JPH08292A - アクリジニウム誘導体の発光方法及びその方法を用いた検査対象物質の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 アクリジニウム誘導体の発光方法及びその方
法を用いた検査対象物質の検出方法を提供する。 【構成】 アクリジニウム誘導体の発光方法は、アスコ
ルビン酸を化学発光誘発剤として用いることからなる。
検出方法は、標識からの信号を検出することを用いて被
検試料中の検査対象物質を検出する方法において、前記
の発光方法によって得られる化学発光を標識からの信号
とする。 【効果】 発光強度が強くなり、発光時間も長くなるの
で、発光測定装置の構成の自由度が高くなる。酵素を用
いると、発光反応直前までアクリジニウム誘導体を酸性
条件下で安定に保存できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アクリジニウム誘導体
の発光方法、及びその発光方法を用いた検査対象物質の
検出方法にも関する。

【０００２】

【従来の技術】診断や医療技術の進歩に伴い、各種疾病
の早期発見や治療効果の確認のために、血清などの生体
試料中に極微量で含まれる特定物質の検出法が求めら
れ、種々の方法が開発されてきた。その中で特に化学発
光法は、高感度であることから特に注目され、近年ます
ます拡大しつつある。化学発光法に実際に使用されてい
る化学発光物質は、ルミノール、アクリジニウム誘導体
又はアダマンタン化合物（ＰＰＤ又はＡＭＰＰＤ）等で
あるが、なかでもアクリジニウム誘導体は、ウッドヘッ
ド等が免疫測定に応用してから、その高感度性から特に
注目されてきた(Clin.Chem.,29,1474-1479,1983)。

【０００３】アクリジニウム誘導体を用いて特定物質を
検出する従来の方法では、アクリジニウム誘導体を標識
物質として用いる。例えば、サンドイッチ法と呼ばれる
免疫測定の場合では、まず、ポリスチレンなどの不溶性
担体に固定化した特定物質に対する抗体に試料を接触さ
せると、試料中に含まれる特定物質が、抗体との親和力
により上記不溶性担体上に結合する。次に、特定物質に
対する抗体にアクリジニウム誘導体を化学的に結合した
標識抗体を、先の不溶性担体に接触させる。この操作に
より、標識抗体は、不溶性担体上に結合している特定物
質の量に相関した量で不溶性担体上に結合する。次に、
不溶性担体上に結合していない過剰の標識抗体を洗浄操
作等により分離してから化学発光測定を行う。アクリジ
ニウム誘導体は、強アルカリ条件下にて過酸化水素と反
応させると強く発光する。従って、化学発光を誘発する
試薬としては、通常、水酸化ナトリウムと過酸化水素の
水溶液が使われる。このような化学発光を誘発する試薬
を、先の不溶性担体上に結合している標識抗体に接触さ
せ、アクリジニウム誘導体を化学反応により発光させ
る。この際の発光強度は、試料中の特定物質濃度に相関
しているので、発光強度をフォトンカウンタ等により測
定することで、試料中の特定物質濃度を求めることがで
きる。

【０００４】このような一連の操作により、試料中の特
定物質を高感度に検出することができるようになってき
た。高感度化が可能になった理由は、モノクローナル抗
体等の高性能な抗体の出現などだけでなく、やはり、ア
クリジニウム誘導体という量子収率の高い発光物質が、
特に貢献しているは明らかである。しかしながら、この
ようなアクリジニウム誘導体を用いた方法にも幾つか問
題点があり、その改善が求められている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】第１の問題点は、アク
リジニウム誘導体の安定性である。アクリジニウム誘導
体は、酸性条件下では長期間安定に保存することができ
るが、中性以上の条件下に晒されると偽塩基が形成さ
れ、この偽塩基となったアクリジニウム誘導体は、化学
発光誘発試薬を接触させても発光不能になることが知ら
れている（I.Weeks,I.Beheshti,F.McCapra,A.K.Campbel
l,and J.S.Woodhead,Clin.Chem.,29,1474-1479,1983;
J.S.Littig and T.A.Nieman,J.Biolumin.Chemilumin.,
8,25-31,1993）。

