JPH0829099B2 - 組換ｄｎａ、発現ベクター及びプラスミド、これらの製法及び誘発可能で抑制可能な外来遺伝子の発現法 - Google Patents
組換ｄｎａ、発現ベクター及びプラスミド、これらの製法及び誘発可能で抑制可能な外来遺伝子の発現法Info
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- JPH0829099B2 JPH0829099B2 JP63073505A JP7350588A JPH0829099B2 JP H0829099 B2 JPH0829099 B2 JP H0829099B2 JP 63073505 A JP63073505 A JP 63073505A JP 7350588 A JP7350588 A JP 7350588A JP H0829099 B2 JPH0829099 B2 JP H0829099B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は組換DNA及び発現ベクター、これらの組換DNA
及び発現ベクターの製法並びに外来遺伝子の誘発可能
で、抑制可能な発現のためのこれらの使用に関する。
及び発現ベクターの製法並びに外来遺伝子の誘発可能
で、抑制可能な発現のためのこれらの使用に関する。
従来の技術 適用された遺伝子操作の重要な目的は組換DNAからの
蛋白質生産である。このためには、特別な部類のベクタ
ー、いわゆる発現ベクターが必要である。このベクター
は組換DNAのクローン化、転移及び増殖のための構造的
条件だけでなく、蛋白質における発現のための構造的条
件を有していなくてはならない。このためにはこの組換
えDNA-分子は特別な調節配列、いわゆるプロモーターを
必要とし、これはリボゾームによる翻訳を完成した蛋白
質にする、RNA中のDNA配列の転写に作用する。
蛋白質生産である。このためには、特別な部類のベクタ
ー、いわゆる発現ベクターが必要である。このベクター
は組換DNAのクローン化、転移及び増殖のための構造的
条件だけでなく、蛋白質における発現のための構造的条
件を有していなくてはならない。このためにはこの組換
えDNA-分子は特別な調節配列、いわゆるプロモーターを
必要とし、これはリボゾームによる翻訳を完成した蛋白
質にする、RNA中のDNA配列の転写に作用する。
１種以上の遺伝子の転写のためのバクテリア由来RNA-
ポリメラーゼに結合しなければならないDNA-域をプロモ
ーターと呼ぶ。このような多くのプロモーターは構造的
な共通点を有し、その意味は特に一定の蛋白質との相互
作用にあると思われる。細胞蛋白質又は他の分子とのそ
のような相互作用によりプロモーターの活性の抑制並び
に誘発が生じる。例えば、このための例はラムダプロモ
ーターP1とラムダリプレツサーcIとの相互作用である。
ポリメラーゼに結合しなければならないDNA-域をプロモ
ーターと呼ぶ。このような多くのプロモーターは構造的
な共通点を有し、その意味は特に一定の蛋白質との相互
作用にあると思われる。細胞蛋白質又は他の分子とのそ
のような相互作用によりプロモーターの活性の抑制並び
に誘発が生じる。例えば、このための例はラムダプロモ
ーターP1とラムダリプレツサーcIとの相互作用である。
遺伝子操作による蛋白質の生産において、リプレツサ
ー又は誘発物質の存在又は添加により発現ベクター中に
存在するプロモーターを制御することができる場合、そ
れは特に有利である。しかしながら従来は、誘発物質の
添加により、又は温度に敏感な微生物の使用及び正確に
保持された温度変化によつてのみそのような抑制又は誘
発生ぜしめることが可能であつた。使用した誘発物質は
多くの場合非常に高く、誘発又は抑制のために適用した
方法は複雑であり、蛋白質の発現の制御のためには条件
付きで好適である。
ー又は誘発物質の存在又は添加により発現ベクター中に
存在するプロモーターを制御することができる場合、そ
れは特に有利である。しかしながら従来は、誘発物質の
添加により、又は温度に敏感な微生物の使用及び正確に
保持された温度変化によつてのみそのような抑制又は誘
発生ぜしめることが可能であつた。使用した誘発物質は
多くの場合非常に高く、誘発又は抑制のために適用した
方法は複雑であり、蛋白質の発現の制御のためには条件
付きで好適である。
発明が解決しようとする課題 従つて、本発明の課題はできるだけ容易な方法で所望
の遺伝子生成物の発現の制御並びに高めた遺伝子生成物
の発現速度をできるだけ簡単な方法で可能とする組換DN
A及び発現ベクターを製造することである。
の遺伝子生成物の発現の制御並びに高めた遺伝子生成物
の発現速度をできるだけ簡単な方法で可能とする組換DN
A及び発現ベクターを製造することである。
課題を解決するための手段 コンセンサス配列： 及びDNA-配列GGN10GCを有するプロモーターを含有する
ことを特徴とする組換DNAによりこの課題は解決する。
ことを特徴とする組換DNAによりこの課題は解決する。
DNA-コンセンサス配列の存在により、その後方にあ
り、かつDNA-配列GGN10GC（ここでN10とは任意のヌクレ
オチド10個を表を有するプロモーターが酸素により抑制
され、これに対し嫌気性条件下にホルミエートにより誘
発されるということが生じる。
り、かつDNA-配列GGN10GC（ここでN10とは任意のヌクレ
オチド10個を表を有するプロモーターが酸素により抑制
され、これに対し嫌気性条件下にホルミエートにより誘
発されるということが生じる。
有利にDNA−コンセンサス配列がプロモーターの制御
下に発現される遺伝子の転写開始位の15〜150塩基対上
流に（すなわち５′−側に）存在し、この際プローモー
ターはコンセンサス配列と転写開始位との間にある。特
に有利にはコンセンサス配列は転写開始位の80〜130塩
