JPH0712731A - 発光接合体を用いた検出または定量方法 - Google Patents
発光接合体を用いた検出または定量方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 試験試料中の少なくとも２つの物質の各々を
検出または定量する方法を提供する。 【構成】 試験試料を少なくとも２つの異なる発光接合
体と混合して、光を放出する少なくとも２つの異なる処
理条件下で活性化し得る複合体を形成することにより試
験反応混合物を調製する。次いで異なる処理条件を施す
ことにより、物質の各々を検出または定量する。
検出または定量する方法を提供する。 【構成】 試験試料を少なくとも２つの異なる発光接合
体と混合して、光を放出する少なくとも２つの異なる処
理条件下で活性化し得る複合体を形成することにより試
験反応混合物を調製する。次いで異なる処理条件を施す
ことにより、物質の各々を検出または定量する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、少なくとも２つの異な
る発光標識接合体（luminescent labelled conjugate）
を用いて、試験試料中の、少なくとも２つの分析物、ま
たは分析物と内部参照材料もしくは対照材料の各々を検
出または定量する方法に関するものである。発光接合体
は、少なくとも２つの異なる反応機構により活性化され
て光を放出する点で特徴付けられている。本発明はま
た、試験試料中の、少なくとも２つの分析物、または分
析物と内部参照材料もしくは対照材料を検出または定量
する少なくとも２つの異なる発光標識接合体を含有する
試験キットを提供する。
る発光標識接合体（luminescent labelled conjugate）
を用いて、試験試料中の、少なくとも２つの分析物、ま
たは分析物と内部参照材料もしくは対照材料の各々を検
出または定量する方法に関するものである。発光接合体
は、少なくとも２つの異なる反応機構により活性化され
て光を放出する点で特徴付けられている。本発明はま
た、試験試料中の、少なくとも２つの分析物、または分
析物と内部参照材料もしくは対照材料を検出または定量
する少なくとも２つの異なる発光標識接合体を含有する
試験キットを提供する。
【０００２】
【従来の技術】様々な試験試料中の分析物の検出または
定量は、分析物と対応する補助試薬または結合パートナ
ーとの間の複合体の形成に負うところの検定技術により
行なわれる。分析物の試薬または結合パートナーとのペ
アリングもしくはアニーリングは、免疫学的検定、タン
パク質結合検定（protein-binding assay ）、核酸雑種
形成検定、および増幅検定に不可欠な部分である。典型
的な免疫学的検定においては、分析物は抗原または抗体
のいずれであってもよく、対応する結合パートナーは一
般的に、それぞれ抗体または抗原である。様々な代わり
の免疫学的検定または雑種形成および増幅技術並びにそ
の形式が当業者によく知られている。
定量は、分析物と対応する補助試薬または結合パートナ
ーとの間の複合体の形成に負うところの検定技術により
行なわれる。分析物の試薬または結合パートナーとのペ
アリングもしくはアニーリングは、免疫学的検定、タン
パク質結合検定（protein-binding assay ）、核酸雑種
形成検定、および増幅検定に不可欠な部分である。典型
的な免疫学的検定においては、分析物は抗原または抗体
のいずれであってもよく、対応する結合パートナーは一
般的に、それぞれ抗体または抗原である。様々な代わり
の免疫学的検定または雑種形成および増幅技術並びにそ
の形式が当業者によく知られている。
【０００３】検出または定量しようとする分析物を含有
する、または含有すると思われる試験試料は、工業的な
供給源または生物学的な供給源のいずれから誘導しても
よく、そして液体、例えば、血液または尿、もしくは固
体、例えば、組織生検材料または糞であってもよい。対
照または参照試料を試験して、分析物の検出量を定量値
に転化するための、そして装置の目盛り測定のための標
準曲線を用意する。
する、または含有すると思われる試験試料は、工業的な
供給源または生物学的な供給源のいずれから誘導しても
よく、そして液体、例えば、血液または尿、もしくは固
体、例えば、組織生検材料または糞であってもよい。対
照または参照試料を試験して、分析物の検出量を定量値
に転化するための、そして装置の目盛り測定のための標
準曲線を用意する。
【０００４】上述した種類の検定はまた、疫学的および
環境的規律における試験試料中の様々な分析物を分析す
るために用いられている。食品工業において、例えば、
そのような検定は、毒素および細菌汚染物を検出するの
に用いられる。
環境的規律における試験試料中の様々な分析物を分析す
るために用いられている。食品工業において、例えば、
そのような検定は、毒素および細菌汚染物を検出するの
に用いられる。
【０００５】免疫学的検定およびタンパク質結合検定を
用いて、タンパク質またはペプチド分析物、治療薬、お
よび他の物質を検出または定量してもよく、一方核酸雑
種形成法を用いて、核酸分析物の存在または不在を測定
してもよい。免疫学的検定のように、雑種形成検定はま
た、分析物と補助結合物質との間の複合体の形成によ
る。雑種形成検定における分析物または標的は、塩基配
列を有するＤＮＡまたはＲＮＡであり、結合物質は核酸
分析物に結合またはアニーリングできる核酸プローブで
ある。
用いて、タンパク質またはペプチド分析物、治療薬、お
よび他の物質を検出または定量してもよく、一方核酸雑
種形成法を用いて、核酸分析物の存在または不在を測定
してもよい。免疫学的検定のように、雑種形成検定はま
た、分析物と補助結合物質との間の複合体の形成によ
る。雑種形成検定における分析物または標的は、塩基配
列を有するＤＮＡまたはＲＮＡであり、結合物質は核酸
分析物に結合またはアニーリングできる核酸プローブで
ある。
【０００６】雑種形成検定は、既知または未知の配列を
有する標的または核酸分析物に関連して用いてもよい。
米国特許第4,851,336 号を参照のこと。したがって、雑
種形成検定は、免疫学的検定およびタンパク質結合検定
に関連して論じられるいずれの適応にも潜在的に有用で
ある。
有する標的または核酸分析物に関連して用いてもよい。
米国特許第4,851,336 号を参照のこと。したがって、雑
種形成検定は、免疫学的検定およびタンパク質結合検定
に関連して論じられるいずれの適応にも潜在的に有用で
ある。
【０００７】最近増幅方法を利用して、分析検定の感受
性をさらに高めた。ポリメラーゼチェーンリアクション
（ＰＣＲ）法を記載している米国特許第4,683,195 号お
よび第4,683,202 号、並びに、ＱＢレプリカーゼによる
組換えＲＮＡの自己触媒複製を記載している米国特許第
4,786,660 号および第4,957,858 号を参照のこと。
性をさらに高めた。ポリメラーゼチェーンリアクション
（ＰＣＲ）法を記載している米国特許第4,683,195 号お
よび第4,683,202 号、並びに、ＱＢレプリカーゼによる
組換えＲＮＡの自己触媒複製を記載している米国特許第
4,786,660 号および第4,957,858 号を参照のこと。
【０００８】上述した検定技術の各々は共通して、検出
可能な複合体を形成する対応または補助結合物質により
分析物を特異的に認識できるけれども、検定は様々な形
式を取り得る。したがって、例えば、直接検定形式にお
いては、複合体は分析物とその結合パートナーとの間に
形成される。あるいは、競合検定のような間接検定形式
においては、複合体は分析物に対する競合体（competit
or）と結合物質との間に形成される。競合体は、結合パ
ートナーまたは補助試薬への結合（attachment）につい
て分析物と競合できることにより特徴付けられる。その
ような検定形式およびその変形は、当業者に公知であ
り、技術書および特許に広く発行されている。
可能な複合体を形成する対応または補助結合物質により
分析物を特異的に認識できるけれども、検定は様々な形
式を取り得る。したがって、例えば、直接検定形式にお
いては、複合体は分析物とその結合パートナーとの間に
形成される。あるいは、競合検定のような間接検定形式
においては、複合体は分析物に対する競合体（competit
or）と結合物質との間に形成される。競合体は、結合パ
ートナーまたは補助試薬への結合（attachment）につい
て分析物と競合できることにより特徴付けられる。その
ような検定形式およびその変形は、当業者に公知であ
り、技術書および特許に広く発行されている。
【０００９】直接形式と間接形式の両方において、複合
体の形成は、検出し得る標識で複合体のどれか１部を標
識付けることにより検出される。そのような標識の群の
例としては、放射性同位体、例えば、125 Ｉ、3 Ｈ、14
Ｃ、32Ｐ；酵素、例えば、ホースラディッシュペルオキ
シダーゼ；蛍光化合物、例えば、フルオレセインまたは
ローダミン；生発光化合物、例えば、ルシフェリン；お
よび化学発光化合物、例えば、ルミノール、イソルミノ
ールおよびその誘導体並びにアクリジニウムエステルお
よびベンズアクリジニウムエステルが挙げられる。しか
しながら、上述のように確認された標識の全てが実際に
有用であるわけではない。ある標識は、適切な濃度で分
析物を検出するための適切な感受性を備えていない。免
疫学的検定における標識として有用であるためには、放
射性同位体は、十分に高い放射エネルギーおよびピコグ
ラムの量、すなわち、10-12 グラム／ｍｌ未満で検出可
能な崩壊速度を有さなければならず、同時に、標識した
試薬が適度な棚寿命を有するほど十分に長い半減期を有
さなければならない。処分、安全問題および短い半減期
は、放射線同位体の使用に際して問題となる。さらに、
標識は、試薬または結合パートナーもしくは競合体が特
異的な結合反応を行なう能力を変更することなく、これ
らの分子に容易に結合できるような化学特性を有さなけ
ればならない。これらの制限のために、実質的に１つの
同位体、125 Ｉのみがラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
用途に広く用いられている。混合物中の125 Ｉから容易
に区別できるように、これらの基準を満たし、十分に異
なる放射エネルギースペクトルを有する第２の同位体が
ないことで、二重標識ＲＩＡ方法の利用可能性または使
用が制限されている。上述した問題をある程度成功して
アドレスする２つの放射線標識の発光を区別するため
の、プログラム可能な液体シンチレーション計数器が発
達している。米国特許第5,134,294 号参照のこと。
体の形成は、検出し得る標識で複合体のどれか１部を標
識付けることにより検出される。そのような標識の群の
例としては、放射性同位体、例えば、125 Ｉ、3 Ｈ、14
Ｃ、32Ｐ；酵素、例えば、ホースラディッシュペルオキ
シダーゼ；蛍光化合物、例えば、フルオレセインまたは
ローダミン；生発光化合物、例えば、ルシフェリン；お
よび化学発光化合物、例えば、ルミノール、イソルミノ
ールおよびその誘導体並びにアクリジニウムエステルお
よびベンズアクリジニウムエステルが挙げられる。しか
しながら、上述のように確認された標識の全てが実際に
有用であるわけではない。ある標識は、適切な濃度で分
析物を検出するための適切な感受性を備えていない。免
疫学的検定における標識として有用であるためには、放
射性同位体は、十分に高い放射エネルギーおよびピコグ
ラムの量、すなわち、10-12 グラム／ｍｌ未満で検出可
能な崩壊速度を有さなければならず、同時に、標識した
試薬が適度な棚寿命を有するほど十分に長い半減期を有
さなければならない。処分、安全問題および短い半減期
は、放射線同位体の使用に際して問題となる。さらに、
標識は、試薬または結合パートナーもしくは競合体が特
異的な結合反応を行なう能力を変更することなく、これ
らの分子に容易に結合できるような化学特性を有さなけ
ればならない。これらの制限のために、実質的に１つの
同位体、125 Ｉのみがラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
用途に広く用いられている。混合物中の125 Ｉから容易
に区別できるように、これらの基準を満たし、十分に異
なる放射エネルギースペクトルを有する第２の同位体が
ないことで、二重標識ＲＩＡ方法の利用可能性または使
用が制限されている。上述した問題をある程度成功して
アドレスする２つの放射線標識の発光を区別するため
の、プログラム可能な液体シンチレーション計数器が発
達している。米国特許第5,134,294 号参照のこと。
【００１０】２つの異なる分析物を検出または定量する
検定において２つの標識を用いる様々な方法が発表され
ている。したがって、異なる色原体または蛍光体を産生
する２つの異なる酵素は、アルカリ性ホスファターゼお
よびベータガラクトシダーゼを用いた放射線サイロキシ
ンおよびトリヨードチロニンの検定におけるように、標
識として用いることができる。高感受性、マルチマイク
ロスポット、多数分析物、免疫学的検定の新世代への蛍
光分光学およびその応用、臨床化学アクタ、194 、91−
114 頁、1990年を参照のこと。
検定において２つの標識を用いる様々な方法が発表され
ている。したがって、異なる色原体または蛍光体を産生
する２つの異なる酵素は、アルカリ性ホスファターゼお
よびベータガラクトシダーゼを用いた放射線サイロキシ
ンおよびトリヨードチロニンの検定におけるように、標
識として用いることができる。高感受性、マルチマイク
ロスポット、多数分析物、免疫学的検定の新世代への蛍
光分光学およびその応用、臨床化学アクタ、194 、91−
114 頁、1990年を参照のこと。
【００１１】酵素標識は、放射線同位体に関連する問題
の多くを避けてきたが、酵素免疫学的検定は、ラジオイ
ムノアッセイほどは感度がなく、一般にミリリットル当
たりナノグラムの範囲、すなわち、10-9グラム／ｍｌに
感度の制限がある。酵素はまた、温度およびｐＨの条件
における変化に対応する活性度の変更を含む、標識とし
ての固有の欠点を有する。さらに、酵素検定には、酵素
標識と反応して検出可能な産物を生成する基質または化
合物を使用しなければならない。多くの基質は一般的に
不安定であり、使用の直前に調製しなければならない。
ある基質はまた毒性であり、そのような基質の１つであ
る、ｏ−フェニレンジアミンは発癌性であると考えられ
ている。
の多くを避けてきたが、酵素免疫学的検定は、ラジオイ
ムノアッセイほどは感度がなく、一般にミリリットル当
たりナノグラムの範囲、すなわち、10-9グラム／ｍｌに
感度の制限がある。酵素はまた、温度およびｐＨの条件
における変化に対応する活性度の変更を含む、標識とし
ての固有の欠点を有する。さらに、酵素検定には、酵素
標識と反応して検出可能な産物を生成する基質または化
合物を使用しなければならない。多くの基質は一般的に
不安定であり、使用の直前に調製しなければならない。
ある基質はまた毒性であり、そのような基質の１つであ
る、ｏ−フェニレンジアミンは発癌性であると考えられ
ている。
【００１２】発光化合物は、酵素免疫学的検定における
基質、または発光免疫学的検定における標識のいずれか
として用いられてきた。発光は、電子的に励起した基質
からのエネルギーの消費と関連する光の放出を意味す
る。発光の異なる形状は、励起を生じる機構により区別
される。フォトルミネセンス、すなわち、蛍光におい
て、発光物質は、長波長の光を放出する特定の波長の光
の光子により刺激される。生物発光において、酵素によ
り媒介された化学反応は、発光物質の励起の原因であ
る。化学発光においては、発光物質による光放出は化学
反応により生じる。生物発光および化学発光、酵素化学