【０００６】一方、試料中の検査対象である特定物質
と、アクリジニウム誘導体で標識した抗体等とを接触さ
せ、効率よく特定物質を捕捉するためには、前記の接触
を中性条件下にて行う必要がある。またアクリジニウム
誘導体で標識される物質が、抗体のようなタンパク質で
あれば、その保存条件は中性条件であることが望まし
い。しかし、アクリジニウム誘導体を標識物質として用
いる場合には、前記のような中性条件がことのほか不都
合となる。この対策として、アクリジニウム誘導体の偽
塩基形成が、溶液のｐＨに依存して可逆的に変化する性
質、すなわち、中性条件に晒されて偽塩基を形成して
も、酸性に戻せばもとのアクリジニウム誘導体に戻る性
質を利用する。具体的には、アクリジニウム誘導体を標
識物質として用いて特定物質の検出を実施する際には、
アクリジニウム誘導体で標識した抗体等によって試料中
の特定物質を中性条件下にて捕捉した後、塩酸や硝酸な
どの酸を添加して酸性にし、一定時間保持してから化学
発光操作を行うのが一般的になっている。しかし、前記
の方法は操作が煩雑になるだけでなく、アクリジニウム
誘導体の偽塩基が酸によって完全にもとの状態に戻るわ
けではないので、本来の化学発光量を得ることはできな
い。更に、アクリジニウム誘導体で標識した抗体等の溶
液を中性条件下で保存しておく過程で、アクリジニウム
誘導体の一部は、暗反応によって分解してしまう（特開
昭６３−１０１３６８号、特開平１−２６１４６１号及
び特開平６−９５６６号各公報）。従って、常に安定し
た結果を得ることは困難である。

【０００７】アクリジニウム誘導体の第２の問題点は、
発光時間が非常に短い点である。化学発光誘発剤を添加
してから１秒以内に発光のピークを迎え、その後急速に
発光強度が低下し、数秒間で完結する。このような発光
特性であるために、化学発光誘発剤を一定量添加すると
同時に、発光強度を測定する必要がある。従って、発光
強度を測定する装置は、完全自動装置であるか簡単な半
自動装置であるかを問わず複雑になってしまう。その理
由は、測定装置において、化学発光誘発剤を一定量添加
する工程を行う部分は、装置のメンテナンスのために、
オープンな構造とする必要があるのに対し、一方、発光
強度を測定する工程を行う部分は、完全密閉され暗室化
されていなければならない、という相反する問題を解決
する必要があるからである。仮に発光時間がある程度長
ければ、測定装置における化学発光誘発剤の添加工程
と、発光強度測定工程との間に時間的及び空間的余裕が
生まれることから、測定装置の設計に自由度が増し、よ
り安価で信頼性の高い装置を供給することができるので
ある。

【０００８】このような状況を鑑みて、本発明者らは、
アクリジニウム誘導体を用いた特定物質の検出法につい
て鋭意研究を行った結果、アスコルビン酸を用いると、
アクリジニウム誘導体を中性からアルカリ性条件下にて
強く発光させることができることを見出し、更に、この
現象を用いて特定物質を検出することもできることを見
出した。本発明は、こうした知見に基づくものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、アス
コルビン酸を化学発光誘発剤として用いることを特徴と
する、アクリジニウム誘導体の発光方法に関する。更
に、本発明は、標識からの信号を検出することを用いて
被検試料中の検査対象物質を検出する方法において、前
記の発光方法によって得られる発光を標識からの信号と
することを特徴とする、検査対象物質の検出方法にも関
する。

