JPH0829419A - 抗原性物質の検出方法 - Google Patents
抗原性物質の検出方法Info
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- JPH0829419A JPH0829419A JP18385394A JP18385394A JPH0829419A JP H0829419 A JPH0829419 A JP H0829419A JP 18385394 A JP18385394 A JP 18385394A JP 18385394 A JP18385394 A JP 18385394A JP H0829419 A JPH0829419 A JP H0829419A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 優れた検出感度を発揮する，抗原性物質の検
出方法を提供すること。 【構成】 第一抗体成分１１と第二抗体成分１２とを結
合してリンカー二価抗体１を調製する。次に，第一抗体
成分１１に，第一ハプテン２１を介して，抗原性物質２
を特異的に結合させる。また，第二抗体成分１２には，
第二ハプテン７２で標識したアルカリホスファターゼ７
を特異的に結合させる。次に，アルカリホスファターゼ
７に，その基質である蛍光物質３を反応させて，シグナ
ルを発生させ，これを検出する。
出方法を提供すること。 【構成】 第一抗体成分１１と第二抗体成分１２とを結
合してリンカー二価抗体１を調製する。次に，第一抗体
成分１１に，第一ハプテン２１を介して，抗原性物質２
を特異的に結合させる。また，第二抗体成分１２には，
第二ハプテン７２で標識したアルカリホスファターゼ７
を特異的に結合させる。次に，アルカリホスファターゼ
７に，その基質である蛍光物質３を反応させて，シグナ
ルを発生させ，これを検出する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は，核酸，タンパク質等の
抗原性物質を検出する方法に関し，特に抗原性物質を抗
体を介して蛍光物質と結合させる方法に関する。
抗原性物質を検出する方法に関し，特に抗原性物質を抗
体を介して蛍光物質と結合させる方法に関する。
【０００２】
【従来技術】ある特定の塩基配列を有する核酸ＤＮＡを
検出する方法としては，図７に示すごとく，核酸ＤＮＡ
９１に，ビオチン９３により標識したプローブ遺伝子９
２を結合させ，次に，このプローブ遺伝子９２に過剰の
ストレプトアビジン９４を抗原抗体反応により結合さ
せ，更に，結合したストレプトアビジン９４の残存活性
部位にビオチン化酵素９５を結合させ，その酵素活性を
検出する方法がある。この検出方法は，一般に，溶液
中，フィルター，又は生体組織中で行われる。
検出する方法としては，図７に示すごとく，核酸ＤＮＡ
９１に，ビオチン９３により標識したプローブ遺伝子９
２を結合させ，次に，このプローブ遺伝子９２に過剰の
ストレプトアビジン９４を抗原抗体反応により結合さ
せ，更に，結合したストレプトアビジン９４の残存活性
部位にビオチン化酵素９５を結合させ，その酵素活性を
検出する方法がある。この検出方法は，一般に，溶液
中，フィルター，又は生体組織中で行われる。
【０００３】
【解決しようとする課題】しかしながら，上記従来の検
出方法においては，図７の右方部分に示すごとく，スト
レプトアビジン９４（Ｓ）の活性部位のすべてに，プロ
ーブ遺伝子９２上のビオチン９３（Ｂ）が結合してしま
い，ビオチン化酵素９５（Ｅ）がストレプトアビジン９
４に結合しないおそれがある。
出方法においては，図７の右方部分に示すごとく，スト
レプトアビジン９４（Ｓ）の活性部位のすべてに，プロ
ーブ遺伝子９２上のビオチン９３（Ｂ）が結合してしま
い，ビオチン化酵素９５（Ｅ）がストレプトアビジン９
４に結合しないおそれがある。
【０００４】この場合には，検出感度が劣化し，核酸Ｄ
ＮＡの正確な検出をすることが困難である。また，ある
特定のアミノ酸配列を有するタンパク質を検出する方法
においても，上記と同様の問題がある。
ＮＡの正確な検出をすることが困難である。また，ある
特定のアミノ酸配列を有するタンパク質を検出する方法
においても，上記と同様の問題がある。
【０００５】本発明はかかる従来の問題点に鑑み，優れ
た検出感度を発揮する，抗原性物質の検出方法を提供し
ようとするものである。
た検出感度を発揮する，抗原性物質の検出方法を提供し
ようとするものである。
【０００６】
【課題の解決手段】本発明は，抗原性物質に特異的に結
合する第一抗体成分と，シグナル物質に特異的に結合す
る第二抗体成分とを予め結合させて二価抗体リンカーを
調製し，次に，該二価抗体リンカーの第一抗体成分に抗
原性物質を結合させると共に，上記二価抗体リンカーの
第二抗体成分にシグナル物質を結合させ，次に，シグナ
ル物質よりシグナルを発生させて，該シグナルを検出す
ることを特徴とする抗原性物質の検出方法にある。
合する第一抗体成分と，シグナル物質に特異的に結合す
る第二抗体成分とを予め結合させて二価抗体リンカーを
調製し，次に，該二価抗体リンカーの第一抗体成分に抗
原性物質を結合させると共に，上記二価抗体リンカーの
第二抗体成分にシグナル物質を結合させ，次に，シグナ
ル物質よりシグナルを発生させて，該シグナルを検出す
ることを特徴とする抗原性物質の検出方法にある。
【０００７】本発明において最も注目すべきことは，抗
原性物質に特異的に結合する第一抗体成分と，シグナル
物質に特異的に結合する第二抗体成分とを結合してなる
二価抗体リンカーを用いていることである。
原性物質に特異的に結合する第一抗体成分と，シグナル
物質に特異的に結合する第二抗体成分とを結合してなる
二価抗体リンカーを用いていることである。
【０００８】上記二価抗体リンカーは，上記第一抗体成
分と上記第二抗体成分とよりなる二価の活性部位を有し
ている。第一抗体成分及び第二抗体成分は，それぞれ抗
原性物質及びシグナル物質に対して特異的に結合する部
位である。
分と上記第二抗体成分とよりなる二価の活性部位を有し
ている。第一抗体成分及び第二抗体成分は，それぞれ抗
原性物質及びシグナル物質に対して特異的に結合する部
位である。
【０００９】上記第一抗体成分は，例えば第一ハプテン
を介して抗原性物質と特異的に結合している。かかる第
一ハプテンとしては，例えば，ｂｉｏｔｉｎ（ビオチ
ン），ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ディゴキシゲニン），
ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ（ＤＮＰ）（ジニトロフェ
ノール），ｔｒｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ（ＴＮＰ）
（トリニトロフェノール），ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ
（フルオレセイン），ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄ
ａｍｉｎｅ Ｂ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＴＲ
ＩＴＣ）（テトラメチルローダミン Ｂ イソチオシア
ネート），ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ローダミン），Ｔｅｘ
ａｓ Ｒｅｄ（テキサス レッド），Ｌｕｃｉｆｅｒ
Ｙｅｌｌｏｗ（ルシフェル イエロー），４，４−ｄｉ
ｆｌｕｏｒｏ−５，７−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４−ｂｏｒ
ａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄａｃｅｎｅ−
３−ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ（ＢＯＤＩＰＹ）（４，４−ジ
フルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−
ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル），７−ｎ
ｉｔｒｏｂｅｎｚ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏｌ
−４−ｙｌ（ＮＢＤ）（７−ニトロベンズ−２−オキサ
−１，３−ジアゾール−４−イル），（ｏ−１１−（５
−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ
−１−ｓｕｌｆｏｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）ｕｎｄｅｃｙｌ
（ｄａｎｓｙｌ）（ダンシル），ｃｏｕｍａｒｉｎ（ク
マリン），ＤＮＡ，ＲＮＡ，又はウイルス等を用いるこ
とができる。
を介して抗原性物質と特異的に結合している。かかる第
一ハプテンとしては，例えば，ｂｉｏｔｉｎ（ビオチ
ン），ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ディゴキシゲニン），
ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ（ＤＮＰ）（ジニトロフェ
ノール），ｔｒｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ（ＴＮＰ）
（トリニトロフェノール），ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ
（フルオレセイン），ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄ
ａｍｉｎｅ Ｂ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＴＲ
ＩＴＣ）（テトラメチルローダミン Ｂ イソチオシア
ネート），ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ローダミン），Ｔｅｘ
ａｓ Ｒｅｄ（テキサス レッド），Ｌｕｃｉｆｅｒ
Ｙｅｌｌｏｗ（ルシフェル イエロー），４，４−ｄｉ
ｆｌｕｏｒｏ−５，７−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４−ｂｏｒ
ａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄａｃｅｎｅ−
３−ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ（ＢＯＤＩＰＹ）（４，４−ジ
フルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−
ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル），７−ｎ
ｉｔｒｏｂｅｎｚ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏｌ
−４−ｙｌ（ＮＢＤ）（７−ニトロベンズ−２−オキサ
−１，３−ジアゾール−４−イル），（ｏ−１１−（５
−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ
−１−ｓｕｌｆｏｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）ｕｎｄｅｃｙｌ
（ｄａｎｓｙｌ）（ダンシル），ｃｏｕｍａｒｉｎ（ク
マリン），ＤＮＡ，ＲＮＡ，又はウイルス等を用いるこ
とができる。
【００１０】例えば，第一ハプテンがビオチンの場合に
は，上記第一抗体成分としては抗ビオチン抗体又はスト
レプトアビジンを用いることができる。ストレプトアビ
ジンは，抗ビオチン抗体と同様にビオチンと特異的に結
合する物質であるため，ビオチンの抗体として働く物質
である。また，第一ハプテンがディゴキシゲニンの場合
には，上記第一抗体成分としては抗ディゴキシゲニン抗
体を用いることができる。第一ハプテンがＤＮＰの場合
には，上記第一抗体成分としては抗ＤＮＰ抗体を用いる
ことができる。
は，上記第一抗体成分としては抗ビオチン抗体又はスト
レプトアビジンを用いることができる。ストレプトアビ
ジンは，抗ビオチン抗体と同様にビオチンと特異的に結
合する物質であるため，ビオチンの抗体として働く物質
である。また，第一ハプテンがディゴキシゲニンの場合
には，上記第一抗体成分としては抗ディゴキシゲニン抗
体を用いることができる。第一ハプテンがＤＮＰの場合
には，上記第一抗体成分としては抗ＤＮＰ抗体を用いる
ことができる。
【００１１】上記第二抗体成分は，例えば第二ハプテン
を介してシグナル物質と特異的に結合している。かかる
第二ハプテンとしては，例えば，ｂｉｏｔｉｎ（ビオチ
ン），ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ディゴキシゲニン），
ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ（ＤＮＰ）（ジニトロフェ
ノール），ｔｒｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ（ＴＮＰ）
（トリニトロフェノール），ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ
（フルオレセイン），ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄ
ａｍｉｎｅ Ｂ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＴＲ
ＩＴＣ）（テトラメチルローダミン Ｂ イソチオシア
ネート），ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ローダミン），Ｔｅｘ
ａｓ Ｒｅｄ（テキサス レッド），Ｌｕｃｉｆｅｒ
Ｙｅｌｌｏｗ（ルシフェル イエロー），４，４−ｄｉ
ｆｌｕｏｒｏ−５，７−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４−ｂｏｒ
ａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄａｃｅｎｅ−
３−ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ（ＢＯＤＩＰＹ）（４，４−ジ
フルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−
ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル），７−ｎ
ｉｔｒｏｂｅｎｚ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏｌ
−４−ｙｌ（ＮＢＤ）（７−ニトロベンズ−２−オキサ
−１，３−ジアゾール−４−イル），（ｏ−１１−（５
−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ
−１−ｓｕｌｆｏｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）ｕｎｄｅｃｙｌ
（ｄａｎｓｙｌ）（ダンシル），ｃｏｕｍａｒｉｎ（ク
マリン），ＤＮＡ，ＲＮＡ，又はウイルス等を用いるこ
とができる。
を介してシグナル物質と特異的に結合している。かかる
第二ハプテンとしては，例えば，ｂｉｏｔｉｎ（ビオチ
ン），ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ディゴキシゲニン），
ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ（ＤＮＰ）（ジニトロフェ
ノール），ｔｒｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ（ＴＮＰ）
（トリニトロフェノール），ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ
（フルオレセイン），ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄ
ａｍｉｎｅ Ｂ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＴＲ
ＩＴＣ）（テトラメチルローダミン Ｂ イソチオシア
ネート），ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ローダミン），Ｔｅｘ
ａｓ Ｒｅｄ（テキサス レッド），Ｌｕｃｉｆｅｒ
Ｙｅｌｌｏｗ（ルシフェル イエロー），４，４−ｄｉ
ｆｌｕｏｒｏ−５，７−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４−ｂｏｒ
ａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄａｃｅｎｅ−
３−ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ（ＢＯＤＩＰＹ）（４，４−ジ
フルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−
ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル），７−ｎ
ｉｔｒｏｂｅｎｚ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏｌ
−４−ｙｌ（ＮＢＤ）（７−ニトロベンズ−２−オキサ
−１，３−ジアゾール−４−イル），（ｏ−１１−（５
−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ
−１−ｓｕｌｆｏｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）ｕｎｄｅｃｙｌ
（ｄａｎｓｙｌ）（ダンシル），ｃｏｕｍａｒｉｎ（ク
マリン），ＤＮＡ，ＲＮＡ，又はウイルス等を用いるこ
とができる。
【００１２】例えば，第二ハプテンがディゴキシゲニン
の場合には，上記第二抗体成分としては抗ディゴキシゲ
ニン抗体を用いることができる。第二ハプテンがＤＮＰ
の場合には，上記第二抗体成分としては抗体ＤＮＰ抗体
を用いることができる。また，第二ハプテンがビオチン
の場合には，上記第二抗体成分としては抗ビオチン抗体
又はストレプトアビジンを用いることができる。
の場合には，上記第二抗体成分としては抗ディゴキシゲ
ニン抗体を用いることができる。第二ハプテンがＤＮＰ
の場合には，上記第二抗体成分としては抗体ＤＮＰ抗体
を用いることができる。また，第二ハプテンがビオチン
の場合には，上記第二抗体成分としては抗ビオチン抗体
又はストレプトアビジンを用いることができる。
【００１３】上記第一抗体成分と第二抗体成分とは同種
のものを用いることもできるが，異種のものを用いるこ
とが好ましい。これにより，第一抗体成分と第二抗体成
分の両方に抗原性物質が結合することがなく，高感度に
抗原性物質を検出することができる。
のものを用いることもできるが，異種のものを用いるこ
とが好ましい。これにより，第一抗体成分と第二抗体成
分の両方に抗原性物質が結合することがなく，高感度に
抗原性物質を検出することができる。
【００１４】上記第一抗体成分及び第二抗体成分は，化
学結合により二価抗体リンカーを形成する。第一抗体成
分と第二抗体成分とは，例えばチオール基とマレイミド
基とにより結合されている。上記二価抗体リンカーの形
成方法としては，例えば第一抗体成分及び第二抗体成分
の非活性部位を切断又は修飾し，その切断又は修飾部位
同志を化合反応により結合する方法がある。
学結合により二価抗体リンカーを形成する。第一抗体成
分と第二抗体成分とは，例えばチオール基とマレイミド
基とにより結合されている。上記二価抗体リンカーの形
成方法としては，例えば第一抗体成分及び第二抗体成分
の非活性部位を切断又は修飾し，その切断又は修飾部位
同志を化合反応により結合する方法がある。
【００１５】具体的には，例えば，第一抗体成分の非活
性部位をマレイミド化し，また，第二抗体成分の非活性
部位をペプシン等の酵素反応により切断して，その末端
にチオール基を露出させ，上記第一抗体成分と第二抗体
成分とを図３，図４に示すごとく結合することができ
る。同図中において，「Ｆａｂ」はアミノ基末端の第一
抗体成分又は第二抗体成分を意味し，「Ｆａｂ′」はチ
オール基末端の第一抗体成分又は第二抗体成分を意味す
る。
性部位をマレイミド化し，また，第二抗体成分の非活性
部位をペプシン等の酵素反応により切断して，その末端
にチオール基を露出させ，上記第一抗体成分と第二抗体
成分とを図３，図４に示すごとく結合することができ
る。同図中において，「Ｆａｂ」はアミノ基末端の第一
抗体成分又は第二抗体成分を意味し，「Ｆａｂ′」はチ
オール基末端の第一抗体成分又は第二抗体成分を意味す
る。
【００１６】上記シグナル物質は，蛍光物質を含むリポ
ソーム，又は蛍光物質になりうる物質を基質とする酵素
等である。上記リポソームに含まれる蛍光物質は，リポ
ソームと共有結合により結合している共有結合性蛍光物
質，又はリポソームの中に封入されている非共有結合性
蛍光物質等である。リポソームは脂質人工膜の一種で，
二分子膜よりなる閉鎖小胞である。リポソームには多数
の蛍光物質を取り込むことができ，蛍光強度を高くする
ことができる。
ソーム，又は蛍光物質になりうる物質を基質とする酵素
等である。上記リポソームに含まれる蛍光物質は，リポ
ソームと共有結合により結合している共有結合性蛍光物
質，又はリポソームの中に封入されている非共有結合性
蛍光物質等である。リポソームは脂質人工膜の一種で，
二分子膜よりなる閉鎖小胞である。リポソームには多数
の蛍光物質を取り込むことができ，蛍光強度を高くする
ことができる。
【００１７】また，蛍光物質は，一般に，疎水性雰囲気
下で蛍光強度が数十倍増加する性質を有する。また，蛍
光物質は水溶液によく溶ける。そのため，蛍光物質は，
特に親水性と疎水性の両面をもつリポソームに取り込ま
れることにより，蛍光強度が５０〜２００倍増幅され
る。それ故，被検体物質の検出感度が向上する。
下で蛍光強度が数十倍増加する性質を有する。また，蛍
光物質は水溶液によく溶ける。そのため，蛍光物質は，
特に親水性と疎水性の両面をもつリポソームに取り込ま
れることにより，蛍光強度が５０〜２００倍増幅され
る。それ故，被検体物質の検出感度が向上する。
【００１８】また，リポソームは，親水性物質を膜内水
相に，疎水性物質を分子膜の中に取り込むことができ
る。また，リポソームには，直接種々の物質を結合させ
ることができる。このため，リポソームには，利用され
にくかった物質も容易に取り込むことができ，蛍光物質
の選択幅が広がり，多色蛍光検出法にも，応用できる。
リポソームとしては，例えば３０００〜４０００個のリ
ン脂質により形成されたものがある。
相に，疎水性物質を分子膜の中に取り込むことができ
る。また，リポソームには，直接種々の物質を結合させ
ることができる。このため，リポソームには，利用され
にくかった物質も容易に取り込むことができ，蛍光物質
の選択幅が広がり，多色蛍光検出法にも，応用できる。
リポソームとしては，例えば３０００〜４０００個のリ
ン脂質により形成されたものがある。
【００１９】上記リポソームに含まれる蛍光物質は，リ
ポソームと共有結合により結合している共有結合性蛍光
物質，又はリポソームの中に封入されている非共有結合
性蛍光物質等である。上記共有結合性蛍光物質はリポソ
ームを構成する分子（例えば，リン脂質）と共有結合に
より結合するため，その分子数が有する反応基の数と同
程度まで，リポソームに結合させることができる。一
方，１つのリポソームに結合する共有結合性蛍光物質が
１０個未満の場合には，蛍光集合体の蛍光強度が弱くな
り，被検体物質の検出感度が低下するおそれがある。
ポソームと共有結合により結合している共有結合性蛍光
物質，又はリポソームの中に封入されている非共有結合
性蛍光物質等である。上記共有結合性蛍光物質はリポソ
ームを構成する分子（例えば，リン脂質）と共有結合に
より結合するため，その分子数が有する反応基の数と同
程度まで，リポソームに結合させることができる。一
方，１つのリポソームに結合する共有結合性蛍光物質が
