JPH0610131B2

JPH0610131B2 - リポソームの製法

Info

Publication number: JPH0610131B2
Application number: JP62273386A
Authority: JP
Inventors: 圭介坂口
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1987-10-30
Filing date: 1987-10-30
Publication date: 1994-02-09
Anticipated expiration: 2009-02-09
Also published as: JPH01117824A

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明はリポソームの製法に関する。本発明のリポソー
ムは特に医薬分野において利用される。

［従来の技術］リポソームは、種々の生理活性物質のキャリアーとして
医学分野において有望視されており、広く研究されてい
る。その主な理由は、リポソーム膜成分や膜構造は、生
体細胞に類似しているため、生体との高親和性、低毒性
が期待できるからである。

リポソームの調製方法は、概に数多く報告されている。
例えば、その概要は、F.Szoka,D.Papahadjopaulos,Ann.
Rev.Biophys.Bioeng.9,467(1980)にまとめられている。
しかし、これらの方法は工業的製造に適用するには規模
が小さいこと、操作や条件が複雑であること、収率が低
いことなどの理由から無理があった。また、リポソーム
の工業的製法として特開昭60-12127号の方法が報告され
ている。この方法は、膜成分物質を溶解した有機溶媒を
除去し、これに水性溶液を加えて分散する方法である
が、単に撹拌しただけでは有機溶媒を除去した後の膜成
分物質は、固化あるいはほとんど流動性を失なった状態
となるため、この状態で水性溶液を加えてもなかなか水
和状態とならず、効率よく薬剤を保持したリポソームが
得られにくいという欠点があった。

［発明が解決しようとする問題点］本発明の目的は、上記従来技術の問題点を解決したリポ
ソームの工業的製造方法を提供することにある。

［問題点を解決するための手段］従来からリポソームの製造方法として広く知られている
薄膜法では、フラスコ等の内壁に膜成分物質のきれいな
薄膜を形成することが必要であるとされていた。しかし
最近の研究によりリポソームを形成させるには、必ずし
もきれいな薄膜になっている必要はなく、膜成分物質が
分子レベルで混合し合い単一結晶を生じていない状態に
あれば、これを水和し分散を行なうことで保持効率の高
いリポソームが得られることが見い出された。ところが
膜成分物質から有機溶媒を除いた状態の膜成分物質は、
ほとんど流動性のない状態にあり大量にこれを作った場
合には、水溶液を加えて撹拌しただけでは、水和が促進
されず全体が膨潤せずリポソームが形成されにくい欠点
があった。

発明者は、膜成分物質を溶解した有機溶媒溶液に水和物
の形成に必要な量の水を添加し撹拌しながら有機溶媒を
除去することで、容易に均一な膜成分物質水和物が得ら
れ、さらにこれを水溶液と撹拌することで再現性よくリ
ポソームが製造できることを見い出し本発明を完成し
た。

本発明で使用する膜成分物質は、ホスファチジルコリン
・スフィンゴミエリン・ホスファチジルエタノールアミ
ン・ホスファチジルセリン等に代表される脂質で卵黄・
大豆その他の天然材料に由来するもの、または、合成に
より得られるものを単独でまたは混合して主成分とす
る。さらに膜安定化剤としてコレステロール、コレスタ
ノール等のステロール類や荷電物質としてホスファチジ
ン酸、ジセチルホスフェート、高級飽和脂肪酸等を添加
してもよい。また酸化防止剤としてトコフェロール等を
加えてもよい。これら膜成分物質の比率は、特に限定さ
れないが好ましくはリン脂質１重量部に対し、ステロー
ル類を０〜２重量部、荷電物質０〜0.2重量部が適当で
ある。

膜成分物質を溶解する揮発性有機溶媒としては、クロロ
ホルム、ジクロロメタン、エタノール、ヘキサン等があ
げられる。その使用量は、膜成分物質を完全に溶解する
量であれば特に制限はないが、膜成分物質１ｇ当たり、
２〜12ml程度が適当である。

