JPH0829422A - 蛍光集合体を用いた検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 優れた検出感度を示す，蛍光集合体を用いた
被検体物質の検出方法を提供すること。 【構成】 固相担体３に，タンパク質等の被検体物質４
を固定し，該被検体物質４に抗原抗体反応によりリンカ
ー２を結合させる。次に，リンカー２に抗原抗体反応に
より蛍光集合体１を結合させ，蛍光集合体１から発する
蛍光を検出する。リンカー２は，被検体物質４に特異的
に結合する第一抗体成分２１と，蛍光集合体１に特異的
に結合する第二抗体成分２２とよりなることが好まし
い。リンカー２は，被検体物質４に結合した第一ハプテ
ン６１を介して被検体物質４と結合することができる。
被検体物質４は，第一被検体結合物５１により第一ハプ
テン６１と特異的に結合させることができる。また，リ
ンカー２は，蛍光集合体１に結合した第二ハプテン１２
を介して結合することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は，蛍光集合体を用いた被
検体物質の検出方法であって，特にメンブレンフィルタ
を利用して，又は生体組織内において，被検体物質を感
度良く検出することができる方法に関する。

【０００２】

【従来技術】核酸やタンパク等を検出する場合，放射性
同位体元素（ＲＩ）方式に匹敵する系ではシグナル発生
物を単独で結合させては感度が不十分なので，ハプテン
など抗原性を有するものを結合させ，それに対する抗体
に酵素など化学増幅させられる物質により最終的にシグ
ナルを発生させて検出するシステムが一般的である。

【０００３】現在メンブレンフィルタ上で検出する非Ｒ
Ｉ方式で一番優れているのは，文献（Ｂｉｏ． Ｃｈｅ
ｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ， ３７１， ９５３−
９６５，１９９０）にみられる，ディゴキシゲニンを用
いた検出方法であろう。しかし，それでも，酵素の結合
反応等の操作が煩雑であるだけでなく，酵素反応による
シグナルの検出に数時間以上を要するため，簡単でかつ
迅速に検出できる方法の開発が望まれている。

【０００４】従来，放射性物質による標識法を用いない
で核酸等の被検体物質を検出する方法としては，リポソ
ームを蛍光物質のキャリアとして用いることにより被検
体物質を検出する方法が，Ｙｏｕｎｇらにより報告され
ている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ，２
８，５８，１９７９）。

【０００５】かかる検出方法は，図７に示すごとく，蛍
光物質９５を封入したリポソーム９３を調製するととも
に，抗体成分９４を結合させる。次に，このリポソーム
９３に，蛋白質等の抗原性を有する被検体物質９１を抗
原抗体反応により直接結合させる。次に，被検体物質９
１に結合しなかったリポソーム９３を洗浄により除去す
る。次に，リポソーム９３を界面活性剤により破壊し，
蛍光物質９５を反応溶液中に浮遊させ，蛍光物質９５の
蛍光を検出する。これにより，被検体物質を検出するこ
とができる。

【０００６】

【解決しようとする課題】しかしながら，上記従来法に
おいては，リポソーム９３と被検体物質９１との結合が
不安定である。そのため，一旦結合したリポソーム９３
が，洗浄時に未反応のリポソームとともに除去される。
それ故，大量の蛍光物質９５を反応溶液中に浮遊させる
ことができず，検出感度が低い。また，上記従来法にお
いては，リポソームを用いて蛍光物質を被検体物質に結
合させた後，リポソームを破壊して蛍光物質を取り出し
ている。そのため，反応溶液により蛍光物質の濃度が希
釈され，蛍光強度が弱く，検出感度が低くなる。

【０００７】更に，蛍光物質を封入したリポソ−ムを用
いて，メンブレンフィルタ上で被検体物質を検出する場
合には，被検体物質がメンブレンのメッシュの中に埋も
れたとき，大きな物質のリポソ−ムはリポソ−ム自身の
立体障害によりメンブレンの表面で止まってしまう。そ
のため，リポソ−ムに結合した抗体成分がメッシュの中
の被検体物質に届かない場合がある。

【０００８】また，生体組織中の被検体物質を検出する
場合にも，大きな物質のリポソ−ムが生体組織中の他の
物質に邪魔されて，リポソ−ムの表面に付着した抗体
が，被検体物質に届かない場合がある。従って，メンブ
レンフィルタ上及び生体組織内で被検体物質を検出する
場合には，特に検出感度が低い。本発明はかかる従来の
問題点に鑑み，優れた検出感度を発揮する，蛍光集合体
を用いた被検体物質の検出方法を提供しようとするもの
である。

【０００９】

【課題の解決手段】本発明は，固相担体に抗原性を有す
る被検体物質を固定し，該被検体物質に抗原抗体反応に
よりリンカーを結合させ，該リンカ−に抗原抗体反応に
より蛍光集合体を結合させ，上記蛍光集合体から発する
蛍光を検出する，蛍光集合体を用いた被検体物質の検出
方法であって，上記リンカ−は，上記被検体物質に特異
的に結合する第一抗体成分と，蛍光集合体に特異的に結
合する第二抗体成分とからなることを特徴とする蛍光集
合体を用いた被検体物質の検出方法にある。

【００１０】本発明において最も注目すべきことは，被
検体物質と蛍光集合体とを，２つの抗体成分を有するリ
ンカ−によりつなぎ合わせた状態となして検出している
ことである。本発明において，上記リンカ−は，被検体
物質と蛍光集合体とを１対１で結合させる仲介物質であ
る。このリンカーは，第一被検体結合物に特異的に結合
する第一抗体成分と，蛍光集合体に特異的に結合する第
二抗体成分とからなる。これにより，第一被検体結合物
と蛍光集合体とが，リンカ−の別々の活性部位に結合す
るため，第一被検体結合物と同数の，蛍光強度が高い蛍
光集合体を結合することができ，検出感度が高い。

