JPH0829079B2 - Ｌ−フェニルアラニンデヒドロゲナ−ゼおよびその製造方法 - Google Patents
Ｌ−フェニルアラニンデヒドロゲナ−ゼおよびその製造方法Info
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- JPH0829079B2 JPH0829079B2 JP62140706A JP14070687A JPH0829079B2 JP H0829079 B2 JPH0829079 B2 JP H0829079B2 JP 62140706 A JP62140706 A JP 62140706A JP 14070687 A JP14070687 A JP 14070687A JP H0829079 B2 JPH0829079 B2 JP H0829079B2
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【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、Ｌ−フェニルアラニンの製造、Ｌ−フェニ
ルアラニンおよびフェニルピルビン酸の定量等に有用
な、Ｌ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼおよびその
製造方法に関する。
ルアラニンおよびフェニルピルビン酸の定量等に有用
な、Ｌ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼおよびその
製造方法に関する。
（従来技術およびその問題点） 本発明のＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼに類
似する作用を有するＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナ
ーゼおよびこの酵素を利用するＬ−アミノ酸の製造方法
は、特開昭59−198972、特開昭61−146183、特開昭61−
239887および特開昭61−239888等に記載されている。し
かしながらこの公開された明細書に記載されているＬ−
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼは常温菌であるブレ
ビバクテリウム（Brevibacterium）属、ロドコッカス
（Rhodococcus）属、スポロサルシナ（Sporosarcina）
属、およびバチルス（Bacillus）属細菌により生産され
たものであり、いずれも常温では活性を示すが、50℃以
上では失活するものであった。しかし、産業上の酵素利
用の観点からは、反応速度が速く、反応液が雑菌により
汚染されにくい条件下で使用可能な酵素を用いる事が要
望される。
似する作用を有するＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナ
ーゼおよびこの酵素を利用するＬ−アミノ酸の製造方法
は、特開昭59−198972、特開昭61−146183、特開昭61−
239887および特開昭61−239888等に記載されている。し
かしながらこの公開された明細書に記載されているＬ−
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼは常温菌であるブレ
ビバクテリウム（Brevibacterium）属、ロドコッカス
（Rhodococcus）属、スポロサルシナ（Sporosarcina）
属、およびバチルス（Bacillus）属細菌により生産され
たものであり、いずれも常温では活性を示すが、50℃以
上では失活するものであった。しかし、産業上の酵素利
用の観点からは、反応速度が速く、反応液が雑菌により
汚染されにくい条件下で使用可能な酵素を用いる事が要
望される。
この様な条件を満たすには耐熱性酵素を用いるのがよ
く、種々の耐熱性酵素の検索が行なわれている。
く、種々の耐熱性酵素の検索が行なわれている。
しかしながら、これまでのところ耐熱性のＬ−フェニ
ルアラニンデヒドロゲナーゼは見いだされていない。
ルアラニンデヒドロゲナーゼは見いだされていない。
（問題を解決するための手段） 本発明者らは、耐熱性に優れたＬ−フェニルアラニン
デヒドロゲナーゼの探索を目的に、該酵素産生能を有す
る菌株を求めて、公知の保存菌株も含めて鋭意に研究を
続けた結果、サーモアクチノマイセス・インターメディ
ウスATCC33205が、従来知られているものとは全く異な
る高度に耐熱性を有するＬ−フェニルアラニンデヒドロ
ゲナーゼを産生することを見い出し本発明に至った。
デヒドロゲナーゼの探索を目的に、該酵素産生能を有す
る菌株を求めて、公知の保存菌株も含めて鋭意に研究を
続けた結果、サーモアクチノマイセス・インターメディ
ウスATCC33205が、従来知られているものとは全く異な
る高度に耐熱性を有するＬ−フェニルアラニンデヒドロ
ゲナーゼを産生することを見い出し本発明に至った。
すなわち、本発明は、 （１）次の理化学的性質を有するＬ−フェニルアラニン
デヒドロゲナーゼ （ａ）作用： １モルのＬ−フェニルアラニン、１モルのNAD+及び１
モルの水から、１モルのフェニルピルビン酸、１モルの
NADH及び１モルのアンモニウムイオンを生成する反応
（酸化的脱アミノ反応）、並びにこの逆反応（還元的ア
ミノ化反応）を触媒する。
デヒドロゲナーゼ （ａ）作用： １モルのＬ−フェニルアラニン、１モルのNAD+及び１