また、膜成分物質を水和させる水としては、イオンまた
は塩類等含まない水が好ましく使用される。その使用量
は、膜成分物質１ｇ当たり、１〜３ml程度が適当であ
る。

また膜成分物質水和物を分散させる水溶液としては、
水、塩類または糖類の水溶液等が好ましく使用される。
その使用比率は、膜成分物質１重量部に対し、１〜500
重量部程度が適当である。

本発明のリポソーム製剤に保持される薬剤としては、特
に制限はなく、種々の生理活性物質が使用できる。ヘモ
グロビン、スーパーオキシドディスムターゼ、ウロキナ
ーゼ等の水溶性物質の場合は、膜成分物質水和物の分散
水溶液に溶解して用い、ビタミンＤ₃、ビタミンＡ、プ
ロスタグランディン等の水に難溶性で膜成分物質と親和
性の強い物質の場合には、膜成分物質に混合して製造を
行なうと良い。

本発明のリポソームの製法は以下に示す手順により好適
に実施される。

膜成分物質はまず揮発性有機溶媒に溶解する。その量
は、膜成分物質１ｇ当たり３〜12ml程度が適当である。
次いで蒸留またはイオン交換を行なった水（膜成分物質
１ｇ当たり１〜３ml適度）を加え、水と有機溶媒が分離
しない程度に撹拌を行ないながら、有機溶媒を除去して
いく。有機溶媒の除去には、減圧まは不活性ガス（アル
ゴンガス、窒素ガス等）の吹きつけ、バブリング等が利
用される。撹拌容器より揮発する有機溶媒は、液体窒
素、ドライアイス−メタノール等で冷却したトラップを
取り付けることで、ほぼ完全に回収されるので作業は安
全に行なうことができる。有機溶媒を除去して膜成分物
質水和物を製するこの操作は、膜成分物質の相転移温度
（Tc）以上の温度で行なうのが望ましい。

次いでこのようにして得られた膜成分物質水和物と水溶
液とを激しく撹拌し分散させる。水溶液の量は膜成分物
質１重量部当たり１〜500重量部が適当であり、一度ま
たは数回に分けて数種類の水溶液を加えてもよい。撹拌
機には特に制限はなく、ホモミキサー、パドルミキサー
等通常乳化に使用される装置が適当である。また小粒径
のリポソーム製剤とするためには、撹拌後にさらに加圧
型乳化機、超音波乳化機、フレンチプレス細胞破砕機で
分散処理することが望ましい。この撹拌、分散する際の
温度は、膜成分物質の相転移温度（Tc）以上が望まし
い。しかし、膜成分物質にステロール類を含有させれ
ば、膜成分全体として相転移が不明瞭となるため、操作
温度がTc以下でも充分にリポソームを製造することがで
きる。このことは、高温で失活しやすい生理活性物質を
リポソームに保持させる場合に応用できる。

このようにして得られたリポソームは、メンブランフィ
ルターで粒径分布を制御してもよいし、未保持の生理活
性物質を限外過、遠心分離、ゲル過の手段で除いて
もよい。

次に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明する。

実施例１完全水素添加卵黄ホスファチジルコリン118.4g、コレス
テロール59.8g、ミリスチン酸8.4gを秤量し、アヂホモ
ミキサー（特殊機化工業製）容器内でクロロホルム400m
lに溶解し、蒸留水400mlを加え、ホモミキサーおよびパ
ドルミキサーを運転しながら、40℃に保ち容器内を減圧
してクロロホルムを除去した。このときドライアイス・
メタノールで冷却したトラップによりクロロホルムはほ
ぼ完全に回収された、こうして得られた膜成分物質水和
物は、白色クリーム状であった。次いでパドルミキサー
による撹拌を行ないながら冷却し容器を５℃に保った。
そこへあらかじめ５℃に冷却してある30%(W/V)ヘモグロ
ビン溶液を600g投入し、パドルミキサー、ホモミキサー
による激しい撹拌を行なった。全体が充分均一化したと
ころで運転を終了した。リポソームに保持されなかった
ヘモグロビンを除くため、得られた液を生理活性食塩水
５で希釈し、孔径0.1μのメンブランフィルターで限
外過し、液にヘモグロビンが検出されなくなるまで
生理食塩水で希釈しながら限外過をくりかえした。こ
うして得られたヘモグロビン保持リポソーム懸濁液５
は、桃色を呈しており、光学顕微鏡により観察したとこ
ろ粒径数μm程度の均一な球状構造が確認できた。シア
ンメトヘモグロビン法によりリポソーム懸濁液のヘモグ
ロビン濃度を求め、懸濁液のヘモグロビン保持量を求め
たところ、作製時に投入したヘモグロビン量に対する比
率（ヘモグロビン収率）は、28.6%であった。また懸濁
液の可視吸収スペクトルは、オキシヘモグロビン特有の
スペクトルを有しており、リポソーム製造においてヘモ
グロビンの変性・酸化が起きていなことが確認された。

