JPH082918B2 - ヒトカルパスタチン様ポリペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒトカルパスタチン様のアミノ酸配列を有
するポリペプチド及びそのDNA配列に関する。

〔従来の技術〕

カルパスタチンは、カルシウム依存性のシステインプ
ロテアーゼとして知られているカルパインを特異的に阻
害する細胞内蛋白質である。カルパスタチンは高等動物
の各種の組織に広く分布し、細胞が刺激を受けることに
よって動員され、活性化されたカルパインの作用を調節
していると考えられている。カルパインの生体における
役割としては、プロテインキナーゼＣ、ホスホリラーゼ
キナーゼＢなどのキナーゼ系統酵素の限定分解による活
性化、細胞骨格蛋白質の分解、増殖因子やホルモンのレ
セプターの分解等が知られている。

カルパスタチンは、これらのカルパインの作用を特異
的に阻害することにより、カルパインの過剰反応を調節
している。したがってカルパイン−カルパスタチン系の
バランスの維持は、病態と密接に関連している。

例えば、筋ジストロフィー疾患においては、カルパイ
ンのレベルが高まっており、筋原繊維やニューロフィラ
メントの分解がカルパインによって促進されることが、
発症と密接に係わっていると推定されている。

また、成人型白血病ウイルスに感染した細胞では、カ
ルパイン活性及びインターロイキン２のレセプター活性
が異常に高まっていることが知られている。これは、カ
ルパインが細胞骨格蛋白質に作用してレセプター活性を
変化させ、その結果、増殖因子等に対する細胞の異常な
反応を生み出し、原因となることを推定させる〔生化
学、第57巻、第1202頁、（1985）〕。更に、カルパイン
は眼水晶体蛋白質を切断することが知られており、その
過剰反応が白内障に関係していることが示唆される。一
方、情報伝達に必要なステロイド−レセプター複合体の
安定化物質がカルパスタチンであるという報告〔ジャー
ナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Journal
of Biological Chemistry）第260巻、第2601頁（198
5）〕や、高血圧ラットにおけるカルパスタチンレベル
の異常な減少も報告されている〔バイオケミカル アン
ド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーション
ズ（Biochemical and Biophysical Research Communica
tions）第145巻、第1287頁（1987）〕。

このようにカルパスタチンは、カルパインの作用を調
節する内存性の蛋白質インヒビターとして、カルパイン
の過剰作用が原因と考えられる様々の疾患に対して有効
な治療剤となることが期待される。

更に、ヒトカルパスタチンをコードするDNA配列はヒ
トカルパイン−ヒトカルパスタチンのアンバランスが原
因となる種々の疾患のDNA診断に用いることができる。

〔発明が解決しようとする課題〕

カルパスタチンは高等動物の各種組織に広く分布し、
ブタ赤血球や心筋からの精製、ウサギ肝臓からの精製が
報告されている。〔ジャーナル オブ バイオケミスト
リー（Journal of Biochemistry）第95巻、第1661頁（1
984）、ザ バイオケミカル ジャーナル（Biochemical
Journal）、第235巻、第97頁（1986）、バイオケミカ
ル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケ
ーションズ、第122巻、第912頁（1984）〕。

更に、ブタ及びウサギのカルパスタチンのcDNAクロー
ニングにより、アミノ酸の一次構造が解明された。その
結果、カルパスタチンは約140アミノ酸残基から成る４
つの繰返し機能単位（ドメイン１〜４）とＮ末側に非相
同性の配列（ドメインＬ）を有することがわかり、ドメ
イン１〜４は各ドメイン単独でカルパスタチンの活性を
有することがわかった〔フェブス レターズ（FEBS Let
ters）、第223巻、第174頁（1987）〕。ヒトカルパスタ
チンについては、赤血球からの精製が報告されている
〔ジャーナル オブ バイオケミストリー、第92巻、第
2021頁（1982）〕が、その遺伝子構造やアミノ酸配列は
依然として不明である。また、ヒトカルパスタチンの工
業的に有利な製造方法についても開示されていない。

本発明の目的は、ヒトカルパスタチン様ポリペプチ
ド、及びその遺伝子工学的製造方法を提供することにあ
る。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はヒトカル
パスタチン様ポリペプチドに関する発明であって、下記
式１で表されることを特徴とする。

〔式中Ｙは下記式 で表される配列又は水酸基（−OH）を示す〕 また、本発明の第２の発明は、上記第１の発明のポリ
ペプチドをコードする核酸に関する。

更に本発明の第３及び第４の発明はそれぞれ本発明の
第１の発明のヒトカルパスタチン様ポリペプチドをコー
ドするDNAを含有させた組換え体プラスミド及びそれを
導入させた形質転換体に関し、また本発明の第５の発明
は第４の発明の形質転換体を培養し、該培養物より本発
明の第１の発明のヒトカルパスタチン様ポリペプチドを
採取する製造方法に関する。

本発明者らはヒトcDNAライブラリーからヒトカルパス
タチンをコードするcDNAクローンを選び出し、その塩基
配列分析からヒトカルパスタチンの全アミノ酸配列を決
定した。更に、そのcDNAを発現ベクターに接続して、大
腸菌に導入し、ヒトカルパスタチン様ポリペプチドを発
現させることに成功した。これらの知見に基づいて本発
明を完成させた。

以下、本発明を具体的に説明する。

ヒトカルパスタチンをコードするcDNAのクローニング
の方法は公知の方法が用いられる。例えば、ヒトカルパ
スタチンが分布する肝臓や心筋あるいはヒト由来の株化
細胞等から、ポリＡを含むRNAを抽出し、これをオリゴd
Tを結合させたセルロース担体等で精製する。これをテ
ンプレート（鋳型）として逆転写酵素を作用させて、cD
NA合成を行い、岡山−バーグ法あるいはガブラー−ホフ
マン法（Gubler-Hoffmann法）等の方法により、プラス
ミドやファージベクターに接続して、宿主に導入し、cD
NAライブラリーを作製する。このようなライブラリー
は、市販もされており、例えばクローンテック社から購
入することもできる。既にcDNAの一部が得られている場
合には、プライマー伸長法によるcDNAライブラリーの作
製も行われる。この方法は５′側のcDNAをクローニング
するのに特に有効である。

cDNAライブラリーから目的のヒトカルパスタチンをコ
ードするcDNAクローンをスクリーニングするためには、
既にその配列が明らかにされているブタ又はウサギのカ
ルパスタチンのcDNA断片をプローブとして用いるのが効
果的である。DNAプローブは化学的に合成しても良い
し、cDNAを含むベクターから制限酵素で切り出して精製
してもよい。