１０個未満の場合には，蛍光集合体の蛍光強度が弱くな
り，被検体物質の検出感度が低下するおそれがある。
【００２０】上記共有結合性蛍光物質としては，例え
ば，クマリン骨格を有する化合物，ナフタレン骨格を有
する化合物，フルオレセイン骨格を有する化合物，ペリ
レン骨格を有する化合物，ピレン骨格を有する化合物，
アントラセン骨格を有する化合物，及びローダミン骨格
を有する化合物等がある。
ば，クマリン骨格を有する化合物，ナフタレン骨格を有
する化合物，フルオレセイン骨格を有する化合物，ペリ
レン骨格を有する化合物，ピレン骨格を有する化合物，
アントラセン骨格を有する化合物，及びローダミン骨格
を有する化合物等がある。
【００２１】クマリン骨格を有する化合物としては，４
−メチルウンベリフェリル ホスホコリン，７−ヒドロ
キシクマリン─３─カルボン酸─オクタデシルエステル
等を用いることができる。ナフタレン骨格を有する化合
物としては，ＮＢＤ標識ホスファチジルエタノールアミ
ン，ｄａｎｓｙｌ標識ホスファチジルエタノールアミン
等を用いることができる。
−メチルウンベリフェリル ホスホコリン，７−ヒドロ
キシクマリン─３─カルボン酸─オクタデシルエステル
等を用いることができる。ナフタレン骨格を有する化合
物としては，ＮＢＤ標識ホスファチジルエタノールアミ
ン，ｄａｎｓｙｌ標識ホスファチジルエタノールアミン
等を用いることができる。
【００２２】フルオレセイン骨格を有する化合物として
は，フルオレセイン標識ホスファチジルエタノールアミ
ン等を用いることができる。ペリレン骨格を有する化合
物としては，１−ヘキサデカノイル−２−（３−ペリレ
ンドデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
等を用いることができる。
は，フルオレセイン標識ホスファチジルエタノールアミ
ン等を用いることができる。ペリレン骨格を有する化合
物としては，１−ヘキサデカノイル−２−（３−ペリレ
ンドデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
等を用いることができる。
【００２３】ピレン骨格を有する化合物としては，１，
２−ビス−（１−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ
−３−ホスホコリン，１２−（１−ピレンドデカノイ
ル）ホスホコリン等を用いることができる。アントラセ
ン骨格を有する化合物としては，１２−（９−アンスロ
イロキシ）−ステアリン酸等を用いることができる。ロ
ーダミン骨格を有する化合物としては，ローダミン標識
ホスファチジルエタノールアミン等を用いることができ
る。
２−ビス−（１−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ
−３−ホスホコリン，１２−（１−ピレンドデカノイ
ル）ホスホコリン等を用いることができる。アントラセ
ン骨格を有する化合物としては，１２−（９−アンスロ
イロキシ）−ステアリン酸等を用いることができる。ロ
ーダミン骨格を有する化合物としては，ローダミン標識
ホスファチジルエタノールアミン等を用いることができ
る。
【００２４】上記非共有結合性蛍光物質は，リポソーム
を構成する分子に結合しているのではなく，リポソーム
の膜内水相又は疎水性の分子膜の中に取り込まれる。１
個のリポソームに取り込まれる非共有結合性蛍光物質の
数は，１０〜１００００であることが好ましい。１０未
満の場合には，蛍光集合体の蛍光強度が弱く，被検体物
質の検出感度が低下するおそれがある。一方，１０００
０を越える場合には，リポソームの水溶性が低下した
り，サイズが大きくなるので立体障害がかなり大きくな
るおそれがある。
を構成する分子に結合しているのではなく，リポソーム
の膜内水相又は疎水性の分子膜の中に取り込まれる。１
個のリポソームに取り込まれる非共有結合性蛍光物質の
数は，１０〜１００００であることが好ましい。１０未
満の場合には，蛍光集合体の蛍光強度が弱く，被検体物
質の検出感度が低下するおそれがある。一方，１０００
０を越える場合には，リポソームの水溶性が低下した
り，サイズが大きくなるので立体障害がかなり大きくな
るおそれがある。
【００２５】上記非共有結合性蛍光物質としては，４−
メチルウンベリフェロン，７−ヒドロキシ−４−ビフェ
ニル−ウンベリフェロン，３−ヒドロキシ−２−ナフト
エ酸２─フェニルアニリド，３−ヒドロキシ−２−ナフ
トエ酸─２，４─ジメチルアニリド，６─ブロモ─２─
ヒドロキシ─３─ナフトエ酸２─メチルアニリド，３─
ヒドロキシ─２─アントラノイック酸 ２─メチルアニ
リド，ピレン，フルオレセイン，ペリレン，ロ─ダミ
ン，テキサスレッド，又はＤＮＡ結合性蛍光物質等があ
る。ＤＮＡ結合性蛍光物質としては，Ｈｏｅｃｈｓｔ３
３２５８（ヘキスト・ジャパン社製），ＤＡＰＩ（ＳＩ
ＧＭＡ社製），エチジウム ブロミド等を用いることが
できる。
メチルウンベリフェロン，７−ヒドロキシ−４−ビフェ
ニル−ウンベリフェロン，３−ヒドロキシ−２−ナフト
エ酸２─フェニルアニリド，３−ヒドロキシ−２−ナフ
トエ酸─２，４─ジメチルアニリド，６─ブロモ─２─
ヒドロキシ─３─ナフトエ酸２─メチルアニリド，３─
ヒドロキシ─２─アントラノイック酸 ２─メチルアニ
リド，ピレン，フルオレセイン，ペリレン，ロ─ダミ
ン，テキサスレッド，又はＤＮＡ結合性蛍光物質等があ
る。ＤＮＡ結合性蛍光物質としては，Ｈｏｅｃｈｓｔ３
３２５８（ヘキスト・ジャパン社製），ＤＡＰＩ（ＳＩ
ＧＭＡ社製），エチジウム ブロミド等を用いることが
できる。
【００２６】上記蛍光物質になりうる物質を基質とする
酵素としては，例えば，アルカリホスファターゼ，アシ
ッドホスファターゼ，パーオキシダーゼ，エステラー
ゼ，グルコシダーゼ，又はホスホリパーゼ等がある。ア
ルカリホスファターゼは，３−ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−
２′−ｂｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ
ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｅｓｔ
ｅｒ（ＨＮＰＰ）及びＦａｓｔ Ｒｅｄ ＴＲを基質と
する。
酵素としては，例えば，アルカリホスファターゼ，アシ
ッドホスファターゼ，パーオキシダーゼ，エステラー
ゼ，グルコシダーゼ，又はホスホリパーゼ等がある。ア
ルカリホスファターゼは，３−ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−
２′−ｂｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ
ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｅｓｔ
ｅｒ（ＨＮＰＰ）及びＦａｓｔ Ｒｅｄ ＴＲを基質と
する。
【００２７】上記抗原性物質としては，組織細胞，ウイ
ルス，核酸，又はタンパク質等の抗原性を有する物質が
ある。
ルス，核酸，又はタンパク質等の抗原性を有する物質が
ある。
【００２８】
【作用及び効果】本発明においては，二価抗体リンカー
を用いて，抗原性物質を検出している。二価抗体リンカ
ーは，抗原性物質に特異的に結合する第一抗体成分と，
シグナル物質に特異的に結合する第二抗体成分とを有し
ている。そのため，二価抗体リンカーは，抗原性物質と
シグナル物質とに対する活性部位をそれぞれ別個に有す
ることになる。それ故，二価抗体リンカーが抗原性物質
と結合したときには，必ずシグナル物質と結合する活性
部位が残る。
を用いて，抗原性物質を検出している。二価抗体リンカ
ーは，抗原性物質に特異的に結合する第一抗体成分と，
シグナル物質に特異的に結合する第二抗体成分とを有し
ている。そのため，二価抗体リンカーは，抗原性物質と
シグナル物質とに対する活性部位をそれぞれ別個に有す
ることになる。それ故，二価抗体リンカーが抗原性物質
と結合したときには，必ずシグナル物質と結合する活性
部位が残る。
【００２９】このため，抗原性物質が直接第一抗体成分
と結合した場合には抗原性物質の数と同数のシグナル物