の方法、LVII巻、アカデミックプレス、1978、チャプタ
ー37、化学発光による特異的タンパク質結合反応のモニ
タリング；および化学発光標識、オールドアンドニュ
ー、分析化学アクタ、227 、11−19頁、1989参照のこ
と。
基質、または発光免疫学的検定における標識のいずれか
として用いられてきた。発光は、電子的に励起した基質
からのエネルギーの消費と関連する光の放出を意味す
る。発光の異なる形状は、励起を生じる機構により区別
される。フォトルミネセンス、すなわち、蛍光におい
て、発光物質は、長波長の光を放出する特定の波長の光
の光子により刺激される。生物発光において、酵素によ
り媒介された化学反応は、発光物質の励起の原因であ
る。化学発光においては、発光物質による光放出は化学
反応により生じる。生物発光および化学発光、酵素化学
の方法、LVII巻、アカデミックプレス、1978、チャプタ
ー37、化学発光による特異的タンパク質結合反応のモニ
タリング；および化学発光標識、オールドアンドニュ
ー、分析化学アクタ、227 、11−19頁、1989参照のこ
と。
【００１３】各々が識別を容易にするために十分に異な
る波長で発光最大値または吸収最大値を有する蛍光標識
を用いた二重標識検定（double label assay）を利用し
て、試料中の１つ以上の分析物の存在または不在を測定
してきた。血清の通常のタンパク質成分の多くは蛍光を
生じることができるので、蛍光標識は特に血清試料の検
定には不適切である。
る波長で発光最大値または吸収最大値を有する蛍光標識
を用いた二重標識検定（double label assay）を利用し
て、試料中の１つ以上の分析物の存在または不在を測定
してきた。血清の通常のタンパク質成分の多くは蛍光を
生じることができるので、蛍光標識は特に血清試料の検
定には不適切である。
【００１４】化学発光物質の中で、免疫学的検定におけ
る標識としてのルミノールの有用性は限定されている。
と言うのは、標識がタンパク質またはペプチドに接合し
た場合には、酸化に際してのルミノールの光出力が著し
く減少するからである。「イソルミノール」誘導体であ
る、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノ
ールは、免疫学的検定における標識として、良好な結果
を伴って利用されている。米国特許第4,297,273 号を参
照のこと。
る標識としてのルミノールの有用性は限定されている。
と言うのは、標識がタンパク質またはペプチドに接合し
た場合には、酸化に際してのルミノールの光出力が著し
く減少するからである。「イソルミノール」誘導体であ
る、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノ
ールは、免疫学的検定における標識として、良好な結果
を伴って利用されている。米国特許第4,297,273 号を参
照のこと。
【００１５】アクリジニウムエステルおよびベンズアク
リジニウムエステルは、試験検定における使用について
良好な効用を示している。アクリジニウムエステルは容
易に酸化され、ルミノールとは違って酸化反応に触媒を
必要としない。さらに、アクリジニウムエステルおよび
ベンズアクリジニウムエステルは、酸化により光の放出
が著しく減少することなく、結合パートナーおよび他の
分子に接合でき、アクリジニウム標識検定試薬は一般的
に水性の環境においてきわめて安定である。
リジニウムエステルは、試験検定における使用について
良好な効用を示している。アクリジニウムエステルは容
易に酸化され、ルミノールとは違って酸化反応に触媒を
必要としない。さらに、アクリジニウムエステルおよび
ベンズアクリジニウムエステルは、酸化により光の放出
が著しく減少することなく、結合パートナーおよび他の
分子に接合でき、アクリジニウム標識検定試薬は一般的
に水性の環境においてきわめて安定である。
【００１６】識別可能な化学発光信号を有する二重標識
検定が、英国特許第2,233,450 号に記載されている。こ
こでは、変化する光放出のアクリジニウムエステルを利
用し、その検定は、化合物のうちの１つが約１秒間で完
全に光を放出するかまたは放出最大値を示すことによる
ものである。
検定が、英国特許第2,233,450 号に記載されている。こ
こでは、変化する光放出のアクリジニウムエステルを利
用し、その検定は、化合物のうちの１つが約１秒間で完
全に光を放出するかまたは放出最大値を示すことによる
ものである。
【００１７】これらの実際的な制限は、ほとんどの免疫
学的検定およびタンパク質結合検定が、１つの標識また
は１つの群の標識から選択された標識を用いた試験試料
中の１つの分析物の検定に向けられてきたことを説明す
るのに役立つ。
学的検定およびタンパク質結合検定が、１つの標識また
は１つの群の標識から選択された標識を用いた試験試料
中の１つの分析物の検定に向けられてきたことを説明す
るのに役立つ。
【００１８】
【発明の構成】本発明の主な実施態様は、試験試料中の
少なくとも２つの物質または少なくとも１つの物質およ
び内部参照材料または対照材料各々を検出または定量す
る方法であって、前記試料を少なくとも２つの異なる発
光接合体と混合して光を放出する少なくとも２つの異な
る処理条件下で活性化し得る複合体を形成することによ
り試験反応混合物を調製し、前記異なる処理条件を施す
ことにより前記物質の各々を検出または定量する各工程
からなる方法を提供する。
少なくとも２つの物質または少なくとも１つの物質およ
び内部参照材料または対照材料各々を検出または定量す
る方法であって、前記試料を少なくとも２つの異なる発
光接合体と混合して光を放出する少なくとも２つの異な
る処理条件下で活性化し得る複合体を形成することによ
り試験反応混合物を調製し、前記異なる処理条件を施す
ことにより前記物質の各々を検出または定量する各工程
からなる方法を提供する。
【００１９】多数の物質の検定において、少なくとも２
つの処理条件は、その処理条件による光放出が識別でき
る限り、同じであってもよい。
つの処理条件は、その処理条件による光放出が識別でき
る限り、同じであってもよい。
【００２０】本発明の別の実施態様は、試験試料中の少
なくとも２つの物質の各々を検出または定量する方法で
あって、前記試験試料と少なくとも２つの異なる発光接
合体を混合して少なくとも２つの処理条件下で活性化し
得る複合体を形成することにより試験混合物を調製し、
その際、少なくとも２つの処理条件の各々を次々と行な
えるようにそれら処理条件の各々は区別可能なものと
し、最初の処理条件が施された後に前記物質のうちの１
つを検出または定量し、続いての処理条件を施した後に
前記物質の他方を検出または定量することからなる方法
を提供する。
なくとも２つの物質の各々を検出または定量する方法で
あって、前記試験試料と少なくとも２つの異なる発光接
合体を混合して少なくとも２つの処理条件下で活性化し
得る複合体を形成することにより試験混合物を調製し、
その際、少なくとも２つの処理条件の各々を次々と行な
えるようにそれら処理条件の各々は区別可能なものと
し、最初の処理条件が施された後に前記物質のうちの１
つを検出または定量し、続いての処理条件を施した後に
前記物質の他方を検出または定量することからなる方法
を提供する。
【００２１】本発明の別の実施態様は、試験試料中の少
なくとも２つの物質を検出または定量する方法であっ
て、少なくとも第１の物質および第２の物質を含有する
試料と、前記第１の物質に特異的に結合できる第１の結
合パートナーであって、該第１の結合パートナーは標識
されていてもいなくてもよく、該第１の結合パートナー
が標識されている場合にはその標識が第１の発光標識で
あり、前記第１の結合パートナーが標識されていない場
合には試験混合物は前記第１の物質に対する標識された
第１の競合体を含むと共にこの標識が第１の発光標識で
ある、第１の結合パートナーと、前記第２の物質に特異
的に結合できる第２の結合パートナーであって、該第２
の結合パートナーは標識されていてもいなくてもよく、
該第２の結合パートナーが標識されている場合にはその
標識が第２の発光標識であり、前記第２の結合パートナ
ーが標識されていない場合には試験混合物は前記第２の
物質に対する標識された第２の競合体を含むと共にこの
標識が第２の発光標識である、第２の結合パートナー
と、からなる試験混合物を調製し；前記第１の物質に結
合した前記標識された第１の結合パートナー、または前
記標識された第１の競合体に結合した前記標識されてい
ない第１の結合パートナーからなる第１の複合体、およ
び前記第２の物質に結合した前記標識された第２の結合
パートナー、または前記標識された第２の競合体に結合
した前記標識されていない第２の結合パートナーからな
る第２の複合体を形成するのに十分な時間と条件下で、
前記試験混合物を反応させ；少なくとも２つの異なる処
理条件を用いて前記第１および第２の発光標識を活性化
することにより前記第１の複合体および前記第２の複合
体を検出または定量して前記第１および第２の物質を検
出または定量する；各工程からなる方法を提供する。
なくとも２つの物質を検出または定量する方法であっ
て、少なくとも第１の物質および第２の物質を含有する
試料と、前記第１の物質に特異的に結合できる第１の結
合パートナーであって、該第１の結合パートナーは標識
されていてもいなくてもよく、該第１の結合パートナー
が標識されている場合にはその標識が第１の発光標識で
あり、前記第１の結合パートナーが標識されていない場
合には試験混合物は前記第１の物質に対する標識された
第１の競合体を含むと共にこの標識が第１の発光標識で
ある、第１の結合パートナーと、前記第２の物質に特異
的に結合できる第２の結合パートナーであって、該第２
の結合パートナーは標識されていてもいなくてもよく、
該第２の結合パートナーが標識されている場合にはその
標識が第２の発光標識であり、前記第２の結合パートナ
ーが標識されていない場合には試験混合物は前記第２の
物質に対する標識された第２の競合体を含むと共にこの
標識が第２の発光標識である、第２の結合パートナー
と、からなる試験混合物を調製し；前記第１の物質に結
合した前記標識された第１の結合パートナー、または前
記標識された第１の競合体に結合した前記標識されてい
ない第１の結合パートナーからなる第１の複合体、およ
び前記第２の物質に結合した前記標識された第２の結合
パートナー、または前記標識された第２の競合体に結合
した前記標識されていない第２の結合パートナーからな
る第２の複合体を形成するのに十分な時間と条件下で、
前記試験混合物を反応させ；少なくとも２つの異なる処
理条件を用いて前記第１および第２の発光標識を活性化
することにより前記第１の複合体および前記第２の複合
体を検出または定量して前記第１および第２の物質を検
出または定量する；各工程からなる方法を提供する。
【００２２】さらに、複数の発光標識接合体各々の少な
くとも１つが少なくとも１つの分析物に結合し、前記発
光標識接合体の各々により放出された光が前記標識の酸
化後に測定される多数の発光標識検定を行ない；次々と
酸化処理を行ない；前記酸化処理の各々に対応して各々
の分析物の存在また不在を検出または定量することから
なる方法を提供する。
くとも１つが少なくとも１つの分析物に結合し、前記発
光標識接合体の各々により放出された光が前記標識の酸
化後に測定される多数の発光標識検定を行ない；次々と
酸化処理を行ない；前記酸化処理の各々に対応して各々
の分析物の存在また不在を検出または定量することから
なる方法を提供する。
【００２３】本発明は、試験試料中の複数の物質を検出
または定量するキットであって、各々が異なる処理条件
により活性化される、少なくとも２つの異なる発光接合
体からなるキットを提供する。
または定量するキットであって、各々が異なる処理条件
により活性化される、少なくとも２つの異なる発光接合
体からなるキットを提供する。
【００２４】ルミノール、イソルミノールおよびそれら
の誘導体は、他の発光標識、すなわち、アクリジニウム
エステルよりも低いｐＨで検出でき、このことにより、
２つの異なる発光標識を用いて検定を行なう可能性が生
じたことが分かった。
の誘導体は、他の発光標識、すなわち、アクリジニウム
エステルよりも低いｐＨで検出でき、このことにより、
２つの異なる発光標識を用いて検定を行なう可能性が生
じたことが分かった。
【００２５】本発明の主な目的は、少なくとも２つの異
なる発光接合体を使用することにより、１つの試験試料
中の複数の異なる物質または少なくとも１つの物質およ
び内部参照材料または対照材料の検出または定量を行な
う手段および方法を提供することにあり、これらの接合
体は、少なくとも２つの異なる処理方法により検出また
は定量のために活性化される。
なる発光接合体を使用することにより、１つの試験試料
中の複数の異なる物質または少なくとも１つの物質およ
び内部参照材料または対照材料の検出または定量を行な
う手段および方法を提供することにあり、これらの接合
体は、少なくとも２つの異なる処理方法により検出また
は定量のために活性化される。
【００２６】本発明の別の目的は、試料中の複数の物質
を検出または定量するキットを提供することにある。こ
のキットは、少なくとも２つの異なる処理条件下で活性
化される少なくとも２つの異なる発光標識接合体を含有
している。
を検出または定量するキットを提供することにある。こ
のキットは、少なくとも２つの異なる処理条件下で活性
化される少なくとも２つの異なる発光標識接合体を含有
している。
【００２７】本発明によると、試験試料中の少なくとも
２つの異なる分析物の各々を検出または定量する方法を
提供する。この方法は、少なくとも２つの異なる発光接
合体と試験試料とを混合して少なくとも２つの異なる処
理条件下で活性化される複合体を形成することにより試
験混合物を調製することからなる。次の段階において
は、前記試験試料を異なる処理条件にさらすことによ
り、分析物の各々を検出または定量する。好ましい実施
態様において、これらの処理条件は、連続して行なわれ
る酸化条件を含む。ルミノメータのような光測定装置中
で放出された光を測定することにより検出を行ない、そ
の後分析物を定量する。
２つの異なる分析物の各々を検出または定量する方法を
提供する。この方法は、少なくとも２つの異なる発光接
合体と試験試料とを混合して少なくとも２つの異なる処
理条件下で活性化される複合体を形成することにより試
験混合物を調製することからなる。次の段階において
は、前記試験試料を異なる処理条件にさらすことによ
り、分析物の各々を検出または定量する。好ましい実施
態様において、これらの処理条件は、連続して行なわれ
る酸化条件を含む。ルミノメータのような光測定装置中
で放出された光を測定することにより検出を行ない、そ
の後分析物を定量する。
【００２８】公知の発光標識、および標準光放出検出装
置を使用することにより、試験混合物中の複数の物質を
検出および定量できることが本発明の利点である。
置を使用することにより、試験混合物中の複数の物質を
検出および定量できることが本発明の利点である。
【００２９】発光標識を用いることにより、放射線同位
体検定に報告された感度に少なくとも匹敵する感度が得
られることが本発明のさらなる利点である。
体検定に報告された感度に少なくとも匹敵する感度が得
られることが本発明のさらなる利点である。
【００３０】本発明のさらなる利点は、発光化合物およ
び発光接合体の安定性により、本発明の製品を市販に供
するのに十分に長い棚寿命が達成される。
び発光接合体の安定性により、本発明の製品を市販に供
するのに十分に長い棚寿命が達成される。
【００３１】これらと他の目的を鑑みて、当業者には明
確なように、本発明は明細書に記載され請求の範囲によ
り包含された構成の組合せにある。
確なように、本発明は明細書に記載され請求の範囲によ