【００１１】上記リンカ−の第一抗体成分は，第一被検
体結合物に結合した第一ハプテンを介して，上記第一被
検体結合物と特異的に結合することができる。上記被検
体物質が抗原性物質ではないため，リンカーの第一抗体
成分と直接結合することができないときには，上記第一
ハプテンを，被検体物質と特異的に結合する第一被検体
結合物を介して，上記被検体物質と特異的に結合するこ
とができる。もちろん，被検体物質が抗原性を有する物
質であっても，第一ハプテンを，上記第一被検体結合物
を介して，上記被検体物質と特異的に結合することがで
きる。上記第一被検体結合物は，第一ハプテンを被検体
物質に結合させるものであれば特に限定しない。例えば
被検体物質がアルカリホスファターゼである場合には，
抗アルカリホスファターゼ抗体を第一被検体結合物とし
て用いることができる。

【００１２】上記リンカーの第一抗体成分は，上記第一
ハプテンと抗原抗体反応により結合するものであれば特
に限定しない。かかる第一ハプテンとしては，例えば，
ｂｉｏｔｉｎ（ビオチン），ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ
（ディゴキシゲニン），ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ
（ＤＮＰ）（ジニトロフェノール），ｔｒｉｎｉｔｒｏ
ｐｈｅｎｏｌ（ＴＮＰ）（トリニトロフェノール），ｆ
ｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（フルオレセイン），ｔｅｔｒａ
ｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ ｉｓｏｔｈｉｏ
ｃｙａｎａｔｅ（ＴＲＩＴＣ）（テトラメチルローダミ
ン Ｂ イソチオシアネート），ｒｈｏｄａｍｉｎｅ
（ローダミン），Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（テキサス レッ
ド），Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ（ルシフェル イ
エロー），４，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−５，７−ｄｉｍ
ｅｔｈｙｌ−４−ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−
ｓ−ｉｎｄａｃｅｎｅ−３−ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ（ＢＯ
ＤＩＰＹ）（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−
４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−
プロピオニル），７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚ−２−ｏｘａ
−１，３−ｄｉａｚｏｌ−４−ｙｌ（ＮＢＤ）（７−ニ
トロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イ
ル），（Ｏ−１１−（５−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ
ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１−ｓｕｌｆｏｎｙｌ）ａｍ
ｉｎｏ）ｕｎｄｅｃｙｌ（ｄａｎｓｙｌ）（ダンシ
ル），ｃｏｕｍａｒｉｎ（クマリン），ＤＮＡ，ＲＮ
Ａ，又はウイルス等を用いることができる。

【００１３】例えば，第一ハプテンがビオチンの場合に
は，上記第一抗体成分としては抗ビオチン抗体又はスト
レプトアビジンを用いることができる。ストレプトアビ
ジンは，抗ビオチン抗体と同様にビオチンと特異的に結
合する物質であるため，ビオチンの抗体として働く物質
である。また，第一ハプテンがディゴキシゲニンの場合
には，上記第一抗体成分としては抗ディゴキシゲニン抗
体を用いることができる。第一ハプテンがＤＮＰの場合
には，上記第一抗体成分としては抗ＤＮＰ抗体を用いる
ことができる。

【００１４】また，上記リンカ−の第二抗体成分は，蛍
光集合体に結合した第二ハプテンを介して，上記蛍光集
合体と結合することができる。上記第二抗体成分は，抗
原抗体反応により上記第二ハプテンと結合するものであ
れば特に限定しない。かかる第二ハプテンとしては，例
えば，ｂｉｏｔｉｎ（ビオチン），ｄｉｇｏｘｉｇｅｎ
ｉｎ（ディゴキシゲニン），ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏ
ｌ（ＤＮＰ）（ジニトロフェノール），ｔｒｉｎｉｔｒ
ｏｐｈｅｎｏｌ（ＴＮＰ）（トリニトロフェノール），
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（フルオレセイン），ｔｅｔｒ
ａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ ｉｓｏｔｈｉ
ｏｃｙａｎａｔｅ（ＴＲＩＴＣ）（テトラメチルローダ
ミン Ｂ イソチオシアネート），ｒｈｏｄａｍｉｎｅ
（ローダミン），Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（テキサス レッ
ド），Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ（ルシフェル イ
エロー），４，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−５，７−ｄｉｍ
ｅｔｈｙｌ−４−ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−
ｓ−ｉｎｄａｃｅｎｅ−３−ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ（ＢＯ
ＤＩＰＹ）（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−
４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−
プロピオニル），７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚ−２−ｏｘａ
−１，３−ｄｉａｚｏｌ−４−ｙｌ（ＮＢＤ）（７−ニ
トロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イ
ル），（Ｏ−１１−（５−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ
ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１−ｓｕｌｆｏｎｙｌ）ａｍ
ｉｎｏ）ｕｎｄｅｃｙｌ（ｄａｎｓｙｌ）（ダンシ
ル），ｃｏｕｍａｒｉｎ（クマリン），ＤＮＡ，ＲＮ
Ａ，又はウイルス等を用いることができる。

【００１５】例えば，第二ハプテンがディゴキシゲニン
の場合には，上記第二抗体成分としては抗ディゴキシゲ
ニン抗体を用いることができる。第二ハプテンがＤＮＰ
の場合には，上記第二抗体成分としては抗ＤＮＰ抗体を
用いることができる。また，第二ハプテンがビオチンの
場合には，上記第二抗体成分としては抗ビオチン抗体又
はストレプトアビジンを用いることができる。上記第一
抗体成分と第二抗体成分とは互いに同種のものを用いる
こともできるが，検出感度向上のため異種同志のものを
用いることが好ましい。

