JPH0779690B2 - 新規エステラーゼ及びその製法 - Google Patents
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- JPH0779690B2 JPH0779690B2 JP3125598A JP12559891A JPH0779690B2 JP H0779690 B2 JPH0779690 B2 JP H0779690B2 JP 3125598 A JP3125598 A JP 3125598A JP 12559891 A JP12559891 A JP 12559891A JP H0779690 B2 JPH0779690 B2 JP H0779690B2
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規エステラーゼ及び
その製法に関する。
その製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、有機合成反応、例えば加水分解反
応にエステラーゼ等の酵素を利用する試みが盛んに行わ
れている。しかし、かかる目的に多く使用される豚肝臓
由来のエステラーゼは高価であり、また多量に消費する
工業的用途には適さない。一方、微生物由来のエステラ
ーゼとしては、例えば，Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇ
ｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ ＩＦ０ １２９５８（特開平１
−１８１７８８）（分子量：４３，０００）、 Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ１ｕｓ
（Ａｒｃｈｉｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１
６０、５０４−５１３（１９７４））（分子量：４７，
０００）、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ Ｃａｎｄｉｄｕｍ
（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７（６）、１４
５７−１４６４（１９７３））（分子量：５３，０００
−５５，０００）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕ
ｇｉｎｏｓａ（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８６、６４３−６
５６（１９７９））（分子量：５５，０００）、Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．９５、１０４７−１０５４（１９８４））
（分子量：４８，０００）等に由来するものが知られて
いるが、これらの酵素は各々基質特異性を有し、繁用性
に欠けるという難点がある。
応にエステラーゼ等の酵素を利用する試みが盛んに行わ
れている。しかし、かかる目的に多く使用される豚肝臓
由来のエステラーゼは高価であり、また多量に消費する
工業的用途には適さない。一方、微生物由来のエステラ
ーゼとしては、例えば，Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇ
ｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ ＩＦ０ １２９５８（特開平１
−１８１７８８）（分子量：４３，０００）、 Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ１ｕｓ
（Ａｒｃｈｉｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１
６０、５０４−５１３（１９７４））（分子量：４７，
０００）、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ Ｃａｎｄｉｄｕｍ
（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７（６）、１４
５７−１４６４（１９７３））（分子量：５３，０００
−５５，０００）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕ
ｇｉｎｏｓａ（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８６、６４３−６
５６（１９７９））（分子量：５５，０００）、Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．９５、１０４７−１０５４（１９８４））
（分子量：４８，０００）等に由来するものが知られて
いるが、これらの酵素は各々基質特異性を有し、繁用性
に欠けるという難点がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、豚肝臓エス
テラーゼと同様に、有機合成反応に広く適用しうる繁用
性のある微生物起源の新規エステラーゼ及びその製法を
提供するものである。
テラーゼと同様に、有機合成反応に広く適用しうる繁用
性のある微生物起源の新規エステラーゼ及びその製法を
提供するものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は次の理化学的性
状をもつ新規エステラーゼに関する。
状をもつ新規エステラーゼに関する。
【０００５】（１）作用有機カルボン酸エステルのエス
テル結合を加水分解する。
テル結合を加水分解する。
【０００６】（２）基質特異性有機カルボン酸のアルキ
ルエステル、トリグリセライド及びチオールエステルに
作用する。例えば、本発明のエステラーゼは低級脂肪
酸、高級脂肪酸、低級アルコキシ基置換フェニルグリシ
ッド酸等各種有機カルボン酸の低級アルキルエステル及
び高級アルキルエステルのいずれに対しても優れた加水
分解能を示し、またトリグリセライド、例えば水溶性の
低級脂肪酸トリグリセライド、水不溶性の高級脂肪酸ト
リグリセライドに対しても高い加水分解能を示す。ま
た、例えば三酪酸ジメルカプロール、ブチリルＣｏＡ、
パルミトイルＣｏＡ等の各種チオールエステルの加水分
解能をも併せ有する。なお、カゼインに対しては加水分
解能を有しない。