り包含された構成の組合せにある。
【００３２】
【実施例】以下、図面に示す実施例に基づいて本発明を
詳細に説明する。
詳細に説明する。
【００３３】好ましい実施態様において、試験試料中に
少なくとも２つの異なる物質の各々を検出または定量す
る方法を提供する。その試料は、工業源、生物学源また
は他の源であってもよく、液体もしくは固体であっても
よい。試料が固体である場合には、水、水性ベースの液
体または有機液体のような適切な懸濁媒体中に担持でき
る。
少なくとも２つの異なる物質の各々を検出または定量す
る方法を提供する。その試料は、工業源、生物学源また
は他の源であってもよく、液体もしくは固体であっても
よい。試料が固体である場合には、水、水性ベースの液
体または有機液体のような適切な懸濁媒体中に担持でき
る。
【００３４】試験試料が生物学上のものである場合に
は、液体、例えば、血漿、血清、尿、啖、大脳脊髄液で
あってもよく、もしくは固体、例えば、組織、生検材
料、細胞、糞であってもよい。ある例においては、試料
を処理または予備処理して、検定に適した成分にするこ
とが必要であるかもしれない。そのような処理には、例
えば、粒子材料を除去するための均質化および遠心分
離、塩基または酸処理、熱処理等を含み、検出または定
量される特定の物質を評価してもよい。
は、液体、例えば、血漿、血清、尿、啖、大脳脊髄液で
あってもよく、もしくは固体、例えば、組織、生検材
料、細胞、糞であってもよい。ある例においては、試料
を処理または予備処理して、検定に適した成分にするこ
とが必要であるかもしれない。そのような処理には、例
えば、粒子材料を除去するための均質化および遠心分
離、塩基または酸処理、熱処理等を含み、検出または定
量される特定の物質を評価してもよい。
【００３５】ここで使用している「物質」という用語
は、対応する補助試薬または結合パートナーとの複合体
の形成により検出されるいかなる材料も広く意味する。
そのような複合体形成は、例えば、免疫学的検定、タン
パク質結合検定、雑種形成検定および増幅検定の一部で
ある雑種形成工程を含む、様々な群の検定に不可欠であ
る。したがって、物質は、免疫学的検定においては１つ
以上の抗原または抗体、タンパク質結合検定においては
１つ以上のタンパク質、雑種形成検定または工程におい
ては１つ以上の核酸または核酸プローブ、およびそのよ
うな検定のいずれにも使用する１つ以上の内部参照材料
または対照材料であり得る。これらの内部参照材料およ
び対照材料は、試験方法の性能を評価する、すなわち、
偽陽性結果に対する検査のために作用する。内部参照材
料および対照材料は、既知の濃度または、核酸配列もし
くはアミノ酸配列の場合の既知の配列のいずれかであ
る。
は、対応する補助試薬または結合パートナーとの複合体
の形成により検出されるいかなる材料も広く意味する。
そのような複合体形成は、例えば、免疫学的検定、タン
パク質結合検定、雑種形成検定および増幅検定の一部で
ある雑種形成工程を含む、様々な群の検定に不可欠であ
る。したがって、物質は、免疫学的検定においては１つ
以上の抗原または抗体、タンパク質結合検定においては
１つ以上のタンパク質、雑種形成検定または工程におい
ては１つ以上の核酸または核酸プローブ、およびそのよ
うな検定のいずれにも使用する１つ以上の内部参照材料
または対照材料であり得る。これらの内部参照材料およ
び対照材料は、試験方法の性能を評価する、すなわち、
偽陽性結果に対する検査のために作用する。内部参照材
料および対照材料は、既知の濃度または、核酸配列もし
くはアミノ酸配列の場合の既知の配列のいずれかであ
る。
【００３６】ここで使用している「接合体」という用語
は、試薬または結合パートナーもしくは競合体に化学的
に結合した標識の組合せを意味する。
は、試薬または結合パートナーもしくは競合体に化学的
に結合した標識の組合せを意味する。
【００３７】複合体形成が免疫学的検定の一部を構成す
る場合には、分析物は、抗原または抗体のいずれかであ
り、対応する補助試薬または結合パートナーは、それぞ
れ抗体または抗原である。ここで使用している「抗原」
または「抗原分析物」という用語は、それに対して抗体
が産生され得るいかなる物質も広く意味する。抗原とい
う用語は、ペプチド、タンパク質、核酸およびそれらよ
り形成される物質のような広範囲の物質を含む。抗原分
析物は、抗原、抗体またはその誘導体、ホルモン、ハプ
テン、受容体、核酸、核酸プローブ、毒素、薬物、有機
分子、ウイルス、および細菌を含む物質の種々のスペク
トルを包含する。抗体の断片または誘導体とは、それら
が由来するところの抗体が元々認識したエピトープを認
識する能力を保持している抗体の部分を意味する。抗体
という用語は、インビボまたはインビトロで産生された
抗体を意味し、ポリクローナル抗体断片、モノクローナ
ル抗体断片、キメラ抗体、および組換え方法、タンパク
質スプライシング技術、並びにこの業界で公知の方法に
より産生される他の材料を含む。
る場合には、分析物は、抗原または抗体のいずれかであ
り、対応する補助試薬または結合パートナーは、それぞ
れ抗体または抗原である。ここで使用している「抗原」
または「抗原分析物」という用語は、それに対して抗体
が産生され得るいかなる物質も広く意味する。抗原とい
う用語は、ペプチド、タンパク質、核酸およびそれらよ
り形成される物質のような広範囲の物質を含む。抗原分
析物は、抗原、抗体またはその誘導体、ホルモン、ハプ
テン、受容体、核酸、核酸プローブ、毒素、薬物、有機
分子、ウイルス、および細菌を含む物質の種々のスペク
トルを包含する。抗体の断片または誘導体とは、それら
が由来するところの抗体が元々認識したエピトープを認
識する能力を保持している抗体の部分を意味する。抗体
という用語は、インビボまたはインビトロで産生された
抗体を意味し、ポリクローナル抗体断片、モノクローナ
ル抗体断片、キメラ抗体、および組換え方法、タンパク
質スプライシング技術、並びにこの業界で公知の方法に
より産生される他の材料を含む。
【００３８】複合体の形成が核酸雑種形成検定または工
程の一部を構成する場合には、分析物は一般的には塩基
配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡであり、その補助試薬
または結合パートナーは、核酸分析物と雑種形成できる
核酸プローブである。「核酸分析物」という用語は、補
助核酸プローブがそれに対して調製される実質的に既知
の配列を有するいかなる核酸も広く意味する。核酸分析
物の配列は、直接核酸配列決定法のような方法により確
実に認識しても、核酸分析物の翻訳産生物についての実
質的に既知のアミノ酸配列から推測してもよい。ここに
用いている「核酸分析物」という用語は、最後にはタン
パク質産生物に翻訳されるＤＮＡまたはＲＮＡに制限さ
れないだけでなく、非暗号核酸または暗号核酸内の非暗
号核酸配列をも含む。
程の一部を構成する場合には、分析物は一般的には塩基
配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡであり、その補助試薬
または結合パートナーは、核酸分析物と雑種形成できる
核酸プローブである。「核酸分析物」という用語は、補
助核酸プローブがそれに対して調製される実質的に既知
の配列を有するいかなる核酸も広く意味する。核酸分析
物の配列は、直接核酸配列決定法のような方法により確
実に認識しても、核酸分析物の翻訳産生物についての実
質的に既知のアミノ酸配列から推測してもよい。ここに
用いている「核酸分析物」という用語は、最後にはタン
パク質産生物に翻訳されるＤＮＡまたはＲＮＡに制限さ
れないだけでなく、非暗号核酸または暗号核酸内の非暗
号核酸配列をも含む。
【００３９】試験混合物を形成するために、各々の結合
パートナーが異なる発光標識に結合するように、試料を
各々の物質の結合パートナーと混合する。接合体の発光
化合物は活性化せしめられ、少なくとも２つの異なる処
理条件下で光を放出できる。もしくは、試験混合物は、
競合検定形式において検出される物質についての標識ま
たは非標識競合体を含む。化学発光標識は、特異的な化
学反応により活性化されて光を放出する発光物質であ
る。代表的な化学発光化合物としては、ルミノール、イ
ソルミノールおよびその誘導体、アクリジニウムエステ
ルおよびベンズアクリジニウムエステルが挙げられる。
少なくとも１つのアクリジニウムエステル接合体および
少なくとも１つのベンズアクリジニウムエステル接合体
を使用する試験試料中の２つ以上の物質の検定方法が、
本出願者に譲渡され、ここに参照文献として包含する、
米国特許出願第08/035,130号に記載されている。
パートナーが異なる発光標識に結合するように、試料を
各々の物質の結合パートナーと混合する。接合体の発光
化合物は活性化せしめられ、少なくとも２つの異なる処
理条件下で光を放出できる。もしくは、試験混合物は、
競合検定形式において検出される物質についての標識ま
たは非標識競合体を含む。化学発光標識は、特異的な化
学反応により活性化されて光を放出する発光物質であ
る。代表的な化学発光化合物としては、ルミノール、イ
ソルミノールおよびその誘導体、アクリジニウムエステ
ルおよびベンズアクリジニウムエステルが挙げられる。
少なくとも１つのアクリジニウムエステル接合体および
少なくとも１つのベンズアクリジニウムエステル接合体
を使用する試験試料中の２つ以上の物質の検定方法が、
本出願者に譲渡され、ここに参照文献として包含する、
米国特許出願第08/035,130号に記載されている。
【００４０】この検定において、各々の発光接合体は検
出される物質に結合せしめられ、別の形式においては、
標識競合体は、結合パートナーへの特異的な結合につい
てその物質と競合する。発光接合体が物質に結合すると
きに、検定は直接検定形式であると言われる。検定が分
析物に対する標識競合体を含む場合には、検定は間接ま
たは競合検定形式であると言われる。上述したいずれの
検定も、例えば、免疫学的検定、タンパク質結合検定、
雑種形成検定等、直接または間接検定形式とすることが
できる。多重発光接合体検定は１つの試験試料中の少な
くとも２つの異なる物質を検出または定量するので、１
つの物質についての検定が直接検定形式であり、他方の
物質についての検定が間接または競合形式であるよう
に、二重の発光検定を計画することもできる。もしく
は、少なくとも２つの異なる物質を共に直接検定形式ま
たは間接検定形式により検出してもよい。
出される物質に結合せしめられ、別の形式においては、
標識競合体は、結合パートナーへの特異的な結合につい
てその物質と競合する。発光接合体が物質に結合すると
きに、検定は直接検定形式であると言われる。検定が分
析物に対する標識競合体を含む場合には、検定は間接ま
たは競合検定形式であると言われる。上述したいずれの
検定も、例えば、免疫学的検定、タンパク質結合検定、
雑種形成検定等、直接または間接検定形式とすることが
できる。多重発光接合体検定は１つの試験試料中の少な
くとも２つの異なる物質を検出または定量するので、１
つの物質についての検定が直接検定形式であり、他方の
物質についての検定が間接または競合形式であるよう
に、二重の発光検定を計画することもできる。もしく
は、少なくとも２つの異なる物質を共に直接検定形式ま
たは間接検定形式により検出してもよい。
【００４１】ルミノール、すなわち、５−アミノ−２、
３、−ジヒドロ−１、４−フタラジン ジオン、イソル
ミノール、その変異体、およびそれらの誘導体並びにア
クリジニウムエステルが発光化合物のよく知られた実施
例である。ミノルール、イソルミノールおよびそれらの
誘導体が、ミクロペルオキシダーゼのような触媒の存在
下で、過酸化水素の希釈溶液により活性化されて、基底
状態に戻るときに光を放出する不安定な産生物を産生す
る。誘導体Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソ
ルミノールが発光標識として用いられる場合、0.01Ｍの
リン酸ナトリウム、ｐＨ7.4 中の過酸化水素の0.3 ％溶
液および0.05ｍｌのミクロペルオキシダーゼ（10ｕｇ／
ｍｌ 水）の添加後に活性化が行なわれる。もしくは、
反応基またはスペーサーアームを有する誘導体を用い
て、接合により適した化合物を用意してもよい。スペー
サーアームは、必要に応じて20までのヘテロ原子を含
む、枝別れまたは直鎖アルキル、置換または非置換アリ
ールまたはアラルキルを含む。
３、−ジヒドロ−１、４−フタラジン ジオン、イソル
ミノール、その変異体、およびそれらの誘導体並びにア
クリジニウムエステルが発光化合物のよく知られた実施
例である。ミノルール、イソルミノールおよびそれらの
誘導体が、ミクロペルオキシダーゼのような触媒の存在
下で、過酸化水素の希釈溶液により活性化されて、基底
状態に戻るときに光を放出する不安定な産生物を産生す
る。誘導体Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソ
ルミノールが発光標識として用いられる場合、0.01Ｍの
リン酸ナトリウム、ｐＨ7.4 中の過酸化水素の0.3 ％溶
液および0.05ｍｌのミクロペルオキシダーゼ（10ｕｇ／
ｍｌ 水）の添加後に活性化が行なわれる。もしくは、
反応基またはスペーサーアームを有する誘導体を用い
て、接合により適した化合物を用意してもよい。スペー
サーアームは、必要に応じて20までのヘテロ原子を含
む、枝別れまたは直鎖アルキル、置換または非置換アリ
ールまたはアラルキルを含む。
【００４２】ルミノール、イソルミノールおよびその誘
導体は、他の発光化合物、すなわち、アクリジニウムエ
ステルより低いｐＨで検出でき、このことにより、２つ
の異なる発光標識を用いた検定を行なう可能性のあるこ
とが分かった。
導体は、他の発光化合物、すなわち、アクリジニウムエ
ステルより低いｐＨで検出でき、このことにより、２つ
の異なる発光標識を用いた検定を行なう可能性のあるこ
とが分かった。
【００４３】アクリジニウムエステルおよびベンズアク
リジニウムエステルは、酸化のための触媒を必要とはせ
ず、活性化されていくぶん異なった酸化条件下で光を放
出する。ある実施態様において、ジメチルアクリジニウ
ムエステル（ＤＭＡＥ）（チバコーニングダイアグノス
ティクス社）が化学発光標識として用いられ、標識の活
性化は、0.1 Ｎの硝酸を含む0.5 ％の過酸化水素溶液お
よび0.5 ％の洗浄剤を含む0.25Ｎの水酸化ナトリウム溶
液の連続添加により行なわれる。
リジニウムエステルは、酸化のための触媒を必要とはせ
ず、活性化されていくぶん異なった酸化条件下で光を放
出する。ある実施態様において、ジメチルアクリジニウ
ムエステル（ＤＭＡＥ）（チバコーニングダイアグノス
ティクス社）が化学発光標識として用いられ、標識の活
性化は、0.1 Ｎの硝酸を含む0.5 ％の過酸化水素溶液お
よび0.5 ％の洗浄剤を含む0.25Ｎの水酸化ナトリウム溶
液の連続添加により行なわれる。
【００４４】特別な実施態様において、試験試料中の少
なくとも２つの異なる物質の各々は、各々の結合パート
ナーが化学的に結合された発光標識を有するように、試
験試料、検出または定量しようとする各々の物質、例え
ば、抗体を含む分析物に対する結合パートナーを含有す
る試験混合物を調製することにより、検出または定量さ
れる。次に、試験混合物は複数の複合体を形成するのに
十分な期間と条件で反応を行なう。好ましい実施態様に
おいて、第１の複合体は、第１の分析物に対する抗体か
らなり、その抗体は標識されている。同様に、第２また
は別の複合体は、第２の分析物に対する抗体からなり、
その抗体は標識されている。その後、分析物の存在また
は不在が、各々の複合体の発光標識の検出により測定さ
れる。
なくとも２つの異なる物質の各々は、各々の結合パート
