JPH0829427A

JPH0829427A - 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス関連抗原のイムノアッセイ、それに使用するモノクローナル抗体、およびこの抗体を産生するハイブリドーマ

Info

Publication number: JPH0829427A
Application number: JP6183904A
Authority: JP
Inventors: Tomiko Kashiwaguma; 富子柏熊; Shintaro Yagi; 慎太郎八木; Akira Hasegawa; 明長谷川; Tadahiro Kajita; 忠宏梶田; Yosuke Ota; 陽介太田; Hiroyuki Mori; 浩之森
Original assignee: International Reagents Corp; Tonen Corp
Current assignee: Tonen General Sekiyu KK; Sysmex International Reagents Co Ltd
Priority date: 1994-07-12
Filing date: 1994-07-12
Publication date: 1996-02-02
Anticipated expiration: 2016-10-09
Also published as: US5871904A; EP0717104B1; EP0717104A2; EP0717104A3; JP3217600B2; DE69532062D1; DE69532062T2

Abstract

(57)【要約】【構成】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスＣＯＲＥ構造蛋白質
上の抗原決定部位に対する結合特異性を有するモノクロ
ーナル抗体、その製造方法、該モノクローナル抗体を用
いた非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス関連抗原のイムノアッセ
イ、およびこのイムノアッセイを実施するための検査キ
ット。【効果】モノクローナル抗体は、非Ａ非Ｂ型肝炎の患
者血清中の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスＣＯＲＥ構造蛋白を
特異的に認識するため、非Ａ非Ｂ型肝炎の各種免疫学的
診断薬の抗体として広く応用することができ、非Ａ非Ｂ
型肝炎の確定診断が行なえる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、検体中の非Ａ非Ｂ型肝
炎ウイルスの構造領域ＣＯＲＥ蛋白質を検出または定量
するイムノアッセイ、ならびにこのイムノアッセイに使
用するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ、及び該モノクローナル抗体を含
む検査キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】輸血後肝炎は、その名の通り輸血によっ
て引き起こされる肝炎を意味する。この輸血後肝炎の原
因ウイルスとして、最初にＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）
が同定されたが、この発見により輸血後肝炎の原因ウイ
ルスがＨＢＶ１種のみでなく、他の原因ウイルスがある
ことが示唆された。この原因ウイルスは非Ａ非Ｂ型肝炎
ウイルス（以下ＮＡＮＢＶと略称する場合がある）、あ
るいはＣ型肝炎ウイルス（以下ＨＣＶと略称する場合が
ある）と名付けられ、その発見が待たれていた。

【０００３】非Ａ非Ｂ型肝炎は、輸血後肝炎の９割以上
を占め、しかも感染者の５〜８割が慢性化し、肝硬変、
肝癌へと高率で移行することから、その生理学的および
生理的機能について大きな感心が持たれていた。この非
Ａ非Ｂ型肝炎の診断に関しては、初期にはＡ型肝炎、Ｂ
型肝炎およびＤ型肝炎、さらには肝障害を引き起こす既
知のウイルス（例えば、サイトメガロウイルスやエプス
タインバーウイルス）による肝炎か否かの診断を行なっ
た後、これらに該当しない場合に非Ａ非Ｂ型肝炎と診断
する、いわゆる除外診断法が主流であった。

【０００４】その後、本ウイルスに関しては、１９８９
年ＣｈｏｏらのグループによりＮＡＮＢＶ感染チンパン
ジーの血漿から遺伝子がクローニングされ（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ２４４：３５９−３６２，１９８９）、その遺伝子
の非構造蛋白領域の一部（ＮＳ３〜ＮＳ４）を酵母に組
み込んで得られたリコンビナント抗原を用いた抗体測定
による診断法が開発された（Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：
３６２−３６４，１９８９）；特表平２−５００８８０
号公報）。

【０００５】第１世代診断薬として米国カイロン社で開
発されたリコンビナント抗原（ｃ１００−３蛋白質）を
用いた試薬では、慢性非Ａ非Ｂ型肝炎患者の７〜８割で
陽性を示すことが明らかとなったが、感染初期にはｃ１
００−３抗体価が上昇せず検出できないため、感染して
いても検出できないケースや自己免疫疾患患者の血清や
高γグロブリン血清などではかなり非特異反応が見られ
ることがわかってきた。

【０００６】その後、ウイルスの構造蛋白であるＣＯＲ
Ｅ抗原を加えた第２世代診断薬の開発により、約９割の
患者を検出することが可能となっているが、散発性非Ａ
非Ｂ型肝炎患者の検出率は約４割に過ぎない。また、こ
れら抗体検出法以外に、ＰＣＲ（ポリメレースチェーン
リアクション）法（Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：１３５０
−１３５４，１９８５）やＤＮＡプローブ法による非Ａ
非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の存在の有無を確認する遺伝
子検出法が開発されている。

【０００７】しかし、ＰＣＲ法を用いた検査法には、い
くつかの困難な問題が存在している。例えば、ＰＣＲ法
を行なうためには、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスがＲＮＡウ
イルスであることからＤＮＡへの逆転写が必須となり、
ＲＮＡからＤＮＡへの転写の際にロスを生じやすいこ
と、特殊な増幅設備等を必要とし、かつ操作が煩雑であ
ることから一度に大量の検体を処理することができない
こと、さらにはコンタミネーションを起こしやすいこと
などが挙げられる。