質を，また抗原性物質が第一ハプテンを介して第一抗体
成分と結合した場合には第一ハプテンの数と同数のシグ
ナル物質を，確実に結合させることができる。それ故，
従来のように抗体の活性部位のすべてに抗原性物質が結
合して，抗体の活性部位が失活するということもない。
従って，優れた検出感度が発揮される。
と結合した場合には抗原性物質の数と同数のシグナル物
質を，また抗原性物質が第一ハプテンを介して第一抗体
成分と結合した場合には第一ハプテンの数と同数のシグ
ナル物質を，確実に結合させることができる。それ故，
従来のように抗体の活性部位のすべてに抗原性物質が結
合して，抗体の活性部位が失活するということもない。
従って，優れた検出感度が発揮される。
【００３０】上記のごとく，本発明によれば，優れた検
出感度を発揮する，抗原性物質の検出方法を提供するこ
とができる。
出感度を発揮する，抗原性物質の検出方法を提供するこ
とができる。
【００３１】
実施例１ 本発明の実施例に係る抗原性物質の検出方法について，
図１，図２を用いて説明する。本例は，ビオチン標識プ
ローブ遺伝子を相補的に結合させたヒト末梢血リンパ球
染色体を抗原性物質２として検出する方法である。検出
方法の概要は，図１に示すごとく，まず，第一抗体成分
１１としての抗ビオチン抗体（抗Ｂ）と，第二抗体成分
１２としての抗ディゴキシゲニン抗体（抗Ｄ）とを結合
して，二価抗体リンカー１を調製する。次に，第一抗体
成分１１に，第一ハプテン２１としてのビオチン（Ｂ）
で標識したプローブ遺伝子２０を介して，ヒト末梢血リ
ンパ球染色体２９を特異的に結合させる。
図１，図２を用いて説明する。本例は，ビオチン標識プ
ローブ遺伝子を相補的に結合させたヒト末梢血リンパ球
染色体を抗原性物質２として検出する方法である。検出
方法の概要は，図１に示すごとく，まず，第一抗体成分
１１としての抗ビオチン抗体（抗Ｂ）と，第二抗体成分
１２としての抗ディゴキシゲニン抗体（抗Ｄ）とを結合
して，二価抗体リンカー１を調製する。次に，第一抗体
成分１１に，第一ハプテン２１としてのビオチン（Ｂ）
で標識したプローブ遺伝子２０を介して，ヒト末梢血リ
ンパ球染色体２９を特異的に結合させる。
【００３２】また，第二抗体成分１２としての抗ディゴ
キシゲニン抗体には，第二ハプテン７２としてのディゴ
キシゲニン（Ｄ）で標識したアルカリホスファターゼ７
を特異的に結合させる。次に，アルカリホスファターゼ
７に，その基質である蛍光物質３を反応させて，シグナ
ルを発生させ，これを検出する。
キシゲニン抗体には，第二ハプテン７２としてのディゴ
キシゲニン（Ｄ）で標識したアルカリホスファターゼ７
を特異的に結合させる。次に，アルカリホスファターゼ
７に，その基質である蛍光物質３を反応させて，シグナ
ルを発生させ，これを検出する。
【００３３】以下，上記検出方法について詳説する。 （１）二価抗体リンカーの調製 抗ディゴキシゲニン抗体の修飾 抗ディゴキシゲニン抗体（ベーリンガー社製）２ｍｇ
を，リン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ．ｐＨ
７）３００μｌに溶解し，さらに，ＳＭＣＣ（Ｓｕｃｃ
ｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅ
ｔｈｙｌ）−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏ
ｘｙｌａｔｅ／ＤＭＦ，５ｍｇ／２５０μｌ）を１０μ
ｌ加え，３０℃で３０分間静置する。
を，リン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ．ｐＨ
７）３００μｌに溶解し，さらに，ＳＭＣＣ（Ｓｕｃｃ
ｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅ
ｔｈｙｌ）−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏ
ｘｙｌａｔｅ／ＤＭＦ，５ｍｇ／２５０μｌ）を１０μ
ｌ加え，３０℃で３０分間静置する。
【００３４】次に，これを遠心後，その上清をＳｅｐｈ
ａｄｅｘ Ｇ−２５（カラムサイズ：１．０×１５ｃ
ｍ：０．１Ｍ リン酸−水酸化ナトリウム，ｐＨ６）で
ゲルろ過により脱塩した。高分子の溶出成分を集め，遠
心限外ろ過で２００μｌに濃縮し，マレイミド化抗ディ
ゴキシゲニン抗体溶液とした。
ａｄｅｘ Ｇ−２５（カラムサイズ：１．０×１５ｃ
ｍ：０．１Ｍ リン酸−水酸化ナトリウム，ｐＨ６）で
ゲルろ過により脱塩した。高分子の溶出成分を集め，遠
心限外ろ過で２００μｌに濃縮し，マレイミド化抗ディ
ゴキシゲニン抗体溶液とした。
【００３５】 抗ビオチン抗体の修飾 抗ビオチン抗体（ベクター社製）３ｍｇを０．１Ｍ 酢
酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ４．５）で透析し，ペプシン
（シグマ社製）０．２ｍｇを加え，３７℃で１６時間静
置した。沈澱を遠心分離により除去し，その上清をゲル
ろ過した（ウルトロゲルＡｃＡ４４，カラムサイズ：
１．０×４５ｃｍ，緩衝液：０．１Ｍ リン酸−水酸化
ナトリウム ｐＨ：７）。
酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ４．５）で透析し，ペプシン
（シグマ社製）０．２ｍｇを加え，３７℃で１６時間静
置した。沈澱を遠心分離により除去し，その上清をゲル
ろ過した（ウルトロゲルＡｃＡ４４，カラムサイズ：
１．０×４５ｃｍ，緩衝液：０．１Ｍ リン酸−水酸化
ナトリウム ｐＨ：７）。
【００３６】抗ビオチン抗体蛋白の溶出画分を集め，硫
酸アンモニウムを濃度０．６６ｇ／ｍｌ（重量％）で加
え，抗ビオチン抗体を沈澱させた（塩析）。遠心分離
後，その沈澱をリン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（０．
１ｍｏｌ ｐＨ：６）０．４ｍｌに溶解し，防腐のた
め，０．１ｇ／ｍｌアジ化ナトリウム４μｌ加え，Ｆ
（ａｂ′）2 フラグメント溶液とした。
酸アンモニウムを濃度０．６６ｇ／ｍｌ（重量％）で加
え，抗ビオチン抗体を沈澱させた（塩析）。遠心分離
後，その沈澱をリン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（０．
１ｍｏｌ ｐＨ：６）０．４ｍｌに溶解し，防腐のた
め，０．１ｇ／ｍｌアジ化ナトリウム４μｌ加え，Ｆ
（ａｂ′）2 フラグメント溶液とした。
【００３７】Ｆ（ａｂ′）2 フラグメント溶液に，０．
１Ｍ メルカプトエチルアミン塩酸塩（０．１Ｍ リン
酸−水酸化ナトリウム緩衝液 ｐＨ：６，５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ）５０μｌを加え，３７℃で９０分静置した。ゲル
ろ過後，可変部単体（Ｆａｂ′）画分を集め，塩析によ
り０．４ｍｌに濃縮し，チオール化抗ビオチン抗体溶液
とした。
１Ｍ メルカプトエチルアミン塩酸塩（０．１Ｍ リン
酸−水酸化ナトリウム緩衝液 ｐＨ：６，５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ）５０μｌを加え，３７℃で９０分静置した。ゲル
ろ過後，可変部単体（Ｆａｂ′）画分を集め，塩析によ
り０．４ｍｌに濃縮し，チオール化抗ビオチン抗体溶液
とした。
【００３８】 抗ディゴキシゲニン抗体と抗ビオチン
抗体との結合反応 のマレイミド化抗ディゴキシゲニン抗体溶液とのチ
オール化抗ビオチン抗体溶液とを混合し，３０℃で１時
間インキュベートした後，ゲルろ過（ウルトロゲルＡｃ
Ａ４４，０．１Ｍ リン酸−水酸化ナトリウム緩衝液，
０．１Ｍ ＮａＣｌ：ｐＨ７）を行ない，抗ディゴキシ
ゲニン抗体と抗ビオチン抗体とが１：１の比で結合した
二価抗体リンカー（図３参照）を分取した。
抗体との結合反応 のマレイミド化抗ディゴキシゲニン抗体溶液とのチ
オール化抗ビオチン抗体溶液とを混合し，３０℃で１時
間インキュベートした後，ゲルろ過（ウルトロゲルＡｃ
Ａ４４，０．１Ｍ リン酸−水酸化ナトリウム緩衝液，
０．１Ｍ ＮａＣｌ：ｐＨ７）を行ない，抗ディゴキシ