【００１０】以下、本発明を詳述する。本発明で用いら
れるアクリジニウム誘導体は、アクリジン環の環窒素原
子が４級化して対イオンを有しており、しかもアクリジ
ン環の９位に−Ｃ（＝Ｏ）−基を介して置換基を有し、
そして、場合により１〜８位が１個又はそれ以上の置換
基によって置換されていることのある化合物、即ち、以
下の一般式（１）：

【化１】 （式中、ｎは、０又は１〜８の整数であり、Ｒ₁ 、Ｒ₂
及びＲ₃ はそれぞれ独立に置換基であり、Ｘ^- は対イオ
ンである）で表される化合物である。

【００１１】前記の一般式（１）で表されるアクリジニ
ウム誘導体は、例えば、ＥＰ公開第８３０６２９号、特
開昭６３−５７５７２号、特開昭６３−１０１３６８号
及び特開昭６３−１１２５６４号各公報に記載されてい
るとおり、化学発光物質として既に公知であり、これら
のアクリジニウム誘導体を本発明方法でも用いることが
できる。具体的には、９−フェノキシカルボニル−１０
−メチルアクリジニウムフルオロスルホネート、２’，
６’−ジメチルフェニル−１０−メチルアクリジニウム
−９−カルボキシレートフルオロスルホネート、２’，
４’，６’−トリクロロフェニル−１０−メチルアクリ
ジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネー
ト、９−クロロカルボニル−１０−メチルアクリジニウ
ムクロライド、又は１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ
−トシル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−９−アクリジ
ニウムカルボキサミド等を挙げることができる。

【００１２】従来の発光方法では、前述の通り、アクリ
ジニウム誘導体を強アルカリ条件下に置き、そこに化学
発光誘発剤としての過酸化水素を作用させることで強く
発光させる。これに対して、本発明方法は、アクリジニ
ウム誘導体に対する化学発光誘発剤としてアスコルビン
酸を使用し、しかも前記化学発光誘発剤を中性からアル
カリ性条件下で作用させることができ、従来は全く知ら
れていなかった新規な方法である。本発明方法による発
光反応の機構はまだ明らかではないので、本明細書にお
いて用いる「化学発光誘発剤」とは、従来の過酸化水素
と同様の発光反応の機構を示すものに限定されるもので
はなく、アクリジニウム誘導体が存在する溶液中に本発
明の化学発光誘発剤・アスコルビン酸が同時に存在し
て、その結果としてアクリジニウム誘導体が化学発光を
起こせばよい。従って、アスコルビン酸がアクリジニウ
ム誘導体と直接的に化学反応を起こして、発光する場合
だけに限定されるものではなく、例えば溶液中に存在す
る溶存酸素に作用し、その溶存酸素を介して発光反応が
進行していることも考えられ、この場合を排除するもの
ではない。

【００１３】本発明方法では、中性からアルカリ性条件
下で化学発光誘発剤・アスコルビン酸を作用させ、アク
リジニウム誘導体を発光させることができる。ここで、
中性からアルカリ性条件下とは、通常、ｐＨ６〜１３を
意味し、好ましくはｐＨ６．５〜１３、更に好ましくは
ｐＨ７〜１２である。ｐＨ６未満になると、発光強度が
低下して検出が事実上困難となる。また、ｐＨが１３を
越えると、アクリジニウム誘導体の偽塩基形成速度が速
くなり、発光時間の短縮と発光強度の低下をもたらす。
なお、酵素を用いる場合には、その酵素活性を発現でき
るｐＨ１１以下が好ましい。

【００１４】本発明方法では、化学発光誘発剤としての
アスコルビン酸又はその塩（例えば、アルカリ金属塩又
はアルカリ土類金属塩）をそのまま発光反応系に添加し
てもよいが、好ましくは、酵素反応を利用して、反応系
内でアスコルビン酸又はその塩（例えば、アルカリ金属
塩又はアルカリ土類金属塩）を誘導する。酵素反応とし
ては、アスコルビン酸又はその塩を誘導する酵素と基質
との任意の組み合わせを用いることができるが、例え
ば、酵素アルカリホスファターゼに、基質としてのアス
コルビン酸リン酸エステルを作用させると、酵素反応に
よってアスコルビン酸が生成される。