ルエステル、トリグリセライド及びチオールエステルに
作用する。例えば、本発明のエステラーゼは低級脂肪
酸、高級脂肪酸、低級アルコキシ基置換フェニルグリシ
ッド酸等各種有機カルボン酸の低級アルキルエステル及
び高級アルキルエステルのいずれに対しても優れた加水
分解能を示し、またトリグリセライド、例えば水溶性の
低級脂肪酸トリグリセライド、水不溶性の高級脂肪酸ト
リグリセライドに対しても高い加水分解能を示す。ま
た、例えば三酪酸ジメルカプロール、ブチリルＣｏＡ、
パルミトイルＣｏＡ等の各種チオールエステルの加水分
解能をも併せ有する。なお、カゼインに対しては加水分
解能を有しない。
【０００７】（３）至適ｐＨ及びｐＨ安定性オリーブ油
を基質とした時の加水分解の至適ｐＨは、７．５−９．
０であり、３０℃、１時間保存後の残存活性は、ｐＨ５
−９では９５％以上である。
を基質とした時の加水分解の至適ｐＨは、７．５−９．
０であり、３０℃、１時間保存後の残存活性は、ｐＨ５
−９では９５％以上である。
【０００８】（４）至適温度及び熱安定性オリーブ油を
基質とした時の加水分解の至適温度は、１００ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液ｐＨ８．０中で４０−５０℃である。同緩
衝液中で、３０分間各温度で処理した後の残存活性は、
５０℃以下で１００％である。
基質とした時の加水分解の至適温度は、１００ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液ｐＨ８．０中で４０−５０℃である。同緩
衝液中で、３０分間各温度で処理した後の残存活性は、
５０℃以下で１００％である。
【０００９】（５）力価測定法 （ａ）オリーブ油に対する力価測定法：オリーブ油を基
質とし、ｐＨ８．０、３７℃で２０分間酵素反応させ、
１分間に１μｍｏｌの脂肪酸を遊離する酵素量を１単位
とする（実施例１参照）。 （ｂ）トリグリセライド、脂肪酸エステルに対する力価
測定法：トリグリセライド又は脂肪酸エステルを基質と
し、ｐＨ８．０、３７℃で１０分間酵素反応させ、１分
間に１μｍｏｌの脂肪酸を遊離する酵素量を１単位とす
る（実施例３参照）。 （ｃ）チオールエステルに対する力価測定法：三酪酸ジ
メルカプロールを基質とし、ｐＨ８．５、３０℃で１０
分間酵素反応させ、反応終了後、発色剤である５，５’
−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）と反応させ、遊離
する５−チオ−２−ニトロ安息香酸の量を分光光度計で
測定する。活性は１分間に１μｍｏｌの５−チオ−２−
ニトロ安息香酸を遊離する酵素量を１単位とする（実施
例４参照）。
質とし、ｐＨ８．０、３７℃で２０分間酵素反応させ、
１分間に１μｍｏｌの脂肪酸を遊離する酵素量を１単位
とする（実施例１参照）。 （ｂ）トリグリセライド、脂肪酸エステルに対する力価
測定法：トリグリセライド又は脂肪酸エステルを基質と
し、ｐＨ８．０、３７℃で１０分間酵素反応させ、１分
間に１μｍｏｌの脂肪酸を遊離する酵素量を１単位とす
る（実施例３参照）。 （ｃ）チオールエステルに対する力価測定法：三酪酸ジ
メルカプロールを基質とし、ｐＨ８．５、３０℃で１０
分間酵素反応させ、反応終了後、発色剤である５，５’
−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）と反応させ、遊離
する５−チオ−２−ニトロ安息香酸の量を分光光度計で
測定する。活性は１分間に１μｍｏｌの５−チオ−２−
ニトロ安息香酸を遊離する酵素量を１単位とする（実施
例４参照）。
【００１０】（６）分子量６２，０００±２，０００
（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）
（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）
【００１１】（７）等電点４．６±０．１
【００１２】（８）金属イオン等による影響 １ｍＭのカルシウムイオン存在下で活性化されると共
に、１ｍＭの亜鉛イオン、銅イオン、マンガンイオン存
在下で４０〜９０％阻害され、１ｍＭのコバルトイオ
ン、ニッケルイオン、二価及び三価の鉄イオン、ＥＤＴ
Ａ存在下では完全に活性は阻害される。上記の如き性状
を有する本発明のエステラーゼは、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミド電気泳動法にて分子量が６２，０００±２，０
００を示し、かつ等電点が４．６±０．１である点で、
従来公知のエステラーゼとは明らかに異なっている。
に、１ｍＭの亜鉛イオン、銅イオン、マンガンイオン存
在下で４０〜９０％阻害され、１ｍＭのコバルトイオ
ン、ニッケルイオン、二価及び三価の鉄イオン、ＥＤＴ
Ａ存在下では完全に活性は阻害される。上記の如き性状
を有する本発明のエステラーゼは、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミド電気泳動法にて分子量が６２，０００±２，０
００を示し、かつ等電点が４．６±０．１である点で、
従来公知のエステラーゼとは明らかに異なっている。
【００１３】本発明によれば、上記性状を有する新規エ
ステラーゼは、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属に属す
る微生物を培養し、培養菌体内外に本酵素を蓄積せし
め、これを分離・採取して製造することができる。かか
る新規エステラーゼ産生菌としては、セラチア属に属
し、上記性状をもつ酵素を産生する能力を持つ菌であれ
ばいかなるものも使用でき、具体的には、例えばセラチ
ア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓ
ｃｅｎｓ）Ｓｒ４１（微工研条寄第４８７号）、その変
異株、変種等があげられる。また、本発明は、上記セラ
チア属微生物に限定されるものではなく、これら菌株を
用いて得られる遺伝子組換え微生物を含め、上記性状の
酵素を産生する菌をも用いることができる。
ステラーゼは、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属に属す
る微生物を培養し、培養菌体内外に本酵素を蓄積せし
め、これを分離・採取して製造することができる。かか
る新規エステラーゼ産生菌としては、セラチア属に属
し、上記性状をもつ酵素を産生する能力を持つ菌であれ