DNAプローブでライブラリーをスクリーニングする手
段としては、まずライブラリーをプレート上で増殖さ
せ、生育したコロニー又はプラークをニトロセルロース
やナイロンのフィルターに移し取り、変性処理によりDN
Aをフィルターに固定する。このフィルターをあらかじ
め³²P等で標識したDNAプローブを含む溶液中でインキュ
ベートし、フィルター上のDNAと、プローブDNAとのハイ
ブリッドを形成させる（以下、この操作をハイブリダイ
ゼーションという）。インキュベーションの温度は、用
いるプローブのTm（融解温度）を目安として設定する。
ハイブリダイゼーション後、非特異的吸着を洗い流し、
オートラジオグラフィーにより、プローブとハイブリッ
ドを形成したクローンを同定する。この操作を再度行っ
てクローンを単離し、次の分析を行う。

組換え体が大腸菌の場合は、試験管等で少量培養を行
い、プラスミドを常法によって抽出し、制限酵素による
切断反応を行い、アガロース又はアクリルアミドゲル電
気泳動に付して、クローン化された挿入断片の生成を調
べる。更にその泳動パターンをニトロセルロースやナイ
ロンフィルターに移し取り、前述の方法によりハイブリ
ダイゼーションを行って挿入断片がDNAプローブとハイ
ブリッドを形成するか否かを調べる。最終的には挿入断
片の塩基配列を公知の方法により決定する。組換え体が
ファージの場合も基本的には同様のステップでクローン
の分析を行う。あらかじめ培養した宿主大腸菌にクロー
ン化ファージを感染させ、その溶菌液からファージDNA
を調製する。ファージがλgt11の場合には溶原菌として
生育させた後に、温度シフトにより溶菌液とすることも
できる。また、感染プレートからDNAを回収することも
可能である。ファージDNAの具体的な調製法に関して
は、例えば、続生化学実験講座１「遺伝子研究法II」の
第100頁（東京化学同人出版）に記載されている。ファ
ージDNAを制限酵素で切断してゲル電気泳動に付し、挿
入断片の確認を行い、更に、ハイブリダイゼーションに
より、ブタカルパスタチンcDNAとの相同性を調べる。最
終的には塩基配列を決定することにより、クローンの確
認を行う。

決定された塩基配列を既知のウサギ及びブタcDNAの比
較することにより、その遺伝子構造及びアミノ酸配列を
知ることができる。

更にブタ及びウサギカルパスタチンの機能単位との比
較からヒトカルパスタチンの機能単位を知ることができ
る。

このようにして、ヒトカルパスタチンの機能単位D1、
D2、D3及びD4のアミノ酸配列及び対応するDNA配列を決
定することができる。ブタカルパスタチンにおいては、
各機能単位単独でカルパインに対する阻害活性がある
が、Ｎ末側の非相同性の配列（機能単位Ｌ）単独では活
性がないことが知られており、ヒトカルパスタチンにお
いても同様の結果が期待できる。したがって、得られた
cDNAの構造遺伝子のすべて、機能単位１〜４のうちの少
なくとも１つの機能単位を含むDNA配列又は、活性保持
に必要な領域を残して、その５′側又は３′側から１部
又は全部を欠失させたDNA配列を適当な宿主細胞におい
て発現できるように発現ベクターに接続して、宿主細胞
に導入し、これを培養することにより、ヒトカルパスタ
チン活性を有するポリペプチドを生産させることができ
る。発現ベクターとしては、既存の種々のベクターを使
用することができる。

ブタ及びウサギのカルパスタチンは、その分子内にS-
S結合を含まないこと、及び糖鎖も有しないことから、
既に大腸菌で発現することが確認されており、ヒトカル
パスタチン様ポリペプチドも同様に大腸菌で発現させる
ことができる。

発現の確認は、カルパインに対する阻害活性を測定す
ることによって行うことができ、例えば、カゼインを基
質としたカルパインの測定系に、大腸菌の細菌抽出液を
加え、酸可溶性画分の減少を分光学的に測定することに
よって確認することができる。

大腸菌からのヒトカルパスタチン様ポリペプチドの精
製には、通常のクロマトグラフィーの手法が用いられ
る。すなわち、培養菌体をリゾチーム処理、次いで超音
波処理して上清を得、更に、カルパスタチンの熱安定性
を利用して、加熱処理を行って、可溶性画分を得る。次
いで、イオン交換、ゲルロ過等のクロマトグラフィーに
よって所望のペプチドを得ることができる。

以上述べてきたごとく、本発明により、ヒトカルパス
タチン様ポリペプチドの一次構造、機能単位、及び機能
単位中の、活性保持に必要な領域が明らかとなり、その
遺伝子工学的製造方法を提供することが可能となった。

〔実施例〕

次に本発明の実施例を示すが、これらは本発明を限定
するものではない。

実施例１ ヒトカルパスタチン cDNAのクローニング （1-1）cDNAライブラリーからのスクリーニング 〈ポジティブクローンの同定、単離〉 cDNAライブラリーは、クローンテック社（米国）から
入手した。これは正常人の肝臓由来のポリA mRNAを鋳型
にして作製されたcDNA（コード番号 HL 1001B）をλgt
11のベクターにクローニングしたものである。宿主菌
として大腸菌Y1090株（以下用いる菌はすべて大腸菌で
ある）を用い、10〜14cmの角シャーレ10枚に１枚当り1
0,000〜20,000個のプラークを形成させた。すなわちY 1
090株をＬ培地にアンピシリンとマルトースをそれぞれ
終濃度50μg/ml、0.4g/mlとなるように添加した培地
（以下Ｌ＋Ap＋Mal培地と略す）で、37℃で一晩培養し
た。これを宿主菌として、これの0.2mlとファージ液0.1
ml、及び軟寒天（Ｌ培地に終濃度0.6％になるようにア
ガロースを加え、オートクレーブで処理した後、50℃に
保ったもの）9mlを加え、Ｌ−プレート上に広げた（以
下この操作をプレーティングと略す）。