モルの水から、１モルのフェニルピルビン酸、１モルの
NADH及び１モルのアンモニウムイオンを生成する反応
（酸化的脱アミノ反応）、並びにこの逆反応（還元的ア
ミノ化反応）を触媒する。
（ｂ）基質特異性： 酸化的脱アミノ反応では、Ｌ−フェニルアラニンに特
異的に作用し、他のアミノ酸には極めてわずかしか作用
しない、または全く作用しない。
異的に作用し、他のアミノ酸には極めてわずかしか作用
しない、または全く作用しない。
還元的アミノ化反応では、フェニルピルビン酸に特異
的に作用し、他のα−ケト酸には極めてわずかしか作用
しない、または全く作用しない。（表−１） （ｃ）至適pH: 酸化的脱アミノ反応ではpH10.8付近、還元的アミノ化
反応ではpH9.2付近（図−１） （ｄ）安定pH範囲： 50℃10分間の処理でpH5.5〜10.8の範囲で活性の低下
は全くみられない。
的に作用し、他のα−ケト酸には極めてわずかしか作用
しない、または全く作用しない。（表−１） （ｃ）至適pH: 酸化的脱アミノ反応ではpH10.8付近、還元的アミノ化
反応ではpH9.2付近（図−１） （ｄ）安定pH範囲： 50℃10分間の処理でpH5.5〜10.8の範囲で活性の低下
は全くみられない。
70℃10分間の処理でpH5.5〜9.8の範囲で活性の低下は
全くみられない。（図−２） （ｅ）熱安定性： 70℃60分間の処理で活性の低下は全くみられない。
全くみられない。（図−２） （ｅ）熱安定性： 70℃60分間の処理で活性の低下は全くみられない。
75℃30分間の処理で活性は約25％残存する。（図−
３） （ｆ）分子量： 全分子量−約27〜29万（ゲル濾過法） サブユニットの分子量−47,000（同一サブユニットの
６量体構造） および （２）サーモアクチノマイセス（Thermoactinomyces）
属に属するＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ生産
菌を培養し、培養物から上記のＬ−フェニルアラニンデ
ヒドロゲナーゼを採取することを特徴とするＬ−フェニ
ルアラニンデヒドロゲナーゼの製造方法 である。
３） （ｆ）分子量： 全分子量−約27〜29万（ゲル濾過法） サブユニットの分子量−47,000（同一サブユニットの
６量体構造） および （２）サーモアクチノマイセス（Thermoactinomyces）
属に属するＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ生産
菌を培養し、培養物から上記のＬ−フェニルアラニンデ
ヒドロゲナーゼを採取することを特徴とするＬ−フェニ
ルアラニンデヒドロゲナーゼの製造方法 である。
本発明のＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼの理
化学的性質について以下に説明する。
化学的性質について以下に説明する。
（ａ）作用： １モルのＬ−フェニルアラニン、１モルのNAD+及び１
モルの水から、１モルのフェニルピルビン酸、１モルの
NADH及び１モルのアンモニウムイオンを生成する反応
（酸化的脱アミノ反応）、並びにこの逆反応（還元的ア
ミノ化反応）を触媒する。
モルの水から、１モルのフェニルピルビン酸、１モルの
NADH及び１モルのアンモニウムイオンを生成する反応
（酸化的脱アミノ反応）、並びにこの逆反応（還元的ア
ミノ化反応）を触媒する。
（ｂ）基質特異性： 酸化的脱アミノ反応では、Ｌ−アミノ酸を、還元的ア
ミノ化反応ではα−ケト酸を基質として酵素活性を測定
した。その結果を表−１の１および１の２に示す。酵素
活性はＬ−フェニルアラニンおよびフェニルピルビン酸
に対する活性を100とした相対活性で表示した。 表−１の１（酸化的脱アミノ反応） 基 質 相対活性 Ｌ−フェニルアラニン 100 Ｌ−ｐ−アミノフェニルアラニン 7.2Ｌ−ロイシン 3.9 また、Ｄ−フェニルアラニン、DL−フェニルグリシ
ン、Ｌ−チロシン、DL−tert−ロイシン、Ｌ−トリプト
ファン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニ
ン、Ｌ−バリン、グリシルグリシン、Ｌ−ヒスチジン、
Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−イソロイシンに
対しては全く作用しない。 表−１の２（還元的アミノ化反応） 基 質 相対活性 フェニルピルビン酸 100 ケトメチオニン 13.9 α−ケトイソカプロン酸 5.5 α−ケトイソ吉草酸 5.0 α−ケトイソロイシン 3.3 α−ケト酪酸 1.3 ピルビン酸 0.7 オキザロ酢酸 0.9 α−ケトグルタル酸 ０ ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸 ０ 表−１からわかるように、本発明のＬ−フェニルアラ
ニンデヒドロゲナーゼは酸化的脱アミノ反応では、Ｌ−
フェニルアラニンに特異的に作用し、他のアミノ酸には
極めてわずかしか作用しない、または全く作用しない。
ミノ化反応ではα−ケト酸を基質として酵素活性を測定
した。その結果を表−１の１および１の２に示す。酵素
活性はＬ−フェニルアラニンおよびフェニルピルビン酸
に対する活性を100とした相対活性で表示した。 表−１の１（酸化的脱アミノ反応） 基 質 相対活性 Ｌ−フェニルアラニン 100 Ｌ−ｐ−アミノフェニルアラニン 7.2Ｌ−ロイシン 3.9 また、Ｄ−フェニルアラニン、DL−フェニルグリシ