ナーが化学的に結合された発光標識を有するように、試
験試料、検出または定量しようとする各々の物質、例え
ば、抗体を含む分析物に対する結合パートナーを含有す
る試験混合物を調製することにより、検出または定量さ
れる。次に、試験混合物は複数の複合体を形成するのに
十分な期間と条件で反応を行なう。好ましい実施態様に
おいて、第１の複合体は、第１の分析物に対する抗体か
らなり、その抗体は標識されている。同様に、第２また
は別の複合体は、第２の分析物に対する抗体からなり、
その抗体は標識されている。その後、分析物の存在また
は不在が、各々の複合体の発光標識の検出により測定さ
れる。
【００４５】上述した実施態様は、各々の分析物が抗原
または抗原分析物である免疫学的検定形式を説明してい
る。これらの実施態様は本発明の範囲を制限することを
意図するものではない。したがって、当業者に分かるよ
うに、本発明は、各々の分析物が抗体であり、補助試薬
または結合パートナーは抗体が向けられる抗原である免
疫学的検定を提供する。同様に、本発明は、１つの分析
物が抗原であり、第２の分析物が抗体である免疫学的検
定を提供する。さらに、上述した試薬のいずれも、直接
検定形式、または間接競合検定形式であってもよい。
または抗原分析物である免疫学的検定形式を説明してい
る。これらの実施態様は本発明の範囲を制限することを
意図するものではない。したがって、当業者に分かるよ
うに、本発明は、各々の分析物が抗体であり、補助試薬
または結合パートナーは抗体が向けられる抗原である免
疫学的検定を提供する。同様に、本発明は、１つの分析
物が抗原であり、第２の分析物が抗体である免疫学的検
定を提供する。さらに、上述した試薬のいずれも、直接
検定形式、または間接競合検定形式であってもよい。
【００４６】また当業者に明確なように、上述した方法
を変更して、追加の発光標識結合パートナー、すなわ
ち、発光接合体、または別の発光標識を形成してもよ
く、並びに、本発明の原理を利用して別の群または形式
の検定を構成してもよい。したがって、例えば、本発明
の方法を用いて、少なくとも２つの異なる遺伝子、１つ
の染色体ゲノム上の少なくとも２つの異なる座、核酸ま
たは抗体を検出または定量することもできる。同様に、
この方法は、少なくとも２つの異なる特異性の抗体の検
定；少なくとも２つの抗原を含む検定；少なくとも１つ
の抗原および少なくとも１つの抗体を含む検定；および
癌、感染病、遺伝子異常、遺伝子気質、遺伝子評価を示
す複数の分子並びに医療治療をモニタする複数の分子の
検定に適応される。例えば、第１の発光標識は、ある遺
伝子に特異的に結合する核酸プローブに結合でき、第２
の発光標識は、別の遺伝子または同一の遺伝子の異なる
座に特異的に結合する核酸プローブに結合できる。
を変更して、追加の発光標識結合パートナー、すなわ
ち、発光接合体、または別の発光標識を形成してもよ
く、並びに、本発明の原理を利用して別の群または形式
の検定を構成してもよい。したがって、例えば、本発明
の方法を用いて、少なくとも２つの異なる遺伝子、１つ
の染色体ゲノム上の少なくとも２つの異なる座、核酸ま
たは抗体を検出または定量することもできる。同様に、
この方法は、少なくとも２つの異なる特異性の抗体の検
定；少なくとも２つの抗原を含む検定；少なくとも１つ
の抗原および少なくとも１つの抗体を含む検定；および
癌、感染病、遺伝子異常、遺伝子気質、遺伝子評価を示
す複数の分子並びに医療治療をモニタする複数の分子の
検定に適応される。例えば、第１の発光標識は、ある遺
伝子に特異的に結合する核酸プローブに結合でき、第２
の発光標識は、別の遺伝子または同一の遺伝子の異なる
座に特異的に結合する核酸プローブに結合できる。
【００４７】本発明のある実施態様において、どの連結
化合物が選択されるかに依存して、アクリジニウムエス
テル化合物およびベンズアクリジニウムエステル化合物
は、水性媒体または有機媒体中の特異的な結合パートナ
ー、配位子、ハプテンのいずれかと直接に反応できる。
化合物が選択されるかに依存して、アクリジニウムエス
テル化合物およびベンズアクリジニウムエステル化合物
は、水性媒体または有機媒体中の特異的な結合パートナ
ー、配位子、ハプテンのいずれかと直接に反応できる。
【００４８】標識は、適切なリービング基（leaving gr
oup ）、または物質を結合するためのスペーサを介して
直接結合または連結され試験検定に利用される接合体を
形成するような反応基に容易に転化されるリービング基
または官能基により結合される求電子官能基を含む。
oup ）、または物質を結合するためのスペーサを介して
直接結合または連結され試験検定に利用される接合体を
形成するような反応基に容易に転化されるリービング基
または官能基により結合される求電子官能基を含む。
【００４９】ルミノール誘導体を結合パートナーに結合
する方法が、参照文献としてここに含む米国特許第4,29
7,273 号に記載されている。
する方法が、参照文献としてここに含む米国特許第4,29
7,273 号に記載されている。
【００５０】結合パートナー、ハプテン、または配位子
をポリヌクレオチドに接合する方法が、ヨーロッパ特許
第0 537 994 号（10/16/91に出願した米国特許出願第77
5,399 号を優先権とする）に記載されており、この特許
は本出願人に譲渡され、ここに参照文献として包含す
る。
をポリヌクレオチドに接合する方法が、ヨーロッパ特許
第0 537 994 号（10/16/91に出願した米国特許出願第77
5,399 号を優先権とする）に記載されており、この特許
は本出願人に譲渡され、ここに参照文献として包含す
る。
【００５１】したがって、Ｎ−（４−アミノブチル）−
Ｎ−エチルイソルミノールおよびジメチルアクリジニウ
ムエステルは、対の各々の発光標識が異なる処理条件下
で光を放出するので、好ましい実施態様において、二重
光標識検定に使用できる一対の発光標識を例示してい
る。処理条件は、発光標識が、例えば、電子的励起状態
に活性化され、電子的に励起されていない状態に戻ると
きに、光を放出できる反応条件を意味する。ここに用い
ているように、第１の処理条件は第１の発光標識を活性
化するために用いる条件を意味する。第２の処理条件は
第２の発光標識を活性化するために用いる条件を意味す
る。各々の場合において、検定の形式により、標識は、
検出する物質のために結合パートナーまたは検出する物
質の競合体に接合される。試験試料中の３つ以上の物質
の検定試験にために、追加の処理条件を加えてもよい。
そのような追加の処理条件は、標識の光放出が重複する
場合、光放出が区別できるかまたは補正できる限り、第
１と第２の処理条件と異なる必要はない。本発明の別の
実施態様により、標識がルミノール誘導体およびアクリ
ジニウムエステルを含み、ルミノール誘導体が第１の処
理段階で酸化され、アクリジニウムエステルが第２の処
理段階により活性化される二重標識検定を提供する。
Ｎ−エチルイソルミノールおよびジメチルアクリジニウ
ムエステルは、対の各々の発光標識が異なる処理条件下
で光を放出するので、好ましい実施態様において、二重
光標識検定に使用できる一対の発光標識を例示してい
る。処理条件は、発光標識が、例えば、電子的励起状態
に活性化され、電子的に励起されていない状態に戻ると
きに、光を放出できる反応条件を意味する。ここに用い
ているように、第１の処理条件は第１の発光標識を活性
化するために用いる条件を意味する。第２の処理条件は
第２の発光標識を活性化するために用いる条件を意味す
る。各々の場合において、検定の形式により、標識は、
検出する物質のために結合パートナーまたは検出する物
質の競合体に接合される。試験試料中の３つ以上の物質
の検定試験にために、追加の処理条件を加えてもよい。
そのような追加の処理条件は、標識の光放出が重複する
場合、光放出が区別できるかまたは補正できる限り、第
１と第２の処理条件と異なる必要はない。本発明の別の
実施態様により、標識がルミノール誘導体およびアクリ
ジニウムエステルを含み、ルミノール誘導体が第１の処
理段階で酸化され、アクリジニウムエステルが第２の処
理段階により活性化される二重標識検定を提供する。
【００５２】本発明の方法によると、放出される光は、
試験混合物を第１の処理条件にさらした後に測定し、そ
の試験混合物を第２の処理条件にさらした後に再度測定
する。好ましい実施態様において、処理条件は、順番に
行なわれる化学的に活性化される酸化反応である。試験
検定により、適切な分離段階が必要であってもよい。酸
化条件は、千分の一秒から分までの反応時間および室温
から60℃までの温度を含む。試験試料中の他の物質を試
験する別の検定形式は、上述した範囲を越えた範囲また
は異なる範囲の反応時間および温度を必要としてもよ
い。別の検定方法において、利用する標識により、処理
段階を同時に行ない、検出は同時でも別々に行なっても
よい。
試験混合物を第１の処理条件にさらした後に測定し、そ
の試験混合物を第２の処理条件にさらした後に再度測定
する。好ましい実施態様において、処理条件は、順番に
行なわれる化学的に活性化される酸化反応である。試験
検定により、適切な分離段階が必要であってもよい。酸
化条件は、千分の一秒から分までの反応時間および室温
から60℃までの温度を含む。試験試料中の他の物質を試
験する別の検定形式は、上述した範囲を越えた範囲また
は異なる範囲の反応時間および温度を必要としてもよ
い。別の検定方法において、利用する標識により、処理
段階を同時に行ない、検出は同時でも別々に行なっても
よい。
【００５３】好ましくは、放出される光は、第１の酸化
段階後と、再度第２の酸化段階後に測定する。放出され
る光は、光電子増倍管検出装置を用いて測定する。検出
装置には、好ましくは、第１および第２の標識を活性化
するのに必要な試薬を自動的に注入する試薬ポンプが備
えられている。マジックR ライトアナライザー（ＭＬＡ
−１）（チバコーニングダイアグノスティクス社）とし
て知られている光電子増倍管検出装置を用いて以下の実
施例において放出された光を測定した。ＭＬＡ−１は、
自動的に試薬を注入し、試料の光放出を測定し、試験試
料中に既知の量の物質を含有する標準物の放出と試料光
放出とを関連付けることにより、光放出を分析物濃度に
変換することができる。複数の光電子増倍管を有するル
ミノメータ（luminometer ）は、3/19/92 に出願された
米国特許出願第08/035,341号に記載されており、この出
願は、本出願人に譲渡され、ここに参照文献として包含
され、本発明の実施に用いてもよい。
段階後と、再度第２の酸化段階後に測定する。放出され
る光は、光電子増倍管検出装置を用いて測定する。検出
装置には、好ましくは、第１および第２の標識を活性化
するのに必要な試薬を自動的に注入する試薬ポンプが備
えられている。マジックR ライトアナライザー（ＭＬＡ
−１）（チバコーニングダイアグノスティクス社）とし
て知られている光電子増倍管検出装置を用いて以下の実
施例において放出された光を測定した。ＭＬＡ−１は、
自動的に試薬を注入し、試料の光放出を測定し、試験試
料中に既知の量の物質を含有する標準物の放出と試料光
放出とを関連付けることにより、光放出を分析物濃度に
変換することができる。複数の光電子増倍管を有するル
ミノメータ（luminometer ）は、3/19/92 に出願された
米国特許出願第08/035,341号に記載されており、この出
願は、本出願人に譲渡され、ここに参照文献として包含
され、本発明の実施に用いてもよい。
【００５４】異なる処理条件下で活性化され得る適切な
発光標識の選択は、多重発光標識検定を発達させるため
の必要条件である。好ましい一対の発光標識を選択する
代表的な工程を実施例１に開示する。その実験におい
て、第１の発光標識、ルミノールは、第１の酸化段階後
に酸化されて光を放出し、第２の発光標識、ジメチルメ
チルアクリジニウムエステルは第２の酸化段階後に酸化
されて光を放出する。この実験は、２つの標識が互いの
存在下で識別できることを示した。
発光標識の選択は、多重発光標識検定を発達させるため
の必要条件である。好ましい一対の発光標識を選択する
代表的な工程を実施例１に開示する。その実験におい
て、第１の発光標識、ルミノールは、第１の酸化段階後
に酸化されて光を放出し、第２の発光標識、ジメチルメ
チルアクリジニウムエステルは第２の酸化段階後に酸化
されて光を放出する。この実験は、２つの標識が互いの
存在下で識別できることを示した。
【００５５】一対の標識の各々が活性化されて異なる処
理条件下で光を放出するように一対の標識を選択する場
合、他の発光標識を、二重標識発光検定に利用すること
もできる。本発明の方法により使用できる別の化学発光
標識の実施例はベンズアクリジニウムエステルを含む。
理条件下で光を放出するように一対の標識を選択する場
合、他の発光標識を、二重標識発光検定に利用すること
もできる。本発明の方法により使用できる別の化学発光
標識の実施例はベンズアクリジニウムエステルを含む。
【００５６】多重発光検定（multi-luminescent ）は、
同一の容器中で、または少なくとも１つの反応生成物ま
たは複合体が１つの容器中で形成され、検出または定量
のための第２の容器中に移送される場合、もしくは第１
の処理段階が第１の容器中で行なわれ、次いでその含有
物また一部が第２の処理段階のための第２の容器に移送
される場合、少なくとも２つの異なる発光検定を行なう
ことを意味する。試験試料中の多重物質を検出または定
量する場合、もしくは検定形式に別の処理および検出段
階を必要とする場合、これらの処理段階を変更してもよ
い。
同一の容器中で、または少なくとも１つの反応生成物ま
たは複合体が１つの容器中で形成され、検出または定量
のための第２の容器中に移送される場合、もしくは第１
の処理段階が第１の容器中で行なわれ、次いでその含有
物また一部が第２の処理段階のための第２の容器に移送
される場合、少なくとも２つの異なる発光検定を行なう
ことを意味する。試験試料中の多重物質を検出または定
量する場合、もしくは検定形式に別の処理および検出段
階を必要とする場合、これらの処理段階を変更してもよ
い。
【００５７】したがって、本発明は、個別の試験反応を
行なわせる必要性または各々の物質を混合する必要性を
なくすことができたので、各々の物質の試験試料中の複
数の異なる物質の有無を検出するためのより有効な工程
を提供する。さらに本発明は、内部標準材料または対照
材料を試験試料に加えるような場合、そして同一の検定
において試験試料中の少なくとも１つの物質を検出また
は定量する場合等の、各々の物質の試験試料中の複数の
異なる物質の有無を検出するためのより有効な工程を提
供する。
行なわせる必要性または各々の物質を混合する必要性を
なくすことができたので、各々の物質の試験試料中の複
数の異なる物質の有無を検出するためのより有効な工程
を提供する。さらに本発明は、内部標準材料または対照
材料を試験試料に加えるような場合、そして同一の検定
において試験試料中の少なくとも１つの物質を検出また
は定量する場合等の、各々の物質の試験試料中の複数の
異なる物質の有無を検出するためのより有効な工程を提
供する。
【００５８】実施例２−５は、用意した試験試料中のウ
サギガンマグロブリン（ＲＧＧ）およびチロキシン（Ｔ
4 ）を定量する二重発光標識免疫学的検定の発達および
遂行を説明している。
サギガンマグロブリン（ＲＧＧ）およびチロキシン（Ｔ
4 ）を定量する二重発光標識免疫学的検定の発達および
遂行を説明している。
【００５９】実施例２は、ＲＧＧ免疫学的検定のための
ＲＧＧとＮ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソル
ミノール（ＡＢＥＩ）との接合体の調製を記載してい
る。