【００１６】上記リンカーの形成方法としては，例えば
第一抗体成分及び第二抗体成分の非活性部位を切断又は
修飾し，その切断又は修飾部位同志を化合反応により結
合する方法がある。具体的には，例えば，第一抗体成分
の非活性部位をマレイミド化し，また，第二抗体成分の
非活性部位をペプシン等の酵素反応により切断して，そ
の末端にチオール基を露出させ，上記第一抗体成分と第
二抗体成分とを図３，図４に示すごとく結合することが
できる。同図中において，「Ｆａｂ」はアミノ基末端の
第一抗体成分又は第二抗体成分を意味し，「Ｆａｂ′」
はチオール基末端の第一抗体成分又は第二抗体成分を意
味する。

【００１７】上記蛍光集合体としては，複数の蛍光物質
を含むリポソ−ムを用いることが好ましい。リポソーム
は脂質人工膜の一種で，二分子膜よりなる閉鎖小胞であ
る。リポソームには多数の蛍光物質を取り込むことがで
き，蛍光強度を高くすることができる。また，蛍光物質
は，一般に，疎水性雰囲気下で蛍光強度が数十倍増加す
る性質を有する。また，蛍光物質は水溶液によく溶け
る。そのため，蛍光物質は，特に親水性と疎水性の両面
をもつリポソームに取り込まれることにより，蛍光強度
が５０〜２００倍増幅される。それ故，被検体物質の検
出感度が向上する。

【００１８】また，リポソームは，親水性物質を膜内水
相に，疎水性物質を分子膜の中に取り込むことができ
る。また，リポソームには，直接種々の物質を結合させ
ることができる。このため，リポソームには，利用され
にくかった物質も容易に取り込むことができ，蛍光物質
の選択幅が広がり，多色蛍光検出法にも応用できる。上
記リポソームとしては，例えば３０００〜４０００個の
リン脂質により形成されたものがある。

【００１９】上記リポソームに含まれる蛍光物質は，リ
ポソームと共有結合により結合している共有結合性蛍光
物質，又はリポソームの中に封入されている非共有結合
性蛍光物質等である。この中，蛍光物質は上記共有結合
性蛍光物質であることが好ましい。これにより，蛍光集
合体の蛍光強度が高くなり，被検体物質を感度良く検出
することができる。その理由は，上記共有結合性蛍光物
質はリポソームの表面に共有結合により結合しているた
め，多量の共有結合性蛍光物質を結合させた場合にも，
共有結合性蛍光物質自身が強い蛍光を発し続けるからで
ある。

【００２０】また，非共有結合性蛍光物質は，リポソー
ムを破壊することにより更に高感度に被検体物質を検出
できる。その理由は，蛍光集合体と被検体物質とはリン
カーにより確実に結合しているため，多量の非共有結合
性蛍光物質を被検体物質に結合することができる。故
に，非共有結合性蛍光物質が高濃度に存在することによ
る非共有結合性蛍光物質自身の蛍光が減少しても，リポ
ソームを破壊することにより，従来よりも高濃度の非共
有結合性蛍光物質を反応溶液中に放出することができ，
その結果，従来よりも高感度に被検体物質を検出するこ
とができる。

【００２１】上記共有結合性蛍光物質はリポソームを構
成する分子（例えば，リン脂質）と共有結合により結合
するため，その分子数が有する反応基の数と同程度ま
で，リポソームに結合させることができる。一方，１つ
のリポソームに結合する共有結合性蛍光物質が１０個未
満の場合には，蛍光集合体の蛍光強度が弱くなり，被検
体物質の検出感度が低下するおそれがある。

【００２２】上記共有結合性蛍光物質としては，例え
ば，クマリン骨格を有する化合物，ナフタレン骨格を有
する化合物，フルオレセイン骨格を有する化合物，ペリ
レン骨格を有する化合物，ピレン骨格を有する化合物，
アントラセン骨格を有する化合物，及びローダミン骨格
を有する化合物等がある。

【００２３】クマリン骨格を有する化合物としては，４
−メチルウンベリフェリル ホスホコリン，７−ヒドロ
キシクマリン─３─カルボン酸─オクタデシルエステル
等を用いることができる。ナフタレン骨格を有する化合
物としては，ＮＢＤ標識ホスファチジルエタノールアミ
ン，Ｄａｎｓｙｌ標識ホスファチジルエタノールアミン
等を用いることができる。

【００２４】フルオレセイン骨格を有する化合物として
は，フルオレセイン標識ホスファチジルエタノールアミ
ン等を用いることができる。ペリレン骨格を有する化合
物としては，１−ヘキサデカノイル−２−（３−ペリレ
ンドデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
等を用いることができる。

【００２５】ピレン骨格を有する化合物としては，１，
２−ビス−（１−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ
−３−ホスホコリン，１２−（１−ピレンドデカノイ
ル）ホスホコリン等を用いることができる。アントラセ
ン骨格を有する化合物としては，１２−（９−アンスロ
イロキシ）−ステアリン酸等を用いることができる。ロ
ーダミン骨格を有する化合物としては，ローダミン標識
ホスファチジルエタノールアミン等を用いることができ
る。

【００２６】上記非共有結合性蛍光物質は，リポソーム
を構成する分子に結合しているのではなく，リポソーム
の膜内水相又は疎水性の分子膜の中に取り込まれる。１
個のリポソームに取り込まれる非共用結合性蛍光物質の
数は，１０〜１００００であることが好ましい。１０未
満の場合には，蛍光集合体の蛍光強度が弱く，被検体物
質の検出感度が低下するおそれがある。一方，１０００
０を越える場合には，リポソームの水溶性が低下した
り，サイズが大きくなるので立体障害がかなり大きくな
るおそれがある。