ばいかなるものも使用でき、具体的には、例えばセラチ
ア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓ
ｃｅｎｓ）Ｓｒ４１（微工研条寄第４８７号）、その変
異株、変種等があげられる。また、本発明は、上記セラ
チア属微生物に限定されるものではなく、これら菌株を
用いて得られる遺伝子組換え微生物を含め、上記性状の
酵素を産生する菌をも用いることができる。
【００１４】培地としては、本エステラーゼ産生微生物
が生育・増殖しうるものであれば、いずれの培地をも用
いることができる。例えば、炭素源としてはブドウ糖、
庶糖、糖密の如き糖類、フマル酸やクエン酸の如き有機
酸またはグリセロールの如きアルコール類、アラニン、
グルタミン、アスパラギンなどのアミノ酸を、窒素源と
しては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムの如き無
機アンモニウム塩または尿素、或はペプトン、コーン・
スティープ・リカー、酵母エキス、カゼイン加水分解物
などを好適に用いることができる。炭素源は、通常、培
地に対し、１−１５重量％、窒素源は０．１−２．０重
量％の範囲で用いるのが好ましい。また培地には必要に
応じて、燐酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、カルシ
ウム塩等の無機塩、鉄、マンガン、銅、亜鉛等の金属イ
オンを適当量添加してもよい。合成培地を用いる場合に
は、必要に応じて、例えば、ビオチンやチアミン等のビ
タミン類或はカルニチン等の生育促進物質を添加しても
よい。さらに、必要に応じて、植物油、界面活性剤等の
酵素誘導物質、消泡剤を添加してもよい。これらの培地
は、ｐＨ５−８に調整して用いるのが好ましい。
が生育・増殖しうるものであれば、いずれの培地をも用
いることができる。例えば、炭素源としてはブドウ糖、
庶糖、糖密の如き糖類、フマル酸やクエン酸の如き有機
酸またはグリセロールの如きアルコール類、アラニン、
グルタミン、アスパラギンなどのアミノ酸を、窒素源と
しては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムの如き無
機アンモニウム塩または尿素、或はペプトン、コーン・
スティープ・リカー、酵母エキス、カゼイン加水分解物
などを好適に用いることができる。炭素源は、通常、培
地に対し、１−１５重量％、窒素源は０．１−２．０重
量％の範囲で用いるのが好ましい。また培地には必要に
応じて、燐酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、カルシ
ウム塩等の無機塩、鉄、マンガン、銅、亜鉛等の金属イ
オンを適当量添加してもよい。合成培地を用いる場合に
は、必要に応じて、例えば、ビオチンやチアミン等のビ
タミン類或はカルニチン等の生育促進物質を添加しても
よい。さらに、必要に応じて、植物油、界面活性剤等の
酵素誘導物質、消泡剤を添加してもよい。これらの培地
は、ｐＨ５−８に調整して用いるのが好ましい。
【００１５】培養は上記培地に微生物を接種後、常法に
よって実施することができ、例えば振とう培養、通気撹
拌培養、静置培養、連続培養などのいずれの方法によっ
ても行うことができる。培養条件は、培地の種類、培養
法により適宜選択すれば良く、本菌株が増殖し、エステ
ラーゼを産生できる条件であれば特に制限はない。通常
は培養開始のｐＨを５〜８に調整し、室温〜加温下、例
えば２０〜４０℃で培養することが望ましい。培養日数
は通常１〜２日が適当である。
よって実施することができ、例えば振とう培養、通気撹
拌培養、静置培養、連続培養などのいずれの方法によっ
ても行うことができる。培養条件は、培地の種類、培養
法により適宜選択すれば良く、本菌株が増殖し、エステ
ラーゼを産生できる条件であれば特に制限はない。通常
は培養開始のｐＨを５〜８に調整し、室温〜加温下、例
えば２０〜４０℃で培養することが望ましい。培養日数
は通常１〜２日が適当である。
【００１６】以上のようにして培養菌体内外に産生され
たエステラーゼは公知の方法により分離、採取し、また
精製することができる。例えば、培地中に含まれるエス
テラーゼは無機塩類（例えば、硫酸アンモニウム、硫酸
アルカリ金属、ハロゲン化アルカリ金属等）による塩析
法、親水性有機溶媒（例えば、アルコール類、アセトン
等）による分画沈澱、イオン交換樹脂及び多種カラムク
ロマトグラフィーによる吸脱着法、ゲル濾過法、蛋白沈
澱剤（例えば、核酸、タンニン等）を利用する方法又は
これらを適宜組合せて分離、採取することができる。ま
たかくして得たエステラーゼは等電点沈澱法、透析法、
電気透析法、電気泳動法等によりさらに精製することが
できる。例えば、菌体を除いた培養液を３５〜４５％飽
和硫酸アンモニウムで塩析し、その沈澱を透析後、陰イ
オン交換樹脂（ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ、Ｍｏｎ
ｏＱ等）にて吸脱着する。その活性画分を透析後、疎水
性樹脂（Ｐｈｅｎｙｌ又はＢｕｔｙｌ−トヨパール６５
０Ｓ等）にて吸脱着する。さらに活性画分を透析・濃縮
後、ゲル濾過法（セファロース６、セファクリルＳ−３
００ＨＲ等）を用いることによって、ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動で単一バンドを示し、分子量６
２，０００±２，０００のポリペプチドである精製エス
テラーゼが得られる。なお、以下の実施例において、％
は、特に記載したものを除き、全てｗ／ｖ％を示す。
たエステラーゼは公知の方法により分離、採取し、また
精製することができる。例えば、培地中に含まれるエス
テラーゼは無機塩類（例えば、硫酸アンモニウム、硫酸
アルカリ金属、ハロゲン化アルカリ金属等）による塩析
法、親水性有機溶媒（例えば、アルコール類、アセトン
等）による分画沈澱、イオン交換樹脂及び多種カラムク
ロマトグラフィーによる吸脱着法、ゲル濾過法、蛋白沈
澱剤（例えば、核酸、タンニン等）を利用する方法又は
これらを適宜組合せて分離、採取することができる。ま
たかくして得たエステラーゼは等電点沈澱法、透析法、
電気透析法、電気泳動法等によりさらに精製することが
できる。例えば、菌体を除いた培養液を３５〜４５％飽
和硫酸アンモニウムで塩析し、その沈澱を透析後、陰イ