ＲＧＧとＮ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソル
ミノール（ＡＢＥＩ）との接合体の調製を記載してい
る。
【００６０】実施例３を参照した、ＲＧＧの発光免疫学
的検定は、ＲＧＧを含む試験混合物、ＡＢＥＩ標識ＲＧ
Ｇおよび限られた量のＲＧＧに対する固定化抗体からな
る。固定化抗体に対してＲＧＧまたはＡＢＥＩ標識ＲＧ
Ｇいずれかの複合体を成形するのに十分な時間と条件で
試験混合物を反応させる。一般的に、反応条件は、試験
混合物の渦流混合、および混合物を室温の標準条件、す
なわち、20℃、および大気圧で60分間に亘り反応させる
ことを含む。ＲＧＧが試料中に存在しない場合には、形
成された複合体は所定の量の標識競合体を含む。試料中
にＲＧＧが存在する場合には、存在する一部が固定化抗
体に結合する。したがって、複合体に存在する発光標識
の量が、試料中のＲＧＧの量に比例した量で減少する。
次に、発光接合体、したがって間接的に試料中のＲＧＧ
の量を定量するために、反応生成物を分離する。
的検定は、ＲＧＧを含む試験混合物、ＡＢＥＩ標識ＲＧ
Ｇおよび限られた量のＲＧＧに対する固定化抗体からな
る。固定化抗体に対してＲＧＧまたはＡＢＥＩ標識ＲＧ
Ｇいずれかの複合体を成形するのに十分な時間と条件で
試験混合物を反応させる。一般的に、反応条件は、試験
混合物の渦流混合、および混合物を室温の標準条件、す
なわち、20℃、および大気圧で60分間に亘り反応させる
ことを含む。ＲＧＧが試料中に存在しない場合には、形
成された複合体は所定の量の標識競合体を含む。試料中
にＲＧＧが存在する場合には、存在する一部が固定化抗
体に結合する。したがって、複合体に存在する発光標識
の量が、試料中のＲＧＧの量に比例した量で減少する。
次に、発光接合体、したがって間接的に試料中のＲＧＧ
の量を定量するために、反応生成物を分離する。
【００６１】一般的に、例えば、補助試薬または結合パ
ートナーを固体支持体または固相に結合させることによ
り、複合体が固体相上に存在するように、検定形式を計
画することが望ましい。実施例３−５に開示した実施態
様において、抗原分析物に対するモノクローナル抗体
を、当業者に知られた接合方法、例えば、グルタルアル
デヒド活性化を用いて常磁性粒子に結合させている。本
発明の方法により、ラテックス粒子、シリカ粒子、ガラ
ス粒子、セルロース粒子、細胞、ポリアクリルアミド、
アガロース、クロマトグラフ支持材料、試験管、マイク
ロタイタウェル、および膜を含む、他の固体支持体を用
いてもよい。
ートナーを固体支持体または固相に結合させることによ
り、複合体が固体相上に存在するように、検定形式を計
画することが望ましい。実施例３−５に開示した実施態
様において、抗原分析物に対するモノクローナル抗体
を、当業者に知られた接合方法、例えば、グルタルアル
デヒド活性化を用いて常磁性粒子に結合させている。本
発明の方法により、ラテックス粒子、シリカ粒子、ガラ
ス粒子、セルロース粒子、細胞、ポリアクリルアミド、
アガロース、クロマトグラフ支持材料、試験管、マイク
ロタイタウェル、および膜を含む、他の固体支持体を用
いてもよい。
【００６２】試験混合物を液相分画と固相分画に分離す
る方法が当業者に知られている。
る方法が当業者に知られている。
【００６３】常磁性粒子を固相として用いる場合、磁力
を用いて当業者の標準方法による分離を行なう。次に、
固相を洗浄して分離段階中に固相に取り込まれたかもし
れない非結合試薬、すなわち、非特異的結合材料を除去
する。洗浄した固相を適切な液体、例えば、蒸留水また
は脱イオン水中に再度懸濁させ、再懸濁固相を含有する
管を検出および／または定量のための検出器、例えば、
ルミノメータ中に配置する。
を用いて当業者の標準方法による分離を行なう。次に、
固相を洗浄して分離段階中に固相に取り込まれたかもし
れない非結合試薬、すなわち、非特異的結合材料を除去
する。洗浄した固相を適切な液体、例えば、蒸留水また
は脱イオン水中に再度懸濁させ、再懸濁固相を含有する
管を検出および／または定量のための検出器、例えば、
ルミノメータ中に配置する。
【００６４】触媒、例えば、ミクロペルオキシダーゼを
管に加える。管を検出器に導入する前また後のいずれで
触媒を加えてもよい。しかしながら、発光接合体による
光の放出は、酸化溶液への露出により比較的瞬時である
ので、管を光測定のための検出器中に配置した後のみ
に、各々の管に希釈過酸化水素溶液、例えば、0.1 Ｍの
リン酸ナトリウム、ｐＨ7.4 中の0.3 ％の過酸化水素溶
液0.3 ｍｌを注入する。既知の量の分析物を含有する標
準物の光放出に対して試料光放出を関連付けることによ
り、試料中に存在する分析物の量を量的に求めることも
できる。
管に加える。管を検出器に導入する前また後のいずれで
触媒を加えてもよい。しかしながら、発光接合体による
光の放出は、酸化溶液への露出により比較的瞬時である
ので、管を光測定のための検出器中に配置した後のみ
に、各々の管に希釈過酸化水素溶液、例えば、0.1 Ｍの
リン酸ナトリウム、ｐＨ7.4 中の0.3 ％の過酸化水素溶
液0.3 ｍｌを注入する。既知の量の分析物を含有する標
準物の光放出に対して試料光放出を関連付けることによ
り、試料中に存在する分析物の量を量的に求めることも
できる。
【００６５】実施例４を参照して、ＲＧＧについての発
光免疫学的検定に記載したのと同様な一般的工程および
条件にしたがって、チロキシン（Ｔ4 ）についての発光
免疫学的分析を行なう。Ｔ4 を測定するための発光免疫
学的検定を、ジメチルアクリジニウムエステルをＴ4 競
合体に接合する競合検定として構成してもよい。ＲＧＧ
検定のように、Ｔ4 検定中の競合体は、検出される分析
物と同一である。
光免疫学的検定に記載したのと同様な一般的工程および
条件にしたがって、チロキシン（Ｔ4 ）についての発光
免疫学的分析を行なう。Ｔ4 を測定するための発光免疫
学的検定を、ジメチルアクリジニウムエステルをＴ4 競
合体に接合する競合検定として構成してもよい。ＲＧＧ
検定のように、Ｔ4 検定中の競合体は、検出される分析
物と同一である。
【００６６】化学発光化合物、ジメチルアクリジニウム
エステルを、当業者によく知られている標準方法により
Ｔ4 に接合する。米国特許第4,745,181 号、第4,918,19
2 号、第5,110,932 号、米国特許出願第07/826,186号、
第07/871,601号は、安定な多置換アリールアクリジニウ
ムエステルについて記載している。これらの特許および
特許出願は本出願人に譲渡されたものであり、ここに参
照文献として包含する。米国特許第08/035,130号は、ベ
ンズアクリジニウム化合物および接合体について記載し
ている。当業者によく知られている標準方法を用いて、
Ｔ4 対して向けられている抗体を常磁性粒子に結合させ
る。ＲＧＧ検定について記載したように、常磁性粒子
は、固相として機能して、検出可能な反応生成物または
複合体の分離を容易にする。そのような分離は、複合体
中の発光接合体を最後に検出するのに必要であり、それ
により、試料中の物質を検出または定量する。
エステルを、当業者によく知られている標準方法により
Ｔ4 に接合する。米国特許第4,745,181 号、第4,918,19
2 号、第5,110,932 号、米国特許出願第07/826,186号、
第07/871,601号は、安定な多置換アリールアクリジニウ
ムエステルについて記載している。これらの特許および
特許出願は本出願人に譲渡されたものであり、ここに参
照文献として包含する。米国特許第08/035,130号は、ベ
ンズアクリジニウム化合物および接合体について記載し
ている。当業者によく知られている標準方法を用いて、
Ｔ4 対して向けられている抗体を常磁性粒子に結合させ
る。ＲＧＧ検定について記載したように、常磁性粒子
は、固相として機能して、検出可能な反応生成物または
複合体の分離を容易にする。そのような分離は、複合体
中の発光接合体を最後に検出するのに必要であり、それ
により、試料中の物質を検出または定量する。
【００６７】分離した分画を洗浄して、分離段階中に分
離した分画に取り込まれたかもしれない溶性試薬を除去
した後、分離分画を適切な液体、例えば、蒸留水中に再
懸濁させて、再懸濁した分離分画を含有する管を検出器
中に配置する。ある検定形式において、単純なデカンテ
ーションで十分であるので、洗浄が必要でないこともあ
る。アクリジニウムエステル標識の光放出は、試薬１
（0.5 ％の過酸化水素、0.1 Ｎの硝酸）および試薬２
（0.25Ｎの水酸化ナトリウム、0.5 ％の洗浄剤）の添加
後比較的瞬時であるので、放出した光の測定のための検
出器中に管を正しく配置した後、各々の管にこれらの２
つの試薬を自動的に注入する。
離した分画に取り込まれたかもしれない溶性試薬を除去
した後、分離分画を適切な液体、例えば、蒸留水中に再
懸濁させて、再懸濁した分離分画を含有する管を検出器
中に配置する。ある検定形式において、単純なデカンテ
ーションで十分であるので、洗浄が必要でないこともあ
る。アクリジニウムエステル標識の光放出は、試薬１
（0.5 ％の過酸化水素、0.1 Ｎの硝酸）および試薬２
（0.25Ｎの水酸化ナトリウム、0.5 ％の洗浄剤）の添加
後比較的瞬時であるので、放出した光の測定のための検
出器中に管を正しく配置した後、各々の管にこれらの２
つの試薬を自動的に注入する。
【００６８】実施例５を参照して、本発明の二重標識発
光免疫学的検定において、ＲＧＧの免疫学的検定である
実施例３を、Ｔ4 の免疫学的検定である実施例４と組み
合わせて、２つの検定を１つの容器中で行なう。二重発
光標識検定には、試験反応後に、第１と第２の処理条件
下で活性化されて光を放出する第１と第２の発光接合体
として、実施例３のＡＢＥＩ標識ＲＧＧ、および実施例
４のジメチルアクリジニウムエステル標識Ｔ4 を使用す
る。第１の発光標識は実施例３のイソルミノール誘導Ａ
ＢＥＩに限定されず、ルミノールまたは他のいかなる発
光標識の誘導体または変異体が第２の発光標識の活性化
に必要な反応条件とは異なる反応条件下で活性化されて
光を放出することのできる限り、第１の発光標識はその
ような変異体または誘導体であってもよい。一般的に、
二重発光標識検定のための検定条件は、単一標識検定の
条件と同一であるが、わずかな変更をともなう。したが
って、二重検定の試験混合物を、室温の標準条件下で60
分間に亘り反応させる。しかしながら、反応条件を変化
させて、反応時間を減少または増加させてもよい。
光免疫学的検定において、ＲＧＧの免疫学的検定である
実施例３を、Ｔ4 の免疫学的検定である実施例４と組み
合わせて、２つの検定を１つの容器中で行なう。二重発
光標識検定には、試験反応後に、第１と第２の処理条件
下で活性化されて光を放出する第１と第２の発光接合体
として、実施例３のＡＢＥＩ標識ＲＧＧ、および実施例
４のジメチルアクリジニウムエステル標識Ｔ4 を使用す
る。第１の発光標識は実施例３のイソルミノール誘導Ａ
ＢＥＩに限定されず、ルミノールまたは他のいかなる発
光標識の誘導体または変異体が第２の発光標識の活性化
に必要な反応条件とは異なる反応条件下で活性化されて
光を放出することのできる限り、第１の発光標識はその
ような変異体または誘導体であってもよい。一般的に、
二重発光標識検定のための検定条件は、単一標識検定の
条件と同一であるが、わずかな変更をともなう。したが
って、二重検定の試験混合物を、室温の標準条件下で60
分間に亘り反応させる。しかしながら、反応条件を変化
させて、反応時間を減少または増加させてもよい。
【００６９】次に、試験混合物を液相と固相に分離す
る。一般的に、反応混合物に結合される磁性粒子により
分離を行なう。しかしながら、上述した固体支持体およ
び方法いずれか１つ以上を用いて、二重標識検定の試験
混合物を１つ以上の溶性分画と不溶性分画に分離しても
よい。固相分画を洗浄して、分離段階中に不溶性分画に
取り込まれたかもしれない非結合試薬または物質を除去
する。その後、洗浄した不溶性分画を適切な溶液、例え
ば、蒸留水または脱イオン水中に再懸濁させ、ミルノー
ル、イソルミノールまたはそれらの誘導体の酸化に必要
な触媒を管に加える。次いで管に、連続して、試薬を注
入し、第１と第２の化学処理条件を活性化できる光電子
増倍管検出装置、すなわち、ルミノメータ中に配置す
る。好ましい実施態様において、第１の化学処理条件
は、実施例３のイソルミノール誘導体標識の活性化のた
めの酸化条件であり、第２の化学反応は、実施例４に記
載したような、ジメチルアクリジニウムエステル標識の
活性化のための酸化反応である。
る。一般的に、反応混合物に結合される磁性粒子により
分離を行なう。しかしながら、上述した固体支持体およ
び方法いずれか１つ以上を用いて、二重標識検定の試験
混合物を１つ以上の溶性分画と不溶性分画に分離しても
よい。固相分画を洗浄して、分離段階中に不溶性分画に
取り込まれたかもしれない非結合試薬または物質を除去
する。その後、洗浄した不溶性分画を適切な溶液、例え
ば、蒸留水または脱イオン水中に再懸濁させ、ミルノー
ル、イソルミノールまたはそれらの誘導体の酸化に必要
な触媒を管に加える。次いで管に、連続して、試薬を注
入し、第１と第２の化学処理条件を活性化できる光電子
増倍管検出装置、すなわち、ルミノメータ中に配置す
る。好ましい実施態様において、第１の化学処理条件
は、実施例３のイソルミノール誘導体標識の活性化のた
めの酸化条件であり、第２の化学反応は、実施例４に記
載したような、ジメチルアクリジニウムエステル標識の
活性化のための酸化反応である。
【００７０】第１の複合体中の第１の発光標識の検出
は、検定の形式により、試料中の第１の物質の存在また
は不在を示す。同様に、第２の複合体中の第２の発光標
識の検出は、検定の形式により、試料中の第２の物質の
存在または不在を示し、この場合、この第２の物質は、
内部参照材料または対照材料を含んでもよい。試験試料
中の物質の量は、既知の量の物質を含有する標準試料の
光出力に対して試料の光出力を関連付けることにより、
または適切な場合には、対照材料との比較により、量的
に測定できる。
は、検定の形式により、試料中の第１の物質の存在また
は不在を示す。同様に、第２の複合体中の第２の発光標
識の検出は、検定の形式により、試料中の第２の物質の
存在または不在を示し、この場合、この第２の物質は、
内部参照材料または対照材料を含んでもよい。試験試料
中の物質の量は、既知の量の物質を含有する標準試料の
光出力に対して試料の光出力を関連付けることにより、
または適切な場合には、対照材料との比較により、量的
に測定できる。
【００７１】理論的な二重発光標識検定を実施例６に示
し、本発明の方法の潜在的な臨床効用を説明する。理論
的検定は、血清試料中に含まれる黄体形成ホルモン（Ｌ
Ｈ）および卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の測定を記載す
る。
し、本発明の方法の潜在的な臨床効用を説明する。理論
的検定は、血清試料中に含まれる黄体形成ホルモン（Ｌ
Ｈ）および卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の測定を記載す
る。
【００７２】上述した方法と実施例に加え、本発明は試
験試料中の少なくとも２つの分析物を検出または定量す
るキットを提供する。このキットは、少なくとも２つの
異なる反応条件下で活性化される複合体を形成する検定
形式により、各々が試験試料中で検出される物質につい
ての結合パートナー、または試験試料中の検出される物
質のための少なくとも１つの標識または非標識競合体に
接合される少なくとも２つの異なる発光標識からなる。
験試料中の少なくとも２つの分析物を検出または定量す
るキットを提供する。このキットは、少なくとも２つの
異なる反応条件下で活性化される複合体を形成する検定