次にこのプレートを42℃１時間インキュベートした
後、37℃で８時間インキュベートした。形成させたファ
ージのプラークをアマシャム社製ナイロン膜（コード番
号Hybond-N）に移し、これを0.5 M NaOH、1.5 M NaClの
溶液に浸したロ紙上で５分間（変性）、0.5Mトリス（Tr
is）HCl（pH7.0）1.5 M NaClの溶液に浸したロ紙上で５
分間（中和）処理した後、２×SSC〔NaCl 17.53 g、ク
エン酸ナトリウム8.82g（H₂O 1中）〕中でリンスし、
ロ紙上で乾燥させた（以下この操作をフィルター処理と
略す）。UVランプで５分間このフィルターを照射し、DN
Aを固定した。プローブとしては、ブタの心臓由来のカ
ルパスタチンcDNAのドメイン１の一部からドメイン３に
またがる１キロベースのPst I断片を用いた。すなわち
ブタカルパスタチンcDNAを含むプラスミドpCSFL 713
（京大ウイルス研より入手）をPst I消化後ヌクレオジ
エン（Nucleogen）DEAE 4000カラムによって目的の断片
を分離精製することによって得た。得られた断片140ng
をアマシャム社製、マルチプライム標識システム（カタ
ログコード番号 RPN.1600Y）を用いて³²Pで標識し、５
×10⁸cpm/ngの比活性のプローブを得た。このプローブ
の全量と上記の調製したフィルターを用い、６×SCC、
１％ SDS100μg/mlのサケ精子DNA、５×デンハルト（D
enhardt）（ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリド
ン、フィコールをそれぞれ0.1％の濃度で含む）を含む
約35mlの溶液中で65℃で一晩ハイブリダイゼーションを
行った。次に室温の２×SCC、0.1％ SDS溶液中で10分
間フィルターを洗浄した。溶液を新たなものに変え、こ
の操作を更に３回繰返した後、50℃の１×SCC、0.1％
SDS中で60分間洗浄した。フィターをキムワイプ〔十条
キンバリー（株）〕の上に置き、余分な水分を除いた
後、ワットマン3MMロ紙をはりつけ、増感紙を当てて、
一晩−70℃でオートラジオグラフを行った。オートラジ
オグラフを行った結果、合計で51個のポジティブシグナ
ルを得た。

これらのシグナルに相当する位置のプラークを寒天ご
と、1mlのSM溶液（NaCl 5.8g、MgSO₄・7H₂Oの2g、1Mト
リスHCl pH 7.5、50ml、２％ゼラチン5mlを800mlの水に
溶解、全量を１とする）中に回収、懸濁し、適度に希
釈してプレーティングし（約300プラーク／φ9cm丸形シ
ャーレ）上記と同様の操作を行った（以下、二次スクリ
ーニングと略す）。その結果、10クローンに関してシン
グルプラークを単離することができた。

〈ファージ粗液の調製〉 次にクローン化できたファージを１枚の丸形シャーレ
に10⁵個程度プレーティングし、42℃で１時間、37℃で
６時間インキュベートした後、5mlのSM溶液を加え、４
℃で２時間穏やかに振とうして、ファージを溶出させ
た。溶出液を回収し、数滴のクロロホルムを加えてかく
はんし、４℃に保存した（以下、プレートライセート法
と略す）。上記の方法で約３×10¹⁰PFU/mlのファージ液
を得た。

〈溶原菌の分離〉 次に得られた上記ファージ液50μｌとY 1089株をＬ＋
Ap＋Mal培地で一晩振とう培養したものの10⁵倍希釈液30
μｌ、及び20μｌのSM溶液を加えてかくはんし、37℃で
15分間インキュベートした。上記の方法により、10クロ
ーンのうち７クローンに関して溶原菌を得ることができ
た。次に溶原菌を終濃度10mMになるようにMgCl₂を添加
したＬ＋Ap培地に植え、30℃で一晩培養した。

〈λ−DNAの調製〉 この一晩培養液0.2mlを10mlの上記MgCl₂を添加したＬ
＋Ap培地に植えて振とう培養し、O.D.600nmが0.5に達し
た時点（植菌後３時間）で45℃で15分間振とうし（ヒー
トインダクション）、次に37℃で2.5時間振とうを続け
た。6.000rpmで10分間遠心分離して集菌し、菌体ペレッ
トを0.2mlのSM溶液に懸濁し、0.2mlのクロロホルムを加
えてかくはんし溶菌させた。30分間放置した後、6,000r
pmで10分間遠心分離し、上清にDNaseとRNaseをそれぞれ
終濃度５μg/ml、50μg/mlになるように加え、37℃で10
分間インキュベートした。フェノール抽出、フェノール
−クロロホルム抽出、クロロホルム抽出を行い、上清に
1/10量の3M酢酸ナトリウム溶液と２倍量のエタノールを
加え、DNAを沈殿させた（以下、エタノール沈殿と略
す）。−20℃に一晩放置した後、10,000rpmで10分間遠
心分離し、沈殿を80％エタノールでリンスした後、沈殿
を乾燥させ、50μｌのTE緩衝液（10mMトリスHCl pH 7.
5、0.1 mM EDTA）に溶解した。

〈挿入断片の同定〉 調製した上記DNA溶液１μｌ、10倍濃縮EcoRI緩衝液
（組成は宝酒造・遺伝子工学用試薬カタログに記載され
ている、以下、10×緩衝液と略す）３μｌ、EcoRI 30ユ
ニットと水を加えて全量30μｌとしてかくはんし、37℃
で２時間インキュベートした後、RNasaを終濃度50μg/m
lになるように加えて更に10分間インキュベートした。
上記反応溶液中から10μｌを取出し２μｌの６倍濃縮電
気泳動用緩衝液（0.25％ブロモフェノールブルー、0.25
％キシレンシアノール、30％グリセロール、以下、６×
EP緩衝液と略す）を加え、1.2％のアガロースゲルで電
気泳動し、７クローンすべてに関して、1.8kbの挿入断
片を同定した。