ゲニン抗体と抗ビオチン抗体とが１：１の比で結合した
二価抗体リンカー（図３参照）を分取した。
【００３９】（２） 二価抗体リンカーを用いたＤＮＡ
の検出 ヒト末梢血リンパ球の染色体標本を７５℃において変性
用溶液で３分間変性させたのち，ニックトランスレーシ
ョンによりビオチン標識したヒトのｃ−ｍｙｃ遺伝子を
プローブＤＮＡとしてｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼー
ションを行った。次に，これを５０％ ｆｏｒｍａｍｉ
ｄｅ，２ＸＳＳＣにより洗浄して，余剰のプローブＤＮ
Ａを除去した。
の検出 ヒト末梢血リンパ球の染色体標本を７５℃において変性
用溶液で３分間変性させたのち，ニックトランスレーシ
ョンによりビオチン標識したヒトのｃ−ｍｙｃ遺伝子を
プローブＤＮＡとしてｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼー
ションを行った。次に，これを５０％ ｆｏｒｍａｍｉ
ｄｅ，２ＸＳＳＣにより洗浄して，余剰のプローブＤＮ
Ａを除去した。
【００４０】次に，脱脂粉乳水溶液によりブロッキング
処理を行ない，二価抗体リンカーの抗ビオチン抗体活性
部位をプローブＤＮＡのビオチンに結合させると共に，
抗ディゴキシゲニン抗体活性部位にディゴキシゲニン標
識アルカリホスファターゼを結合させた。
処理を行ない，二価抗体リンカーの抗ビオチン抗体活性
部位をプローブＤＮＡのビオチンに結合させると共に，
抗ディゴキシゲニン抗体活性部位にディゴキシゲニン標
識アルカリホスファターゼを結合させた。
【００４１】次に，アルカリホスファターゼの基質であ
る蛍光物質，即ち，３−ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−２′−ｂ
ｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｃａｒｂ
ｏｘａｍｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｅｓｔｅｒ（Ｈ
ＮＰＰ）及びＦａｓｔ Ｒｅｄ ＴＲ（シグマ社製）の
水溶液で室温において３０分間四回反応させた。染色体
はヘキスト−キナクリンで対比染色した。スライドは封
入溶液で封入した。次に蛍光顕微鏡を用いて，染色体の
観察をおこなったところ，図２に示すごとく，第８染色
体に強い赤色の蛍光シグナル（写真中の白抜部分）が検
出でき，同時に染色体の蛍光分染パターンが検出でき
た。
る蛍光物質，即ち，３−ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−２′−ｂ
ｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｃａｒｂ
ｏｘａｍｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｅｓｔｅｒ（Ｈ
ＮＰＰ）及びＦａｓｔ Ｒｅｄ ＴＲ（シグマ社製）の
水溶液で室温において３０分間四回反応させた。染色体
はヘキスト−キナクリンで対比染色した。スライドは封
入溶液で封入した。次に蛍光顕微鏡を用いて，染色体の
観察をおこなったところ，図２に示すごとく，第８染色
体に強い赤色の蛍光シグナル（写真中の白抜部分）が検
出でき，同時に染色体の蛍光分染パターンが検出でき
た。
【００４２】一方，比較例（一般的手法）として，本例
の二価抗体リンカーの代わりにストレイプトアビジンを
用いて検出したが，特異的蛍光シグナルは検出できなか
った。このことから，本例の検出方法は，従来になく高
い感度でヒト末梢リンパ球染色体を検出できたことがわ
かる。
の二価抗体リンカーの代わりにストレイプトアビジンを
用いて検出したが，特異的蛍光シグナルは検出できなか
った。このことから，本例の検出方法は，従来になく高
い感度でヒト末梢リンパ球染色体を検出できたことがわ
かる。
【００４３】実施例２ 本例は，抗原性物質としてのアルカリホスファターゼを
検出する方法であり，シグナル物質としてリポソームに
封入された蛍光物質を用いている。また，抗原性物質に
特異的に結合する第一抗体成分として抗ディゴキシゲニ
ン抗体を，シグナル物質に特異的に結合する第二抗体成
分として抗ビオチン抗体を用いている。更に，本例にお
いては，実施例１でシグナル物質として用いたアルカリ
ホスファターゼを，抗原性物質として用いている。
検出する方法であり，シグナル物質としてリポソームに
封入された蛍光物質を用いている。また，抗原性物質に
特異的に結合する第一抗体成分として抗ディゴキシゲニ
ン抗体を，シグナル物質に特異的に結合する第二抗体成
分として抗ビオチン抗体を用いている。更に，本例にお
いては，実施例１でシグナル物質として用いたアルカリ
ホスファターゼを，抗原性物質として用いている。
【００４４】上記検出方法の概要について図５を用いて
説明すると，まず，蛍光物質３０をリポソーム３９に共
有結合させ，第二ハプテン２２としてのビオチンで標識
した。蛍光物質３０としてはローダミンを用いた。ロー
ダミンは，リポソーム３９と共有結合する共有結合性蛍
光物質である。
説明すると，まず，蛍光物質３０をリポソーム３９に共
有結合させ，第二ハプテン２２としてのビオチンで標識
した。蛍光物質３０としてはローダミンを用いた。ロー
ダミンは，リポソーム３９と共有結合する共有結合性蛍
光物質である。
【００４５】次に，スライドグラス上において，ビーズ
４に抗アルカリホスファターゼ抗体４０を固定し，抗原
性物質２５としてのアルカリホスファターゼを結合さ
せ，更に第一ハプテン７１としてのディゴキシゲニン
（Ｄ）で標識した抗アルカリホスファターゼ抗体７０を
反応させた。
４に抗アルカリホスファターゼ抗体４０を固定し，抗原
性物質２５としてのアルカリホスファターゼを結合さ
せ，更に第一ハプテン７１としてのディゴキシゲニン
（Ｄ）で標識した抗アルカリホスファターゼ抗体７０を
反応させた。
【００４６】次に，上記ディゴキシゲニンに，実施例１
の二価抗体リンカー１の抗ディゴキシゲニン抗体を第一
抗体成分１１０として結合させた。更に，この二価抗体
リンカー１の抗ビオチン抗体を，第二抗体成分１２０と
して，上記のリポソーム３９を結合させた。その後，リ
ポソーム３９に共有結合している蛍光物質３０を検出し
た。
の二価抗体リンカー１の抗ディゴキシゲニン抗体を第一
抗体成分１１０として結合させた。更に，この二価抗体
リンカー１の抗ビオチン抗体を，第二抗体成分１２０と
して，上記のリポソーム３９を結合させた。その後，リ
ポソーム３９に共有結合している蛍光物質３０を検出し
た。
【００４７】以下，これを詳説する。 リポソームの調製及び蛍光物質のリポソームへの封
入 レシチン（１μｍｏｌ），コレステロール（０．６５μ
ｍｏｌ），ローダミン−ＤＨＰＥ（０．２５μｍｏｌ）
及びビオチン−Ｘ−ＤＨＰＥ（０．１μｍｏｌ）を，溶
媒としてのクロロホルム５ｍｌに溶解して，ナスフラス
コに入れ，よく攪拌した後エバポレータで溶媒を除去し
た。
入 レシチン（１μｍｏｌ），コレステロール（０．６５μ
ｍｏｌ），ローダミン−ＤＨＰＥ（０．２５μｍｏｌ）
及びビオチン−Ｘ−ＤＨＰＥ（０．１μｍｏｌ）を，溶
媒としてのクロロホルム５ｍｌに溶解して，ナスフラス
コに入れ，よく攪拌した後エバポレータで溶媒を除去し
た。
【００４８】再び，このナスフラスコに溶媒としてのク
ロロホルムを３ｍｌ入れ，攪拌した後，ロータリーエバ
ポレータで溶媒を除去した。これを３〜５回繰り返し
た。するとフラスコ壁面に薄膜状のリポソームが形成さ
れるので，これを真空デシケーターに移して，１昼夜真
空ポンプで真空吸引して溶媒を完全に除去した。調製さ
れたリポソームの表面には，蛍光物質（ローダミン）が
共有結合により結合している。
ロロホルムを３ｍｌ入れ，攪拌した後，ロータリーエバ
ポレータで溶媒を除去した。これを３〜５回繰り返し
た。するとフラスコ壁面に薄膜状のリポソームが形成さ
れるので，これを真空デシケーターに移して，１昼夜真
空ポンプで真空吸引して溶媒を完全に除去した。調製さ
れたリポソームの表面には，蛍光物質（ローダミン）が
共有結合により結合している。
【００４９】次いで，フラスコ内部を窒素で置換した