基対前方にある。
下に発現される遺伝子の転写開始位の15〜150塩基対上
流に（すなわち５′−側に）存在し、この際プローモー
ターはコンセンサス配列と転写開始位との間にある。特
に有利にはコンセンサス配列は転写開始位の80〜130塩
基対前方にある。
プロモーターとして好適であるのはfdhF-プロモータ
ー、ヒドロゲナーゼ発現に必須の転写単位のプロモータ
ー又はntrA-依存プロモーターの必須構成成分である
が、これらは前記のDNA-配列を有している。fdhF-プロ
モーターを使用するのが有利である。
ー、ヒドロゲナーゼ発現に必須の転写単位のプロモータ
ー又はntrA-依存プロモーターの必須構成成分である
が、これらは前記のDNA-配列を有している。fdhF-プロ
モーターを使用するのが有利である。
本発明のもう１つの課題は本発明による組換DNAを好
適なベクター中に組込んで含有する発現ベクターであ
る。ベクターとしてはこの際通常使用されるベクター、
例えばpBR322又はpUC-ベクターを使用することができ
る。更に、本発明による発現ベクターはプロモーターの
後方にポリリンカーを有しており、このポリリンカーは
多くの制限切断位の存在により任意の外来遺伝子の組込
みを容易にする。
適なベクター中に組込んで含有する発現ベクターであ
る。ベクターとしてはこの際通常使用されるベクター、
例えばpBR322又はpUC-ベクターを使用することができ
る。更に、本発明による発現ベクターはプロモーターの
後方にポリリンカーを有しており、このポリリンカーは
多くの制限切断位の存在により任意の外来遺伝子の組込
みを容易にする。
本発明のもう１つの課題はプラスミドpBN80、DSM4073
であり、これはfdhF-遺伝子の翻訳開始位から240塩基上
流域から翻訳開始位までを含有することを特徴とする。
このfdhF-遺伝子の上流域に前記のDNA-コンセンサス配
列、並びにDNA配列GGN10GCを有するfdhF-プロモーター
を有する。このプラスミドはO2により抑制可能であり、
嫌気性条件下にホルミエートにより誘発可能なテトラサ
イクリン抵抗性を示す。しかしながら、好適な制限ヌク
レアーゼで切断し、かつ他の外来遺伝子をこのプラスミ
ド中に挿入し、かつこの発現を前記の方法で制御するこ
とも可能である。
であり、これはfdhF-遺伝子の翻訳開始位から240塩基上
流域から翻訳開始位までを含有することを特徴とする。
このfdhF-遺伝子の上流域に前記のDNA-コンセンサス配
列、並びにDNA配列GGN10GCを有するfdhF-プロモーター
を有する。このプラスミドはO2により抑制可能であり、
嫌気性条件下にホルミエートにより誘発可能なテトラサ
イクリン抵抗性を示す。しかしながら、好適な制限ヌク
レアーゼで切断し、かつ他の外来遺伝子をこのプラスミ
ド中に挿入し、かつこの発現を前記の方法で制御するこ
とも可能である。
本発明のもう１つの課題は本発明による組換DNAの製
法であり、この方法はO2により抑制可能であり、嫌気性
条件下にホルミエートにより誘発可能である遺伝子を含
有する、微生物の遺伝子バンクからコンセンサス配列を
有するDNA配列を公知法で同定し、単離し、かつ好適な
プロモーターと結合することを特徴とする。
法であり、この方法はO2により抑制可能であり、嫌気性
条件下にホルミエートにより誘発可能である遺伝子を含
有する、微生物の遺伝子バンクからコンセンサス配列を
有するDNA配列を公知法で同定し、単離し、かつ好適な
プロモーターと結合することを特徴とする。
このDNA-配列の同定のために、例えば指示遺伝子との
ハイブリツド化又はカツプリング及び好気性及び嫌気性
条件下での発現検査を実施することができる。
ハイブリツド化又はカツプリング及び好気性及び嫌気性
条件下での発現検査を実施することができる。
E.コリ、DSM2093、DSM2102又はサルモネラ・チフイム
リウム（Salmonella typhimurium）、DSM554からDNA-配
列を単離するのが有利である。組換DNAの製法と同様に
して、コンセンサス配列のみを含有するDNA-フラグメン
トのかわりに、コンセンサス配列並びにDNA-配列GGN10G
Cを有するプロモーターを含有する、ホルミエートによ
り誘発可能でO2により抑制可能な遺伝子の全上流域を単
離することもできる。このことは、fdhF-遺伝子の上流
域又はヒドロゲナーゼ表現に必須の転写単位の上流域を
単離することによつても有利に実施される。
リウム（Salmonella typhimurium）、DSM554からDNA-配
列を単離するのが有利である。組換DNAの製法と同様に
して、コンセンサス配列のみを含有するDNA-フラグメン
トのかわりに、コンセンサス配列並びにDNA-配列GGN10G
Cを有するプロモーターを含有する、ホルミエートによ
り誘発可能でO2により抑制可能な遺伝子の全上流域を単
離することもできる。このことは、fdhF-遺伝子の上流
域又はヒドロゲナーゼ表現に必須の転写単位の上流域を
単離することによつても有利に実施される。
本発明のもう１つの課題は本発明による組換DNAを含
有する、本発明による発現ベクターの製法であり、この
際前記のように単離した、コンセンサス配列を好適なプ
ロモーターと結合して含有する、組換DNA-配列を又はコ
ンセンサス配列並びにプロモーターを含有する、ホルミ
エートにより誘発可能で、O2により抑制可能な遺伝子の
上流域を場合により付加的にポリリンカーと共に好適な
ベクター中に挿入する。この際ベクターとしては前記の
ベクター並びに外来遺伝子の発現に常用の好適なベクタ
ーを挙げることができる。
有する、本発明による発現ベクターの製法であり、この
際前記のように単離した、コンセンサス配列を好適なプ
ロモーターと結合して含有する、組換DNA-配列を又はコ