オン交換樹脂（ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ、Ｍｏｎ
ｏＱ等）にて吸脱着する。その活性画分を透析後、疎水
性樹脂（Ｐｈｅｎｙｌ又はＢｕｔｙｌ−トヨパール６５
０Ｓ等）にて吸脱着する。さらに活性画分を透析・濃縮
後、ゲル濾過法（セファロース６、セファクリルＳ−３
００ＨＲ等）を用いることによって、ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動で単一バンドを示し、分子量６
２，０００±２，０００のポリペプチドである精製エス
テラーゼが得られる。なお、以下の実施例において、％
は、特に記載したものを除き、全てｗ／ｖ％を示す。
【００１７】
【実施例】実施例１ デキストリン１％、硫酸アンモニウム０．２％、ミース
トＳ２％、燐酸一カリウム０．１％、硫酸マグネシウム
０．０５％、塩化カルシウム０．０１％、硫酸第一鉄
０．００１％、Ｔｗｅｅｎ８０ ０．５％ｖ／ｖ及びポ
リアルキレングリコール誘導体系界面活性剤（カラリン
１０２、三洋化成工業社製）０．１％ｖ／ｖよりなる液
体培地２０１（ｐＨ７．０）を３０１容ジャーファーメ
ンターに入れ滅菌後、あらかじめ同培地で、３０℃、２
０時間往復振とう培養したセラチア・マルセッセンスＳ
ｒ４１（微工研条寄第４８７号）の前培養液２００ｍｌ
を接種し、３０℃で２００ｒｐｍ、０．５ｖｖｍで攪
拌、通気を行い、１８時間培養した。この培養液を遠心
分離し、得られた上清液４．５リットルを４５％飽和硫
酸アンモニウムで塩析した。生じた沈澱をセライト濾過
して集め、水で溶出し、透析後、凍結乾燥して１８，６
００単位／ｇの活性を持つエステラーゼ４．１ｇを粗酵
素粉末として得た。なお、酵素活性は下記方法により測
定した。
トＳ２％、燐酸一カリウム０．１％、硫酸マグネシウム
０．０５％、塩化カルシウム０．０１％、硫酸第一鉄
０．００１％、Ｔｗｅｅｎ８０ ０．５％ｖ／ｖ及びポ
リアルキレングリコール誘導体系界面活性剤（カラリン
１０２、三洋化成工業社製）０．１％ｖ／ｖよりなる液
体培地２０１（ｐＨ７．０）を３０１容ジャーファーメ
ンターに入れ滅菌後、あらかじめ同培地で、３０℃、２
０時間往復振とう培養したセラチア・マルセッセンスＳ
ｒ４１（微工研条寄第４８７号）の前培養液２００ｍｌ
を接種し、３０℃で２００ｒｐｍ、０．５ｖｖｍで攪
拌、通気を行い、１８時間培養した。この培養液を遠心
分離し、得られた上清液４．５リットルを４５％飽和硫
酸アンモニウムで塩析した。生じた沈澱をセライト濾過
して集め、水で溶出し、透析後、凍結乾燥して１８，６
００単位／ｇの活性を持つエステラーゼ４．１ｇを粗酵
素粉末として得た。なお、酵素活性は下記方法により測
定した。
【００１８】（活性測定法）２％ポリビニルアルコール
（ポバール１１７、クラレ社製）２２５ｍｌと局方品オ
リーブ油７５ｍｌの混液を５−１０℃にて１０分間、１
４，５００ｒｐｍで乳化し、得られたオリーブ油乳化液
５．０ｍｌと０．２５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）４．０ｍｌ（２．５ｍＭ塩化カルシウムを含む）を
３７℃で１０分間、予熱しておく。これに１ｍｌの酵素
液を加え、３７℃で２０分間反応させた後、アセトン−
エタノール混液２０ｍｌを加えて反応を停止し、フェノ
ールフタレインを指示薬として０．０５Ｎ Ｎａ０Ｈ溶
液で滴定する。ブランクとして、先にアセトン−エタノ
ールを加えた後、酵素液を加え、同様に滴定する。以上
の方法で１分間に１μｍｏｌの脂肪酸を遊離する酵素量
を１単位とした。
（ポバール１１７、クラレ社製）２２５ｍｌと局方品オ
リーブ油７５ｍｌの混液を５−１０℃にて１０分間、１
４，５００ｒｐｍで乳化し、得られたオリーブ油乳化液
５．０ｍｌと０．２５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）４．０ｍｌ（２．５ｍＭ塩化カルシウムを含む）を
３７℃で１０分間、予熱しておく。これに１ｍｌの酵素
液を加え、３７℃で２０分間反応させた後、アセトン−
エタノール混液２０ｍｌを加えて反応を停止し、フェノ
ールフタレインを指示薬として０．０５Ｎ Ｎａ０Ｈ溶
液で滴定する。ブランクとして、先にアセトン−エタノ
ールを加えた後、酵素液を加え、同様に滴定する。以上
の方法で１分間に１μｍｏｌの脂肪酸を遊離する酵素量
を１単位とした。
【００１９】実施例２ 実施例１に準じて得た培養上清液１０，０００ｍｌを４
５％飽和硫酸アンモニウムで塩析した。沈殿物として得
たエステラーゼを２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）に溶解し、透析して脱塩後、同一緩衝液で平衡化し
た陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ、
東洋曹達工業（株）製）に加えた。２０ｍＭトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７．５）で充分に非吸着分を除いた後、０
−１．０Ｍ塩化ナトリウム直線濃度勾配法にて溶出を行
った。その結果、エステラーゼが０．２７Ｍ塩化ナトリ
ウム付近に溶出した。活性画分を集め、２０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析後、同一緩衝液で平衡
化した強陰イオン交換樹脂（ＭｏｎｏＱ、ファルマシア
社製）に加えた。同一緩衝液で充分に非吸着分を除いた
後、０−０．６Ｍ塩化ナトリウム直線濃度勾配法にて溶
出した。その結果、エステラーゼが０．３５Ｍ塩化ナト
リウム付近に溶出した。活性画分を集め、５％飽和硫酸
アンモニウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）にて透析後、同一緩衝液で平衡化した疎水性樹
脂（Ｂｕｔｙｌ−トヨパール６５０Ｓ，東洋曹達工業
（株）製）に加えた。同一緩衝液で充分に非吸着分を除
いた後、５−０％飽和硫酸アンモニウム直線濃度勾配法
にて溶出を行った。活性画分を集め、０．１５Ｍ塩化ナ
トリウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で透析、濃縮後、同一緩衝液にて平衡化した分子篩
樹脂（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６、ファルマシア社製）にて