【００１５】本発明で用いることのできるアルカリホス
ファターゼは、中性からアルカリ性に至適ｐＨがあれ
ば、酵素の由来は問わないが、特に好ましくは、仔ウシ
腸由来のアルカリホスファターゼである。本発明で用い
ることのできるアルカリホスファターゼの基質として
は、アスコルビン酸−２−リン酸エステル又はアスコル
ビン酸−３−リン酸エステル、あるいはそれらのアルカ
リ金属塩又はアルカリ土類金属塩を挙げることができ、
それら化合物の１種又はそれ以上を組み合わせて用いる
ことができる。

【００１６】本発明方法によれば、アルカリ性ホスファ
ターゼとその基質（例えば、アスコルビン酸リン酸エス
テル）との酵素反応によってアスコルビン酸を生成させ
てからアクリジニウム誘導体を接触させることができる
ので、アクリジニウム誘導体を、発光反応の直前まで酸
性溶液として保存することが可能となる。

【００１７】本発明の前記発光方法を利用すると、例え
ば、生体試料中に存在する特定の微量成分の検出法にお
いて、標準物質に付した標識からの信号の検出を効率よ
く実施することができる。標識を用いる特定物質の検出
方法においては、被検試料中に存在する検査対象物質に
対して種々の標準物質を用い、その標準物質に標識を付
け、検査対象物質と標準物質とが参加する各種の反応の
後に、標識からの信号を検出して、検査対象物質の検出
を行う。

【００１８】すなわち、検査対象物質を含有する被検試
料と、その検査対象物質に親和性を有し検査対象物質と
複合体を形成することのできる標準物質を用いる場合、
被験試料と過剰量の標準物質とを接触させることによ
り、検査対象物質と標準物質は、一定比率で複合体を形
成する。ここで形成された複合体量は、標準物質が過剰
量であることから、被検試料に含まれている検査対象物
質量に相関している。従って、形成された複合体量が分
かれば、被検試料中の検査対象物質量又は濃度を求める
ことができる。複合体量を求める方法は、形成された複
合体を必要により既知の方法で分離し、その複合体の標
準物質に付いている標識が発生する信号の強度、すなわ
ち、標識に由来する化学発光の発光強度を測定すること
により、検査対象物質の検出が達成される。

【００１９】また、検査対象物質と化学的あるいは免疫
学的に同一又は類似の標準物質を用いる場合、検査対象
物質及び標準物質双方に親和性が有り、複合体を形成す
ることのできる第３の物質が参加する反応を利用するこ
とができる。この場合には、被検試料と一定量の標準物
質及び第３の物質をそれぞれ接触させる。この工程によ
り、検査対象物質と第３の物質、標準物質と第３の物質
の複合体形成反応が競合し、被検試料中に含有される検
査対象物質の量に相関して、標準物質と第３の物質とか
ら形成される複合体の量は減少する。従って、この標準
物質と第３の物質とから形成される複合体の量が分かれ
ば、検査対象物質中の検査対象物質量又は濃度を求める
ことができる。複合体量を求める方法は、前記方法と同
様に、標準物質に付いている標識に由来した化学発光の
発光強度を測定すればよい。