ンセンサス配列並びにプロモーターを含有する、ホルミ
エートにより誘発可能で、O2により抑制可能な遺伝子の
上流域を場合により付加的にポリリンカーと共に好適な
ベクター中に挿入する。この際ベクターとしては前記の
ベクター並びに外来遺伝子の発現に常用の好適なベクタ
ーを挙げることができる。
プラスミドpBN80、DSM4073Pの本発明による製法は、f
dhF-遺伝子の翻訳開始位から240bp上流から翻訳開始位
前をPstI及びBglIIで切断したベクターpGA46、DSM4068P
中に挿入することを特徴とする。
dhF-遺伝子の翻訳開始位から240bp上流から翻訳開始位
前をPstI及びBglIIで切断したベクターpGA46、DSM4068P
中に挿入することを特徴とする。
誘発可能で抑制可能な、遺伝子の表現のために前記の
ような組換DNA又は発現ベクターを本発明により使用す
る際に、誘発が嫌気性条件下にホルミエートにより、抑
制がO2により行なわれることを特徴とする。
ような組換DNA又は発現ベクターを本発明により使用す
る際に、誘発が嫌気性条件下にホルミエートにより、抑
制がO2により行なわれることを特徴とする。
この際この発現は、このためにエンテロバクテリアツ
エー（Enterobacteriaceae）の好適な微生物中で、有利
にE.コリ又はサルモネラ・チフイムリウム中で実施する
ことができる。
エー（Enterobacteriaceae）の好適な微生物中で、有利
にE.コリ又はサルモネラ・チフイムリウム中で実施する
ことができる。
発現をntrAプラスである宿主菌株中で実施するのが有
利である。
利である。
ntrA-遺伝子生成物は微生物の嫌気的代謝で重要な役
割をはたす。すなわち、ntrA-遺伝子生成物は、RNA-ポ
リメラーゼ酵素のプロモーター選択性を、本発明の組換
DNA及び表現ベクター中に含有されるコンセンサス配列
及びプロモーター配列をより良好に知ることができるよ
うに変えるシグマフアクターである。本発明の組換DNA
又は発現ベクターの使用はntrA-遺伝子の存在なしでも
可能であるが、ntrA遺伝子生成物は外来遺伝子の発現を
著しく強化する。
割をはたす。すなわち、ntrA-遺伝子生成物は、RNA-ポ
リメラーゼ酵素のプロモーター選択性を、本発明の組換
DNA及び表現ベクター中に含有されるコンセンサス配列
及びプロモーター配列をより良好に知ることができるよ
うに変えるシグマフアクターである。本発明の組換DNA
又は発現ベクターの使用はntrA-遺伝子の存在なしでも
可能であるが、ntrA遺伝子生成物は外来遺伝子の発現を
著しく強化する。
ntrA-である宿主菌株を使用する時、それにもかかわ
らず該細胞がntrA-遺伝子生成物を供給するための２つ
の可能性がある。可能性の１つはntrA-遺伝子を、所望
の外来遺伝子をも有する組換DNA又は発現ベクター中に
組込み、こうして外来遺伝子の発現とntrA遺伝子生成物
の発現とを同時に達成するか、又は宿主細胞中の付加的
なベクター上にntrA-遺伝子を組込むことである。ntrA-
遺伝子の生成は、ntrA-遺伝子生成物によりプラスの影
響を受ける外来遺伝子の生成から独立している。
らず該細胞がntrA-遺伝子生成物を供給するための２つ
の可能性がある。可能性の１つはntrA-遺伝子を、所望
の外来遺伝子をも有する組換DNA又は発現ベクター中に
組込み、こうして外来遺伝子の発現とntrA遺伝子生成物
の発現とを同時に達成するか、又は宿主細胞中の付加的
なベクター上にntrA-遺伝子を組込むことである。ntrA-
遺伝子の生成は、ntrA-遺伝子生成物によりプラスの影
響を受ける外来遺伝子の生成から独立している。
宿主細胞中に挿入するために、宿主細胞のそれに相応
するntrA-遺伝子を組換DNA又は発現ベクターを介して、
又は付加的なベクター上で使用するのが有利である。こ
うして異種のntrA-遺伝子を使用する際よりも明らかに
良好な結果が得られる（第１表、最終行）。
するntrA-遺伝子を組換DNA又は発現ベクターを介して、
又は付加的なベクター上で使用するのが有利である。こ
うして異種のntrA-遺伝子を使用する際よりも明らかに
良好な結果が得られる（第１表、最終行）。
本発明による組換DNA及び発現ベクターにより外来遺
伝子の発現を制御することが容易な方法で可能である。
こうして、例えば、使用した微生物の好気性早期成長期
において、場合による外来遺伝子の発現の妨害を抑さえ
る。後期対数的嫌気性成長期への移行において、発現は
微生物により生じたホルミエートにより誘発され、微生
物の成長媒体中へのホルミエートの添加により発現の強
化が達せられる。誘発物質の添加は異なる成長期におい
て細胞を外来遺伝子の発現のために刺激し、このことが
更なる成長を場合により阻害し、かつ細胞自体にマイナ
スに影響することもあるのだが、前記のようにしてこれ
らのことを回避することができる。嫌気性後期対数的成
長期において、細胞は十分に成長し、最適な密度を達成
した。この際自動的に酸素限界が生じ、発酵技術的にさ
らに強化又は制御されうる。微生物の高い細胞密度によ
り最適な外来遺伝子の発現が達せられる。
伝子の発現を制御することが容易な方法で可能である。
こうして、例えば、使用した微生物の好気性早期成長期
において、場合による外来遺伝子の発現の妨害を抑さえ
る。後期対数的嫌気性成長期への移行において、発現は
微生物により生じたホルミエートにより誘発され、微生
物の成長媒体中へのホルミエートの添加により発現の強
化が達せられる。誘発物質の添加は異なる成長期におい
て細胞を外来遺伝子の発現のために刺激し、このことが
更なる成長を場合により阻害し、かつ細胞自体にマイナ
スに影響することもあるのだが、前記のようにしてこれ
らのことを回避することができる。嫌気性後期対数的成