ゲル濾過を行った。かくして、精製エステラーゼ蛋白５
６．８ｍｇを得た。
５％飽和硫酸アンモニウムで塩析した。沈殿物として得
たエステラーゼを２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）に溶解し、透析して脱塩後、同一緩衝液で平衡化し
た陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ、
東洋曹達工業（株）製）に加えた。２０ｍＭトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７．５）で充分に非吸着分を除いた後、０
−１．０Ｍ塩化ナトリウム直線濃度勾配法にて溶出を行
った。その結果、エステラーゼが０．２７Ｍ塩化ナトリ
ウム付近に溶出した。活性画分を集め、２０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析後、同一緩衝液で平衡
化した強陰イオン交換樹脂（ＭｏｎｏＱ、ファルマシア
社製）に加えた。同一緩衝液で充分に非吸着分を除いた
後、０−０．６Ｍ塩化ナトリウム直線濃度勾配法にて溶
出した。その結果、エステラーゼが０．３５Ｍ塩化ナト
リウム付近に溶出した。活性画分を集め、５％飽和硫酸
アンモニウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）にて透析後、同一緩衝液で平衡化した疎水性樹
脂（Ｂｕｔｙｌ−トヨパール６５０Ｓ，東洋曹達工業
（株）製）に加えた。同一緩衝液で充分に非吸着分を除
いた後、５−０％飽和硫酸アンモニウム直線濃度勾配法
にて溶出を行った。活性画分を集め、０．１５Ｍ塩化ナ
トリウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で透析、濃縮後、同一緩衝液にて平衡化した分子篩
樹脂（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６、ファルマシア社製）にて
ゲル濾過を行った。かくして、精製エステラーゼ蛋白５
６．８ｍｇを得た。
【００２０】この精製エステラーゼは、ゲル濾過法にて
分子量約５９０，０００を示し、ＳＤＳ−ポリアクリル
アミド電気泳動法にて分子量約６２，０００を示した。
また、上記各精製過程における比活性及び回収率は、下
記第１表の通りである（酵素活性は実施例１記載の方法
で測定し、蛋白量はローリー法で測定）。なお、上記精
製エステラーゼは、カゼインを基質とした場合には、プ
ロテアーゼ活性が認められなかった。
分子量約５９０，０００を示し、ＳＤＳ−ポリアクリル
アミド電気泳動法にて分子量約６２，０００を示した。
また、上記各精製過程における比活性及び回収率は、下
記第１表の通りである（酵素活性は実施例１記載の方法
で測定し、蛋白量はローリー法で測定）。なお、上記精
製エステラーゼは、カゼインを基質とした場合には、プ
ロテアーゼ活性が認められなかった。
【００２１】
【表１】
【００２２】実施例３ 実施例２で得た精製エステラーゼを用い、下記活性測定
法により、各種トリグリセライド及び脂肪酸エステルに
対する基質特異性を調べた。（トリグリセライド、脂肪
酸エステルの加水分解活性測定法）１００ｍｌ三角フラ
スコ中に０．２ｇの各基質と０．２Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）４ｍｌと６ｍＭ塩化カルシウム溶液１ｍ
ｌを添加し、３７℃ １０分間予熱しておく。これに１
ｍｌの酵素溶液を加えて１分間に８０回振とうしながら
３７℃で１０分間反応させた後、アセトン−エタノール
混液２０ｍｌを加えて反応を停止し、フェノールフタレ
インを指示薬として、０．０５Ｎ水酸化ナトリウム溶液
で滴定する。ブランクとして、先にアセトン−エタノー
ルを加えた後、酵素液を加え、同様に滴定する。以上の
方法で１分間に１μｍｏｌの脂肪酸を遊離する酵素量を
１単位とした。 （結果）結果は下記第２〜３表の通りである。なお、表
２中の酵素活性は、ｎ−カプリル酸メチルを１００とし
たときの相対値（％）で、表３中の酵素活性は、トリカ
プリリンを１００としたときの相対値（％）で表した。
法により、各種トリグリセライド及び脂肪酸エステルに
対する基質特異性を調べた。（トリグリセライド、脂肪
酸エステルの加水分解活性測定法）１００ｍｌ三角フラ
スコ中に０．２ｇの各基質と０．２Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）４ｍｌと６ｍＭ塩化カルシウム溶液１ｍ
ｌを添加し、３７℃ １０分間予熱しておく。これに１
ｍｌの酵素溶液を加えて１分間に８０回振とうしながら
３７℃で１０分間反応させた後、アセトン−エタノール
混液２０ｍｌを加えて反応を停止し、フェノールフタレ
インを指示薬として、０．０５Ｎ水酸化ナトリウム溶液
で滴定する。ブランクとして、先にアセトン−エタノー
ルを加えた後、酵素液を加え、同様に滴定する。以上の
方法で１分間に１μｍｏｌの脂肪酸を遊離する酵素量を
１単位とした。 （結果）結果は下記第２〜３表の通りである。なお、表
２中の酵素活性は、ｎ−カプリル酸メチルを１００とし
たときの相対値（％）で、表３中の酵素活性は、トリカ
プリリンを１００としたときの相対値（％）で表した。
【００２３】
【表２】
【００２４】
【表３】
【００２５】実施例４ 実施例２で得た精製エステラーゼの三酪酸ジメルカプロ
ールに対する基質特異性を調べた。即ち、本エステラー
ゼをリパーゼ定量用試薬であるリパーゼキットＳ［基
質：三酪酸ジメルカプロール、大日本製薬（株）製］の
基質溶液に加え、加水分解終了後、発色剤である５，
５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）と反応させ、
遊離した５−チオ−２−ニトロ安息香酸を４１２ｎｍの
吸光度で測定した。その結果、本エステラーゼの活性は
１．７Ｘ１０５単位／ｍｇ蛋白であった。
ールに対する基質特異性を調べた。即ち、本エステラー
ゼをリパーゼ定量用試薬であるリパーゼキットＳ［基
質：三酪酸ジメルカプロール、大日本製薬（株）製］の
基質溶液に加え、加水分解終了後、発色剤である５，
５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）と反応させ、
遊離した５−チオ−２−ニトロ安息香酸を４１２ｎｍの
吸光度で測定した。その結果、本エステラーゼの活性は