ン、Ｌ−チロシン、DL−tert−ロイシン、Ｌ−トリプト
ファン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニ
ン、Ｌ−バリン、グリシルグリシン、Ｌ−ヒスチジン、
Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−イソロイシンに
対しては全く作用しない。 表−１の２（還元的アミノ化反応） 基 質 相対活性 フェニルピルビン酸 100 ケトメチオニン 13.9 α−ケトイソカプロン酸 5.5 α−ケトイソ吉草酸 5.0 α−ケトイソロイシン 3.3 α−ケト酪酸 1.3 ピルビン酸 0.7 オキザロ酢酸 0.9 α−ケトグルタル酸 ０ ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸 ０ 表−１からわかるように、本発明のＬ−フェニルアラ
ニンデヒドロゲナーゼは酸化的脱アミノ反応では、Ｌ−
フェニルアラニンに特異的に作用し、他のアミノ酸には
極めてわずかしか作用しない、または全く作用しない。
還元的アミノ化反応では、フェニルピルビン酸に特異
的に作用し、他のα−ケト酸には極めてわずかしか作用
しない、または全く作用しない。
的に作用し、他のα−ケト酸には極めてわずかしか作用
しない、または全く作用しない。
本発明のＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼは、
従来の該酵素と比較し、Ｌ−フェニルアラニンおよびフ
ェニルピルビン酸に対して極めて基質特異性の高い酵素
であるといえる。
従来の該酵素と比較し、Ｌ−フェニルアラニンおよびフ
ェニルピルビン酸に対して極めて基質特異性の高い酵素
であるといえる。
（ｃ）至適pH: 酸化的脱アミノ反応においては、0.2M Gly-KCl-KOH緩
衝液（pH9〜11）、50mM K2HPO4−KOH緩衝液（pH11〜1
2）を用いて検討した。還元的アミノ化反応では、200mM
NH4Cl−NH4OH緩衝液（pH8〜10）を、100mM Na2CO3−Na
HCO3緩衝液と2M NH4Clの代わりに用いて検討した。
衝液（pH9〜11）、50mM K2HPO4−KOH緩衝液（pH11〜1
2）を用いて検討した。還元的アミノ化反応では、200mM
NH4Cl−NH4OH緩衝液（pH8〜10）を、100mM Na2CO3−Na
HCO3緩衝液と2M NH4Clの代わりに用いて検討した。
その結果、図−１に示すように、至適pHは、酸化的脱
アミノ反応ではpH10.8付近、還元的アミノ化反応ではpH
9.2付近である。
アミノ反応ではpH10.8付近、還元的アミノ化反応ではpH
9.2付近である。
（ｄ）安定pH範囲： 本酵素液0.1mlに対し、後述する各pH値の緩衝液を0.4
ml加え、50℃と70℃で10分間処理し氷冷してサンプルと
した。これについて比活性を求めた。緩衝液は、pH4〜
６に対しては50mM CH3COOH-CH3COONa、pH6〜８に対して
は50mM KH2PO4-K2H PO4、pH8〜8.6に対しては50mM Tris
-HCl、pH9〜11に対しては50mM Gly-KCl-KOH、pH11〜12.
5に対しては50mM K2HPO4-K3PO4をそれぞれ使用した。
ml加え、50℃と70℃で10分間処理し氷冷してサンプルと
した。これについて比活性を求めた。緩衝液は、pH4〜
６に対しては50mM CH3COOH-CH3COONa、pH6〜８に対して
は50mM KH2PO4-K2H PO4、pH8〜8.6に対しては50mM Tris
-HCl、pH9〜11に対しては50mM Gly-KCl-KOH、pH11〜12.
5に対しては50mM K2HPO4-K3PO4をそれぞれ使用した。
その結果、図−２に示すように、本酵素は50℃10分間
の処理ではpH5.5〜10.8付近まで安定である。また70℃1
0分間の処理ではpH5.5〜9.8付近まで安定である。
の処理ではpH5.5〜10.8付近まで安定である。また70℃1
0分間の処理ではpH5.5〜9.8付近まで安定である。
このことから本発明のフェニルアラニンデヒドロゲナ
ーゼは、従来の該酵素と比較して広範囲において安定で
あることより、酵素の取り扱いが容易であるといえる。
ーゼは、従来の該酵素と比較して広範囲において安定で
あることより、酵素の取り扱いが容易であるといえる。
（ｅ）熱安定性： 本酵素液0.1mlに対し、0.01％２−メルカプトエタノ
ール、1mM EDTAを含む10mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.
2）0.4mlを加えた試験管を10本用意し、20℃、37℃、45
℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃の温度
でそれぞれを５分間処理し、氷冷してサンプルとした。
これについて比活性を求めた。さらに、70℃および75℃
で０〜60分間処理し同様に比活性を求めた。その結果、
図−３に示すように、本酵素は５分間の処理では、70℃
まで安定であり、活性の低下は全くみられず、75℃では
約50％の活性が残存する。また、70℃では60分の処理で
も安定で活性の低下は全くみられず、75℃では30分間の
処理で約25％の活性が残存する。
ール、1mM EDTAを含む10mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.