形式により、各々が試験試料中で検出される物質につい
ての結合パートナー、または試験試料中の検出される物
質のための少なくとも１つの標識または非標識競合体に
接合される少なくとも２つの異なる発光標識からなる。
【００７３】キットを用いて、抗原、抗体、ホルモン、
ハプテン、受容体、核酸、核酸プローブ、毒素、有機化
学物、薬品、および感染剤を含む、複数の物質を検出ま
たは定量できる。各々の物質について、キットは、少な
くとも１つの標識補助試薬または結合パートナー、もし
くは検定形式により検出される物質の標識または非標識
競合体を含有してもよい。好ましい実施態様の１つにお
いて、分析物は抗原であり、試薬または結合パートナー
は抗体である。別の実施態様において、分析物は核酸で
あり、試薬または結合パートナーは、核酸分析物に結合
できる核酸プローブである。
ハプテン、受容体、核酸、核酸プローブ、毒素、有機化
学物、薬品、および感染剤を含む、複数の物質を検出ま
たは定量できる。各々の物質について、キットは、少な
くとも１つの標識補助試薬または結合パートナー、もし
くは検定形式により検出される物質の標識または非標識
競合体を含有してもよい。好ましい実施態様の１つにお
いて、分析物は抗原であり、試薬または結合パートナー
は抗体である。別の実施態様において、分析物は核酸で
あり、試薬または結合パートナーは、核酸分析物に結合
できる核酸プローブである。
【００７４】以下の実施例は本発明を説明するものであ
るが、本発明の範囲を限定するものとして考えるべきで
はない。２つの異なる処理条件による２つの発光標識の
間の実験的識別を実施例１に記載する。実施例２は、Ｒ
ＧＧに対するイソルミノール誘導体標識の接合について
の好ましい方法を示す。実施例３は、１つの分析物を測
定する発光標識免疫学的検定を説明する。実施例４は、
１つの分析物（Ｔ4 ）を測定する発光標識免疫学的検定
を説明する。本発明の方法による２つの異なる分析物を
測定する二重発光接合体免疫学的検定を実施例５に記載
する。実施例６は、ＦＳＨおよびＬＨを測定する理論的
二重発光標識免疫学的検定を説明する。
るが、本発明の範囲を限定するものとして考えるべきで
はない。２つの異なる処理条件による２つの発光標識の
間の実験的識別を実施例１に記載する。実施例２は、Ｒ
ＧＧに対するイソルミノール誘導体標識の接合について
の好ましい方法を示す。実施例３は、１つの分析物を測
定する発光標識免疫学的検定を説明する。実施例４は、
１つの分析物（Ｔ4 ）を測定する発光標識免疫学的検定
を説明する。本発明の方法による２つの異なる分析物を
測定する二重発光接合体免疫学的検定を実施例５に記載
する。実施例６は、ＦＳＨおよびＬＨを測定する理論的
二重発光標識免疫学的検定を説明する。
【００７５】実施例１：２つの発光化合物の独立検出の実演 発光化合物 ＰＢＳ／ＢＳＡ（0.1 Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ7.4
、0.15Ｍの塩化ナトリウム、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清
アルブミン）中において0.25−5.0 ｎｇ／ｍｌの範囲の
表１に示したような既知の濃度での５−アミノ−２、３
−ジヒドロ−１、４−フタルアジンジオン（ルミノー
ル）の溶液を、メタノール中の0.5 ｍｇ／ｍｌの保存溶
液（stock solution）を希釈することにより調製した。
表１に示したような既知の濃度でのＤＭＡＥ（ジメチル
アクリジニウムエステル）の標準溶液を、ＤＭＦ（ジチ
メルホルムアミド）（153 ｕｇ／ｍｌ）中のＤＭＡＥ−
ＮＨＳ（２、６−ジメチル−４−）２−サクシンイミジ
ルオキシカルボニルエチル）−フェニル−１０−メチル
アクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホ
ネート）の保存溶液を、ＰＢＳ／ＢＳＡにより0.25−1
0.0ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度に希釈することにより調製
した。
、0.15Ｍの塩化ナトリウム、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清
アルブミン）中において0.25−5.0 ｎｇ／ｍｌの範囲の
表１に示したような既知の濃度での５−アミノ−２、３
−ジヒドロ−１、４−フタルアジンジオン（ルミノー
ル）の溶液を、メタノール中の0.5 ｍｇ／ｍｌの保存溶
液（stock solution）を希釈することにより調製した。
表１に示したような既知の濃度でのＤＭＡＥ（ジメチル
アクリジニウムエステル）の標準溶液を、ＤＭＦ（ジチ
メルホルムアミド）（153 ｕｇ／ｍｌ）中のＤＭＡＥ−
ＮＨＳ（２、６−ジメチル−４−）２−サクシンイミジ
ルオキシカルボニルエチル）−フェニル−１０−メチル
アクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホ
ネート）の保存溶液を、ＰＢＳ／ＢＳＡにより0.25−1
0.0ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度に希釈することにより調製
した。
【００７６】光測定 全ての測定は、標準チバコーニングＭＬＡ−１マジック
ライトアナライザー中で行なった。ルミノールの濃度を
測定するために、0.3 ％の過酸化水素溶液を注入した。
ジメチルアクリジニウムエステルの濃度を測定するため
に、試薬１、続いて試薬２を加えた。
ライトアナライザー中で行なった。ルミノールの濃度を
測定するために、0.3 ％の過酸化水素溶液を注入した。
ジメチルアクリジニウムエステルの濃度を測定するため
に、試薬１、続いて試薬２を加えた。
【００７７】発光試料の調製 様々な濃度の、ルミノール単体、ジメチルアクリジニウ
ムエステル単体、またはルミノールとジメチルアクリジ
ニウムエステルの混合物を含有する一連の試料（0.2 ｍ
ｌ）をポリスチレン管に配した。各試料に0.05ｍｌのミ
クロペルオキシダーゼ（ＭＰ−１１、シグマケミカル
社、水中で10ｕｇ／ｍｌ）を加え、ルミノールの光放出
酸化に触媒作用をうながした。全ての試料をＭＬＡ−１
中に配置して、0.3 ｍｌの0.3 ％の過酸化水素の注入に
より酸化させた。ＭＬＡ−１中の試薬を、試薬１（0.5
％の過酸化水素と0.1 Ｎの硝酸）および試薬２（0.25Ｎ
の水酸化ナトリウムと界面活性剤）（チバ コーニング
ダイアグノスティクス社）に変更した。同一の試料
を、試薬１と試薬２の連続の注入により２度目として酸
化させ、発生した光を再度60秒間に亘り測定した。各々
の試料管について放出された光の合計カウントを記録
し、これを表１に示す。この結果をまた、図１（ルミノ
ール放出）および図２（アクリジニウムエステル放出）
にグラフとして示す。
ムエステル単体、またはルミノールとジメチルアクリジ
ニウムエステルの混合物を含有する一連の試料（0.2 ｍ
ｌ）をポリスチレン管に配した。各試料に0.05ｍｌのミ
クロペルオキシダーゼ（ＭＰ−１１、シグマケミカル
社、水中で10ｕｇ／ｍｌ）を加え、ルミノールの光放出
酸化に触媒作用をうながした。全ての試料をＭＬＡ−１
中に配置して、0.3 ｍｌの0.3 ％の過酸化水素の注入に
より酸化させた。ＭＬＡ−１中の試薬を、試薬１（0.5
％の過酸化水素と0.1 Ｎの硝酸）および試薬２（0.25Ｎ
の水酸化ナトリウムと界面活性剤）（チバ コーニング
ダイアグノスティクス社）に変更した。同一の試料
を、試薬１と試薬２の連続の注入により２度目として酸
化させ、発生した光を再度60秒間に亘り測定した。各々
の試料管について放出された光の合計カウントを記録
し、これを表１に示す。この結果をまた、図１（ルミノ
ール放出）および図２（アクリジニウムエステル放出）
にグラフとして示す。
【００７８】
【表１】
【００７９】表１を参照すると、１度目の酸化、すなわ
ち、第１の化学処理条件後に放出された光（60秒間のカ
ウントとして表す）は、ルミノールの濃度に直接的に比
例した。結果はまた、10ｎｇ／ｍｌほどの高い濃度のア
クリジニウムエステルの存在はルミノールの測定を妨害
しなかった。すなわち、アクリジニウムエステルは第１
の処理条件中には相当な量の光を放出しなかった。同様
に、第２の処理条件後に放出された光のカウントは、混
合物中のアクリジニウムエステルの濃度に比例した。５
ｎｇ／ｍｌまでの濃度のルミノールの存在は、第１の処
理条件後に生じたカウントのわずかな分画に帰した。バ
ックグラウンドのカウント、すなわち、０ｎｇ／ｍｌで
放出された光を百分率の測定の前に引いた場合、２度目
の酸化後のルミノールによる放出光の寄与は、第１の処
理条件後に生じたカウントの約0.5 ％しか示さなかっ
た。これらの結果は、異なる処理条件を用いて、同一の
試料混合物中において正確に独立してルミノールまたは
関連混合物およびジメチルアクリジニウムエステルの標
識を測定する可能性を示す。他の組または多数の発光標
識検定の使用可能性を試験する同様の実験を行なっても
よい。
ち、第１の化学処理条件後に放出された光（60秒間のカ
ウントとして表す）は、ルミノールの濃度に直接的に比
例した。結果はまた、10ｎｇ／ｍｌほどの高い濃度のア
クリジニウムエステルの存在はルミノールの測定を妨害
しなかった。すなわち、アクリジニウムエステルは第１
の処理条件中には相当な量の光を放出しなかった。同様
に、第２の処理条件後に放出された光のカウントは、混
合物中のアクリジニウムエステルの濃度に比例した。５
ｎｇ／ｍｌまでの濃度のルミノールの存在は、第１の処
理条件後に生じたカウントのわずかな分画に帰した。バ
ックグラウンドのカウント、すなわち、０ｎｇ／ｍｌで
放出された光を百分率の測定の前に引いた場合、２度目
の酸化後のルミノールによる放出光の寄与は、第１の処
理条件後に生じたカウントの約0.5 ％しか示さなかっ
た。これらの結果は、異なる処理条件を用いて、同一の
試料混合物中において正確に独立してルミノールまたは
関連混合物およびジメチルアクリジニウムエステルの標
識を測定する可能性を示す。他の組または多数の発光標
識検定の使用可能性を試験する同様の実験を行なっても
よい。
【００８０】実施例２：イソルミノール誘導体のウサギガンマグロブリンへの接
合 イソルミノール誘導体標識をウサギガンマグロブリン
（ＲＧＧ）に接合する方法をここに記載する。
合 イソルミノール誘導体標識をウサギガンマグロブリン
（ＲＧＧ）に接合する方法をここに記載する。
【００８１】活性化 ５ミリグラムのＮ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチル
イソルミノール（ＡＢＥＩ）を１ｍｌのＤＭＦ（モメキ
ュラーシーブ上で乾燥させた）に加えた。ここに、0.06
ｍｌのＤＭＦ中の2.2 ｍｇのサクシン酸無水物、続いて
0.1 ｍｌのＤＭＦの1.8 ｍｇのトリエチルアミンを加え
た。
イソルミノール（ＡＢＥＩ）を１ｍｌのＤＭＦ（モメキ
ュラーシーブ上で乾燥させた）に加えた。ここに、0.06
ｍｌのＤＭＦ中の2.2 ｍｇのサクシン酸無水物、続いて
0.1 ｍｌのＤＭＦの1.8 ｍｇのトリエチルアミンを加え
た。
【００８２】混合物を70℃で1.5 時間に亘り加熱し、透
明な溶液を得た。この溶液を冷却し、ここに、0.025 ｍ
ｌのＤＭＦ中の3.7 ｍｇのジシクロヘキシルカルボジイ
ミドおよび0.025 ｍｌのＤＭＦ中の2.5 ｍｇのＮ−ヒド
ロキシ−サクシンイミドを加えた。この「活性化ＡＢＥ
Ｉ溶液」を２日間に亘り約４℃で貯蔵した。
明な溶液を得た。この溶液を冷却し、ここに、0.025 ｍ
ｌのＤＭＦ中の3.7 ｍｇのジシクロヘキシルカルボジイ
ミドおよび0.025 ｍｌのＤＭＦ中の2.5 ｍｇのＮ−ヒド
ロキシ−サクシンイミドを加えた。この「活性化ＡＢＥ
Ｉ溶液」を２日間に亘り約４℃で貯蔵した。
【００８３】カップリング ２ミリグラムのＲＧＧを１ｍｌの0.1 Ｍの炭酸塩／重炭
酸塩緩衝液、ｐＨ９中に溶解させ、0.1 ｍｌの活性化Ａ
ＢＥＩ溶液を撹拌しながら（vortexing ）加えた。混合
物を室温で２時間に亘り放置し、約４℃で一晩貯蔵し
た。
酸塩緩衝液、ｐＨ９中に溶解させ、0.1 ｍｌの活性化Ａ
ＢＥＩ溶液を撹拌しながら（vortexing ）加えた。混合
物を室温で２時間に亘り放置し、約４℃で一晩貯蔵し
た。
【００８４】セファデックスＧ２５を予備装填したＰＤ
−１０ゲル濾過カラム（ファーマシフ）上で非接合ＡＢ
ＥＩから接合体を分離し、ＰＢＳ（リン酸ナトリウム、
0.15Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ7.4 ）で溶出した。発光
材料の最初のピークを含有する分画をＲＧＧについての
発光免疫学的検定に使用するために組み合わせた。これ
を実施例３に記載する。
−１０ゲル濾過カラム（ファーマシフ）上で非接合ＡＢ
ＥＩから接合体を分離し、ＰＢＳ（リン酸ナトリウム、
0.15Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ7.4 ）で溶出した。発光
材料の最初のピークを含有する分画をＲＧＧについての
発光免疫学的検定に使用するために組み合わせた。これ
を実施例３に記載する。
【００８５】実施例３：ウサギガンマグロブリンについての発光検定 2.5 から200 ｕｇ／ｍｌの範囲の表２に示したような50
ｕｌの既知の濃度のＲＧＧ（ＰＢＳ／ＢＳＡ中で希釈し
た）（ＰＢＳは１ｍｌ当たり１ｍｇのウシ血清アルブミ
ンを含有する）を含有するポリスチレン管（ＲＧＧを含
有していないＰＢＳ／ＢＳＡ管を含む）に、ＰＢＳ／Ｂ
ＳＡ中で希釈した等量のＡＢＥＩ−ＲＧＧトレーサを加
え、約５×105 の非消光カウント（unquenched count）
を得た。グルタルアルデヒド活性化により常磁性粒子に
結合させた、100 マイクロリットルのＲＧＧに対して向
いた抗体（ＭＡｂ−抗ＲＧＧ）を各管に加えた。好まし
い実施態様において、ＰＢＳ／ＢＳＡにより、粒子に結
合した抗体の10ｍｇ／ｍｌの保存懸濁液を１：50まで希
釈することにより抗体溶液を調製した。反応管を撹拌し
（vortexed）、室温で１時間に亘り培養した。その後、
３分間の磁気分離を行ない、続いてデカンテーションし
た。次いで固相分画を1.0 ｍｌの水中に再懸濁させ、３
分間に亘り分離させ、３分間に亘ってデカンテーション
を行なった。次に、固相分画を含有する反応管に、100
マイクロリットルの水を加えた。
ｕｌの既知の濃度のＲＧＧ（ＰＢＳ／ＢＳＡ中で希釈し
た）（ＰＢＳは１ｍｌ当たり１ｍｇのウシ血清アルブミ
ンを含有する）を含有するポリスチレン管（ＲＧＧを含
有していないＰＢＳ／ＢＳＡ管を含む）に、ＰＢＳ／Ｂ
ＳＡ中で希釈した等量のＡＢＥＩ−ＲＧＧトレーサを加
え、約５×105 の非消光カウント（unquenched count）
を得た。グルタルアルデヒド活性化により常磁性粒子に
結合させた、100 マイクロリットルのＲＧＧに対して向
いた抗体（ＭＡｂ−抗ＲＧＧ）を各管に加えた。好まし
い実施態様において、ＰＢＳ／ＢＳＡにより、粒子に結
合した抗体の10ｍｇ／ｍｌの保存懸濁液を１：50まで希
釈することにより抗体溶液を調製した。反応管を撹拌し
（vortexed）、室温で１時間に亘り培養した。その後、
３分間の磁気分離を行ない、続いてデカンテーションし
た。次いで固相分画を1.0 ｍｌの水中に再懸濁させ、３
分間に亘り分離させ、３分間に亘ってデカンテーション
を行なった。次に、固相分画を含有する反応管に、100
マイクロリットルの水を加えた。
【００８６】50マイクロリットルのミクロペルオキシダ
ーゼ（ＭＰ−１１、シグマ、水中で10ｕｇ／ｍｌ）を各
管に加えた。次いで、全ての管をデカンター（ＭＬＡ−
１）に移し、0.01Ｍのリン酸ナトリウムｐＨ7.5 中の0.