１．７Ｘ１０５単位／ｍｇ蛋白であった。
【００２６】実施例５ 実施例２で得た精製エステラーゼ蛋白１．５ｍｇを１ｍ
Ｍ塩化カルシウム水溶液７５ｍｌに添加した。この溶液
に１Ｍの濃度でラセミ型トランス−３−（４−メトキシ
フェニル）グリシッド酸メチルエステルを溶解したトル
エン溶液７５ｍｌを加え、ｐＨを８．０にコントロール
して３０℃で４時間攪拌した。反応後、トルエン層中の
トランス−３−（４−メトキシフェニル）グリシッド酸
メチルエステルの（＋）体［（２Ｓ，３Ｒ）体］と
（−）体［（２Ｒ，３Ｓ）体］との比を高速液体クロマ
トグラフイー（カラム：キラルセル０Ｊ，ダイセル化学
工業社製、移動相：ｎ−ヘキサン：イソプロピルアルコ
ール＝９：１）で測定した。その結果は第４表の通りで
ある。
Ｍ塩化カルシウム水溶液７５ｍｌに添加した。この溶液
に１Ｍの濃度でラセミ型トランス−３−（４−メトキシ
フェニル）グリシッド酸メチルエステルを溶解したトル
エン溶液７５ｍｌを加え、ｐＨを８．０にコントロール
して３０℃で４時間攪拌した。反応後、トルエン層中の
トランス−３−（４−メトキシフェニル）グリシッド酸
メチルエステルの（＋）体［（２Ｓ，３Ｒ）体］と
（−）体［（２Ｒ，３Ｓ）体］との比を高速液体クロマ
トグラフイー（カラム：キラルセル０Ｊ，ダイセル化学
工業社製、移動相：ｎ−ヘキサン：イソプロピルアルコ
ール＝９：１）で測定した。その結果は第４表の通りで
ある。
【００２７】
【表４】
【００２８】実施例６ 実施例２で得た精製エステラーゼの至適ｐＨ値及びｐＨ
安定性を調べた。即ち、酵素の至適ｐＨについては、酵
素反応時のｐＨを変える以外は、実施例１記載の方法に
従ってエステラーゼ活性を測定し、ｐＨ８の活性値を１
００とした時の相対活性（％）で表した。一方、酵素の
ｐＨ安定性は、酵素液を、各ｐＨの緩衝液中で３０℃、
１時間インキュベーションした後、実施例１記載の方法
によりエステラーゼ活性を測定し、０時間の活性値を１
００とした時の活性残存率（％）で表した。なお、ｐＨ
調整には、マックルバイン（ＭｃＩｌｖａｉｎｅ）緩衝
液（ｐＨ３．０−７．０）、１００ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８．０−９．０）、１００ｍＭグリシン緩衝液
（ｐＨ９．０−１１．０）を用いた。（結果）結果は下
記第５〜６表の通りであり、至適ｐＨは７．５−９．０
であり、ｐＨ５−９で安定であった。
安定性を調べた。即ち、酵素の至適ｐＨについては、酵
素反応時のｐＨを変える以外は、実施例１記載の方法に
従ってエステラーゼ活性を測定し、ｐＨ８の活性値を１
００とした時の相対活性（％）で表した。一方、酵素の
ｐＨ安定性は、酵素液を、各ｐＨの緩衝液中で３０℃、
１時間インキュベーションした後、実施例１記載の方法
によりエステラーゼ活性を測定し、０時間の活性値を１
００とした時の活性残存率（％）で表した。なお、ｐＨ
調整には、マックルバイン（ＭｃＩｌｖａｉｎｅ）緩衝
液（ｐＨ３．０−７．０）、１００ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８．０−９．０）、１００ｍＭグリシン緩衝液
（ｐＨ９．０−１１．０）を用いた。（結果）結果は下
記第５〜６表の通りであり、至適ｐＨは７．５−９．０
であり、ｐＨ５−９で安定であった。
【００２９】
【表５】
【００３０】
【表６】
【００３１】実施例７ 実施例２で得た精製エステラーゼの至適温度及び熱安定
性を調べた。即ち、至適温度については、酵素反応時の
温度を変える以外は実施例１記載の測定法によってエス
テラーゼ活性を測定し、４５℃の活性値を１００とした
ときの相対活性（％）で表した。一方、酵素の熱安定性
は、酵素を１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
中、各温度で３０分間インキュベーションした後、実施
例１記載の測定法によってエステラーゼ活性を測定し、
０時間の活性値を１００とした時の活性残存率（％）で
表した。 （結果）結果は下記第７〜８表の通りであり、至適温度
は４０−５０℃であり、５０℃以下で安定であった。
性を調べた。即ち、至適温度については、酵素反応時の
温度を変える以外は実施例１記載の測定法によってエス
テラーゼ活性を測定し、４５℃の活性値を１００とした
ときの相対活性（％）で表した。一方、酵素の熱安定性
は、酵素を１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
中、各温度で３０分間インキュベーションした後、実施
例１記載の測定法によってエステラーゼ活性を測定し、
０時間の活性値を１００とした時の活性残存率（％）で
表した。 （結果）結果は下記第７〜８表の通りであり、至適温度
は４０−５０℃であり、５０℃以下で安定であった。
【００３２】
【表７】
【００３３】
【表８】
【００３４】実施例８ 実施例２で得た精製エステラーゼについて、ｐＨ３〜１
０のアンホライン（ＬＫＢ製）を用い、０〜５０％ショ
糖密度勾配の条件下で、等電点電気泳動（通電条件：初
期２６時間を４００Ｖの定電圧、その後の１４時間を８
００Ｖの定電圧、温度２℃、１１０ｍｌ容カラムを使
用）を４０時間行った。その結果、本エステラーゼの等
電点は４．６±０．１であった。
０のアンホライン（ＬＫＢ製）を用い、０〜５０％ショ
糖密度勾配の条件下で、等電点電気泳動（通電条件：初
期２６時間を４００Ｖの定電圧、その後の１４時間を８
００Ｖの定電圧、温度２℃、１１０ｍｌ容カラムを使
用）を４０時間行った。その結果、本エステラーゼの等
電点は４．６±０．１であった。
【００３５】実施例９ 実施例２で得た精製エステラーゼ（蛋白量９５μｇ相
当）を蒸留水に対して透析後、乾固し、気相アミノ酸シ
ークエンサー４７７Ａ（アプライド・バイオシステム社
製）にかけ、本エステラーゼのＮ末端から１２番目まで
のアミノ酸配列を決定した。決定されたＮ末アミノ酸配
列は以下の通りである。 （但し、Ｘは未決定のアミノ酸を表す。）
当）を蒸留水に対して透析後、乾固し、気相アミノ酸シ
ークエンサー４７７Ａ（アプライド・バイオシステム社
製）にかけ、本エステラーゼのＮ末端から１２番目まで
のアミノ酸配列を決定した。決定されたＮ末アミノ酸配
列は以下の通りである。 （但し、Ｘは未決定のアミノ酸を表す。）
【００３６】実施例１０ 金属イオン及び酵素阻害剤として公知である各種試薬の
実施例２で得た精製エステラーゼに対する影響を調べ