【００２７】上記非共有結合性蛍光物質としては，４−
メチルウンベリフェロン，７−ヒドロキシ−４−ビフェ
ニル−ウンベリフェロン，３−ヒドロキシ−２−ナフト
エ酸２─フェニルアニリド，３−ヒドロキシ−２−ナフ
トエ酸─２，４─ジメチルアニリド，６─ブロモ─２─
ヒドロキシ─３─ナフトエ酸２─メチルアニリド，３─
ヒドロキシ─２─アントラノイック酸 ２─メチルアニ
リド，ピレン，フルオレセイン，ペリレン，ロ─ダミ
ン，テキサスレッド，又はＤＮＡ結合性蛍光物質等があ
る。ＤＮＡ結合性蛍光物質としては，Ｈｏｅｃｈｓｔ３
３２５８（ヘキスト・ジャパン社製），ＤＡＰＩ（ＳＩ
ＧＭＡ社製），エチジウム ブロミド等を用いることが
できる。

【００２８】上記蛍光集合体としては，複数の上記蛍光
物質を結合したポリペプチドを用いることもできる。上
記ポリペプチドの分子量は，１万〜５０万であり，その
側鎖上には複数の蛍光物質が結合している。かかるポリ
ペプチドとしては，例えば，ポリ−Ｌ−リジン等があ
る。

【００２９】ポリペプチドには，１００〜１００００個
の蛍光物質を結合させることが好ましい。１００個未満
の場合には，蛍光強度が弱くなり，被検体物質の検出感
度が低下するおそれがある。一方，１００００個を越え
る場合には，ポリペプチド自体の重合度が高くなり，ポ
リペプチドの水溶性が低下するおそれがある。

【００３０】上記固相担体は，被検体物質を一定の場所
に固定できるものであれば特に限定しないが，例えば，
ビ−ズ，プラスチックプレート，ガラスプレート，ゲ
ル，又は，メンブレン等を用いることができる。上記固
相担体は，被検体物質に特異的に結合する第二被検体結
合物を介して，上記被検体物質を固定することができ
る。例えば，被検体物質がアルカリホスファターゼの場
合には，第二被検体結合物は，抗アルカリホスファター
ゼ抗体である。

【００３１】上記被検体物質は，抗原性を有する物質で
あれば特に限定しないが，例えば，組織細胞，ウイル
ス，核酸，又はタンパク質がある。

【００３２】

【作用及び効果】本発明の被検体物質の検出方法におい
ては，被検体物質と蛍光集合体とを，リンカ−によりつ
なぎ合わせた状態となして検出している。リンカーは，
被検体物質及び蛍光集合体に対し，抗原抗体反応により
結合する。そのため，リンカーは，被検体物質と蛍光集
合体との間の結合安定性が高い。それ故，被検体物質
は，リンカーを介して蛍光集合体に確実に安定して結合
する。

【００３３】また，このリンカーは，第一被検体結合物
に特異的に結合する第一抗体成分と，蛍光集合体に特異
的に結合する第二抗体成分とからなる。そのため，第一
被検体結合物と蛍光集合体とが，リンカーの別々の活性
部位に結合するため，第一被検体結合物と同数の，蛍光
強度が高い蛍光集合体を結合することができ，検出感度
が高い。

【００３４】また，蛍光集合体は多数の蛍光物質の集合
体であり，蛍光強度が高いため，１つの蛍光集合体を被
検体物質に結合させるだけで，十分な蛍光強度が得ら
れ，被検体物質を充分に検出することができる。

【００３５】更に，従来法のように一旦蛍光集合体を被
検体物質に結合した後，蛍光集合体を破壊することな
く，そのまま蛍光集合体の蛍光を検出することができ
る。そのため，蛍光集合体は，反応溶液により希釈され
ることなく，そのまま１つの強い輝点として検出するこ
とができる。

【００３６】また，被検体物質と蛍光集合体とはリンカ
ーを介在させて結合している。そのため，被検体物質と
蛍光集合体との間はその距離が長くなっても確実に結合
することになる。このため，メンブレンフィルタ，ニト
ルセルロースフィルタ等のフィルタを用いて被検体物質
を検出する場合に，メッシュの中に被検体物質が埋もれ
てしまっても，該被検体物質は，フィルタ表面に存在す
る蛍光集合体と確実に結合することができる。

【００３７】また，生体組織中において被検体物質を検
出する場合に，他の物質の存在により被検体物質と蛍光
集合体との距離が近接できないときにも，該被検体物質
は，離れて存在する蛍光集合体と確実に結合することが
できる。従って，フィルタを用いた場合，及び生体組織
中においても，蛍光集合体の立体障害の問題を回避する
ことができ，感度良く，被検体物質を検出することがで
きる。更に，本発明の検出方法によれば，被検体物質を
簡単に，かつ短時間で検出することができる。

【００３８】上記のごとく，本発明によれば，優れた検
出感度を示す，蛍光集合体を用いた被検体物質の検出方
法を提供することができる。

【００３９】

【実施例】

実施例１ 本発明の実施例にかかる被検体物質の検出方法につい
て，図１，図２を用いて説明する。本例は，被検体物質
としてのアルカリホスファターゼを検出する方法であ
る。本例の検出方法の概要について説明すると，図１に
示すごとく，まず，第一抗体成分２１と第二抗体成分２
２とからなるリンカー２を調製する。また，蛍光物質１
０をリポソーム１１に封入した蛍光集合体１を調製す
る。この蛍光集合体１には，第二ハプテン１２を結合さ
せておく。

【００４０】次に，固相担体３に，第二被検体結合物３
２を介して，被検体物質４を固定する。次いで，被検体
物質４に，第一被検体結合物５１を結合させる。この第
一被検体結合物５１には予め第一ハプテン６１が結合し
ている。次に，第一ハプテン６１に抗原抗体反応によ
り，上記のリンカー２を介して，蛍光集合体１の第二ハ
プテン１２を結合させる。その後，蛍光集合体１から発
する蛍光を検出する。