【００２０】本発明による検出方法では、前記発光系に
関与する化合物の１種を前記の標識として使用する。例
えば、アクリジニウム誘導体、アスコルビン酸、基質と
反応してアスコルビン酸を生成する酵素、又は酵素と反
応してアスコルビン酸を生成する基質を標識として用い
ることができる。標識物質の選択は、試薬の保存条件、
被検試料と標識化標準物質との接触工程の条件、発光反
応の条件などを考慮して適切に行うことができる。標識
として酵素を用いると、酵素による増幅効果が得られ、
高感度検出が可能になる点で有利である。従って、本発
明による検出方法では、特にアルカリホスファターゼを
標識物質として用い、酵素反応を介してアスコルビン酸
を誘導してアクリジニウム誘導体を発光させ、検査対象
物質の検出を実施するのが好ましい。

【００２１】検査対象物質が含まれる被検試料は、限定
されるものではないが、特には生体試料、例えば、血
液、血清、血漿、尿、唾液又は髄液や、細胞又は組織抽
出物等を挙げることができる。検査対象物質も限定され
るものではないが、例えば、各種タンパク質、多糖類、
脂質又は核酸を挙げることができ、より具体的には、フ
ィブリノーゲン、アルブミン、ＡＦＰ、ＣＲＰ、ＨＢ_S
抗体、ＨＢ_C 抗体、ＨＩＶ抗体、ＨＴＬＶ抗体、ホルモ
ン等や、抗てんかん薬及びジゴキシン等の各種薬剤等を
挙げることができる。また、検査対象物質の核酸には、
特定の塩基配列を有するＤＮＡ断片なども含まれる。ま
た、標識、例えば、アルカリホスファターゼを付ける被
標識物質としては、検査対象物質に対する抗体、検査対
象物質、相補的ＤＮＡなどである。

【００２２】本発明による検出方法を用いて、アルカリ
ホスファターゼを標識とし、免疫学的方法により血清試
料中のタンパク質を検出する場合について以下に説明す
る。この場合、検査対象物質のタンパク質を特異的に認
識する抗体に、アルカリホスファターゼを既知の方法に
て標識し、その標識抗体と血清中の目的タンパク質との
間で抗原抗体反応を行わせ、必要に応じてＢ／Ｆ分離に
より未反応の標識抗体を除去し、続いて、例えば、以下
の２の方法によって発光工程を実施することができる。

【００２３】１つの方法は、酵素反応と発光反応をワン
ステップで行う方法である。アルカリホスファターゼの
基質としてアスコルビン酸のリン酸エステルを加え、ア
ルカリホスファターゼの至適ｐＨであるｐＨ１０近辺で
酵素反応を行う、それと同時に、酸性条件下で保存して
あったアクリジニウム誘導体を添加し、酵素反応によっ
て生成するアスコルビン酸と接触させることで発光を生
じさせる。これによって生じた発光は、従来法によるア
クリジニウム誘導体の発光よりも、はるかに長い時間発
光するので、従来のような特別に準備された装置を用い
なくても、容易にその発光強度を測定することができ
る。

【００２４】もう１つの方法は、酵素反応と発光反応を
ツーステップで行う方法である。アスコルビン酸のリン
酸エステルを加え、ｐＨ１０近辺で酵素反応を一定時間
行い、次に酵素反応を停止するための試薬、例えば、ｐ
Ｈ７のリン酸緩衝液を添加して酵素反応を停止する。そ
して、酸性条件下で保存してあったアクリジニウム誘導
体を添加して、ｐＨ７の条件下で発光させる。このとき
生じる発光の強度は、前記のワンスッテップ法と比較し
て数千分の一となるが、Ｓ／Ｎ比は前記方法と同等かそ
れ以上であり、また、発光時間は更に長時間となるた
め、血清中の目的とするタンパク質を高感度に検出する
ことができる。

【００２５】ここで挙げた、本発明の応用例は一部の例
であって、例えば、アクリジニウム誘導体とアスコルビ
ン酸が接触して発光する際のｐＨは、その発光強度が最
低限確保できるｐＨ６から、アルカリホスファターゼが
酵素活性を発現できるｐＨ１１までの範囲であれば、本
発明は実施可能である。更に本発明によれば、前記抗体
を用いた免疫学的検出法だけではなく、核酸に対して
も、その核酸と相補的な核酸との親和性を利用し、目的
の核酸を検出することができる。