2）0.4mlを加えた試験管を10本用意し、20℃、37℃、45
℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃の温度
でそれぞれを５分間処理し、氷冷してサンプルとした。
これについて比活性を求めた。さらに、70℃および75℃
で０〜60分間処理し同様に比活性を求めた。その結果、
図−３に示すように、本酵素は５分間の処理では、70℃
まで安定であり、活性の低下は全くみられず、75℃では
約50％の活性が残存する。また、70℃では60分の処理で
も安定で活性の低下は全くみられず、75℃では30分間の
処理で約25％の活性が残存する。
このことから本発明のフェニルアラニンデヒドロゲナ
ーゼは、従来の約50℃で失活する常温菌由来の該酵素と
比較して、それより20℃も高い70℃でも全く活性の低下
はみられず、非常に熱安定性に優れた酵素であるといえ
る。
ーゼは、従来の約50℃で失活する常温菌由来の該酵素と
比較して、それより20℃も高い70℃でも全く活性の低下
はみられず、非常に熱安定性に優れた酵素であるといえ
る。
（ｆ）分子量： 全分子量の測定は、トヨパールHW55Fのカラム（径1.5
×63.5cm）（東洋曹達製）を用いるゲル濾過法で行っ
た。標準タンパク質には、フェリチン（分子量460,00
0）、バチルス・スフェリカス（Bacillus sphaericus）
由来のアラニンデヒドロゲナーゼ（分子量235,000）、
馬心臓由来の乳酸脱水素酵素（分子量140,000）、牛血
清アルブミン（分子量68,000）、卵白アルブミン（分子
量43,000）を用いた。
×63.5cm）（東洋曹達製）を用いるゲル濾過法で行っ
た。標準タンパク質には、フェリチン（分子量460,00
0）、バチルス・スフェリカス（Bacillus sphaericus）
由来のアラニンデヒドロゲナーゼ（分子量235,000）、
馬心臓由来の乳酸脱水素酵素（分子量140,000）、牛血
清アルブミン（分子量68,000）、卵白アルブミン（分子
量43,000）を用いた。
サブユニットの分子量測定は、SDS−スラブ電気泳動
法で行った。標準タンパク質には、牛血清アルブミン
（分子量68,000）、α−キモトリプシノーゲンＡ（分子
量25,700）、カタラーゼ（分子量60,000）、オバルブミ
ン（分子量43,000）、チトクローム（分子量12,384）を
用いた。
法で行った。標準タンパク質には、牛血清アルブミン
（分子量68,000）、α−キモトリプシノーゲンＡ（分子
量25,700）、カタラーゼ（分子量60,000）、オバルブミ
ン（分子量43,000）、チトクローム（分子量12,384）を
用いた。
その結果、全分子量は270,000〜290,000である。ま
た、サブユニットの分子量は47,000であり、SDSタンパ
ク質バンドが１つであったことから、本酵素は同一サブ
ユニットの６量体構造であることがわかる。
た、サブユニットの分子量は47,000であり、SDSタンパ
ク質バンドが１つであったことから、本酵素は同一サブ
ユニットの６量体構造であることがわかる。
（ｇ）金属イオンの影響 後述する酵素活性測定の反応液中に、各種金属イオン
を塩化物として混合し、活性を測定した。その結果、表
−２に示すように、本酵素はFe3+、Hg2+によって阻害さ
れる。
を塩化物として混合し、活性を測定した。その結果、表
−２に示すように、本酵素はFe3+、Hg2+によって阻害さ
れる。
従来知られている酵素については、Fe3+によって酵素
活性が増加することが多く報告されているが本発明によ
る酵素はFe3+により阻害されることからも新規な酵素で
ある事が裏づけられる。
活性が増加することが多く報告されているが本発明によ
る酵素はFe3+により阻害されることからも新規な酵素で
ある事が裏づけられる。
本発明のＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼは、
例えばサーモアクチノマイセス属に属するフェニルアラ
ニンデヒドロゲナーゼ産生菌を培養し、培養物からＬ−
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼを採取することによ
って製造することができる。
例えばサーモアクチノマイセス属に属するフェニルアラ
ニンデヒドロゲナーゼ産生菌を培養し、培養物からＬ−
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼを採取することによ
って製造することができる。
本発明のＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼの製
造方法に用いられる微生物は、Ｌ−フェニルアラニンデ
ヒドロゲナーゼを産生することができるサーモアクチノ
マイセス属に属するすべての菌株、突然変異株、変種を
含む。その好ましい具体例は、サーモアクチノマイセス
・インターメディウスであり、この種に属する保存菌と
しては、サーモアクチノマイセス・インターメディウス
ATCC33205を挙げることができる。
造方法に用いられる微生物は、Ｌ−フェニルアラニンデ
ヒドロゲナーゼを産生することができるサーモアクチノ
マイセス属に属するすべての菌株、突然変異株、変種を
含む。その好ましい具体例は、サーモアクチノマイセス
・インターメディウスであり、この種に属する保存菌と
しては、サーモアクチノマイセス・インターメディウス
ATCC33205を挙げることができる。
本発明のＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼを得
るにあたってのＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ
産生菌の培養は、通常の基礎栄養培地中で行うことがで
きる。例えば、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、無機
塩類などを含む培地が用いられる。また、この基礎栄養
培地に誘導物質として少量のＬ−フェニルアラニンを添
加すると、Ｌ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼが誘
導される。Ｌ−フェニルアラニンの添加量は、培地の組
成、菌株の性質により異なるが、0.1〜１％程度が好ま
しい。
るにあたってのＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ
産生菌の培養は、通常の基礎栄養培地中で行うことがで
きる。例えば、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、無機
塩類などを含む培地が用いられる。また、この基礎栄養
培地に誘導物質として少量のＬ−フェニルアラニンを添
加すると、Ｌ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼが誘
導される。Ｌ−フェニルアラニンの添加量は、培地の組
成、菌株の性質により異なるが、0.1〜１％程度が好ま
しい。
培養は固体培地又は液体培地のいずれを用いて行って
もよいが、目的酵素を多量に得るためには、液体培地を
用い、振盪培養、通気撹拌培養等により好気的条件下で
培養を行うことが好ましい。培養温度は菌が成育し、Ｌ
−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼが生産される温度
範囲内であればよいが、好ましくは25〜60℃である。培
養時間は酵素活性が発現される時間を選べば良いが好ま
しくは６〜110時間である。培養のpHは、７〜7.5が好ま
しい。
もよいが、目的酵素を多量に得るためには、液体培地を
用い、振盪培養、通気撹拌培養等により好気的条件下で
培養を行うことが好ましい。培養温度は菌が成育し、Ｌ
−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼが生産される温度
範囲内であればよいが、好ましくは25〜60℃である。培
養時間は酵素活性が発現される時間を選べば良いが好ま
しくは６〜110時間である。培養のpHは、７〜7.5が好ま
しい。
この培養によって本酵素の大部分は菌体内に蓄積され
る。
る。
培養終了後は培養物をそのまま酵素源として利用して
もよいが、通常は分離精製を行なう。精製法としては、
通常の酵素精製法を用いることが出来る。例えば遠心分
離により菌体を集め、超音波処理、ダイノミル等の機械
的方法によって菌体を破砕する。続いて遠心分離などに
より細胞片などの固形物を除き、粗酵素液を得る。次に
この粗酵素液を硫安沈殿法により分画し、メルカプトエ
タノール、EDTAの添加による透析、アフィニテイクロマ
トグラフィー等によって均一の結晶酵素標品を単離する
ことができる。
もよいが、通常は分離精製を行なう。精製法としては、
通常の酵素精製法を用いることが出来る。例えば遠心分
離により菌体を集め、超音波処理、ダイノミル等の機械
的方法によって菌体を破砕する。続いて遠心分離などに
より細胞片などの固形物を除き、粗酵素液を得る。次に
この粗酵素液を硫安沈殿法により分画し、メルカプトエ
タノール、EDTAの添加による透析、アフィニテイクロマ
トグラフィー等によって均一の結晶酵素標品を単離する
ことができる。
次に本発明のＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ
の活性測定法について説明する。
の活性測定法について説明する。
ナーゼの活性測定法について説明する。
酸化的脱アミノ反応においては、補酵素NAD+と基質を含
む表−３の１に示すような反応液を、一方、還元的アミ
ノ化反応においては補酵素NADHと基質を含む表−３の２
に示すような反応液を２〜３分間、37℃でインキュベー
トし、それぞれの反応に伴うNADHの増減量を定量するこ
とで反応速度を決定する。ただし反応の開始は補酵素で
行なう。NADHは340nmに吸収極大を持つスペクトルを示
すので、この340nmの経時的な変化量を分光光度計で測
定する。測定においては、吸収が直線的に増減するよう
酵素量を加減して使用する。
む表−３の１に示すような反応液を、一方、還元的アミ
ノ化反応においては補酵素NADHと基質を含む表−３の２
に示すような反応液を２〜３分間、37℃でインキュベー
トし、それぞれの反応に伴うNADHの増減量を定量するこ
とで反応速度を決定する。ただし反応の開始は補酵素で
行なう。NADHは340nmに吸収極大を持つスペクトルを示
すので、この340nmの経時的な変化量を分光光度計で測
定する。測定においては、吸収が直線的に増減するよう
酵素量を加減して使用する。
本酵素における酵素活性単位は、１μmol/minのNADH
を生成する酵素量を1unit（単位）と定義する。比活性
は酵素タンパク質1mgあたりの単位数で表わす。
を生成する酵素量を1unit（単位）と定義する。比活性
は酵素タンパク質1mgあたりの単位数で表わす。
次に実施例によって、本発明のＬ−フェニルアラニン
デヒドロゲナーゼの製造方法を詳細に説明するが本発明
はこれに限定されるものではない。
デヒドロゲナーゼの製造方法を詳細に説明するが本発明
はこれに限定されるものではない。
（実施例） 第１段階 サーモアクチノマイセス・インターメディウスATCC33
205を表−４に示す培地に白金耳で植菌し、50℃で７時
間振盪培養した。菌体を含む培地を遠心分離（8000G、1