〈挿入断片の制限酵素地図作成〉 1.8kbの挿入断片が固定された７つのクローンのうち
から任意に１クローンを選びλ_CS19と命名した。λ_CS19
から調製したDNA溶液40μｌと10×緩衝液40μｌ、EcoRI
200ユニットと水を加えて全量を400μｌとしてかくは
んし、37℃で2.5時間インキュベートした後、RNasaを終
濃度50μg/mlになるように加えて更に10分間37℃でイン
キュベートした。上記反応系から10mlを取出し、アガロ
ースゲル電気泳動で挿入断片が切り出されていることを
確認した後、5M酢酸アンモニウムを終濃度2Mになるよう
に加え、かくはんした後エタノール沈殿を行った。

−20℃に一晩静置した後、10,000rpmで10分間遠心
し、沈殿を80％エタノールでリンスし、沈殿を室温で乾
燥させ、40μｌのT.E.緩衝液に溶解させた。これに10μ
ｌの６×EP緩衝液を加え、１％のアガロースゲルで電気
泳動した。泳動後、ゲルを１μg/mlのエチジウムブロマ
イド溶液で10分間染色した後、紫外線照射下で目的の挿
入断片を含む部分をゲルから切り出した。これを電気抽
出用緩衝液（0.004M−トリス酢酸、0.1mM EDTA、pH8、
以下EE緩衝液と略す）を満たした透析チューブに挿入
し、外液も同じ溶液を満たし、17V/cmで20分間通電し
た。透析チューブからゲルを静かに抜き出した後、チュ
ーブを元の位置に戻して45秒間逆向きの電流をかけ、DN
Aをチューブ内の緩衝液中に溶出させた。このDNA溶液を
取出し、等量のフェノール／クロロホルム混液を加えて
かくはんし、6,000 rpmで５分間遠心した後上清を回収
した（以下フェノール／クロロホルム抽出と略す）。

上清のDNAをエタノール沈殿し、80％エタノールでリ
ンスした後80μｌのTEに溶解させた。得られたλ_CS19の
1.8kbの挿入断片を含むDNA溶液15μｌとpUC 118（宝酒
造）をEcoRI消化したもの0.2μｇ、10×ライゲーション
緩衝液（0.5MトリスHCl（pH 7.5）、0.1M MgCl₂、0.1M
ジチオスレイトール、10mMスペルミジン、2mM ATP）2.5
μｌ、T₄DNAリガーゼ2.8ユニットと水とを加え、全量25
μｌとしてかくはんし、15℃で一晩インキュベートし
た。

このライゲーション反応液５μｌを用いて、JM109株
を形質転換しX-Gal（５−ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）とIPTG（イソプロピ
ル−β−Ｄ−チオガラクトシド）をそれぞれ40μg/ml、
19μg/mlの濃度で含むＬ＋Ap培地のプレート上にまき白
いコロニーを選ぶことによって1.8kbの断片が挿入され
ている組換え体を得た。得られた組換え体のうちから任
意に４クローンを選び出し、5mlのL-Ap培地で一晩培養
した後1.5mlの培養液からアルカリ溶菌法〔文献:1982
年、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発
行、T.マニアスティス（T.Maniastis）ほか著、モレキ
ュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル
（Molecular Cloning,A Laboratory Manual）第368頁〕
によってプラスミドDNAを調製し、15μｌのT.E.緩衝液
に溶解した。上記の４クローンから調製したDNAをそれ
ぞれpUC 118のポリリンカーシークエンス内に認識配列
が存在する制限酵素単独で消化し、続いて上記の酵素と
BamHIとを組合せて消化し、電気泳動で切断パターンを
解析した。第１図に制限酵素地図を示す。DNAの消化は
上記の調製したDNA溶液１μｌ、各酵素別の10倍濃縮緩
衝液（宝酒造遺伝子工学用試薬カタログに記載、以下10
×緩衝液と略す）１μｌ、各酵素５ユニットと水とを加
えて全量10μｌとし、かくはんした後、37℃で２時間イ
ンキュベートすることによって行った。反応終了後、反
応液に２μｌの６×EP緩衝液を加え、1.2％のアカロー
スゲルを用いて電気泳動を行った。

〈挿入断片の塩基配列決定〉 先に調製したλ_CS19の挿入断片DNA溶液15μｌとM13mp
19（宝酒造）のRF DNAをEcoRI消化したもの0.2μｇ、10
倍濃縮ライゲーション緩衝液2.5μｌ、T₄DNAリガーゼ2.
8ユニットと水とを加え、全量25μｌとしてかくはん
し、15℃で一晩インキュベートした。このライゲーショ
ン反応液１μｌを用いて、既述同様にしてJM109株を形
質転換し、X-GalとIPTGをそれぞれ1mg、0.238mg指示菌
としてJM109株をＬ培地中で一晩培養したもの0.2ml、軟
寒天（Ｂ培地に終濃度0.6％になるように寒天を加え、
オートクレーブで処理した後50℃にしたもの）4mlを加
え、Ｂ培地（バクト トリプトン10g、NaCl 8g/l、１％
ビタミンB₁）のプレート上にまき、白いプラークを選ぶ
ことによって1.8kbの断片が挿入されている組換え体を
得た。

得られた組換え体12クローンのファージをプラークか
らとり5mlのJM109株の一晩培養液をＬ−培地で1/100に
希釈したものに感染させ、６時間振とう培養した。組換
え体ファージのRF DNAをプラスミドDNAと同様、既述の
アルカリ溶菌法によって調製し、15μｌのTE緩衝液に溶
解した。このDNA溶液５μｌとHind III用10×緩衝液１
μｌ、HindIII5ユニットと水を混ぜて全量10μｌとし、
かくはんした後37℃で２時間インキュベートした。２μ
ｌの６×EP緩衝液を加え、1.2％のアガロースゲルづ電
気泳動し、切断パターンから1.8kbの挿入断片の方向を
決めた（１つの方向のをMCS2と命名しもう一方向のをMC
S5と命名する）。MCS2とMCS5を作製したのと同様にし
て、λ_CS19の挿入断片がM13mp 19のEcoR Iサイトに異な
った向きに挿入されている２クローン（MCS 22とMCS 29
と命名）を作製した。20mlの培養液から、MCS 22とMCS
29のRF DNAを同様にして調製し、10μg/50μlTEのDNA溶
液を得た。MCS 22のRF DNA 1μｇ（５μｌ）と10×緩衝
液２μｌ、50μg/ml RNase溶液１μｌ、Xho I 5ユニッ
ト、Sal I 5ユニットと水とを加えて全量20μｌとし、
かくはんした後37℃で１時間インキュベートした。反応
液を10分間65℃に保って、制限酵素を失活させた後２μ
ｌを取出し、これに10×ライゲーション緩衝液10μｌ、
T₄DNAリガーゼと水とを加えて全量100μｌとし、かくは
んした後、16℃で３時間インキュベートした。反応液の
40μｌを用いて既述と同様にしてJM109株を形質転換
し、白いプラークのクローンを解析し、1.8kbの挿入断
片のXho IサイトからＮ末側が欠失している誘導体MCS41
と命名）を得た。