【００４１】本例においては，固相担体３はビーズであ
り，第一被検体結合物５１及び第二被検体結合物３２は
抗アルカリホスファターゼ抗体である。また，第一ハプ
テン６１はディゴキシゲニン，第一抗体成分２１は抗デ
ィゴキシゲニン抗体，第二ハプテン１２はビオチン，第
二抗体成分２２は抗ビオチン抗体である。蛍光集合体１
は，共有結合性蛍光物質としてのローダミンを結合させ
たリポソーム１１である。

【００４２】以下，上記アルカリホスファターゼの検出
方法について詳説する。 （１）リンカーの調製 抗ディゴキシゲニン抗体の修飾 抗ディゴキシゲニン抗体（ベーリンガー社製）２ｍｇ
を，０．１Ｍリン酸緩衝液（１ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ，０．
１Ｍ ＺｎＣｌ₂ ，ｐＨ７）３００μｌに溶解し，さら
に，ＳＭＣＣ（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ−
ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）−ｃｙｃｌｏｈｅｘ
ａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ／ＤＭＳＯ，５ｍ
ｇ／２５０μｌ）を１０μｌ加え，３０℃で３０分間静
置し，遠心後，上清をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（カ
ラムサイズ：１．０×１５ｃｍ：０．１Ｍ リン酸緩衝
液，１ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ，０．１Ｍ ＺｎＣｌ₂ ，ｐＨ
７）でゲルろ過により脱塩した。高分子の溶出成分を集
め，遠心限外ろ過で２００μｌに濃縮し，マレイミド化
抗ディゴキシゲニン抗体溶液とした。

【００４３】 抗ビオチン抗体の修飾 抗ビオチン抗体（ベクター社製）３ｍｇを０．１Ｍ 酢
酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ４．５）で透析し，ペプシン
（シグマ社製）０．２ｍｇを加え，３７℃で１６時間静
置した。沈澱を遠心分離により除去し，その上清をゲル
ろ過した（ウルトロゲルＡｃＡ４４，カラムサイズ：
１．０×４５ｃｍ，緩衝液：０．１Ｍ リン酸 ｐＨ：
７）。

【００４４】抗体蛋白の溶出画分を集め，硫酸アンモニ
ウムを濃度０．６６ｇ／ｍｌ（重量％）で加え，抗体を
沈澱させた（塩析）。遠心分離後，沈澱をリン酸緩衝液
（０．１ｍｏｌ ｐＨ：６）０．４ｍｌに溶解し，防腐
のため ０．１ｇ／ｍｌアジ化ナトリウム４μｌ加え，
Ｆ（ａｂ′）₂ フラグメント溶液とした。

【００４５】Ｆ（ａｂ′）₂ 溶液に，０．１Ｍ メルカ
プトエチルアミン塩酸塩（０．１Ｍリン酸緩衝液 ｐ
Ｈ：６，５ｍＭ ＥＤＴＡ）５０μｌを加え，３７℃で
９０分静置した。ゲルろ過後，可変部単体（Ｆａｂ′）
画分を集め，塩析により０．４ｍｌに濃縮し，チオール
化抗ビオチン抗体溶液とした。

【００４６】 抗ディゴキシゲニン抗体と抗ビオチン
抗体との結合反応 のマレイミド化抗ディゴキシゲニン抗体溶液とのチ
オール化抗ビオチン抗体溶液とを混合し，３０℃で１時
間インキュベートした後，ゲルろ過（ウルトロゲルＡｃ
Ａ４４，０．１Ｍ リン酸緩衝液，０．１Ｍ ＮａＣ
ｌ：ｐＨ７）を行ない，抗ディゴキシゲニン抗体と抗ビ
オチン抗体とを結合してなるリンカー（図３参照）を分
取した。

【００４７】（２）蛍光物質含有リポソームの調製 レシチン（１μｍｏｌ），コレステロール（０．６５μ
ｍｏｌ），ローダミン−ＤＨＰＥ（０．２５μｍｏｌ）
及びビオチン−Ｘ−ＤＨＰＥ（０．１μｍｏｌ）を，溶
媒としてのクロロホルム５ｍｌに溶解して，ナスフラス
コに入れ，よく攪拌した後エバポレータで溶媒を除去し
た。

【００４８】再び，このナスフラスコに，溶媒としての
クロロホルムを３ｍｌ入れ，攪拌した後，ロータリーエ
バポレータで溶媒を除去した。これを３〜５回繰り返し
た。するとフラスコ壁面に薄膜が形成されるので，これ
を真空デシケーターに移して，１昼夜真空ポンプで真空
吸引して溶媒を完全に除去した。調製されたリポソーム
の表面には，蛍光物質（ローダミン）が共有結合により
結合している。

【００４９】次いで，フラスコ内部を窒素で置換し，次
いで，バッファー（０．１ｍｏｌ／リットル リン酸緩
衝液，５ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ：６）を５ｍｌ加え，約
６０℃の温水槽に浸した後，バスタイプの超音波処理機
で２０分間超音波処理をした。するとナスフラスコの壁
面から薄膜状のリポソームが剥がれながら，小径リポソ
ームが調製された。

【００５０】リポソームサイズを均一化するために，細
孔０．２μｍのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦ
Ｅ）メンブレンフィルターでろ過することにより，リポ
ソームを押し出し，その径を０．２μｍ以下にそろえ
た。得られたリポソームは，３０００〜４０００のレシ
チンからなる脂質人工膜である。

【００５１】（３）蛍光物質含有リポソームを用いた被
検体物質の検出 ポリサイエンス社製のＰＯＬＹＢＥＡＤ，ＣＡＲＢＯＸ
ＹＬＡＴＥＭＩＣＲＯＳＰＨＥＲＥＳ（ビーズ）を用
い，スライドグラス上で微量のアルカリホスファターゼ
を検出した。