長期において、細胞は十分に成長し、最適な密度を達成
した。この際自動的に酸素限界が生じ、発酵技術的にさ
らに強化又は制御されうる。微生物の高い細胞密度によ
り最適な外来遺伝子の発現が達せられる。
非常に関心のある蛋白質の生産のために本発明による
発現ベクターを使用すると、高価で複雑な誘発（誘発物
質の添加、温度変換等）をもはや必要としなくなるの
で、安価で簡単な制御可能性が得られる。
発現ベクターを使用すると、高価で複雑な誘発（誘発物
質の添加、温度変換等）をもはや必要としなくなるの
で、安価で簡単な制御可能性が得られる。
実施例 次に図面と関連させて実施例につき本発明を詳細に説
明する。
明する。
例１ fdhF-lac-Z-融合プラスミドの構造 プラスミドpBN2、DSM4072PのAatII-フラグメント（約
1.5kb）、fdhF-lac-Z-融合プラスミド（Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA、第83巻（1986年）、第4650〜4654頁を調製
用アガロース・ゲル電気泳動により単離し、異なる長さ
で、20℃でDNABa131エキソヌクレアーゼ0.2U/μｇと恒
温保持する。DNA-ポリメラーゼ（クレノウフラグメン
ト）で突出する５′‐末端を充たした後、該フラグメン
トをEcoRI-リンカー（dGGAATTCC）と結合し、引き続き
制限エンドヌクレアーゼEcoRI及びBamHIで消化する。調
製用アガロース‐ゲル電気泳動によりフラグメント混合
物を分離し、三つの大きなフラクシヨン（長さマーカー
として公知の大きさの制限フラグメントと比較）をゲル
から溶離する。このフラグメントをプラスミドpMC140
3、DSM4067Pのマルチリンカー位でクローン化操作し
た。この際レシピエントとしてはE.コリFM911、DSM4066
P（MC4100、fdhF、recA56、lac-）を使用する。上方域
の５′‐側から短かくしたクローンがここから生じた。
第２の工程においては、最も短かいクローン、pBN208、
DSM4069が単離され、EcoRIでの消化により線状となり、
DNA Ba1310.1U/μｇと共に20℃で恒温保持した。突出し
た５′‐末端の充填の後、EcoRI-リンカーを再たび結合
させ、次にDNAをEcoRI及びClaIで切断した。一連のフラ
グメントが生じ、これはEcoRI/Cla I-消化ベクターpMC1
403、DSM4067P中にバツククローン化した。得られたプ
ラスミドを新たにE.コリ菌株FM911中で形質転換した。
両方のクローン、pBN210、DSM4070P、及びpBN211、DSM4
071Pを単離した。
1.5kb）、fdhF-lac-Z-融合プラスミド（Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA、第83巻（1986年）、第4650〜4654頁を調製
用アガロース・ゲル電気泳動により単離し、異なる長さ
で、20℃でDNABa131エキソヌクレアーゼ0.2U/μｇと恒
温保持する。DNA-ポリメラーゼ（クレノウフラグメン
ト）で突出する５′‐末端を充たした後、該フラグメン
トをEcoRI-リンカー（dGGAATTCC）と結合し、引き続き
制限エンドヌクレアーゼEcoRI及びBamHIで消化する。調
製用アガロース‐ゲル電気泳動によりフラグメント混合
物を分離し、三つの大きなフラクシヨン（長さマーカー
として公知の大きさの制限フラグメントと比較）をゲル
から溶離する。このフラグメントをプラスミドpMC140
3、DSM4067Pのマルチリンカー位でクローン化操作し
た。この際レシピエントとしてはE.コリFM911、DSM4066
P（MC4100、fdhF、recA56、lac-）を使用する。上方域
の５′‐側から短かくしたクローンがここから生じた。
第２の工程においては、最も短かいクローン、pBN208、
DSM4069が単離され、EcoRIでの消化により線状となり、
DNA Ba1310.1U/μｇと共に20℃で恒温保持した。突出し
た５′‐末端の充填の後、EcoRI-リンカーを再たび結合
させ、次にDNAをEcoRI及びClaIで切断した。一連のフラ
グメントが生じ、これはEcoRI/Cla I-消化ベクターpMC1
403、DSM4067P中にバツククローン化した。得られたプ
ラスミドを新たにE.コリ菌株FM911中で形質転換した。
両方のクローン、pBN210、DSM4070P、及びpBN211、DSM4
071Pを単離した。
菌株FM911中でプラスミドpBN2、pBN208、pBN210、pBN
211、pMC1403の形質転換を主にコーヘン（Cohen）等に
より記載された方法（Cohen等著、1977年、PNAS第69
巻：第2110〜2114頁）により実施した： 早期対数期細胞を０℃に冷却した後に集め、引き続き
氷冷CaCl2（50mM）での処理を行なつた。DNSの添加を０
℃で行ない、かつ０℃で45分間恒温保持した後、熱衝撃
（４分間、43℃）を実施する。室温に冷却した後、この
細胞を表現型発現のために37℃で１時間完全培地中で恒
温保持する。プラスミドpBN2、pBN208、pBN210、pBN21
1、pMC1403におけるアンピシリン抵抗による選択はアン
ピシリン100μg/mlでプレート上で行なう。
211、pMC1403の形質転換を主にコーヘン（Cohen）等に
より記載された方法（Cohen等著、1977年、PNAS第69
巻：第2110〜2114頁）により実施した： 早期対数期細胞を０℃に冷却した後に集め、引き続き
氷冷CaCl2（50mM）での処理を行なつた。DNSの添加を０
℃で行ない、かつ０℃で45分間恒温保持した後、熱衝撃
（４分間、43℃）を実施する。室温に冷却した後、この
細胞を表現型発現のために37℃で１時間完全培地中で恒