同様にして、それぞれ、Sac I、Acc I、Hind III、Ps
t I、Bgl II＋BamH I、Xba Iを用いることによって、対
応する挿入フラグメントのサイトからＮ末側から欠失し
ている誘導体を得た。ただしAcc Iの場合は、認識配列
が一意的には決まっていないので、末端の粘着末端を平
滑末端にしてからライゲーションを行った。同様にして
MCS29から出発することによって、上述のサイトのＣ末
側が欠失している誘導体を得た。更に、1.8kbの断片内
にある0.4kbのHind III断片は、M13mp18のHind IIIサイ
トにサブクローニングした。

上記の誘導体クローンを用いて、ジデオキシ法によっ
て、1.8kbの挿入断片の全塩基配列を決定した。この挿
入断片がカバーする物理地図上での領域をλ_CS19として
第１図に示した。決定された塩基配列を、ブタのカルパ
スタチンのcDNAと比較することによって、1.8kbの挿入
断片は、カルパスタチン遺伝子のコーティング領域の９
割をカバーすることが明らかになった。

（1-2）プライマー伸長法によるcDNAクローニング 次に上記1.8kbの断片ではカバーされていない、機能
単位１の一部をカバーするクローンを得るため、mRNAの
プライマー伸長法によるcDNAクローニングを行った。

（ポジティブクローンの同定、単離） mRNAは、正常人肝由来のものを、前述のクローンテッ
ク社から得た（コード番号6510）。プライマーは、塩基
配列の602から586の位置に５′→３′の方向で存在する
17bpの合成DNAを用いた。mRNA2μｇと、プライマー0.1
μｇとを加え、アマシャム社製cDNA合成キットを使っ
て、cDNAを合成した。次に同じくアマシャム社製cDNAク
ローニングシステムλgt 10を使って、無細胞系で、cDN
Aをλgt 10のEcoR Iサイトに組込んだものを、ラムダフ
ァージにパッケージした。ただし、パッケージには、ス
トラテジーン社のギガパックゴールド（GIGAPACK GOL
D）を用いた。宿主菌もストラテジーン社推薦のC600Hfl
株を用いてプレーティングを行い、角シャーレ10枚に、
１枚当り6,000個のファージを形成させ、これをフィル
ターに移してフィルター処理を行った。プローブとし
て、塩基配列の316から690の位置に相当するEcoR I-Xho
I断片を用いた。

前述のpCS8の56μｇと、10×緩衝液、EcoRI 100ユニ
ット、Xho I 100ユニットと水とを加えて400μｌとし、
かくはんした後37℃で２時間インキュベートした。反応
終了後、1.2％のアガロースゲルで電気泳動を行い、目
的の断片を含む部分を切り出した後、DNAを前述のよう
に電気的に抽出し、2.2μｇを得た。このうち0.1μｇ
を、前述のマルチプライム標識システムを用いて、³²P
で標識し、２×10⁸CPM/μｇの比活性のプローブを得
た。このプローブ３×10⁶CPMと先に調製したフィルター
を用い、ハイブリダイゼーションを行った。次にフィル
ターを洗浄し、オートラジオグラフを行った。ポジティ
ブシグナルが１つ得られたので２次スクリーニングを行
い、シングルプラークを単離した（λcs 131と命名す
る）。

（λcs131のDNAの調製） 次にファージを液体培養法（遺伝子研究法、第100
頁、東京化学同人出版）によって40mlの培養液から調製
し、これから24μｇのDNAを得た。

（挿入断片の同定） 先に得られたDNA1μｇと10×緩衝液３μｌ、EcoRI 30
ユニットを加え、全量30μｌとし、かくはんした後37℃
で２時間インキュベートした。反応後を1.2％アガロー
スゲルで解析し、0.5kbの挿入断片を同定した。

（挿入断片の塩基配列の決定） 先に得られたファージDNA 20μｇと、10×緩衝液60μ
ｌ、EcoRI 100ユニットを加え、全量600μｌとし、かく
はんした後37℃で２時間反応させた。反応液をエタノー
ル沈殿を行って濃縮し、DNAを40μｌのTEに溶解させ
た。これを1.2％のアガロースゲル電気泳動にかけ、目
的の挿入断片を含む部分を切り出し、DNAを電気的に抽
出し、100ngを得た。得られたDNA断片50ngと、RFM13mp1
9のEcoRI消化物50ng、10×ライゲーション緩衝液１μ
ｌ、T₄DNAリガーゼ2.8ユニットと水とを加えて10μｌと
してかくはんし、15℃で一晩インキュベートした。

ライゲーション反応液１μｌを用いてJM 109株を形質
転換し、前述したのと同様にして組換え体クローンを得
た。このクローンを用い、ジデオキシ法によって、0.5k
bの挿入断片の塩基配列を決定した。この挿入断片がカ
バーする物理地図上での領域をλ_CS131として第１図に
示した。実施例（1-1）、及び（1-2）での塩基配列分析
の結果からヒトカルパスタチンの機能単位Ｌの一部と、
機能単位１から４までをカバーするクローンが得られた
ことが明らかになった。

（1-3）Ｎ末端領域のcDNAクローニング 更にＮ末端領域をカバーするcDNAクローンを得るため
に、ランダムプライマーを用いて作製したcDNAライブラ
リーから、既得のcDNAクローンのＮ末側断片をプローブ
に用いてスクリーニングを行った。その結果、カルパス
タチン蛋白の開始コドンの上流90塩基対までをカバーす
るクローンを得た。下記にその過程を示す。