0分間）して集菌し、0.85％食塩水により洗浄した後、
菌体を0.01％２−メルカプトエタノール、1mM EDTAを含
む10mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.2）に懸濁し、氷冷
しながら超音波破砕器により破砕した。さらに、20000
G、20分間の条件で遠心分離機により沈降させ、上清液
を粗酵素液として分離した。
205を表−４に示す培地に白金耳で植菌し、50℃で７時
間振盪培養した。菌体を含む培地を遠心分離（8000G、1
0分間）して集菌し、0.85％食塩水により洗浄した後、
菌体を0.01％２−メルカプトエタノール、1mM EDTAを含
む10mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.2）に懸濁し、氷冷
しながら超音波破砕器により破砕した。さらに、20000
G、20分間の条件で遠心分離機により沈降させ、上清液
を粗酵素液として分離した。
表−４ ペプトン 5g グリセリン 5g KH2PO4 1g K2HPO4 2g MgSO4・７H2O 0.1g CaCl2 0.05g 酵母エキス 2g 肉エキス 2g ビオチン ９μg Ｌ−チロシン 0.4g NH4Cl 5g H2O １ pH7.2 第２段階 第１段階で得られた粗酵素液を氷冷しながら撹拌し、
硫安を最終濃度が25％飽和になるように、徐々に酵素液
に添加した。酵素液のpHが低下した場合14％アンモニア
水を添加しpH7〜８に調製した。次にこの溶液を遠心分
離（10000G、10分間）し、沈殿を除去した。上清液に、
最終濃度が60％飽和になるように硫安を添加し、上記と
同様にして、沈殿と上清とを分けた。この沈殿をできる
限り少量の0.01％２−メルカプトエタノール、1mM EDTA
を含む10mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.2）に溶解し、
同じ組成の緩衝液（pH6.7）１で２回約20時間、低温
室（５〜10℃）でスターラーで撹拌しながら透析し、透
析した酵素液を得た。
硫安を最終濃度が25％飽和になるように、徐々に酵素液
に添加した。酵素液のpHが低下した場合14％アンモニア
水を添加しpH7〜８に調製した。次にこの溶液を遠心分
離（10000G、10分間）し、沈殿を除去した。上清液に、
最終濃度が60％飽和になるように硫安を添加し、上記と
同様にして、沈殿と上清とを分けた。この沈殿をできる
限り少量の0.01％２−メルカプトエタノール、1mM EDTA
を含む10mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.2）に溶解し、
同じ組成の緩衝液（pH6.7）１で２回約20時間、低温
室（５〜10℃）でスターラーで撹拌しながら透析し、透
析した酵素液を得た。
第３段階 第２段階で得られた透析した酵素液を、あらかじめ0.
01％２−メルカプトエタノール、1mM EDTAを含む10mMリ
ン酸カリウム緩衝液（pH6.7）で平衡化したレッドセフ
ァロース4Bカラム（径３×22cm）に吸着させ、0.01％２
−メルカプトエタノール、1mM EDTAを含む10mMリン酸カ
リウム緩衝液（pH6.7）500mlを用いて非吸着蛋白質を洗
浄した。その後0.1M NaCl、0.3M NaClをそれぞれ加えた
0.01％２−メルカプトエタノール、1mM EDTAを含む10mM
リン酸カリウム緩衝液（pH6.7）500mlを段階的に流しフ
ェニルアラニンデヒド□ゲナーゼを溶出させた。
01％２−メルカプトエタノール、1mM EDTAを含む10mMリ
ン酸カリウム緩衝液（pH6.7）で平衡化したレッドセフ
ァロース4Bカラム（径３×22cm）に吸着させ、0.01％２
−メルカプトエタノール、1mM EDTAを含む10mMリン酸カ
リウム緩衝液（pH6.7）500mlを用いて非吸着蛋白質を洗
浄した。その後0.1M NaCl、0.3M NaClをそれぞれ加えた
0.01％２−メルカプトエタノール、1mM EDTAを含む10mM
リン酸カリウム緩衝液（pH6.7）500mlを段階的に流しフ
ェニルアラニンデヒド□ゲナーゼを溶出させた。
第４段階 第３段階で得られた酸素溶液を１の0.01％２−メル
カプトエタノール、1mM EDTAを含む10mMリン酸カリウム
緩衝液（pH6.7）で２回約20時間透析した後、限外濾過
器（濾紙UHP43、UP20）で濃縮した。
カプトエタノール、1mM EDTAを含む10mMリン酸カリウム
緩衝液（pH6.7）で２回約20時間透析した後、限外濾過
器（濾紙UHP43、UP20）で濃縮した。
得られた濃縮液をスラブゲル（厚さ１×10×10cm:7.5
％ポリアクリルアミドゲルpH8.9）を用いて約６時間電
気泳動した後、速やかに一端を5mm幅で切り取り活性染
色を行った。その断片を元に戻し、活性バンドを指標に
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ部分を切り取った。
得られたゲルを氷冷しながら、ポッター型テフロンホモ
ジナイザーですりつぶし、1mM EDTAを含む10mMリン酸カ
リウム緩衝液（pH7.2）を用いて酵素を抽出した。次
に、この抽出液を遠心分離（10000G、10分間）し、上清
を酵素液として得た。
％ポリアクリルアミドゲルpH8.9）を用いて約６時間電
気泳動した後、速やかに一端を5mm幅で切り取り活性染
色を行った。その断片を元に戻し、活性バンドを指標に
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ部分を切り取った。
得られたゲルを氷冷しながら、ポッター型テフロンホモ
ジナイザーですりつぶし、1mM EDTAを含む10mMリン酸カ