【００２６】本発明方法によれば、従来法のようにアク
リジニウム誘導体を標識物質として使用するのではな
く、標識物質として、アルカリ性ホスファターゼやその
基質としてアスコルビン酸のリン酸エステルを用い、酵
素反応によってアスコルビン酸を生成させてからアクリ
ジニウム誘導体を接触させることができるので、免疫反
応系にアクリジニウム誘導体を存在させる必要がなくな
る。従って、アクリジニウム誘導体を、発光反応の直前
まで酸性溶液として保存することが可能となる。更に、
長時間の発光も可能となるため、従来法における種々の
問題点を一挙に解消することができる。

【００２７】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１：ワンステップ法による発光反応の発光パター
ン 仔ウシ腸由来のアルカリホスファターゼ溶液１０μｌ
（７×１０^-14 ｍｏｌ）に、１０ｍＭの炭酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ１０）で調製した、１０ｍＭのアスコルビ
ン酸−２−リン酸のマグネシウム塩、及びアスコルビン
酸−３−リン酸のマグネシウム塩の約１：１の混合物の
溶液９０μｌと、塩酸でｐＨ４に調整した、２５μＭの
９−フェノキシカルボニル−１０−メチルアクリジニウ
ムフルオロスルホネート（ＰＭＡ）５０μｌを、それぞ
れ加え、フォトンカウンタにて経過時間に対する発光強
度を測定し、発光パターンを得た。その結果を図１と図
２に示す。

【００２８】図１及び図２（更に後記図３）で、ＡＰ
（＋）は、アルカリホスファターゼ存在の場合、ＡＰ
（−）は、アルカリホスファターゼ不存在の場合の結果
を示す。図１から明らかなように、本発明方法によって
発光時間が長くなり、また十分なＳ／Ｎ比が得られるこ
とがわかる。図２は、図１の発光初期部分の拡大図であ
る。この図から発光の初期段階では、発光強度が直線的
に増加することがわかる。従って、この直線部分の傾き
を求めることにより、精度の高い測定が可能となる。

【００２９】実施例２：ツーステップ法による発光反応
の発光パターン 実施例１と同量のアルカリホスファターゼに、実施例１
と同様にアスコルビン酸のリン酸エステルを加え、１５
分間酵素反応を行った。次に０．５Ｍのリン酸緩衝液
（ｐＨ７）１００μｌを加え、酵素反応を停止した。こ
の反応溶液の１００μｌに、実施例１と同じアクリジニ
ウム誘導体８０μｌを加え、直ちに、発光強度を測定し
発光パターンを得た。その結果を図３に示す。図３にお
ける縦軸の単位は、図１の縦軸の単位の１／１０００に
相当している。図３からわかるように、更に長時間安定
した発光が得られた。