（ポジティブクローンの同定、単離） 前述のmRNA 5μｇと、プライマーとしてランダムヘキ
サマー1.5μｇを用いて（1-2）に示したのと同様にして
cDNAライブラリーを作製した。次にプローブとして塩基
配列の390から465の位置に相当する、前述のλ_CS19のEc
oR I-AccI断片を用い、これに相同の断片を有するクロ
ーンを約10万個の組換え体からスクリーニングした。そ
の結果、４つのポジティブクローンを単離した。

（挿入断片の解析） 次に（1-2）に示したのと同様にして挿入断片を同定
し、塩基配列を解析した結果、１つのクローン（λ_CS14
3と命名）は、カルパスタチン蛋白の開始コドンを含む
−96から1294までをカバーすることが明らかになった。
λ_CS143がカバーする物理地図上での領域を第１図に示
した。実施例（1-1）、（1-2）及び（1-3）での塩基配
列の分析の結果から、前記した本発明のヒトカルパスタ
チンcDNAの全塩基配列及び蛋白の全アミノ酸配列が明ら
かになった。

実施例２ 発現プラスミドの構築 以下の手順で、λ_CS19とλ_CS131の挿入EcoR I断片
を、シークエンスがオーバーラップする領域内にあるAc
cIサイトでつなぎ合せ、これをpUC 119（Ｎ）のNco Iサ
イトにインフレームで挿入した発現プラスミド（pHCS 1
21と命名）を構築した。

pCS 860μｇをEcoR Iで消化し、エタノール沈殿をし
た後、10×緩衝液45μｌ、AccI 270ユニットと水とを加
え、全量450μｌとしてかくはんし、37℃で2.5分間イン
キュベートした後、270μｌの0.2MEDTAを加えて反応を
終了させ、プラスミドDNAをAccIで部分的に消化した。
次に１％アガロースゲルで電気泳動を行い、1.77kbのEc
oR I-AccI部分消化断片を含む部分を切り出し、DNAを電
気的に抽出した（実際には、未消化EcoR I断片との混液
で、４μｇ得られた）。この部分消化断片２μｇと、λ
_CS131から切り出し調製したBamH I-AccI断片0.3μg pUC
119（Ｎ）をEcoR IとBamH Iで二重消化したもの0.2μ
ｇ、10×ライゲーション緩衝液２μｌと水とを加え、全
量20μｌとしてかくはんし、15℃で一晩反応させた。

反応液を70℃に10分間保ってリガーゼを失活させた後
10μｌを取出し、これに10×TA緩衝液５μｌと、Sma I
10ユニット、水とを加え全量50μｌとし、37℃で１時間
インキュベートした。このうち15μｌを用いてJM109株
を形質転換し、pHCS13を得た。pHCS13のプラスミドDNA
を調製し、0.8μｇのDNAをBamH Iで消化した後、フェノ
ール抽出、エタノール沈殿をし、DNAを回収した。次に1
0×緩衝液（70mM トリスHCl、pH 7.5、200mM Nacl、70
mM MgCl₂）1.5μｌと、クレノウ酵素２ユニット、dNTP
混液（それぞれ1mM）と水とを加え、全量15μｌとして
かくはんし、37℃で10分間インキュベートした。

次にこれに12merのNco Iリンカー〔ｄ（pCAGCCATGGCT
H）〕0.1μｇ、200mMdTT 1μｌ、10mMA TP0.5μｌ、T₄D
NAリガーゼ2.8ユニットと水とを加え、全量20μｌとし
てかくはんし、15℃で一晩インキュベートした。

ベッド体積1.5mlのセファロースCL-4Bカラム〔ファル
マシア社、0.15M NaCl、トリス塩酸（pH 7.5）、0.1mM
EDTAで平衡化〕で過剰のリンカーを除いた後、MgCl₂
を終濃度10mMになるように加え、更にNco Iを100ユニッ
ト加え全量を550μｌとし、37℃で2.5時間インキュベー
トした。次に70℃に10分間保ち、Nco Iを失活させた
後、反応系から250μｌ取出し、これにATPとDTTをそれ
ぞれ終濃度0.2mM、10mMになるように加え、更にT₄DNAリ
ガーゼ15ユニットを加え、15℃で一晩インキュベートし
た。次に反応液を70℃に10分間保ち、リガーゼを失活さ
せた後、5M NaCl 5μｌ、Sal I 50ユニットを加え、37
℃で２時間インキュベートした後、コンセントレーター
で濃縮し、これを水に対して透析した（終体積63μ
ｌ）。これから25μｌを取出しJM109株を形質転換し、p
HCS 121を得た。第２図（その１）にその構築過程を工
程図として示す。

pHCS 121を導入した大腸菌JM109をEscherichia coli
JM 109/pHCS 121と表示し、工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託した〔微工研菌寄第9989号（FERM P-998
9）〕。

次にpHCS 121のカルパスタチンの構造遺伝子の下流
に、pIN III-ompAベクター〔K.中村及びM.井上（K.Naka
mura、M.Inouye）、セル（Cell）第18巻、第1109頁（19
79）〕のターミネーター断片を、以下の手順で導入し
た。

pUC 118（Ｎ）をNco IとSal Iで切断し、このベクタ
ー断片10ngと、pIN III-omp Aのターミネーターを含むE
coR I-Sal I断片50ng及び先のpHCS 121のカルパスタチ
ン構造遺伝子のNco I-EcoR I断片50ngを混合し、T₄DNA
リガーゼを加え、一晩15℃で反応させた。この反応液15
μｌのうち３μｌを用いてJM109株を形質転換し、第２
図（その２）に示したようにpHCS 131を得た。

次に、以下の手順でλ_CS143の挿入EcoR I断片とpHCS
131を、シークエンスがオーバーラップする領域内にあ
る制限酵素サイトでつなぎ合せ、Nco Iサイトでフレー
ムが合うようにつなぎ合せた発現プラスミドpHCS 181を
構築した。