3 ％の過酸化水素0.3 ｍｌを各管に注入し、各管中で放
出された光を10秒間に亘り測定した。結合カウント（co
unts bound）、すなわち、固相に結合したＡＢＥＩ標識
ＲＧＧに帰する光のカウントを表２に示す。
ーゼ（ＭＰ−１１、シグマ、水中で10ｕｇ／ｍｌ）を各
管に加えた。次いで、全ての管をデカンター（ＭＬＡ−
１）に移し、0.01Ｍのリン酸ナトリウムｐＨ7.5 中の0.
3 ％の過酸化水素0.3 ｍｌを各管に注入し、各管中で放
出された光を10秒間に亘り測定した。結合カウント（co
unts bound）、すなわち、固相に結合したＡＢＥＩ標識
ＲＧＧに帰する光のカウントを表２に示す。
【００８７】
【表２】
【００８８】表２および図３から分かるように、ＲＧＧ
の125 ｎｇまたは0.833 ｐモルに等しい、2.5 ｕｇ／ｍ
ｌのＲＧＧの添加は、固相に結合したＡＢＥＩ標識ＲＧ
Ｇの量が減少したことにより検出可能であった。
の125 ｎｇまたは0.833 ｐモルに等しい、2.5 ｕｇ／ｍ
ｌのＲＧＧの添加は、固相に結合したＡＢＥＩ標識ＲＧ
Ｇの量が減少したことにより検出可能であった。
【００８９】実施例４：Ｔ 4 についての発光検定 Ｔ4 についての発光検定は、この実施例の目的のために
変更した、チバ コーニング ダイアグノスティクス社
により販売されているマジックライトＴ4 検定キットの
型に基づいている。変更は、キットに含まれた２つの血
清ベースの標準物の代わりに、ＰＢＳ／ＢＳＡ中の、0.
5 から50ｕｇ／ｄｌの範囲のＴ4 標準物を使用すること
にある。この実施例に用いた他の試薬は、キットに含ま
れる試薬、すなわち、常磁性粒子に結合したＴ4 に対す
るモノクローナル抗体（ＭＡｂ−抗Ｔ4 ＰＭＰ）、およ
びジメチルアクリジニウムエステルＴ4 の懸濁液であ
る。
変更した、チバ コーニング ダイアグノスティクス社
により販売されているマジックライトＴ4 検定キットの
型に基づいている。変更は、キットに含まれた２つの血
清ベースの標準物の代わりに、ＰＢＳ／ＢＳＡ中の、0.
5 から50ｕｇ／ｄｌの範囲のＴ4 標準物を使用すること
にある。この実施例に用いた他の試薬は、キットに含ま
れる試薬、すなわち、常磁性粒子に結合したＴ4 に対す
るモノクローナル抗体（ＭＡｂ−抗Ｔ4 ＰＭＰ）、およ
びジメチルアクリジニウムエステルＴ4 の懸濁液であ
る。
【００９０】それ自身で行なうときには、以下の方法を
用いてＴ4 検定を行なう：検定する50ｕｌの試料、また
は50ｕｌのＴ4 標準溶液を含有するポリスチレン管に、
ＰＢＳ／ＢＳＡで希釈した、100 ｕｌのジメチルアクリ
ジニウムエステルＴ4 を加え、約５×105 カウントを得
る。500 マイクロリットルの常磁性粒子を各管に加え
る。反応管を撹拌し、室温で60分間に亘り培養する。こ
の間に、抗体は分析物またはアクリジニウムエステルＴ
4 に結合する。
用いてＴ4 検定を行なう：検定する50ｕｌの試料、また
は50ｕｌのＴ4 標準溶液を含有するポリスチレン管に、
ＰＢＳ／ＢＳＡで希釈した、100 ｕｌのジメチルアクリ
ジニウムエステルＴ4 を加え、約５×105 カウントを得
る。500 マイクロリットルの常磁性粒子を各管に加え
る。反応管を撹拌し、室温で60分間に亘り培養する。こ
の間に、抗体は分析物またはアクリジニウムエステルＴ
4 に結合する。
【００９１】試験混合物の溶性分画と不溶性分画への分
離は実施例３に記載したように行なう。次いで結合分析
物または標識分析物による、不溶性抗体のペレットを１
ｍｌの水中に再懸濁させて、非結合標識を洗い取る。粒
子を含有する抗体を再度３分間に亘り磁界において集積
し、水をデカンテーションして捨てた。最後に、粒子を
100 ｕｌの水中で再懸濁して、酸化反応と放出される光
の測定を行なうためにＭＬＡ−１に移す。
離は実施例３に記載したように行なう。次いで結合分析
物または標識分析物による、不溶性抗体のペレットを１
ｍｌの水中に再懸濁させて、非結合標識を洗い取る。粒
子を含有する抗体を再度３分間に亘り磁界において集積
し、水をデカンテーションして捨てた。最後に、粒子を
100 ｕｌの水中で再懸濁して、酸化反応と放出される光
の測定を行なうためにＭＬＡ−１に移す。
【００９２】ここに記載するような処理条件からなる試
薬１および試薬２を自動に注入するようにＭＬＡ−１を
プログラムする。試薬１を最初に、続いて試薬２を注入
する。各管中で放出される光を２秒間に亘り測定する。
抗体に結合したアクリジニウムエステル標識Ｔ4 を示
す、記録したカウントは、試料中のＴ4 が増加すると減
少する逆の関係を有する。
薬１および試薬２を自動に注入するようにＭＬＡ−１を
プログラムする。試薬１を最初に、続いて試薬２を注入
する。各管中で放出される光を２秒間に亘り測定する。
抗体に結合したアクリジニウムエステル標識Ｔ4 を示
す、記録したカウントは、試料中のＴ4 が増加すると減
少する逆の関係を有する。
【００９３】実施例５：ウサギガンマグロブリンおよびＴ 4 についての二重発光
標識検定 二重標識発光免疫学的検定とは、同一容器中において２
つの発光免疫学的検定を行なうことを意味する。この実
施例において、ＲＧＧ抗原についてのイソルミノールベ
ースの検定を、Ｔ4 抗原についてのアリジニウムエステ
ルベースの検定と組み合わせた。
標識検定 二重標識発光免疫学的検定とは、同一容器中において２
つの発光免疫学的検定を行なうことを意味する。この実
施例において、ＲＧＧ抗原についてのイソルミノールベ
ースの検定を、Ｔ4 抗原についてのアリジニウムエステ
ルベースの検定と組み合わせた。
【００９４】二重発光標識免疫学的検定のための試薬
を、以下の順番でポリスチレン管に加えた：ＲＧＧ標準
物およびＡＢＥＩ標識ＲＧＧ、Ｔ4 標準物およびアクリ
ジニウムエステルＴ4 、並びに常磁性粒子に結合した２
つの不溶性抗体。管を撹拌し、60分間に亘り培養し、Ｒ
ＧＧとＴ4 についての個々の検定に記載したように、常
磁性粒子を分離し、洗浄し、再懸濁した。50マイクロリ
ットルの10ｕｇ／ｍｌマイクロペルオキシダーゼを各管
に加えた。その後、管をＭＬＡ−１中に配置し、0.3 ｍ
ｌの0.3 ％の過酸化水素溶液を各管に注入した。ＡＢＥ
Ｉ標識ＲＧＧの酸化により放出した光を10秒間に亘り集
積した。試薬１、続いて試薬２を同一の一連の管に注入
した。試薬１と試薬２への露出によりジメチルアクリジ
ニウムＴ4により放出された光を10秒間に亘り集積し
た。
を、以下の順番でポリスチレン管に加えた：ＲＧＧ標準
物およびＡＢＥＩ標識ＲＧＧ、Ｔ4 標準物およびアクリ
ジニウムエステルＴ4 、並びに常磁性粒子に結合した２
つの不溶性抗体。管を撹拌し、60分間に亘り培養し、Ｒ
ＧＧとＴ4 についての個々の検定に記載したように、常
磁性粒子を分離し、洗浄し、再懸濁した。50マイクロリ
ットルの10ｕｇ／ｍｌマイクロペルオキシダーゼを各管
に加えた。その後、管をＭＬＡ−１中に配置し、0.3 ｍ
ｌの0.3 ％の過酸化水素溶液を各管に注入した。ＡＢＥ
Ｉ標識ＲＧＧの酸化により放出した光を10秒間に亘り集
積した。試薬１、続いて試薬２を同一の一連の管に注入
した。試薬１と試薬２への露出によりジメチルアクリジ
ニウムＴ4により放出された光を10秒間に亘り集積し
た。
【００９５】表３に示した結果は、組合せ二重発光標識
免疫学的検定におけるＲＧＧ分析物についての検定感度
は、実施例３に示した単一のＲＧＧ検定について観察さ
れた感度とほぼ等しいことが分かった。同様に、組合せ
Ｔ4 二重発光標識免疫学的検定におけるＴ4 分析物につ
いての検定感度は、実施例４に示した単一のＴ4 検定に
ついて報告された感度とほぼ等しかった。
免疫学的検定におけるＲＧＧ分析物についての検定感度
は、実施例３に示した単一のＲＧＧ検定について観察さ
れた感度とほぼ等しいことが分かった。同様に、組合せ
Ｔ4 二重発光標識免疫学的検定におけるＴ4 分析物につ
いての検定感度は、実施例４に示した単一のＴ4 検定に
ついて報告された感度とほぼ等しかった。
【００９６】
【表３】
【００９７】ＲＧＧとＴ4 についての二重発光検定を用
いて、既知の濃度でのＲＧＧとＴ4を含有する一連の模
擬の「未知」混合物中にＲＧＧとＴ4 の濃度を測定し
た。表４に示すように、Ｔ4 およびＲＧＧの相対濃度を
選択して、ある分析物の測定において、別の分析物によ
り検定干渉を最大にした。すなわち、ある分析物の高濃
度の存在下において、低濃度の別の分析物を測定した。
いて、既知の濃度でのＲＧＧとＴ4を含有する一連の模
擬の「未知」混合物中にＲＧＧとＴ4 の濃度を測定し
た。表４に示すように、Ｔ4 およびＲＧＧの相対濃度を
選択して、ある分析物の測定において、別の分析物によ
り検定干渉を最大にした。すなわち、ある分析物の高濃
度の存在下において、低濃度の別の分析物を測定した。
【００９８】
【表４】
【００９９】「未知」混合物中の各分析物の量を、二重
発光標識検定における各分析物について作成した標準曲
線を用いて測定した（図４は、ＲＧＧについて得られた
標準曲線を示す；図５は、Ｔ4 について得られた標準曲
線を示す）。各々の分析物の実験的に測定した濃度を表
５の既知の濃度と比較する。
発光標識検定における各分析物について作成した標準曲
線を用いて測定した（図４は、ＲＧＧについて得られた
標準曲線を示す；図５は、Ｔ4 について得られた標準曲
線を示す）。各々の分析物の実験的に測定した濃度を表
５の既知の濃度と比較する。
【０１００】
【表５】
【０１０１】表５に示す結果は、二重発光接合体検定に
より同一の検定管中の２つの別々の分析物を正確に独立
して測定したことを示す。
より同一の検定管中の２つの別々の分析物を正確に独立
して測定したことを示す。
【０１０２】実施例６：黄体形成ホルモン（ＬＨ）および卵胞刺激ホルモン（Ｆ
ＳＨ）についての同時検定 その濃度を測定する、ＬＨおよびＦＳＨを含有する試料
のアリコート（例えば100 ｕｌ）を、ＤＭＡＥで標識し
たＬＨに対する抗体と、イソルミノール誘導体、例えば
ＡＢＥＩで標識したＦＳＨに対する抗体とを含有するあ
る量（例えば100 ｕｌ）の緩衝液と混合する。混合物を
所定の時間（例えば30分間）に亘り培養させる。その間
に標識した抗体はＬＨおよびＦＳＨと結合する。結合し
たＬＨに対する抗体を有するある量の磁性粒子と、結合
したＦＳＨに対する抗体を有するある量の磁性粒子とを
含有する所定の量の（例えば500 ｕｌ）緩衝液を加え
る。さらに、培養（例えば30分間）を行なう。その間に
それぞれ標識された抗体とＬＨおよびＦＳＨとの複合体
は、磁性粒子上の対応する抗体により次々に結合せしめ
られる。次いで磁性粒子を、磁界を適応することによ
り、培養管の底に集積し、上澄液をデカンテーション
し、捨てる。粒子を水中で再懸濁し、磁界の適応により
再度集積する。上澄洗浄液をデカンテーションし、捨て
る。
ＳＨ）についての同時検定 その濃度を測定する、ＬＨおよびＦＳＨを含有する試料
のアリコート（例えば100 ｕｌ）を、ＤＭＡＥで標識し
たＬＨに対する抗体と、イソルミノール誘導体、例えば
ＡＢＥＩで標識したＦＳＨに対する抗体とを含有するあ
る量（例えば100 ｕｌ）の緩衝液と混合する。混合物を
所定の時間（例えば30分間）に亘り培養させる。その間
に標識した抗体はＬＨおよびＦＳＨと結合する。結合し
たＬＨに対する抗体を有するある量の磁性粒子と、結合
したＦＳＨに対する抗体を有するある量の磁性粒子とを
含有する所定の量の（例えば500 ｕｌ）緩衝液を加え
る。さらに、培養（例えば30分間）を行なう。その間に
それぞれ標識された抗体とＬＨおよびＦＳＨとの複合体
は、磁性粒子上の対応する抗体により次々に結合せしめ
られる。次いで磁性粒子を、磁界を適応することによ
り、培養管の底に集積し、上澄液をデカンテーション
し、捨てる。粒子を水中で再懸濁し、磁界の適応により
再度集積する。上澄洗浄液をデカンテーションし、捨て
る。
【０１０３】粒子を少量の（例えば100 ｕｌ）水中に再
懸濁させる。そこに、マイクロペルオキシダーゼの溶液
（例えば、50ｕｌの10ｕｇ／ｍｌの溶液）を加える。反
応管を順番にルミノメータ中に配置する。過酸化水素
（リン酸緩衝液中0.3 ％、ｐＨ7.4 ）を注入し、放出さ
れる光を数秒間に亘り（例えば５秒間）測定する。この
測定は、磁気粒子に結合したイソルミノール標識ＦＳＨ
抗体の量を示し、したがって、試料中のＦＳＨの量に関
係する。次に、同一の管中に試薬１および試薬２を注入
し、続いて放出される光を測定する。この２回目の測定
は、粒子に結合したＤＭＡＥ標識ＬＨ抗体の量を示し、
したがって、試料中のＬＨの量に関係する。定量した発
光標識の量は、試料中のＬＨまたはＦＳＨの量に比例す
る量で減少する。
懸濁させる。そこに、マイクロペルオキシダーゼの溶液
（例えば、50ｕｌの10ｕｇ／ｍｌの溶液）を加える。反
応管を順番にルミノメータ中に配置する。過酸化水素
（リン酸緩衝液中0.3 ％、ｐＨ7.4 ）を注入し、放出さ
れる光を数秒間に亘り（例えば５秒間）測定する。この
測定は、磁気粒子に結合したイソルミノール標識ＦＳＨ
抗体の量を示し、したがって、試料中のＦＳＨの量に関
係する。次に、同一の管中に試薬１および試薬２を注入
し、続いて放出される光を測定する。この２回目の測定
は、粒子に結合したＤＭＡＥ標識ＬＨ抗体の量を示し、
したがって、試料中のＬＨの量に関係する。定量した発
光標識の量は、試料中のＬＨまたはＦＳＨの量に比例す
る量で減少する。
【０１０４】未知の試料中のＦＳＨおよびＬＨの実際の
濃度は、同一の検定方法を行なった、既知の量のＦＳＨ
およびＬＨを含有する標準物から放出された光の量を参
照して計算される。
濃度は、同一の検定方法を行なった、既知の量のＦＳＨ
およびＬＨを含有する標準物から放出された光の量を参
照して計算される。
【０１０５】上記実施例は、２つの異なる物質の検出ま