【００５２】即ち，まず，抗アルカリホスファターゼ抗
体をビーズに固定した。次に，アルカリホスファターゼ
（ＡＰ）を含む溶液を，１個のビーズに１個のＡＰが結
合する割合で反応させた。更に，ディゴキシゲニン
（Ｄ）で標識された抗アルカリホスファターゼ抗体を反
応させた。

【００５３】次に，過剰の抗アルカリホスファターゼ抗
体をＴＲＩＳ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ─
ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．５）により洗
浄した。次いで，上記のリンカー抗体溶液を反応させた
後，更に，上記のＴＲＩＳｂｕｆｆｅｒにより未反応の
リンカー抗体溶液を良く洗浄した。次に，上記の蛍光物
質含有リポソームを３０分間，反応させ，蛍光を検出し
た。検出は蛍光顕微鏡（倍率１０００倍）で観察を行っ
た。その結果，図２に示すごとく，分散したビーズに結
合したと判断される蛍光輝点が検出できた。

【００５４】１個のリポソームが同じ輝点の大きさに見
えた。このことから，１個のビーズに１個のリポソーム
が結合し，検出できたということになる。つまり，今回
のように分散させた標的物質でなくとも，リポソームが
結合できる反応基が１個あれば，検出できるということ
で，臨床分野などで，超高感度な検出系といえる。

【００５５】実施例２ 本例においては，ナイロンメンブレンフィルタを用い
て，被検体物質としてのラムダＤＮＡの検出を行った。
本例の検出方法の概要について図５を用いて説明する
と，まず，固相担体３０に被検体物質４００を固定し
た。次に，被検体物質４００に，第一ハプテン６１０を
結合させた被検体物質４００を結合させた。次に，第一
ハプテン６１０に，抗原抗体反応により，実施例１のリ
ンカー２を介して，蛍光集合体１の第二ハプテン１２を
結合させ，蛍光集合体１から発する蛍光を検出した。

【００５６】本例においては，固相担体３０はナイロン
メンブレンフィルタである。また，第一ハプテン６１０
はディゴキシゲニン，第一抗体成分２１０は抗ディゴキ
シゲニン抗体であって，第二ハプテン１２はビオチン，
第二抗体成分２２０は抗ビオチン抗体である。蛍光集合
体１は，共有結合性蛍光物質としてのローダミンを結合
させたリポソーム１１である。尚，上記第一抗体成分２
１０と第二抗体成分２２０とよりなるリンカー２，及び
蛍光集合体１は，実施例１と同様のものである。

【００５７】以下，上記ラムダＤＮＡの検出方法につい
て詳説する。まず，被検体物質としてラムダＤＮＡをデ
ィゴキシゲニン（Ｄ）によりラムダＤＮＡを標識し，
０，１０² ，１０³ ，１０⁴ ，１０⁵ ，１０⁶ ，１０⁷
分子／ｓｐｏｔ（非特異的ＤＮＡとして１００ｎｇ／ｍ
ｌ ニシン精子ＤＮＡを含む。）となるように希釈を行
ない，ナイロンメンブレンフィルタにスポットし，５０
℃で１５分間加熱して，固定した。

【００５８】ナイロンメンブレンフィルタをブロッキン
グ処理し，リンカーを反応させ，リンカーの抗ディゴキ
シゲニン抗体を，ディゴキシゲニンで標識したラムダＤ
ＮＡに結合させた。次に，過剰のリンカーをＴＲＩＳ
ｂｕｆｆｅｒにより洗浄して，未反応物を除去した。そ
の後，複数の蛍光物質（ローダミン）を含有するリポソ
ーム１１を室温で５時間反応させ，蛍光を検出した。上
記リンカー２とリポソーム１１は，実施例１と同様に調
製したものを用いた。

【００５９】上記蛍光を蛍光顕微鏡（倍率４００倍）で
観察すると，１０³ 分子のスポットまで輝点として検出
できた。この結果より，１分子のラムダＤＮＡが１つの
輝点として検出できた。このことから，１個の上記リポ
ソームが，リンカーを介して，ラムダＤＮＡに結合する
ことにより，これを検出できることがわかる。つまり，
被検体物質を特異的に検出できる反応系が確立できたと
いえる。

【００６０】実施例３ 本例においては，ニトロセルロースフィルタを用いて，
被検体物質として，ビオチン化タンパク（抗ウサギ抗
体）の検出を行った。本例の検出方法の概要について図
６を用いて説明すると，まず，第一ハプテン６１１を有
する被検体物質４１０を固相担体３１に固定する。次
に，第一ハプテン６１１に，抗原抗体反応により，第一
抗体成分２１１と第二抗体成分２２１とよりなるリンカ
ー２０を介して，蛍光集合体１の第二ハプテン１２１を
結合させ，蛍光集合体１から発する蛍光を検出する。

【００６１】本例においては，固相担体３１はニトロセ
ルロースフィルタである。また，第一ハプテン６１１は
ビオチン，第一抗体成分２１１は抗ビオチン抗体であっ
て，第二抗体成分２２１は抗ジニトロフェノール抗体，
第二ハプテン１２１はジニトロフェノールである。蛍光
集合体１は，共有結合性蛍光物質としてのローダミンを
結合させたリポソーム１１である。

【００６２】以下，上記抗ウサギ抗体の検出方法につい
て詳説する。 （１）リンカーの調製 抗ビオチン抗体の修飾 抗ビオチン抗体（ベクター社製）３ｍｇを０．１Ｍ酢酸
−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ４．５）で透析し，ペプシン
（シグマ社製）０．２ｍｇを加え，３７℃で１６時間静
置した。沈澱を遠心分離により除去し，その上清をゲル
ろ過（ウルトロゲルＡｃＡ４４，カラムサイズ：１．０
×４５ｃｍ，緩衝液：０．１Ｍリン酸ｐＨ：７）した。