リウム緩衝液（pH7.2）を用いて酵素を抽出した。次
に、この抽出液を遠心分離（10000G、10分間）し、上清
を酵素液として得た。
次に第１〜４段階の各精製段階で得られた酵素液につ
いて、総タンパク質量、総活性および比活性を測定し
た。その結果を表−５に示す。総タンパク質量の測定
は、第１〜３段階についてはKalb and Bernlohrによる
方法で、また、第４段階についてはFolin-Lowry法で行
った。総活性の測定は、前述した活性測定法に従って行
った。
いて、総タンパク質量、総活性および比活性を測定し
た。その結果を表−５に示す。総タンパク質量の測定
は、第１〜３段階についてはKalb and Bernlohrによる
方法で、また、第４段階についてはFolin-Lowry法で行
った。総活性の測定は、前述した活性測定法に従って行
った。
続いて、第４段階で得られた酵素液についてDavis an
d Ornstein法により純度の検定を行った。すなわちガラ
スチューブ（径0.5×7.5cm）で、7.5％（W/V）ポリアク
リルアミドゲル（pH9.4）を作り、１本あたり2mAの電流
を流し、約１時間電気泳動を行った。
d Ornstein法により純度の検定を行った。すなわちガラ
スチューブ（径0.5×7.5cm）で、7.5％（W/V）ポリアク
リルアミドゲル（pH9.4）を作り、１本あたり2mAの電流
を流し、約１時間電気泳動を行った。
タンパク質染色はCoomasie brilliant blue R-250
で、また活性染色は表−６に示す反応液を用いて37℃に
おいてPMS（フェナジンメトサルフェイト）−INT（ヨー
ドニトロテトラゾリウム）法で行なった。その後、脱色
液（10％（V/V）酢酸＋10％（V/V）エチルアルコール）
で脱色し、純度検定を行なった。
で、また活性染色は表−６に示す反応液を用いて37℃に
おいてPMS（フェナジンメトサルフェイト）−INT（ヨー
ドニトロテトラゾリウム）法で行なった。その後、脱色
液（10％（V/V）酢酸＋10％（V/V）エチルアルコール）
で脱色し、純度検定を行なった。
その結果、タンパク染色、活性染色共に、バンドが１
本となり、Rf値も一致した。これより、本酵素の精製に
成功したことがわかった。
本となり、Rf値も一致した。これより、本酵素の精製に
成功したことがわかった。
（効果） 本発明のＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼは、
従来のものと比較して、 耐熱性に非常に優れている。
従来のものと比較して、 耐熱性に非常に優れている。
Ｌ−フェニルアラニン、フェニルピルビン酸に対し
て基質特異性が非常に高い。
て基質特異性が非常に高い。
安定pH範囲が広い。
というメリットを有するものである。これらの性質を有
する本発明のＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ
は、Ｌ−フェニルアラニンの製造、Ｌ−フェニルアラニ
ンおよびフェニルピルビン酸の定量等に極めて有用であ
る。
する本発明のＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ
は、Ｌ−フェニルアラニンの製造、Ｌ−フェニルアラニ
ンおよびフェニルピルビン酸の定量等に極めて有用であ
る。
フェニルケトン尿症は、肝臓のフェニルアラニンヒド
ロキシラーゼの欠如によって血中のフェニルアラニン濃
度および尿中のフェニルピルビン酸等のフェニルケトン
体濃度の上昇をもたらし、精神発育遅帯を招く遺伝性ア
ミノ酸代謝異常症であり、このフェニルケトン尿症の診
断は血中フェニルアラニン濃度または尿中フェニルピル
ビン酸濃度を測定することによって行うことができる
が、本発明のＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ
は、前述したような非常に優れた性質を有するものであ
るため、フェニルケトン尿症の診断としてのフェニルア
ラニンおよびフェニルピルビン酸の微量定量にも大変有
用である。
ロキシラーゼの欠如によって血中のフェニルアラニン濃
度および尿中のフェニルピルビン酸等のフェニルケトン
体濃度の上昇をもたらし、精神発育遅帯を招く遺伝性ア
ミノ酸代謝異常症であり、このフェニルケトン尿症の診
断は血中フェニルアラニン濃度または尿中フェニルピル
ビン酸濃度を測定することによって行うことができる
が、本発明のＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ
は、前述したような非常に優れた性質を有するものであ
るため、フェニルケトン尿症の診断としてのフェニルア
ラニンおよびフェニルピルビン酸の微量定量にも大変有
用である。
図−１は、本発明のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ
の至適pHを示す図である。 図−２は、本発明のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ
の安定pH範囲を示す図である。 図−３は、本発明のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ
の熱安定性を示す図である。
の至適pHを示す図である。 図−２は、本発明のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ
の安定pH範囲を示す図である。 図−３は、本発明のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ
の熱安定性を示す図である。
Claims (3)