実施例２完全水素添加卵黄レシチン（リン脂質99%以上）115.0
g、コレステロール31.3gを秤量し、ホモディスパー（特
殊機化工業製）容器内でジクロロメタン500mlに溶解
し、蒸留水350mlを加え、ディスパー羽根で液を撹拌し
ながら、容器を40℃に保ち真空ポンプで容器内を減圧
し、ジクロロメタンを除去した。このとき反応容器−真
空ポンプ間にドライアイス・メタノールで冷却したトラ
ップを取りつけ、ジクロロメタンはほぼ完全に回収され
た。こうして得られた膜成分物質水和物は、白色クリー
ム状であった。次いでディスパーによる撹拌を行ないな
がら冷却し、容器を５℃に保った。そこへあらかじめ５
℃に冷却してある30%(W/V)ヘモグロビン溶液を600g投入
し、ディスパーを高速回転して全体を均一にした。より
小さなリポソームを製造するため、得られた液を50ml取
り出し、これをフレンチプレス細胞破砕機（大岳製作所
製）で５℃圧力700kg/cm²の処理を行なった。さらにこ
の液（液）のリポソームに保持されなかったヘモグロ
ビンを除くため、15mMトリスバッファー(pH7.4)含有生
理食塩水（以下トリス生食と略す）300ml加えた後５℃
にて遠心分離（180000×g、30分間）を行なった。得られ
た沈殿をトリス生食100mlにて懸濁し、遠心上清にヘモ
グロビンが検出されなくなるまで、遠心分離、再懸濁を
繰り返した。最終的に得られたリポソーム懸濁液は桃色
を呈していた。ヘモグロビン定量を行ない、遠心分離前
の液（液）のヘモグロビン量に対するリポソーム懸濁
液のヘモグロビン保持量の比率（ヘモグロビン保持率）
を求めたところ26.3%であった。懸濁液を光学顕微鏡に
より観察したところ、数μｍの球状の粒子が少量と１μ
ｍ以下のブラウン運動する多くの粒子が観察された。

上記実施例１および２において、卵黄ホスファチジルコ
リンまたはレシチンの有機溶媒溶液に蒸留水を添加しな
かった場合にはリポソームが生成しなかった。

［発明の効果］本発明によれば、膜成分物質を溶解した有機溶媒溶液に
水和物の形成に必要な量の水を添加し、撹拌しながら有
機溶媒を除去することにより容易に均一な膜成分物質水
和物を得ることができ、これを水溶液と激しく撹拌する
ことによりリポソームを製造することができる。このよ
うに膜成分物質の均一混合物形成時に水を添加するだけ
の簡単な操作でリポソームを収率よく製造することがで
きるので、本発明は工業的なリポソームの製法として極
めて優れた方法である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】リポソーム膜成分物質を揮発性有機溶媒に
溶解し、得られた溶液に水和物の形成に必要な量の生理
活性物質を含まない水を加え、撹拌しながら有機溶媒を
除去して薄膜を形成することなく膜成分物質水和物を作
り、これに生理活性物質を含有する水溶液を加えて分散
することを特徴とするリポソームの製法。
【請求項２】生理活性物質はヘモグロビンである特許請
求の範囲第１項記載のリポソームの製法。
【請求項３】リポソーム膜成分物質は生理活性物質を含
有する特許請求の範囲第１項記載のリポソームの製法。