gの脂質混合物と、これと等量の純水とを高
速攪拌機（ワーリングブレンダー：ワーリング社製）に
投入し、オートクレーブ滅菌処理した。処理条件は、12
1℃、20分間とした。オートクレーブ滅菌された脂質混
合物を室温まで冷却した後、50重量％ヘモグロビン溶液
（無菌）200mlを加え、前記と同様の高速攪拌機を用い
て密閉系を維持したまま14,000r.p.mで３分間の処理を1
0回繰り返した。得られた処理液に、1,000mlの生理食塩
水を加え、60,000Gの遠心加速度で遠心処理を３回行
い、得られたリポソームのペレットに1,000mlの生理食
塩水を加え、リポソームを再浮遊させた。このリポソー
ム浮遊液を、0.4μｍのフィルター（ミリポア社製）に
より濾過し、濾液を限外濾過により濃縮し、無菌状態が
維持されたヘモグロビン濃度５重量％のヘモグロビン内
包リポソーム390mlを得た。本実施例におけるヘモグロ
ビン回収率は19.5％であった。なお器具類はすべて滅菌
後使用した。

【比較例】

開放容器に、実施例と同様の脂質混合物と、該脂質混
合物と等量の純水とを投入し、70℃にて60分間保持し、
脂質混合物の水和処理を行った。その後、実施例と同様
の方法でリポソームを形成し、ヘモグロビン洗浄を行っ
た。このリポソーム懸濁液を、実施例と同様に0,45μｍ
フィルター（ミリポア社製）により濾過を行ったとこ
ろ、フィルターの目詰まりが激しく、ヘモグロビン濃度
５重量％のヘモグロビン内包リポソームを200mlしか得
ることができなかった。また、ヘモグロビンの収率は10
％であった。なお、器具類はすべて滅菌後使用した。 実施例と比較例において調整した高速攪拌処理液を光
学顕微鏡により観察したところ、比較例において調整し
た処理液には、フィルターに通らないような粗大な粒
子、特にコレステロールと推察される板状結晶が多く存
在し、これがフィルターを目詰まりさせ、ヘモグロビン
の収率を悪化させていることが判明した。これに対し、
実施例において調整した処理液には、粗大な粒子は存在
しなかった。これは、実施例においては、オートクレー
ブ処理することにより脂質混合物が十分に水和したのに
対し、比較例においては水和が不十分であるためであ
る。また、実施例において調整したリポソーム懸濁液中
には、菌が全く存在しなかったのに対し、比較例におい
て調整したリポソーム懸濁液中には、1cc当たり50個程
度の菌が存在していた。 ［発明の効果］ 以上、詳述したように、本発明に係るリポソームの製
法は、密閉系を維持可能な容器内にリポソーム形成脂質
と水とを投入して高圧蒸気滅菌する工程を含むこと特徴
し、このため粗大な粒子が存在することのないリポソー
ム懸濁液を無菌的に提供することができる。 また、本発明に係るリポソームの製法は、密閉系を維
持可能な攪拌容器内にリポソーム形成脂質と水とを投入
して高圧蒸気滅菌し、滅菌された脂質に薬剤を添加し、
次いで内容物を高速攪拌することにより懸濁処理を行う
ものであるから、より確実に粗大な粒子が存在すること
のないリポソーム懸濁液を無菌的に提供することができ
る。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】密閉系を維持可能な容器内にリポソーム形
   成脂質と水とを投入して高圧蒸気滅菌する工程を含むこ
   と特徴とするリポソームの製法。
2. 【請求項２】リポソーム形成脂質に対する水の添加比率
   が、1:0.2〜５重量部である請求項１記載のリポソーム
   の製法。
3. 【請求項３】前記高圧蒸気滅菌の処理条件は、処理温度
   115℃〜126℃、処理時間が15分〜30分である請求項１ま
   たは２に記載のリポソームの製法。
4. 【請求項４】密閉系を維持可能な攪拌容器内にリポソー
   ム形成脂質と水とを投入して高圧蒸気滅菌し、滅菌され
   た脂質に薬剤を添加し、次いで当該攪拌容器を用いて内
   容物を高速攪拌することにより懸濁処理を行うものであ
   る請求項１ないし３のいずれかに記載のリポソームの製
   法。
5. 【請求項５】前記薬剤がヘモグロビンである請求項４記
   載のリポソームの製法。