- 【請求項１】次の理化学的性質を有するＬ−フェニルア
ラニンデヒドロゲナーゼ （ａ）作用： １モルのＬ−フェニルアラニン、１モルのNAD+及び１モ
ルの水から、１モルのフェニルピルビン酸、１モルのNA
DH及び１モルのアンモニウムイオンを生成する反応（酸
化的脱アミノ反応）、並びにこの逆反応（還元的アミノ
化反応）を触媒する。 （ｂ）基質特異性： 酸化的脱アミノ反応では、Ｌ−フェニルアラニンに特異
的に作用し、他のアミノ酸には極めてわずかしか作用し
ない、または全く作用しない。 還元的アミノ化反応では、フェニルピルビン酸に特異的
に作用し、他のα−ケト酸には極めてわずかしか作用し
ない、または全く作用しない。 （ｃ）至適pH: 酸化的脱アミノ反応では、pH10.8付近、還元的アミノ化
反応では、pH9.2付近。 （ｄ）安定pH範囲： 50℃10分間の処理でpH5.5〜10.8の範囲で活性の低下は
全くみられない。 70℃10分間の処理でpH5.5〜9.8の範囲で活性の低下は全
くみられない。 （ｅ）熱安定性： 70℃60分間の処理で活性の低下は全くみられない。 75℃30分間の処理で活性は約25％残存する。 （ｆ）分子量： 全分子量は約27〜29万（ゲル濾過法）。 サブユニットの分子量は47000（同一サブユニットの６
量体構造）。 - 【請求項２】サーモアクチノマイセス（Thermoactinomy
ces）属に属するＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナー
ゼ生産菌を培養し、培養物から次の理化学的性質を有す
るＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ （ａ）作用： １モルのＬ−フェニルアラニン、１モルのNAD+及び１モ
ルの水から、１モルのフェニルピルビン酸、１モルのNA
DH及び１モルのアンモニウムイオンを生成する反応（酸
化的脱アミノ反応）、並びにこの逆反応（還元的アミノ
化反応）を触媒する。 （ｂ）基質特異性： 酸化的脱アミノ反応では、Ｌ−フェニルアラニンに特異
的に作用し、他のアミノ酸には極めてわずかしか作用し
ない、または全く作用しない。 還元的アミノ化反応では、フェニルピルビン酸に特異的
に作用し、他のα−ケト酸には極めてわずかしか作用し
ない、または全く作用しない。 （ｃ）至適pH: 酸化的脱アミノ反応では、pH10.8付近、還元的アミノ化
反応では、pH9.2付近。 （ｄ）安定pH範囲： 50℃10分間の処理でpH5.5〜10.8の範囲で活性の低下は
全くみられない。 70℃10分間の処理でpH5.5〜9.8の範囲で活性の低下は全
くみられない。 （ｅ）熱安定性： 70℃60分間の処理で活性の低下は全くみられない。 75℃30分間の処理で活性は約25％残存する。 （ｆ）分子量： 全分子量は約27〜29万（ゲル濾過法）。 サブユニットの分子量は47000（同一サブユニットの６
量体構造）。 を採取することを特徴とするＬ−フェニルアラニンデヒ
ドロゲナーゼの製造方法。 - 【請求項３】サーモアクチノマイセス属に属するＬ−フ
ェニルアラニンデヒドロゲナーゼ生産菌がサーモアクチ
ノマイセス・インターメデイウス（Termoactinomyces i
ntermedius）ATCC33205である特許請求の範囲第２項記
載の製造方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62140706A JPH0829079B2 (ja) | 1987-06-04 | 1987-06-04 | Ｌ−フェニルアラニンデヒドロゲナ−ゼおよびその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62140706A JPH0829079B2 (ja) | 1987-06-04 | 1987-06-04 | Ｌ−フェニルアラニンデヒドロゲナ−ゼおよびその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63304980A JPS63304980A (ja) | 1988-12-13 |
| JPH0829079B2 true JPH0829079B2 (ja) | 1996-03-27 |
Family
ID=15274834
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62140706A Expired - Lifetime JPH0829079B2 (ja) | 1987-06-04 | 1987-06-04 | Ｌ−フェニルアラニンデヒドロゲナ−ゼおよびその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0829079B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010067578A1 (ja) | 2008-12-09 | 2010-06-17 | 株式会社カネカ | 新規なアミノ酸脱水素酵素、およびｌ－アミノ酸、２－オキソ酸、又はｄ－アミノ酸の製造方法 |
| CN109517778B (zh) * | 2018-12-20 | 2021-03-02 | 江南大学 | 一种枯草芽孢杆菌全细胞转化苯丙氨酸生产苯乳酸的方法 |
-
1987
- 1987-06-04 JP JP62140706A patent/JPH0829079B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63304980A (ja) | 1988-12-13 |
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