後，バッファー（０．１ｍｏｌ／リットル リン酸緩衝
液，５ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ：６）を５ｍｌ加え，約６
０℃の温水槽に浸し，バスタイプの超音波処理機で２０
分間超音波処理をした。するとナスフラスコの壁面から
薄膜が剥がれながら，小径のリポソームが調製された。
リポソームサイズを均一化するために，細孔０．２μｍ
のポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）メンブレン
フィルターでろ過することにより，リポソームを押し出
し，その径を０．２μｍ以下にそろえた。
後，バッファー（０．１ｍｏｌ／リットル リン酸緩衝
液，５ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ：６）を５ｍｌ加え，約６
０℃の温水槽に浸し，バスタイプの超音波処理機で２０
分間超音波処理をした。するとナスフラスコの壁面から
薄膜が剥がれながら，小径のリポソームが調製された。
リポソームサイズを均一化するために，細孔０．２μｍ
のポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）メンブレン
フィルターでろ過することにより，リポソームを押し出
し，その径を０．２μｍ以下にそろえた。
【００５０】 蛍光物質含有リポソームを用いたアル
カリホスファターゼの検出 ポリサイエンス社製のＰＯＬＹＢＥＡＤ，ＣＡＲＢＯＸ
ＹＬＡＴＥＭＩＣＲＯＳＰＨＥＲＥＳ（ビーズ）を用
い，スライドグラス上で微量アルカリホスファターゼの
検出を行った。
カリホスファターゼの検出 ポリサイエンス社製のＰＯＬＹＢＥＡＤ，ＣＡＲＢＯＸ
ＹＬＡＴＥＭＩＣＲＯＳＰＨＥＲＥＳ（ビーズ）を用
い，スライドグラス上で微量アルカリホスファターゼの
検出を行った。
【００５１】即ち，あらかじめ抗アルカリホスファター
ゼ抗体をビーズに固定し，アルカリホスファターゼ（Ａ
Ｐ）を含む溶液を反応させた。このとき，１個のビーズ
に１個のＡＰが結合する割合となるようにアルカリホス
ファターゼの濃度を調整した。次に，ディゴキシゲニン
で標識された抗アルカリホスファターゼ抗体を反応させ
た後，過剰の抗アルカリホスファターゼ抗体をＴＲＩＳ
ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， １
５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．５）により洗浄した。次
いで，実施例１で調製した二価抗体リンカーを反応さ
せ，その後，未反応の二価抗体リンカー抗体を，ＴＲＩ
Ｓ ｂｕｆｆｅｒにより良く洗浄した。そして上記リポ
ソームを３０分間，反応させた。
ゼ抗体をビーズに固定し，アルカリホスファターゼ（Ａ
Ｐ）を含む溶液を反応させた。このとき，１個のビーズ
に１個のＡＰが結合する割合となるようにアルカリホス
ファターゼの濃度を調整した。次に，ディゴキシゲニン
で標識された抗アルカリホスファターゼ抗体を反応させ
た後，過剰の抗アルカリホスファターゼ抗体をＴＲＩＳ
ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， １
５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．５）により洗浄した。次
いで，実施例１で調製した二価抗体リンカーを反応さ
せ，その後，未反応の二価抗体リンカー抗体を，ＴＲＩ
Ｓ ｂｕｆｆｅｒにより良く洗浄した。そして上記リポ
ソームを３０分間，反応させた。
【００５２】検出は蛍光顕微鏡（倍率１０００倍）で観
察を行った。その結果，図６に示すごとく，分散したビ
ーズに結合したと判断される蛍光輝点（白抜部分）が検
出できた。また，１個のリポソームが同じ輝点の大きさ
に見えた。このことから，二価抗体リンカーは，蛍光物
質を含有した１個のリポソームと１個のアルカリホスフ
ァターゼとを結合させることができ，１個のアルカリホ
スファターゼを検出できたことがわかる。
察を行った。その結果，図６に示すごとく，分散したビ
ーズに結合したと判断される蛍光輝点（白抜部分）が検
出できた。また，１個のリポソームが同じ輝点の大きさ
に見えた。このことから，二価抗体リンカーは，蛍光物
質を含有した１個のリポソームと１個のアルカリホスフ
ァターゼとを結合させることができ，１個のアルカリホ
スファターゼを検出できたことがわかる。
【００５３】従って，抗原性物質との間をつなぐ物質，
即ち，本発明の二価抗体リンカーと１個の上記リポソー
ムとがあれば，１個の抗原性物質を検出できる反応系が
確立できたといえる。故に，本発明の検出方法は，臨床
分野などで，超高感度な検出系といえる。
即ち，本発明の二価抗体リンカーと１個の上記リポソー
ムとがあれば，１個の抗原性物質を検出できる反応系が
確立できたといえる。故に，本発明の検出方法は，臨床
分野などで，超高感度な検出系といえる。
【００５４】また，本例においては被検体のアルカリホ
スファターゼをビーズに固定して検出を行ったが，メン
ブレン等のフィルタに固定したアルカリホスファター
ゼ，又は生体組織中に存在するアルカリホスファターゼ
を検出する場合にも，リポソームによる立体障害がな
く，高い感度で検出することができる。
スファターゼをビーズに固定して検出を行ったが，メン
ブレン等のフィルタに固定したアルカリホスファター
ゼ，又は生体組織中に存在するアルカリホスファターゼ
を検出する場合にも，リポソームによる立体障害がな
く，高い感度で検出することができる。
【図１】実施例１の，ビオチン標識プローブ遺伝子を相
補的に結合させたヒト末梢血リンパ球染色体の検出方法
を示す説明図。
補的に結合させたヒト末梢血リンパ球染色体の検出方法
を示す説明図。
【図２】実施例１の検出方法において，スライド（基
板）上に形成された染色体の蛍光分染パターンの検出結
果を示す蛍光顕微鏡写真（倍率１０００倍）による説明
図。
板）上に形成された染色体の蛍光分染パターンの検出結
果を示す蛍光顕微鏡写真（倍率１０００倍）による説明
図。
【図３】本発明の，二価抗体リンカーの第一抗体成分と
第二抗体成分との結合状態を示す説明図。
第二抗体成分との結合状態を示す説明図。
【図４】本発明の，二価抗体リンカーの第一抗体成分と
第二抗体成分との他の結合状態を示す説明図。
第二抗体成分との他の結合状態を示す説明図。
【図５】実施例２のアルカリホスファターゼの検出方法
を示す説明図。
を示す説明図。
【図６】実施例２の検出方法において，アルカリホスフ
ァターゼの形態を示す蛍光顕微鏡写真（倍率１０００
倍）による説明図。
ァターゼの形態を示す蛍光顕微鏡写真（倍率１０００
倍）による説明図。
【図７】従来例の抗原性物質の検出方法を示す説明図。
１．．．二価抗体リンカー， １１，１１０．．．第一抗体成分， １２，１２０．．．第二抗体成分， ２，２５．．．抗原性物質， ２１，７１．．．第一ハプテン， ２２，７２．．．第二ハプテン， ３，３０．．．蛍光物質， ３９．．．リポソーム， ４．．．ビーズ， ４０，７０．．．抗アルカリホスファターゼ抗体， ７．．．アルカリホスファターゼ，
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 近藤 恭光 愛知県刈谷市朝日町２丁目１番地 アイシ ン精機株式会社内
Claims (12)
- 【請求項１】 抗原性物質に特異的に結合する第一抗体
成分と，シグナル物質に特異的に結合する第二抗体成分
とを予め結合させて二価抗体リンカーを調製し，次に，
該二価抗体リンカーの第一抗体成分に抗原性物質を結合
させると共に，上記二価抗体リンカーの第二抗体成分に
シグナル物質を結合させ，次に，シグナル物質よりシグ
ナルを発生させて，該シグナルを検出することを特徴と
する抗原性物質の検出方法。 - 【請求項２】 請求項１において，上記第一抗体成分
は，上記抗原性物質に結合した第一ハプテンを介して，
抗原性物質と特異的に結合していることを特徴とする抗
原性物質の検出方法。 - 【請求項３】 請求項１又は２において，上記第二抗体
成分は，上記シグナル物質に結合した第二ハプテンを介