【００３０】実施例３：ＡＦＰ（α−フェトプロテイ
ン）の検出 ９６穴のマイクロプレートに、抗ＡＦＰ抗体の希釈液１
００μｌを分注し、４℃で１７時間放置することによ
り、抗ＡＦＰ抗体をマイクロプレートに吸着固定した。
次に、マイクロプレートをＴＢＳＢＴ（０．０５％−Ｂ
ＳＡ，０、５ｍｌ／リットルのＴｗｅｅｎ２０，及び
８．７７ｇ／リットルのＮａＣｌを含むトリス塩酸緩衝
液）で３回洗浄し、未吸着の抗ＡＦＰ抗体を取り除い
た。このマイクロプレートに、トリス塩酸緩衝液にて調
製した１％ＢＳＡ溶液２００μｌを分注し、室温で２時
間放置してブロッキングを行った。ＴＢＳＢＴで３回洗
浄し、未吸着のＢＳＡを取り除いた。それぞれの濃度に
希釈したＡＦＰの標準溶液を、マイクロプレートに分注
して、室温にて２時間抗原抗体反応を行った。ＴＢＳＢ
Ｔで３回洗浄してから、アルカリホスファターゼで標識
した抗ＡＦＰ抗体溶液を１００μｌ分注し、室温にて３
０分間反応させた。ＴＢＳＢＴで５回洗浄し、未反応の
標識抗体を取り除いた。次に酵素の基質として、実施例
１及び２で用いた、アスコルビン酸のリン酸エステル溶
液１００μｌを分注し、１５分間酵素反応を行った。次
に、０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７）１００μｌを分
注して酵素反応を停止した。この反応溶液１００μｌを
発光測定用容器に入れ、実施例１及び２で用いたアクリ
ジニウム誘導体の溶液８０μｌを注入し、９０秒後の発
光強度を測定した。この一連の操作で得られたＡＦＰの
検出曲線を、図４に示した。図４において実線と・（−
・−）はＡＦＰの検出曲線であり、破線（−−−）はＡ
ＦＰ０ｇ／ｍｌの際の発光強度の平均値＋３ＳＤを示
す。この実施例では、５ピコグラム／ｍｌの濃度のＡＦ
Ｐまで検出することが可能であった。

【００３１】

【発明の効果】本発明の発光方法によれば、アスコルビ
ン酸を化学発光誘発剤として用いることにより、中性か
らアルカリ性条件下でアクリジニウム誘導体を発光させ
ることができ、従来法の問題点を一挙に解決することが
できる。同時に発光強度は強くなり、また、発光時間も
延長させることが可能となり、高精度に検査対象物質を
検出することができる。この発光方法を応用して検査対
象物質の検出を行うことで、例えば、アルカリホスファ
ターゼを標識物質として用い、中性からアルカリ性条件
下で不安定なアクリジニウム誘導体は、発光反応直前ま
で酸性条件下にて保存可能となった。また従来法よりも
著しく発光時間が長いため、発光測定装置の構成の自由
度が高くなるばかりでなく、より正確で高精度の検出方
法を提供することができる。本発明により、化学発光分
析法、例えばＣＬＥＩＡ（ケミルミネッセントエンザイ
ムイムノアッセイ）等の酵素を標識物質として用い、そ
の酵素活性を化学発光法により測定することで、試料中
の検査対象物質を検出する方法において、化学発光物質
としてアクリジニウム誘導体を用いた検査対象物質の検
出方法に極めて有効な手段を提供するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】アルカリ性ホスファターゼの酵素反応とアクリ
ジニウム誘導体の発光反応を、ワンステップで行った場
合の発光パターンを示すグラフである。

【図２】図１の初期段階の拡大図である。

【図３】アルカリ性ホスファターゼの酵素反応とアクリ
ジニウム誘導体の発光反応を、ツーステップで行った場
合の発光パターンを示すグラフである。

【図４】アルカリ性ホスファターゼで標識した抗ＡＦＰ
抗体を用いて、ＡＦＰを検出した場合の検量線である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/532 Ｂ

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アスコルビン酸を化学発光誘発剤として
   用いることを特徴とする、アクリジニウム誘導体の発光
   方法。
2. 【請求項２】 酵素反応により生成するアスコルビン酸
   を用いる、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 アスコルビン酸リン酸エステルとアルカ
   リホスファターゼとの酵素反応により生成するアスコル
   ビン酸を用いる、請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 標識からの信号を検出することを用いて
   被検試料中の検査対象物質を検出する方法において、請
   求項１〜３のいずれか一項に記載の発光方法によって得
   られる発光を標識からの信号とすることを特徴とする、
   検査対象物質の検出方法。
5. 【請求項５】 検査対象物質を検出する方法が免疫学的
   反応である、請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】 基質と反応してアスコルビン酸を生成す
   る酵素を標識として用いる、請求項４に記載の方法。