λ_CS143から切り出し、調製したEcoR I断片50 ng、pU
C 119（Ｎ）をEcoR I消化したもの10 ngをTAKARAライゲ
ーションキットを使って15℃で30分間反応させた。この
反応液60μｌから20μｌを用いてJM109株を形質転換
し、pHCS 51を得た。pHCS 51から切り出し、調製したHi
nfI断片に、クレノウ フラグメントによる末端修復を
施した後、Bcn I消化し、平滑末端‐Bcn I断片を得た。
またpHCS 121から切ら出し、調製したNco I-Xho I断片
をBcn I消化し、Bcn I-Xho I断片を得た。更にpHCS 121
をNco I消化した後、クレノウ フラグメントによる末
端修復を行い、Xho I消化した。１％低融点アガロース
ゲルで電気泳動を行い、4.5kbの平滑末端−Xho I断片を
含む部分を切り出し、DNAを回収した。上記の３つの断
片である平滑末端−Bcn I断片50μｇ、Bcn I-Xho I断片
50μｇ、平滑末端−Xho I断片50 ngをTAKARAライゲーシ
ョンキットを用いて15℃で30分間反応させた。この反応
液60μｌから20μｌを用いてJM 109株を形質転換し、pH
CS 181を得た。第２図（その２）にその構築過程を工程
図として示す。

pHCS 181を導入した大腸菌JM 109をEscherichia coli J
M 109/pHCS 181と表示し、工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託した〔微工研菌寄第10188号（FERM P-1018
8）〕。

次に、以下の手順で、ドメインＬ−ドメイン１蛋白の
欠失誘導体を作製した。

まず、pHCS 181の50mgをSac IとXba Iで完全に切断し
た後、200ユニットのSIヌクレアーゼで処理し、DNAの切
断位を平滑末端にした。フェノール抽出、エタノール沈
殿の後、回収したDNAと、10×ライゲーション緩衝液2.5
μｌ、T₄DNAリガーゼ2.8ユニットと水とを加え、全量を
25μｌとし、15℃で一晩インキュベートした。このライ
ゲーション反応液10μｌを用いてJM 109株を形質転換し
た。得られた形質転換体のうちから任意に24クローンを
選び、プラスミドDNAを調製した後、制限酵素EcoR IとA
ccIで切断し、電気泳動にかけDNAを解析することにより
ドメイン2-4を含むSac I-Xba I断片が欠失したクローン
７個を得た。このうち１つのクローンをpHCS 82と命名
した。

次に^５′TATCTGATGCATGCTTGGGTA³′と、^５′GTGAGCAT
CGATACTTCCTG³′のオリゴデオキシヌクレオチドを合成
し、宝酒造のサイト−ダイレクテッド ミュータジェネ
シス システム、ミュータン−Ｋ（Site-directed muta
genesissystem,Mutan-K）のキットを用いてpHCS 82のド
メインＬのＮ末領域の、Ｎ末側にAva III認識配列を、
Ｃ末側にCla I認識配列の導入を試みた。その結果、24
の形質導入体のうち、10クローンは、２つの酵素の認識
配列が導入されていることが明らかになった。このうち
１つのクローンを任意に選び、pHCS 83と命名した。

同様にして^５′CCTTTCTTTACTTCTCTTG³′のオリゴヌク
レオチドを合成し、これと前述のミュータン−Ｋ（Muta
n-K）のキットを用いてpHCS 83のドメインＩのＣ末領域
に、終止コドンを導入した。11個のクローンが得られ、
このうち任意に１つを選択し、pHCS 84と命名した。そ
の構築過程を第２図（その３）に工程図として示す。

次に、pHCS 84のプラスミドDNAを調製し、５μｇのDN
AをAva IIIとSal Iで切断し、アガロースゲル電気泳動
にかけた後、DNAを電気的に抽出し１μｇのドメインＬ
−ドメイン１と、ターミネーターを含むAva III-Sal I
断片を得た。また、pTV 119N（宝酒造）２μｇをPst I
とSal Iで切断し、この0.1μｇと前述のAva III-Sal I
0.02μｇ、タカラ（TAKARA）ライゲーションキットを用
いて15℃で30分間反応させた。

この反応液の75μｌのうち５μｌを用いて大腸菌JM 1
09株を形質転換し、得られた形質転換体のうちから任意
に６クローンを選び、DNAを調製した。これらのクロー
ンに関して制限酵素Sph IとSal IでDNAを切断し、アガ
ロース電気泳動にかけて解析し、pTV 119NのPst I-Sal
Iのポリリンカーの断片がこの向きで、pHCS 84のAva II
I-Sal I断片に置き変わったクローンを得、pHCS 231と
命名した。pHCS 231を、形質転換により導入した大腸菌
JM 109を、Escherichia coli JM 109/pHCS 231と表示
し、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した〔微工
研条寄第2829号（FERM BP-2829） 次に、以下の手順で、pHCS 231を出発物質に用いて、
ドメインＬ−ドメイン１蛋白をＮ末側から段階的に欠失
させた一連のクローンを得た。

まず、pHCS 231のDNAを調製し、この25μｇをSph Iと
Cla Iで切断した。この消化物25μｇを、宝酒造のキロ
−シークエンス（Kilo-Sequence）用デリーションキッ
ト（Deletion Kit）を用い、DNAをCla Iサイトから、反
応時間を５段階に変化させた条件で欠失させた。ただし
反応は、23℃で行った。次にこの反応液の全量と、それ
ぞれ0.15μｇの３種のNco Iリンカー（ファルマシア
製、^５′CAGCCATGGCTG³′、^５′AGCCATGGCT³′及び^５′
GCCATGGC³′）、３μｌの10×ライゲーション緩衝液、
及び350ユニットのT₄DNAリガーゼを用い、全量25μｌと
して15℃で一晩反応させた。これに120ユニットの制限
酵素Nco Iを、75μｌの反応系で37℃で３時間作用させ
た。反応液を65℃で５分間処理した後、過剰のNco Iリ
ンカーを除いた後、エタノール沈殿を行い、これに10μ
ｌの10×ライゲーション緩衝液、及び350ユニットのT₄D
NAリガーゼを用い、全量100μｌとし、15℃で一晩反応
させた。反応系から20μｌ取出し、これに12ユニットの
制限酵素Cla Iを25μｌの反応系で37℃で１時間反応さ
せた。反応液の15μｌを用いてJM 109株を形質転換し、
形質転換体を得た。このうち108個のクローンに関し
て、コロニーの一部を100μｌの蒸留水に懸濁し、100℃
で10分間処理した後、この50μｌと、M13プライマーRV-
N及び19merプライマー（いずれも宝酒造、^５′TGTGGAAT
TGTGAGCGG³′、^５′CCTTTCTTTACTTCTCTTG³′）をそれぞ
れ10pmolを用い、PCRのシステム（パーキンエルマー・
シータス社製のジーンアンプキット及びサーマルサイク
ラー）で、欠失の長さを調べた。この結果得られた一連
のクローンの発現蛋白のＮ末端を第３図に示した。