【００６３】抗ビオチン抗体蛋白の溶出画分を集め，硫
酸アンモニウムを濃度０．６６ｇ／ｍｌ（重量％）で加
え，抗ビオチン抗体を沈澱させた（塩析）。遠心分離
後，沈澱をリン酸緩衝液（０．１ｍｏｌ ｐＨ：６）
０．４ｍｌに溶解し，防腐のため０．１ｇ／ｍｌアジ化
ナトリウム４μｌ加え，Ｆ（ａｂ′）₂ フラグメント溶
液とした。

【００６４】Ｆ（ａｂ′）₂ フラグメント溶液に，０．
１Ｍメルカプトエチルアミン塩酸塩（０．１Ｍ リン酸
緩衝液 ｐＨ：６，５ｍＭ ＥＤＴＡ）５０μｌを加
え，３７℃で９０分静置した。ゲルろ過後，可変部単体
（Ｆａｂ′）画分を絵詰め，塩析により０．４ｍｌに濃
縮し，抗ビオチン抗体（Ｆａｂ′）溶液とした。

【００６５】上記抗ビオチン抗体（Ｆａｂ′）溶液に，
２ｍｇ／ｍｌ １，６−ｂｉｓ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｈ
ｅｘａｎｅを３０ｍｌ加え，３０℃で１時間反応させ，
反応物をゲルろ過（Ｓｅｐｈｅｄｅｘ Ｇ−２５（カラ
ムサイズ：１．０×１５ｃｍ：０．１Ｍ リン酸緩衝
液，１ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ，０．１Ｍ ＺｎＣｌ₂ ，ｐＨ
７））により精製し，マレイミド化抗ビオチン抗体（Ｆ
ａｂ′）溶液とした。

【００６６】 抗ジニトロフェノール（ＤＮＰ）抗体
の修飾 抗ジニトロフェノール（ＤＮＰ）抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）をの抗ビオチン抗体の修飾
法Ｆａｂ′フラグメント画分まで，還元させ，抗ＤＮＰ
抗体（Ｆａｂ′）溶液とした。

【００６７】 抗ビオチン抗体（Ｆａｂ′）溶液と抗
ＤＮＰ抗体（Ｆａｂ′）溶液の結合反応 の抗ビオチン抗体（Ｆａｂ′）溶液との抗ＤＮＰ抗
体（Ｆａｂ′）溶液とを混合し，３０℃で１時間インキ
ュベートした後，ゲルろ過（ウルトロゲルＡｃＡ４４，
０．１Ｍ リン酸緩衝液，０．１Ｍ ＮａＣｌ；ｐＨ
７）を行ない，抗ビオチン抗体と抗ＤＮＰ抗体とを結合
してなるリンカー（図４参照）を分取した。

【００６８】（２）蛍光物質含有リポソームの調製 実施例１で用いたビオチン−Ｘ−ＤＥＰＥの変わりに，
０．１μｍｏｌのＤＮＰをリポソームに結合させた。そ
の他は，実施例１と同様に蛍光物質含有リポソームを調
製した。

【００６９】（３）蛍光物質含有リポソームを用いたタ
ンパクの検出 ビオチンで標識した抗ウサギ抗体を，０，１０² ，１０
³ ，１０⁴ ，１０⁵ ，１０⁶ ，１０⁷ 分子／ｓｐｏｔと
なるように希釈を行ない，ニトロセルロースフィルター
にスポットし，風乾により固定した。なおこの際全ての
スポットが，非特異的物質としての１０¹⁰分子／ｓｐｏ
ｔのＢＳＡ（牛血清アルブシン）を含むようにした。

【００７０】ニトロセルロースフィルターをブロッキン
グ処理し，次に，リンカーを反応させて，リンカーの抗
ビオチン抗体を，ビオチンで標識した抗ウサギ抗体に結
合させた。次に，過剰のリンカーをＴＲＩＳ ｂｕｆｆ
ｅｒにより洗浄して，未反応の反応物を除いた後，ＤＮ
Ｐ標識ローダミン含有リポソームを室温で５時間反応さ
せた。

【００７１】蛍光顕微鏡で観察すると，１０⁴ 分子のス
ポットまで輝点として検出できた。この輝点の数が１０
⁴ 分子確認できる事から，１分子の抗ウサギ抗体が１つ
の輝点として検出できた事になる。このことから，１個
の上記リポソームがリンカーを介して抗ウサギ抗体に結
合することにより，抗ウサギ抗体を検出できることがわ
かる。つまり，一分子の被検体物質を特異的に検出でき
る反応系が確立できたといえる。尚，１０⁴ 分子以下の
スポットについては，フィルターに対するタンパクの吸
着能の低下により検出できなかった。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１の被検体物質の検出方法を示す概要説
明図。

【図２】実施例１において，蛍光集合体により検出され
たアルカリホスファターゼの粒子構造を示す蛍光顕微鏡
写真（倍率１０００倍）による説明図。

【図３】本発明の，リンカーの第一抗体成分と第二抗体
成分との結合状態を示す説明図。

【図４】本発明の，リンカーの第一抗体成分と第二抗体
成分との，他の結合状態を示す説明図。

【図５】実施例２の被検体物質の検出方法を示す説明
図。

【図６】実施例３の被検体物質の検出方法を示す説明
図。

【図７】従来例の問題点を示す説明図。

【符号の説明】

１．．．蛍光集合体， １０．．．蛍光物質， １１．．．リポソーム， １２，１２１．．．第二ハプテン， ２，２０．．．リンカー， ２１，２１０，２１１．．．第一抗体成分， ２２，２２０，２２１．．．第二抗体成分， ３，３０，３１．．．固相担体， ３２，４５，４９．．．第二被検体結合物， ４，４００，４１０．．．被検体物質， ５１．．．第一被検体結合物， ６１，６１０，６１１．．．第一ハプテン，

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 近藤 恭光 愛知県刈谷市朝日町２丁目１番地 アイシ ン精機株式会社内