た。即ち、酵素溶液中に各金属イオン及び阻害剤を１ｍ
Ｍ添加し、実施例１記載の測定法によりエステラーゼ活
性を測定し、金属イオン及び阻害剤無添加の場合の活性
値を１００とした時の相対活性（％）で表した。 （結果）結果は下記第９〜１０表の通りである。
実施例２で得た精製エステラーゼに対する影響を調べ
た。即ち、酵素溶液中に各金属イオン及び阻害剤を１ｍ
Ｍ添加し、実施例１記載の測定法によりエステラーゼ活
性を測定し、金属イオン及び阻害剤無添加の場合の活性
値を１００とした時の相対活性（％）で表した。 （結果）結果は下記第９〜１０表の通りである。
【００３７】
【表９】
【００３８】
【表１０】
【００３９】実施例１１ 実施例１に準じて得た培養上精液１２リットルを限外ろ
過膜（ＳＩＰ−３０１３、旭化成工業社製）を用いて濃
縮した。濃縮液を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）を含む３５％飽和硫酸アンモニウムで塩析した。沈
澱物として得たエステラーゼを１０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．５）に溶解し、透析して脱塩後、同一緩衝
液で平衡化した陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ−トヨパー
ル６５０Ｍ、東洋曹達工業社製）に加えた。１０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分に非吸着分を除い
た後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を含む
０−０．８Ｍ塩化ナトリウム直線濃度勾配法にて溶出を
行った。その結果、エステラーゼが０．３Ｍ塩化ナトリ
ウム付近に溶出した。活性画分を集め、１０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を含む０．１５Ｍ塩化ナトリ
ウム溶液に対して透析した。透析液１０１ｍｌは、限外
ろ過膜（ダイアフローメンブレンＰＭ−１０、アミコン
社製）にて８ｍｌに濃縮し、同一緩衝液で充分に平衡化
した分子篩樹脂（セファクリルＳ−３００ＨＲ、ファル
マシア社製）でゲルろ過を行なった。活性画分を集め、
１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を含む２％飽
和硫酸アンモニウムで透析後、同一緩衝液で平衡化した
疎水性樹脂（Ｐｈｅｎｙｌ−トヨパール６５０Ｓ、東洋
曹達工業社製）に加えた。同一緩衝液で充分に非吸着分
を除いた後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
を含む２−０％飽和硫酸アンモニウム段階濃度勾配法に
て溶出を行なった。以上、精製の全ての操作は５℃以下
で行なった。なお、この精製エステラーゼは、実施例２
で得られた酵素と同様の物理化学的並びに酵素化学的性
質を有していた。また、上記各精製過程における比活性
及び回収率は、下記第１１表の通りである（酵素活性は
実施例１記載の方法で測定し、蛋白量はローリー法で測
定）。
過膜（ＳＩＰ−３０１３、旭化成工業社製）を用いて濃
縮した。濃縮液を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）を含む３５％飽和硫酸アンモニウムで塩析した。沈
澱物として得たエステラーゼを１０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．５）に溶解し、透析して脱塩後、同一緩衝
液で平衡化した陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ−トヨパー
ル６５０Ｍ、東洋曹達工業社製）に加えた。１０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分に非吸着分を除い
た後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を含む
０−０．８Ｍ塩化ナトリウム直線濃度勾配法にて溶出を
行った。その結果、エステラーゼが０．３Ｍ塩化ナトリ
ウム付近に溶出した。活性画分を集め、１０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を含む０．１５Ｍ塩化ナトリ
ウム溶液に対して透析した。透析液１０１ｍｌは、限外
ろ過膜（ダイアフローメンブレンＰＭ−１０、アミコン
社製）にて８ｍｌに濃縮し、同一緩衝液で充分に平衡化
した分子篩樹脂（セファクリルＳ−３００ＨＲ、ファル
マシア社製）でゲルろ過を行なった。活性画分を集め、
１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を含む２％飽
和硫酸アンモニウムで透析後、同一緩衝液で平衡化した
疎水性樹脂（Ｐｈｅｎｙｌ−トヨパール６５０Ｓ、東洋
曹達工業社製）に加えた。同一緩衝液で充分に非吸着分
を除いた後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
を含む２−０％飽和硫酸アンモニウム段階濃度勾配法に
て溶出を行なった。以上、精製の全ての操作は５℃以下
で行なった。なお、この精製エステラーゼは、実施例２
で得られた酵素と同様の物理化学的並びに酵素化学的性
質を有していた。また、上記各精製過程における比活性
及び回収率は、下記第１１表の通りである（酵素活性は
実施例１記載の方法で測定し、蛋白量はローリー法で測
定）。
【００４０】
【表１１】
【００４１】実施例１２ 実施例１１で得られた精製エステラーゼのアミノ酸組成
を次の条件下にて、アミノ酸自動分析計（日立製作所製
ｍｏｄｅｌ Ｌ−８５００）を用いて測定した。 （全アミノ酸の測定）２．０ｍｇ精製酵素蛋白を６Ｎ塩
酸１ｍｌと共に試験管に添加し、減圧下封管した。この
サンプルを１１０℃で、２０、４０及び７０時間加水分
解した後、減圧下で溶媒を留去し、残査を０．０２Ｎ塩
酸に溶解して全アミノ酸分析用のサンプルとした。 （システイン、シスチンの測定）モール（Ｍｏｏｒｅ）
の方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ，２３８，２
３５−２３７（１９６３））に従い、試料を過ギ酸で処
理し、システイン酸として測定した。 （トリプトファンの測定）シンプソン（Ｓｉｍｐｓｏ