して，シグナル物質と特異的に結合していることを特徴
とする抗原性物質の検出方法。 - 【請求項４】 請求項２又は３において，上記第一ハプ
テンは，ビオチン，ディゴキシゲニン，ジニトロフェノ
ール，トリニトロフェノール，フルオレセイン，テトラ
メチルローダミン Ｂ イソチオシアネート，ローダミ
ン，テキサスレッド，ルシフェル イエロー，４，４−
ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ
−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル，７−ニ
トロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イ
ル，ダンシル，クマリン，ＤＮＡ，ＲＮＡ，又はウイル
スのいずれか一種であることを特徴とする抗原性物質の
検出方法。 - 【請求項５】 請求項２〜４のいずれか一項において，
上記第二ハプテンは，ビオチン，ディゴキシゲニン，ジ
ニトロフェノール，トリニトロフェノール，フルオレセ
イン，テトラメチルローダミン Ｂ イソチオシアネー
ト，ローダミン，テキサスレッド，ルシフェル イエロ
ー，４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ
−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオ
ニル，７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾ
ール−４−イル，ダンシル，クマリン，ＤＮＡ，ＲＮ
Ａ，又はウイルスのいずれか一種であることを特徴とす
る抗原性物質の検出方法。 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか一項において，
上記第一抗体成分と第二抗体成分とは，チオール基とマ
レイミド基とにより結合されていることを特徴とする抗
原性物質の検出方法。 - 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか一項において，
上記シグナル物質は，蛍光物質を含むリポソーム，又は
蛍光物質になりうる物質を基質とする酵素であることを
特徴とする抗原性物質の検出方法。 - 【請求項８】 請求項７において，上記リポソームに含
まれる蛍光物質は，リポソームと共有結合により結合し
ている共有結合性蛍光物質，又はリポソームの中に封入
されている非共有結合性蛍光物質であることを特徴とす
る抗原性物質の検出方法。 - 【請求項９】 請求項８において，上記共有結合性蛍光
物質は，クマリン骨格を有する化合物，ナフタレン骨格
を有する化合物，フルオレセイン骨格を有する化合物，
ペリレン骨格を有する化合物，ピレン骨格を有する化合
物，アントラセン骨格を有する化合物，及びローダミン
骨格を有する化合物のグループから選ばれる一種又は二
種以上であることを特徴とする抗原性物質の検出方法。 - 【請求項１０】 請求項８において，上記非共有結合性
蛍光物質は，４−メチルウンベリフェロン，７−ヒドロ
キシ−４−ビフェニル−ウンベリフェロン，３−ヒドロ
キシ−２−ナフトエ酸 ２─フェニルアニリド，３−ヒ
ドロキシ−２−ナフトエ酸─２，４─ジメチルアニリ
ド，６─ブロモ─２─ヒドロキシ─３─ナフトエ酸２─
メチルアニリド，３─ヒドロキシ─２─アントラノイッ
ク酸 ２─メチルアニリド，ピレン，フルオレセイン，
ペリレン，ロ─ダミン，テキサスレッド，及びＤＮＡ結
合性蛍光物質のグループから選ばれる一種又は二種以上
であることを特徴とする抗原性物質の検出方法。 - 【請求項１１】 請求項７において，上記蛍光物質にな
りうる物質を基質とする酵素は，アルカリホスファター
ゼ，アシッドホスファターゼ，パーオキシダーゼ，エス
テラーゼ，グルコシダーゼ，又はホスホリパーゼのいず
れかであることを特徴とする抗原性物質の検出方法。 - 【請求項１２】 請求項１〜１１のいずれか一項におい
て，上記抗原性物質は，組織細胞，ウイルス，核酸，又
はタンパク質のいずれかであることを特徴とする抗原性
物質の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18385394A JPH0829419A (ja) | 1994-07-12 | 1994-07-12 | 抗原性物質の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18385394A JPH0829419A (ja) | 1994-07-12 | 1994-07-12 | 抗原性物質の検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0829419A true JPH0829419A (ja) | 1996-02-02 |
Family
ID=16142977
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18385394A Pending JPH0829419A (ja) | 1994-07-12 | 1994-07-12 | 抗原性物質の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0829419A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998008875A1 (de) * | 1996-08-28 | 1998-03-05 | Viva Diagnostika Diagnostische Produkte Gmbh | Kombinationspräparationen und ihre verwendung in der immundiagnostik und immuntherapie |
| JP2012532174A (ja) * | 2009-07-06 | 2012-12-13 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 二重特異性ジゴキシゲニン結合抗体 |
| JP2023524931A (ja) * | 2020-03-04 | 2023-06-14 | シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド | イムノアッセイシグナルを増幅するための方法 |
-
1994
- 1994-07-12 JP JP18385394A patent/JPH0829419A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998008875A1 (de) * | 1996-08-28 | 1998-03-05 | Viva Diagnostika Diagnostische Produkte Gmbh | Kombinationspräparationen und ihre verwendung in der immundiagnostik und immuntherapie |
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| US9050375B2 (en) | 2009-07-06 | 2015-06-09 | Hoffmann-La Roche, Inc. | Bi-specific digoxigenin binding antibodies |
| JP2023524931A (ja) * | 2020-03-04 | 2023-06-14 | シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド | イムノアッセイシグナルを増幅するための方法 |
| JP2024123215A (ja) * | 2020-03-04 | 2024-09-10 | シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド | イムノアッセイシグナルを増幅するための方法 |
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