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 固相担体に抗原性を有する被検体物質を
   固定し，該被検体物質に抗原抗体反応によりリンカーを
   結合させ，該リンカ−に抗原抗体反応により蛍光集合体
   を結合させ，上記蛍光集合体から発する蛍光を検出す
   る，蛍光集合体を用いた被検体物質の検出方法であっ
   て，上記リンカ−は，上記被検体物質に特異的に結合す
   る第一抗体成分と，蛍光集合体に特異的に結合する第二
   抗体成分とからなることを特徴とする蛍光集合体を用い
   た被検体物質の検出方法。
2. 【請求項２】 請求項１において，上記リンカ−は，被
   検体物質に結合した第一ハプテンを介して，上記被検体
   物質と特異的に結合していることを特徴とする蛍光集合
   体を用いた被検体物質の検出方法。
3. 【請求項３】 請求項２において，上記第一ハプテン
   は，被検体物質と抗原抗体反応により結合する第一被検
   体結合物を介して，上記被検体物質と特異的に結合して
   いることを特徴とする蛍光集合体を用いた被検体物質の
   検出方法。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか一項において，
   上記リンカ−は，蛍光集合体に結合した第二ハプテンを
   介して，上記蛍光集合体と結合していることを特徴とす
   る蛍光集合体を用いた被検体物質の検出方法。
5. 【請求項５】 請求項２〜４のいずれか一項において，
   上記第一ハプテンは，ビオチン，ディゴキシゲニン，ジ
   ニトロフェノール，トリニトロフェノール，フルオレセ
   イン，テトラメチルローダミン Ｂ イソチオシアネー
   ト，ローダミン，テキサスレッド，ルシフェル イエロ
   ー，４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ
   −３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオ
   ニル，７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾ
   ール−４−イル，ダンシル，クマリン，ＤＮＡ，ＲＮ
   Ａ，又はウイルスのいずれか一種であることを特徴とす
   る蛍光集合体を用いた被検体物質の検出方法。
6. 【請求項６】 請求項４，５のいずれか一項において，
   上記第二ハプテンは，ビオチン，ディゴキシゲニン，ジ
   ニトロフェノール，トリニトロフェノール，フルオレセ
   イン，テトラメチルローダミン Ｂ イソチオシアネー
   ト，ローダミン，テキサスレッド，ルシフェル イエロ
   ー，４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ
   −３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオ
   ニル，７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾ
   ール−４−イル，ダンシル，クマリン，ＤＮＡ，ＲＮ
   Ａ，又はウイルスのいずれか一種であることを特徴とす
   る蛍光集合体を用いた被検体物質の検出方法。
7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか一項において，
   上記第一抗体成分と第二抗体成分とは，チオール基とマ
   レイミド基とにより結合されていることを特徴とする蛍
   光集合体を用いた被検体物質の検出方法。
8. 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか一項において，
   上記蛍光集合体は，複数の蛍光物質を取り込んだリポソ
   ームであることを特徴とする蛍光集合体を用いた被検体
   物質の検出方法。
9. 【請求項９】 請求項８において，上記リポソームに取
   り込まれた蛍光物質は，リポソームと共有結合により結
   合している共有結合性蛍光物質，又はリポソームの中に
   封入されている非共有結合性蛍光物質であることを特徴
   とする蛍光集合体を用いた被検体物質の検出方法。
10. 【請求項１０】 請求項９において，上記共有結合性蛍
    光物質は，クマリン骨格を有する化合物，ナフタレン骨
    格を有する化合物，フルオレセイン骨格を有する化合
    物，ペリレン骨格を有する化合物，ピレン骨格を有する
    化合物，アントラセン骨格を有する化合物，及びローダ
    ミン骨格を有する化合物のグループから選ばれる一種又
    は二種以上であることを特徴とする蛍光集合体を用いた
    被検体物質の検出方法。
11. 【請求項１１】 請求項９において，上記非共有結合性
    蛍光物質は，４−メチルウンベリフェロン，７−ヒドロ
    キシ−４−ビフェニル−ウンベリフェロン，３−ヒドロ
    キシ−２−ナフトエ酸 ２─フェニルアニリド，３−ヒ
    ドロキシ−２−ナフトエ酸─２，４─ジメチルアニリ
    ド，６─ブロモ─２─ヒドロキシ─３─ナフトエ酸２─
    メチルアニリド，３─ヒドロキシ─２─アントラノイッ
    ク酸 ２─メチルアニリド，ピレン，フルオレセイン，
    ペリレン，ロ─ダミン，テキサスレッド，及びＤＮＡ結
    合性蛍光物質のグループから選ばれる一種又は二種以上
    であることを特徴とする蛍光集合体を用いた被検体物質
    の検出方法。
12. 【請求項１２】 請求項１〜７のいずれか一項におい
    て，上記蛍光集合体は，複数の蛍光物質を結合したポリ
    ペプチドであることを特徴とする蛍光集合体を用いた被
    検体物質の検出方法。
13. 【請求項１３】 請求項１〜１２のいずれか一項におい
    て，上記固相担体は，ビ−ズ，プラスチックプレート，
    ガラスプレート，ゲル，又はメンブレンのいずれかであ
    ることを特徴とする蛍光集合体を用いた被検体物質の検
    出方法。
14. 【請求項１４】 請求項１〜１３のいずれか一項におい
    て，上記被検体物質は，該被検体物質に特異的に結合す
    る第二被検体結合物を介して，上記固相担体に固定する
    ことを特徴とする蛍光集合体を用いた被検体物質の検出
    方法。
15. 【請求項１５】 請求項１〜１４のいずれか一項におい
    て，上記被検体物質は，組織細胞，ウイルス，核酸，又
    はタンパク質のいずれかであることを特徴とする蛍光集
    合体を用いた被検体物質の検出方法。