ｎ）らの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２５
１，１９３６−１９４０（１９７６））に従って測定し
た。結果は、下記第１２表の通りである。なお、分子量
は６２０００として計算し、アスパラギンとアスパラギ
ン酸及びグルタミンとグルタミン酸は、いずれもそれら
の総和をもとめた。また、セリン、スレオニンについて
は、加水分解により徐々に分解するため、０時間の値を
外挿法でもとめた。
を次の条件下にて、アミノ酸自動分析計（日立製作所製
ｍｏｄｅｌ Ｌ−８５００）を用いて測定した。 （全アミノ酸の測定）２．０ｍｇ精製酵素蛋白を６Ｎ塩
酸１ｍｌと共に試験管に添加し、減圧下封管した。この
サンプルを１１０℃で、２０、４０及び７０時間加水分
解した後、減圧下で溶媒を留去し、残査を０．０２Ｎ塩
酸に溶解して全アミノ酸分析用のサンプルとした。 （システイン、シスチンの測定）モール（Ｍｏｏｒｅ）
の方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ，２３８，２
３５−２３７（１９６３））に従い、試料を過ギ酸で処
理し、システイン酸として測定した。 （トリプトファンの測定）シンプソン（Ｓｉｍｐｓｏ
ｎ）らの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２５
１，１９３６−１９４０（１９７６））に従って測定し
た。結果は、下記第１２表の通りである。なお、分子量
は６２０００として計算し、アスパラギンとアスパラギ
ン酸及びグルタミンとグルタミン酸は、いずれもそれら
の総和をもとめた。また、セリン、スレオニンについて
は、加水分解により徐々に分解するため、０時間の値を
外挿法でもとめた。
【００４２】
【００４３】実施例１３ 実施例１１で得られた精製エステラーゼのカルシウム含
量を、精製エステラーゼを透析した後、原子吸光分光光
度計（日立製作所製ｍｏｄｅｌ Ｚ−９０００）を用い
て測定した。その結果、精製エステラーゼ中のカルシウ
ム含量は、分子量６２０００当たり、１原子であった。
量を、精製エステラーゼを透析した後、原子吸光分光光
度計（日立製作所製ｍｏｄｅｌ Ｚ−９０００）を用い
て測定した。その結果、精製エステラーゼ中のカルシウ
ム含量は、分子量６２０００当たり、１原子であった。
【００４４】実施例１４ 実施例１１で得られた精製エステラーゼを用いて、実施
例４と同様にして、３酪酸ジメルカプロールに対する基
質特異性を調べた。その結果、この精製エステラーゼの
活性は、５．２Ｘ１０５単位／ｍｇ蛋白であった。
例４と同様にして、３酪酸ジメルカプロールに対する基
質特異性を調べた。その結果、この精製エステラーゼの
活性は、５．２Ｘ１０５単位／ｍｇ蛋白であった。
【００４５】
【発明の効果】本発明のエステラーゼは、有機カルボン
酸のアルコールエステル、チオールエステル、トリグリ
セライド等広範囲の基質に対して優れた加水分解能を有
し、豚肝臓エステラーゼと同様に、有機合成反応に広く
適用しうる繁用性のあるエステラーゼである。例えばラ
セミ型化合物からの光学活性体の製造やプロキラルな化
合物からのキラル化合物の製造等に適用することができ
る。とりわけ、本発明のエステラーゼは、低級アルコキ
シ基置換フェニルグリシッド酸低級アルキルエステルに
対して強い不斉加水分解能を有するという特長を有して
いるので、例えばラセミ型トランス−３−（４−低級ア
ルコキシフェニル）グリシッド酸低級アルキルエステル
に適用すれば、塩酸ジルチアゼム等医薬化合物の合成中
間体として有用な（２Ｒ，３Ｓ）−３−（４−低級アル
コキシフェニル）グリシッド酸低級アルキルエステルを
極めて効率よく製造することができる。
酸のアルコールエステル、チオールエステル、トリグリ
セライド等広範囲の基質に対して優れた加水分解能を有
し、豚肝臓エステラーゼと同様に、有機合成反応に広く
適用しうる繁用性のあるエステラーゼである。例えばラ
セミ型化合物からの光学活性体の製造やプロキラルな化
合物からのキラル化合物の製造等に適用することができ
る。とりわけ、本発明のエステラーゼは、低級アルコキ
シ基置換フェニルグリシッド酸低級アルキルエステルに
対して強い不斉加水分解能を有するという特長を有して
いるので、例えばラセミ型トランス−３−（４−低級ア
ルコキシフェニル）グリシッド酸低級アルキルエステル
に適用すれば、塩酸ジルチアゼム等医薬化合物の合成中
間体として有用な（２Ｒ，３Ｓ）−３−（４−低級アル
コキシフェニル）グリシッド酸低級アルキルエステルを
極めて効率よく製造することができる。
Claims (4)
- 【請求項１】 下記の特徴を有する新規エステラーゼ： １）作用：有機カルボン酸エステルのエステル結合を加
水分解する； ２）基質特異性：有機カルボン酸のアルキルエステル、
トリグリセライド及びチオールエステルに作用する； ３）至適ｐＨ及びｐＨ安定性：オリーブ油を基質とした
時の加水分解の至適ｐＨは７．５−９．０であり、３０
℃、１時間保存後もｐＨ５−９では安定である； ４）至適温度及び温度安定性：オリーブ油を基質とした
時の加水分解の至適温度は、４０−５０℃であり、ｐＨ
８．０の条件下では５０℃以下の温度で安定である； ５）分子量：６２，０００±２，０００（ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法） ６）等電点：４．６±０．１ ７）金属イオン等の影響：１ｍＭのカルシウムイオン存
在下で活性化され、１ｍＭのコバルトイオン、ニッケル
イオン、鉄イオン、エチレンジアミン四酢酸存在下では
阻害される。 - 【請求項２】 セラチア属に属し、請求項１記載の新規
エステラーゼを産生する微生物を培養し、その培養物か
ら該酵素を採取することを特徴とするエステラーゼの製
造方法。 - 【請求項３】 微生物がセラチア・マルセッセンスであ
る請求項２記載の製造方法。 - 【請求項４】 ラセミ型トランス-3-(4-低級アルコキシ
フェニル) グリシッド酸低級アルキルエステルを請求項
１記載の新規エステラーゼで不斉加水分解し、反応液か
ら未反応の(2R,3S)-3-(4- 低級アルコキシフェニル) グ
リシッド酸低級アルキルエステルを分離・採取すること
を特徴とする光学活性フェニルグリシッド酸エステルの
製法。
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