温保持する。プラスミドpBN2、pBN208、pBN210、pBN21
1、pMC1403におけるアンピシリン抵抗による選択はアン
ピシリン100μg/mlでプレート上で行なう。
ベクターとfdhF-DNA-フラグメントとの正確な結合位
置、すなわちEcoRI-リンカーの位置はマキサム（Maxa
m）及びギルバート（Gilbert）の方法（Methods of Enz
ymology、第65巻、第499〜560頁、1980年）に従つて、D
NA-配列決定により実施された。
置、すなわちEcoRI-リンカーの位置はマキサム（Maxa
m）及びギルバート（Gilbert）の方法（Methods of Enz
ymology、第65巻、第499〜560頁、1980年）に従つて、D
NA-配列決定により実施された。
第1a図及び第1b図中には５′上流域を含むfdhF-遺伝
子のヌクレオチド配列が示されている（第1b図には第1a
図に記載された配列の続きの配列が示されている）。AT
Gは翻訳の開始位を示す。図面からプラスミドpBN208、p
BN210及びpBN211に関する残つたfdhF-域を知ることがで
きる。
子のヌクレオチド配列が示されている（第1b図には第1a
図に記載された配列の続きの配列が示されている）。AT
Gは翻訳の開始位を示す。図面からプラスミドpBN208、p
BN210及びpBN211に関する残つたfdhF-域を知ることがで
きる。
例２ プラスミドpBN208、pBN210及びpBN211のβ‐ガラクトシ
ダーゼ‐発現の比較 例１に記載したようにして得られたfdhF-lacZ−融合
プラスミドを嫌気性及び好気性成長条件下にβ‐ガラク
トシダーゼ活性の発現に関して実験した。β‐ガラクト
シダーゼ活性はJ.H.ミラー（Miller;Experiments in mo
lecular genetics、cold Spring Harbor Laboratory,Co
ld Spring Harbor,New York（1972年））により測定
し、比活性を計算した。結果は第２図に示す。第２図の
Ａ部分中には嫌気性条件下での発現の結果を、Ｂ部分中
には好気性成長条件下での発現の結果を示す。横座標に
は欠失の位置を示すが、これは翻訳開始位（位置＋１）
前のエコ・リンカーの位置を表わす。−240におけるエ
コ・リンカーはプラスミドpBN208であり、−184はプラ
スミドpBN210及び−143はプラスミドpBN211である。ニ
トレートを10mmolの量で、ホルミエートを30mmolの最終
濃度で添加する。
ダーゼ‐発現の比較 例１に記載したようにして得られたfdhF-lacZ−融合
プラスミドを嫌気性及び好気性成長条件下にβ‐ガラク
トシダーゼ活性の発現に関して実験した。β‐ガラクト
シダーゼ活性はJ.H.ミラー（Miller;Experiments in mo
lecular genetics、cold Spring Harbor Laboratory,Co
ld Spring Harbor,New York（1972年））により測定
し、比活性を計算した。結果は第２図に示す。第２図の
Ａ部分中には嫌気性条件下での発現の結果を、Ｂ部分中
には好気性成長条件下での発現の結果を示す。横座標に
は欠失の位置を示すが、これは翻訳開始位（位置＋１）
前のエコ・リンカーの位置を表わす。−240におけるエ
コ・リンカーはプラスミドpBN208であり、−184はプラ
スミドpBN210及び−143はプラスミドpBN211である。ニ
トレートを10mmolの量で、ホルミエートを30mmolの最終
濃度で添加する。
例３ プラスミドpBN80、DSM4073Pの製造 プラスミドpBN208の1.11kb BamHI/PstIフラグメント
を調製用ゲル電気泳動で単離し、引き続き制限エンドヌ
クレアーゼPst I及びBgl IIで切断されたベクターpGA4
6,DSM4068P中にクローン化操作する。組換プラスミド中
でこれによりβ‐ラクタマーゼ遺伝子が再構成される。
結合したプラスミドpBN80、DSM4073Pを、プラスミドpBN
2、pBN208、pBN210、pBN211及びpMC1403に関して例１で
記載したように、E.コリFM911中で形質転換した。従つ
て、組換プラスミドでの形質転換による選択はクロラム
フエニコール抵抗（30μg/ml）及びアンピシリン抵抗
（100μg/ml）により行なわれた。得られたクローンは
好気性及び嫌気性条件下にそのテトラサイクリン抵抗に
関して調べた。燐酸塩緩衝（pH7）完全培地（0.8％グル
コース含有）を有するプレート上で、該クローンは好気
性条件下にテトラサイクリン感作性である。嫌気性条件
下にはテトラサイクリン抵抗性を発現し、ホルミエート
（30mM）で誘発される。これに対して、ニトレート50mM
の存在下で嫌気性条件下で、クローンはテトラサイクリ
ン感作性である。pBN80の制限酵素地図を次に示す： 例４ fdhF-lacZ-融合遺伝子の発現に関するntrA-突然変異の
効果 ntrA-遺伝子中での突然変異の影響を調べるために、f
dhF-lacZ-融合遺伝子を含有するプラスミドpBN208、DSM
4069で形質転換された、２種の異なるE.コリ菌株中でβ
‐ガラクトシダーゼ活性を嫌気性及び好気性条件下に調
べた。このためにはntrAプラスであるE.コリ菌株FM90
9、DSM4279並びにntrAマイナスであるE.コリ菌株BN95
0、DSM4278を使用する。E.コリ菌株を、グルタミン0.2
％（W/V）及び指示量のホルミエート又はニトレートを
含有するTGYEP培地、pH6.5（Begg等、1977年、FEMS Mik
robiol.Let.2:47〜57頁）中で培養した。更に、菌株BN9
50、DSM4278を３つのその他のプラスミド、すなわちpBN