最後に、Ｃ末端側も短くなっているドメインＬ−ドメ
イン１蛋白を得るために、これまでに得られたクローン
のコーディング領域内に終止コドンを、前述のpHCS 84
と同様にして導入した。

変異（終止コドン）導入のための出発プラスミドとし
て、pHCSd 42とpHCSd 94を用い、前者から終止コドンの
位置が異なる２種類の変異体（pHCSd 421とpHCSd 422と
命名）を、後者から１種類の変異体（pHCSd 941と命
名）を得た。ここでpHCSd 421及びpHCSd 941は、^５′TT
CACCTGAGGGTCGCC³′のオリゴヌクレオチドを用いて変異
を導入し、元のプラスミドより、Ｃ末側が37アミノ酸残
基短くなるように作製し、pHCSd 422は、^５′TATTGGCTT
AACCCATA³′のオリゴヌクレオチドを用い53アミノ酸残
基短くなるように作製した。得られた３つのクローンの
発現蛋白のＣ末端も第３図に示した。このようにして得
られた欠失導入プラスミドを用いて大腸菌545πHR株を
形質転換し、得られた形質転換体を実施例３の蛋白の発
現の試料に用いた。

得られた欠失導入プラスミドの１つ、pHCSd 42を導入
した大腸菌545πHRをEscherichia coli 545πHR/pHCSd
42と表示し、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託し
た〔微工研菌寄第10649号（FERM P-10649）〕。

実施例３ ヒトカルパスタチンポリペプチドの大腸菌に
おける発現 実施例２で得られたEscherichia coli 545 πHR/欠
失導入プラスミドを１のＬ培地に植えて37℃で振とう
培養し、対数増殖中期に達した時点で、終濃度2mMにな
るようにIPTGを加え、更に15時間培養を行った。培養
後、菌体を０℃に冷やした後、NaN₃を終濃度0.02％にな
るように加え、かくはんした後、集菌した。上清を捨て
菌体を40mlのＮ緩衝液〔20mM MES〔２−（Ｎ−モルホリ
ノ）エタンスルホン酸（pH 5.5）〕、1mM EDTA、４μM
PMSF、5mM 2−メルカプトエタノール〕で洗浄し、遠心
した後、40mlのＮ緩衝液に懸濁し、リゾチームを終濃度
0.5mg/mlとなるように加え、10分間０℃でインキュベー
トする。次に、超音波処理を行い、14,000rpmで20分間
遠心し、上清を95℃に10分間保った。更にこれを12,000
rpmで20分間遠心し、上清を回収した。この加熱処理済
上清を20mM MES、1mM EDTA、４μM PMSF、50mM NaCl pH
5.5を含む緩衝液で平衡化したDEAE・トヨパール650Mの
カラム（東ソー株式会社）80mlに通した。

カラムを350mlの上記緩衝液で洗浄した後、50mMから2
00mMの一次濃度勾配となるNaClを含む上記緩衝液1000ml
で溶離分画した。このようにして得た一各画分のカルパ
スタチン活性を、以下に示すようにカルパインの阻害を
見ることにより測定した〔ジャーナル オブ バイオケ
ミストリー、第95巻、第1759頁（1984）〕。サンプルと
カルパイン２μｌ（0.4U）２％カゼイン40μｌ、6mg/ml
システイン溶液と水とを混合し、全量180μｌとした。

次に30℃に20分間予熱した後、50mM塩化カルシウムを
20μｌ加えて混合し、30℃で20分間インキュベートし
た。次に５％TCAを200μｌ加えて反応を停止し、12,000
rpmで10分間遠心し、上清を回収した。この上清のOD280
nmを測定し、これによりカルパイン阻害活性を算出し
た。そしてカルパイン阻害活性を有する画分をSDS−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動に供し、電気泳動的に単
一な画分を水で透析し凍結乾燥を行った。上記の方法で
pHCSd 42,pHCSd 94,pHCSd 65,pHCSd 421,pHCSd 422,の
凍結乾燥標品を得た。なお、pHCSd 81に関しては、同様
に処理した加熱処理済上清を20mMトリス−HCl 1mM EDTA
4μM PMSFを含む緩衝液で透析し、上記緩衝液で平衡化
したDEAEトヨパール650Mカラム（80ml）に通し、未吸着
画分を分画した。そして同様に電気泳動的に単一なカル
パスタチン活性を有する標品を得た。これらの構築過程
を第２図（その４）に工程図として示す。上記の方法で
得た標品は、第４図に示したようにブタ赤血球カルパイ
ン１に対して阻害活性を示した。次に、この標品の構造
が、前記pHCSd 42で示されるポリペプチドであることを
確認した。

〔発明の効果〕

以上の結果から、本発明により、ヒトカルパスタチン
様ポリペプチドの遺伝子工学的製造法が提供された。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒトカルパスタチンcDNAの制限酵素地図及び機
能単位構造を示した図、第２図は、ヒトカルパスタチン
様ポリペプチドを発現させるための組換え体プラスミド
の構築過程を示した工程図、第３図は欠失誘導体のＮ末
端及びＣ末端の位置を示す図、第４図は欠失誘導体のカ
ルパイン阻害活性の強さを示した図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寶酒造 株式会社中央研究所内 (56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，３（１）〔1989〕 Ｐ．49−56 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ ｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, 263（５）〔1988〕Ｐ．2364−2370

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記一般式I: 〔式中Ｙは下記式 で表される配列又は水酸基（−OH）を示す〕で表される
   ことを特徴とするヒトカルパスタチン様ポリペプチド。
2. 【請求項２】請求項１記載のポリペプチドをコードする
   核酸。
3. 【請求項３】請求項１記載のヒトカルパスタチン様ポリ
   ペプチドをコードするDNAを含有させた組換え体プラス
   ミド。
4. 【請求項４】請求項３記載の組換え体プラスミドを導入
   せしめた形質転換体。
5. 【請求項５】請求項４記載の形質転換体を培養し、該培
   養物より請求項１記載のヒトカルパスタチン様ポリペプ
   チドを採取することを特徴とするヒトカルパスタチン様
   ポリペプチドの製造方法。