たは定量に関して、両者とも直接検定形式または間接
（競合）検定形式により行なっているが、いずれか一方
を直接検定形式により行ない、他方を間接検定形式によ
り行なってもよいことが、当業者には容易に理解されよ
う。
たは定量に関して、両者とも直接検定形式または間接
（競合）検定形式により行なっているが、いずれか一方
を直接検定形式により行ない、他方を間接検定形式によ
り行なってもよいことが、当業者には容易に理解されよ
う。
【０１０６】当業者にとって、様々な他の変更が明確で
あり、本発明の範囲および材料から逸脱することなく、
この開示により、そのような変更が容易にできることが
理解されよう。しかしながら、請求の範囲は、ここに記
載した内容に制限されるものではなく、むしろ当業者に
より本発明が保持する特性と等しく扱われる全ての特性
を含む、本発明が帰する特許性の新規の特性を包含する
ものとして構成されることを意図するものである。ま
た、実施例は本発明を説明することを意図したものであ
り、制限することを意図したものではないことに注意さ
れたい。
あり、本発明の範囲および材料から逸脱することなく、
この開示により、そのような変更が容易にできることが
理解されよう。しかしながら、請求の範囲は、ここに記
載した内容に制限されるものではなく、むしろ当業者に
より本発明が保持する特性と等しく扱われる全ての特性
を含む、本発明が帰する特許性の新規の特性を包含する
ものとして構成されることを意図するものである。ま
た、実施例は本発明を説明することを意図したものであ
り、制限することを意図したものではないことに注意さ
れたい。
【図１】所定の濃度のミクロペルオキシダーゼを加えた
様々な濃度のルミノールを含有する溶液の、0.3 ％の過
酸化水素の添加による光放出のグラフ、並びに、同一の
試料へのマジックライト試薬１および試薬２の続いての
添加による光放出のグラフ；（実施例１）
様々な濃度のルミノールを含有する溶液の、0.3 ％の過
酸化水素の添加による光放出のグラフ、並びに、同一の
試料へのマジックライト試薬１および試薬２の続いての
添加による光放出のグラフ；（実施例１）
【図２】所定の濃度のミクロペルオキシダーゼを加えた
様々な濃度のＤＭＡＥを含有する溶液の、0.3 ％の過酸
化水素の添加による光放出のグラフ、並びに、同一の試
料へのマジックライト試薬１および試薬２の続いての添
加による光放出のグラフ；（実施例１）
様々な濃度のＤＭＡＥを含有する溶液の、0.3 ％の過酸
化水素の添加による光放出のグラフ、並びに、同一の試
料へのマジックライト試薬１および試薬２の続いての添
加による光放出のグラフ；（実施例１）
【図３】本発明の発光標識検定によるＲＧＧの測定のた
めの標準曲線；（実施例３）
めの標準曲線；（実施例３）
【図４】二重発光標識免疫学的検定によるＲＧＧの測定
のための標準曲線；（実施例５）
のための標準曲線；（実施例５）
【図５】二重発光標識免疫学的検定によるＴ4 の測定の
ための標準曲線；（実施例５）
ための標準曲線；（実施例５）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハワード エイチ ウィートール アメリカ合衆国 メリーランド州 20852 ロックヴィル テンプルトン プレース 1329 (72)発明者 ジョゼフ イー コノリー アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02026 デッダム ドワイト ストリート 51
Claims (34)
- 【請求項１】 試験試料中の少なくとも２つの物質の各
々を検出または定量する方法であって、 前記試験試料を少なくとも２つの異なる発光接合体と混
合して光を放出する少なくとも２つの異なる処理条件下
で活性化し得る複合体を形成することにより試験反応混
合物を調製し、 前記異なる処理条件を施すことにより、前記物質の各々
を検出または定量する各工程からなることを特徴とする
方法。 - 【請求項２】 前記複合体を分離する工程を含むことを
特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記物質が、１つ以上の抗原と、抗体
と、ハプテンと、ホルモンと、受容体と、核酸と、核酸
プローブと、毒素と、有機化学物質と、薬物と、感染剤
と、内部参照材料または対照材料とからなる群より選択
されることを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 前記処理条件が化学手段による酸化処理
を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 少なくとも１つの酸化工程が触媒および
適切なｐＨを使用するものであることを特徴とする請求
項４記載の方法。 - 【請求項６】 前記試験試料に内部参照材料または対照
材料を加えることを含むことを特徴とする請求項１記載
の方法。 - 【請求項７】 前記発光接合体が、ルミノール、イソル
ミノールおよびその誘導体、アクリジニウムエステル、
並びにベンズアクリジニウムエステルからなる群より選
択される標識を含むことを特徴とする請求項１記載の方
法。 - 【請求項８】 発光標識が酸化により活性化されて光を
放出できることを特徴とする請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 化学処理条件が酸化条件であり、前記放
出される光が１度目の酸化工程後および再度２度目の酸
化工程後に測定されて試験試料中の少なくとも２つの物
質を検出または定量することを特徴とする請求項８記載
の方法。 - 【請求項１０】 前記１度目の酸化工程後に活性化され
る発光標識がＮ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイ
ソルミノールであり、前記２度目の酸化工程後に活性化
される発光標識がジメチルアクリジニウムエステルであ
ることを特徴とする請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 前記発光接合体の各々が、検出または
定量される物質の結合パートナーまたは競合体、並びに
標識を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項１２】 前記処理条件のうちの少なくとも２つ
が同一であり、前記処理条件による光放出が区別できる
ことを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項１３】 試験試料中の少なくとも２つの物質の
各々を検出または定量する方法であって、前記試験試料
と少なくとも２つの異なる発光標識を有する少なくとも
２つの異なる発光接合体を混合して少なくとも２つの処
理条件下で活性化し得る複合体を形成することにより試
験混合物を調製し、その際、前記処理条件の各々を順番
に施すことができるようにそれら処理条件の各々は区別
可能のものとし、第１の処理条件を施した後に前記物質
の一方をまず検出または定量し、次いで他方の処理条件
を施した後に前記物質の他方を検出または定量する各工
程からなることを特徴とする方法。 - 【請求項１４】 前記物質が、抗原と、抗体と、ハプテ
ンと、ホルモンと、受容体と、核酸と、核酸プローブ
と、毒素と、有機化学物質と、薬物と、感染剤と、内部
参照材料または対照材料とからなる群より選択されるこ
とを特徴とする請求項１３記載の方法。 - 【請求項１５】 前記処理条件が化学手段による酸化処
理を含むことを特徴とする請求項１３記載の方法。 - 【請求項１６】 少なくとも１つの酸化工程が触媒およ
び適切なｐＨを使用するものであることを特徴とする請
求項１５記載の方法。 - 【請求項１７】 前記試験試料に内部参照材料または対
照材料を加えることを含むことを特徴とする請求項１３
記載の方法。 - 【請求項１８】 前記発光標識が酸化により活性化さ
れ、光を放出できることを特徴とする請求項１３記載の
方法。 - 【請求項１９】 前記放出される光が１度目の酸化工程
後および再度２度目の酸化工程後に測定されて試験試料
中の少なくとも２つの物質の各々を検出または定量する
ことを特徴とする請求項１８記載の方法。 - 【請求項２０】 前記１度目の酸化工程後に活性化し得
る前記発光標識がＮ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチ
ルイソルミノールを含み、前記２度目の酸化工程後に活
性化し得る前記発光標識がジメチルアクリジニウムエス
テルを含むことを特徴とする請求項１９記載の方法。 - 【請求項２１】 試験試料中の少なくとも２つの物質を
検出または定量する方法であって、 (a) (i) 少なくとも第１の物質および第２の物質を含
有する試料と、(ii) 前記第１の物質に特異的に結合で
きる第１の結合パートナーであって、該第１の結合パー
トナーは標識されていてもいなくてもよく、該第１の結
合パートナーが標識されている場合にはその標識が第１
の発光標識であり、前記第１の結合パートナーが標識さ
れていない場合には試験混合物は前記第１の物質に対す
る標識された第１の競合体を含むと共にこの標識が第１
の発光標識である、第１の結合パートナーと、(iii) 前
記第２の物質に特異的に結合できる第２の結合パートナ
ーであって、該第２の結合パートナーは標識されていて
もいなくてもよく、該第２の結合パートナーが標識され
ている場合にはその標識が第２の発光標識であり、前記
第２の結合パートナーが標識されていない場合には試験
混合物は前記第２の物質に対する標識された第２の競合
体を含むと共にこの標識が第２の発光標識である、第２
の結合パートナーと、からなる試験混合物を調製し、 (b) 前記第１の物質に結合した前記標識された第１の結
合パートナー、または前記標識された第１の競合体に結
合した前記標識されていない第１の結合パートナーから
なる第１の複合体、および前記第２の物質に結合した前
記標識された第２の結合パートナー、または前記標識さ
れた第２の競合体に結合した前記標識されていない第２
の結合パートナーからなる第２の複合体を形成するのに
十分な時間と条件下で、前記試験混合物を反応させ、 (c) 少なくとも２つの異なる処理条件を用いて前記第１
および第２の発光標識を活性化することにより前記第１
の複合体および前記第２の複合体を検出または定量して
前記第１および第２の物質を検出または定量する、各工
程からなることを特徴とする方法。 - 【請求項２２】 前記第１および第２の複合体が固体支
持体に結合されることを特徴とする請求項２１記載の方
法。 - 【請求項２３】 前記方法が分離工程を含むことを特徴
とする請求項２２記載の方法。 - 【請求項２４】 前記固体支持体が、常磁性粒子、ラテ
ックス粒子、シリカ粒子、ガラス粒子、セルロース粒
子、試験管、細胞、ポリアクリルアミド、アガロース、
クロマトグラフ支持材料、マイクロタイタ ウェル、お
よび膜からなる群より選択されることを特徴とする請求
項２２記載の方法。 - 【請求項２５】 前記試験試料に内部参照材料または対
照材料を加えることを含むことを特徴とする請求項２１
記載の方法。 - 【請求項２６】 前記第１および第２の発光標識が酸化
により活性化され、光を放出できることを特徴とする請
求項２１記載の方法。 - 【請求項２７】 前記放出される光を第１の酸化工程後
と再度第２の酸化工程後に測定して、前記物質、参照材
料または対照材料の各々を検出または定量することを特
徴とする請求項２６記載の方法。 - 【請求項２８】 前記第１の発光標識および前記第２の
発光標識が異なる化学処理条件下で活性化でき、前記試
験混合物を前記異なる化学処理条件にさらすことによ
り、前記物質の各々を測定することを特徴とする請求項
２１記載の方法。 - 【請求項２９】 少なくとも１つの酸化工程が触媒およ
び適切なｐＨを使用するものであることを特徴とする請
求項２７記載の方法。 - 【請求項３０】 前記物質が、抗原と、抗体と、ハプテ
ンと、ホルモンと、受容体と、核酸と、核酸プローブ
と、毒素と、有機化学物質と、薬物と、感染剤と、内部
参照材料または対照材料とからなる群より選択されるこ
とを特徴とする請求項２１記載の方法。 - 【請求項３１】 前記発光標識が、ルミノール、イソル
ミノールおよびその誘導体、アクリジニウムエステル、
並びにベンズアクリジニウムエステルからなる群より選
択されることを特徴とする請求項２１記載の方法。 - 【請求項３２】 前記第１の発光標識がＮ−（４−アミ
ノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノールを含み、前記第
２の発光標識がジメチルアクリジニウムエステルまたは
ベンズアクリジニウムエステルを含むことを特徴とする
請求項３１記載の方法。 - 【請求項３３】 異なる発光標識が複数の物質の各々ま
たは該物質に対する競合体に結合され、前記発光標識の
各々により放出される光が複数の酸化反応後に測定され
る、試験試料中における多重発光標識検定を行なう方法
であって、 複数の異なる発光標識化された複合体を前記試験試料中
に形成し、複数の酸化反応を行なわせ、前記酸化反応の
各々に応答して前記物質の各々を検出または定量するこ
とからなることを特徴とする方法。 - 【請求項３４】 試験試料中の複数の物質の有無を検出
またはそれら物質を定量するキットであって、 少なくとも２つの異なる発光接合体を含み、該接合体が
少なくとも２つの異なる処理条件下で活性化し得ること
を特徴とするキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US5861793A | 1993-05-06 | 1993-05-06 | |
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