17、DSM4280P、pBN18（例６参照）、及びpBN61、DSM428
1Pで形質転換した。両方のプラスミドpBN17及びpBN18は
クレブシエラ・プノイモニアエ（Klebsiella pneumonia
e）からのntrA-遺伝子を異なる方向づけでベクター中に
組込んで含有する。プラスミドpBN61はE.コリからのntr
A-遺伝子をベクター中に挿入して含有する。これはE.コ
リ‐DNAからの2.7kbの大きさのフラグメントをベクター
pACYC184（J.Bacteriol.134（1978）、第1141〜1156
頁）のBamHI-切断位に挿入することにより製造される。
この形質転換した菌株に関しても、E.コリ菌株の提示し
た培養培地中でβ‐ガラクトシダーゼの発現に関して試
験し、結果を第１表に示した。
を調製用ゲル電気泳動で単離し、引き続き制限エンドヌ
クレアーゼPst I及びBgl IIで切断されたベクターpGA4
6,DSM4068P中にクローン化操作する。組換プラスミド中
でこれによりβ‐ラクタマーゼ遺伝子が再構成される。
結合したプラスミドpBN80、DSM4073Pを、プラスミドpBN
2、pBN208、pBN210、pBN211及びpMC1403に関して例１で
記載したように、E.コリFM911中で形質転換した。従つ
て、組換プラスミドでの形質転換による選択はクロラム
フエニコール抵抗（30μg/ml）及びアンピシリン抵抗
（100μg/ml）により行なわれた。得られたクローンは
好気性及び嫌気性条件下にそのテトラサイクリン抵抗に
関して調べた。燐酸塩緩衝（pH7）完全培地（0.8％グル
コース含有）を有するプレート上で、該クローンは好気
性条件下にテトラサイクリン感作性である。嫌気性条件
下にはテトラサイクリン抵抗性を発現し、ホルミエート
（30mM）で誘発される。これに対して、ニトレート50mM
の存在下で嫌気性条件下で、クローンはテトラサイクリ
ン感作性である。pBN80の制限酵素地図を次に示す： 例４ fdhF-lacZ-融合遺伝子の発現に関するntrA-突然変異の
効果 ntrA-遺伝子中での突然変異の影響を調べるために、f
dhF-lacZ-融合遺伝子を含有するプラスミドpBN208、DSM
4069で形質転換された、２種の異なるE.コリ菌株中でβ
‐ガラクトシダーゼ活性を嫌気性及び好気性条件下に調
べた。このためにはntrAプラスであるE.コリ菌株FM90
9、DSM4279並びにntrAマイナスであるE.コリ菌株BN95
0、DSM4278を使用する。E.コリ菌株を、グルタミン0.2
％（W/V）及び指示量のホルミエート又はニトレートを
含有するTGYEP培地、pH6.5（Begg等、1977年、FEMS Mik
robiol.Let.2:47〜57頁）中で培養した。更に、菌株BN9
50、DSM4278を３つのその他のプラスミド、すなわちpBN
17、DSM4280P、pBN18（例６参照）、及びpBN61、DSM428
1Pで形質転換した。両方のプラスミドpBN17及びpBN18は
クレブシエラ・プノイモニアエ（Klebsiella pneumonia
e）からのntrA-遺伝子を異なる方向づけでベクター中に
組込んで含有する。プラスミドpBN61はE.コリからのntr
A-遺伝子をベクター中に挿入して含有する。これはE.コ
リ‐DNAからの2.7kbの大きさのフラグメントをベクター
pACYC184（J.Bacteriol.134（1978）、第1141〜1156
頁）のBamHI-切断位に挿入することにより製造される。
この形質転換した菌株に関しても、E.コリ菌株の提示し
た培養培地中でβ‐ガラクトシダーゼの発現に関して試
験し、結果を第１表に示した。
例５ pBN17の製造 プラスミドpMM17のClaI-フラグメント1.96kb（配列:N
ucl.Acids Res.第13巻（1985）、第7607〜7620頁）をCl
aI-切断位中のベクターpACYC184（J.Bacteriol.第134
巻、1978年、第1141〜1156頁）中にクローン化操作す
る。この際ntrA-遺伝子を含有し、かつEcoRVでの処理に
おいて長さ1.35kb/750b及び3.83kbのフラグメントに切
断されるベクターpBN17（DSM4280P）が得られる。
ucl.Acids Res.第13巻（1985）、第7607〜7620頁）をCl
aI-切断位中のベクターpACYC184（J.Bacteriol.第134
巻、1978年、第1141〜1156頁）中にクローン化操作す
る。この際ntrA-遺伝子を含有し、かつEcoRVでの処理に
おいて長さ1.35kb/750b及び3.83kbのフラグメントに切
断されるベクターpBN17（DSM4280P）が得られる。
例６ pBN18の製造 pBN18はpBN17と同様に逆の方向づけでntrA-遺伝子を
有しており、かつClaIでのpBN17の切断及び引き続くT4
‐リガーゼでの結合により製造される。
有しており、かつClaIでのpBN17の切断及び引き続くT4
‐リガーゼでの結合により製造される。
プラスミドpBN18はEcoRVでの処理により長さ1.35kb/1
50b及び4.43kbのフラグメントが得られる。
50b及び4.43kbのフラグメントが得られる。
第1a図及び第1b図は５′‐上流域を含むfdhF-遺伝子の
ヌクレオチド配列を示す図であり；第２図は嫌気性培養
条件（Ａ）下及び好気性培養条件（Ｂ）下にプラスミド
pBN208、pBN210及びpBN211の発現によるβ‐ガラクトシ
ダーゼ活性を示すグラフ図である。 第３図はプラスミドpBN2の制限酵素地図を示す図であ
る。
ヌクレオチド配列を示す図であり；第２図は嫌気性培養
条件（Ａ）下及び好気性培養条件（Ｂ）下にプラスミド
pBN208、pBN210及びpBN211の発現によるβ‐ガラクトシ
ダーゼ活性を示すグラフ図である。 第３図はプラスミドpBN2の制限酵素地図を示す図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:42） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ Ｃ１２Ｒ 1:42） 微生物の受託番号 ＤＳＭ ４２７９ 微生物の受託番号 ＤＳＭ ４２７８ 微生物の受託番号 ＤＳＭ ４０７２Ｐ 微生物の受託番号 ＤＳＭ ４０６９Ｐ 微生物の受託番号 ＤＳＭ ４０７０Ｐ 微生物の受託番号 ＤＳＭ ４０７１Ｐ 微生物の受託番号 ＤＳＭ ４２８０Ｐ
Claims (22)
- 【請求項１】コンセンサス配列： 及びDNA−配列GGN10GC（ここでN10は10個の任意のヌク
レオチドを表わす）を有するプロモーターを含有するこ
とを特徴とする組換DNA。 - 【請求項２】コンセンサス−配列がプロモーターの制御
下に発現される遺伝子の転写開始位から15〜150塩基対
上流に、かつプロモーターがコンセンサス配列と転写開
始位との間に存在する請求項１記載の組換DNA。 - 【請求項３】コンセンサス配列が転写開始位の前80〜13
0塩基対に存在する請求項２記載の組換DNA。 - 【請求項４】ヒドロゲナーゼ発現に必須な転写単位のプ
ロモーター又はfdhF−プロモーターを含有する請求項１
から３までのいずれか１項記載の組換DNA。 - 【請求項５】ntrA−依存プロモーターの必須構成成分を
含有する請求項１から３までのいずれか１項記載の組換
DNA。 - 【請求項６】請求項１から５による組換DNAを好適なベ
クター中に組み込んで含有することを特徴とする発現ベ
クター。 - 【請求項７】外来遺伝子の組込みのためにポリリンカー
を付加的に含有する請求項６記載の発現ベクター。 - 【請求項８】fdhF−プロモーターを含めてfdhF遺伝子の
翻訳開始位から240bp上流域から翻訳開始位までを含有
し、次の制限酵素地図： を有することを特徴とするプラスミドpBN80（DSM4073
P）。 - 【請求項９】O2により抑制可能であり、嫌気性条件下に
ホルミエートにより誘発可能である遺伝子を含有する微
生物の遺伝子バンクからコンセンサス配列を有するDNA
−配列を公知法により同定し、単離し、かつ好適なプロ
モーターと結合することを特徴とする請求項１から５ま
でのいずれか１項記載の組換DNAの製法。 - 【請求項１０】エンテロ・バクテリアツエーの群からの
微生物の遺伝子バンクからDNA−配列を単離する請求項
９記載の方法。 - 【請求項１１】E.コリ、DSM2093又は2102、又はサルモ
ネラ・チフイムリウム、DSM554からDNA−配列を単離す
る請求項10記載の方法。 - 【請求項１２】コンセンサス配列及びプロモーターを含
有する、ホルミエートにより誘発可能で、O2により抑制
可能な遺伝子の全上流域を単離する請求項９から11まで
のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１３】fdhF−遺伝子の上流域を単離する請求項
12記載の方法。 - 【請求項１４】ヒドロゲナーゼ発現に関して必須の転写
単位のプロモーターの上流域を単離する請求項12記載の
方法。 - 【請求項１５】コンセンサス配列及びプロモーターを含
有する単離組換DNA−配列を場合によりポリリンカーと
共に好適なベクター中に挿入することを特徴とする請求
項６又は７による発現ベクターを製造するための請求項
９から14までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１６】fdhF−遺伝子の翻訳開始位から240bp上
流域から翻訳開始位までのfdhF−遺伝子の上流域をPstI
及びBglIIで切断したベクターpGA46、DSM4068P中に組み
込むことを特徴とする請求項８によるプラスミドpBN80
（DSM4073P）を製造するための請求項13記載の方法。 - 【請求項１７】請求項１から５までのいずれか１項によ
る組換DNA又は請求項６又は７による発現ベクターを使
用し、誘発が嫌気性条件下にホルミエートにより、抑制
がO2により生じることを特徴とする誘発可能で、抑制可
能な外来遺伝子の発現法。 - 【請求項１８】E.コリ又はサルモネラ・チフイリウム中
で発現を実施する請求項17記載の発現法。 - 【請求項１９】ntrAプラスである宿主菌株中で実現する
請求項17又は18記載の発現法。 - 【請求項２０】発現をntrA-である宿主菌株中で実施
し、かつntrA−遺伝子を組換DNA又は発現ベクター中に
組込む請求項17又は18記載の発現法。 - 【請求項２１】ntrA-である宿主菌株を使用し、付加的
なベクター上のntrA−遺伝子を宿主細胞中に挿入する請
求項17又は18記載の発現法。 - 【請求項２２】宿主細胞のそれに相応するntrA−遺伝子
を使用する請求項20又は21記載の発現法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19873710633 DE3710633A1 (de) | 1987-03-31 | 1987-03-31 | Rekombinante dna zur reprimierbaren und induzierbaren expression von fremdgenen |
| DE3710633.3 | 1987-03-31 | ||
| DE19873735381 DE3735381A1 (de) | 1987-03-31 | 1987-10-19 | Rekombinante dna zur reprimierbaren und induzierbaren expression von fremdgenen |
| DE3735381.0 | 1987-10-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63254985A JPS63254985A (ja) | 1988-10-21 |
| JPH0829099B2 true JPH0829099B2 (ja) | 1996-03-27 |
Family
ID=25854113
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63073505A Expired - Lifetime JPH0829099B2 (ja) | 1987-03-31 | 1988-03-29 | 組換ｄｎａ、発現ベクター及びプラスミド、これらの製法及び誘発可能で抑制可能な外来遺伝子の発現法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4963482A (ja) |
| EP (1) | EP0285152B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0829099B2 (ja) |
| DE (2) | DE3735381A1 (ja) |
Families Citing this family (10)
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| DE3926076A1 (de) * | 1989-04-21 | 1990-10-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Rekombinante dna und expressionsvektor |
| US5830720A (en) * | 1989-04-21 | 1998-11-03 | Boehringer Mannheim Gmbh | Recombinant DNA and expression vector for the repressible and inducible expression of foreign genes |
| GB9104596D0 (en) * | 1991-03-05 | 1991-04-17 | Wellcome Found | Production of recombinant proteins |
| JP3415145B2 (ja) * | 1991-03-05 | 2003-06-09 | ザ ウエルカム ファウンデーション リミテッド | 弱毒化細菌における組換えタンパク質の発現 |
| CN1253551C (zh) | 1997-09-10 | 2006-04-26 | 维昂药品公司 | 减毒的遗传修饰肿瘤靶向细菌 |
| US6080849A (en) | 1997-09-10 | 2000-06-27 | Vion Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence |
| US6962696B1 (en) | 1999-10-04 | 2005-11-08 | Vion Pharmaceuticals Inc. | Compositions and methods for tumor-targeted delivery of effector molecules |
| EP2434015B1 (en) * | 2004-09-09 | 2013-11-20 | Research Institute Of Innovative Technology For The Earth | DNA fragment having promoter function |
| US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
-
1987
- 1987-10-19 DE DE19873735381 patent/DE3735381A1/de not_active Ceased
-
1988
- 1988-03-29 JP JP63073505A patent/JPH0829099B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-30 DE DE8888105219T patent/DE3877233D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-03-30 EP EP88105219A patent/EP0285152B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-31 US US07/175,780 patent/US4963482A/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PROC.NATI.ACAD.SCI.USA=1986´Æ83´±4650-4654 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0285152B1 (de) | 1993-01-07 |
| EP0285152A3 (en) | 1989-11-15 |
| DE3735381A1 (de) | 1989-05-03 |
| EP0285152A2 (de) | 1988-10-05 |
| US4963482A (en) | 1990-10-16 |
| DE3877233D1 (de) | 1993-02-18 |
| JPS63254985A (ja) | 1988-10-21 |
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