【０００８】一方、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスは、体内で
のウイルス量が少ないことやｉｎｖｉｔｒｏでの増殖系
が確立していないために、現在でもネイティブなウイル
ス粒子や精製ウイルス蛋白を用いた免疫血清は得られて
いない。ヒト血清は、個体によって抗原に対する抗体の
産生が異なり、高い抗体価を示すものや、全く抗体を産
生しない個体がある。また、ある領域の抗原に対する抗
体は含んでいるが、他の領域の抗原に対する抗体は全く
含んでいない個体もある。さらにポリクローナル抗体で
あるために、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス以外の物質に対す
る抗体も含んでおり、交差反応等も充分考慮して結果を
判定しなければならない。

【０００９】従って、抗体で未知の抗原評価を行なう場
合には、充分な注意が必要となる。このような状況の中
で、確定診断のためのウイルス検出法が注目されてい
る。

【００１０】本発明以前に非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスに対
するモノクローナル抗体に関して、欧州特許第３１８，
２１６号および同第３８８，２３２号などの特許明細書
において、当業者により容易に産生できるとの記載がな
されているが、その可能性が推測されているだけであ
り、具体例は示されていない。これとは別に、非Ａ非Ｂ
型肝炎ウイルスのＣＯＲＥ蛋白質上のエピトープに対し
て特異性を有するモノクローナル抗体も開示（特開平５
−２６０９６０号公報）されているが、本発明とはモノ
クローナル抗体の製造方法が異なり、認識するエピトー
プならびに測定法、検出感度など全く異なるものであ
る。

【００１１】

【発明が解決しようとする問題点】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイ
ルスは、ＲＮＡウイルス種で一般的に観察される高度の
変異を起こすことが知られている。また上述したよう
に、感染患者内ではウイルス粒子自体が極めて少なく、
そのため患者血中に含まれる該ウイルス関連抗原に対す
る抗体量も少ないことから、依然として抗体検出試薬で
は検出できない患者が存在する。また、非Ａ非Ｂ型肝炎
は予防法が確立されていないばかりか、感染者（キャリ
ア）の多くは１０〜３０年で肝硬変や肝癌へ移行するこ
とが推定されており、早期発見と早期治療が重要である
ことは言うまでもない。近年、慢性疾患の患者に対して
インターフェロン（以下ＩＦＮと略す）投与等の治療法
が効果を上げているが、ＩＦＮ治療によって肝機能異常
を鎮静化できるとは限らず、ＩＦＮ投与終了後に再発す
る症例も多く報告され、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスを完全
に排除するのは困難であるのが現状である。寧ろ、治療
や予後の推定にとって重要なのは病態の把握であり、単
に抗体を検出するだけでなく、より意義のあるウイルス
関連マーカー（抗原）の測定が強く望まれている。

【００１２】すなわち、血清中の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイル
ス粒子、特にウイルス関連抗原を簡便かつ高収率で得ら
れる方法と、その検出および定量法の開発が望まれてい
た。

【００１３】従って、本発明の目的は、検体中の非Ａ非
Ｂ型肝炎ウイルス関連抗原を濃縮し、変性させるための
簡便な処理方法を提供することである。

【００１４】本発明の別の目的は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイ
ルス関連抗原を特異的に認識するモノクローナル抗体お
よび該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマお
よびこれらを産生するための方法を提供するこである。

【００１５】本発明のさらに別の目的は、該モノクロー
ナル抗体を用いて非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス関連抗原を高
感度で検出ならびに定量するための測定方法を提供する
ことである。

【００１６】

【問題点を解決するための手段】本発明者らは、これま
でに非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの構造蛋白質領域に関し
て、モノクローナル抗体による抗原検出法を鋭意研究し
てきた。その結果、検体（例えば血清）をポリエチレン
グリコールと共に遠心し、沈殿物をアルカリ処理を行な
うことによりウイルス粒子を濃縮ならびに分解できるこ
とを見いだした。さらに、ＣＯＲＥ構造蛋白質遺伝子を
大腸菌で発現させたＨＣＶ抗原活性を有するリコンビナ
ントポリペプチドを免疫原として、ＨＣＶ構造蛋白質に
非常に特異的なモノクローナル抗体を得ることに成功
し、さらに該モノクローナル抗体とウイルス粒子のＣＯ
ＲＥ構造蛋白質とが特異的に反応することを見い出し、
本発明を完成させるに至った。

【００１７】従って、本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイル
スＣＯＲＥ構造蛋白質上の抗原決定部位に対する結合特
異性を有するモノクローナル抗体を提供する。

【００１８】具体的には、配列番号１に示されるアミノ
酸配列をコードする塩基配列を含む非Ａ非Ｂ型肝炎ウイ
ルスのＣＯＲＥ構造蛋白質遺伝子断片を含む組換えベク
ターで宿主細胞を形質転換した後、この形質転換宿主を
培養せしめ、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原活性を有する
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでなるポリペ
プチドを製造し、該ポリペプチドを免疫原とするモノク
ローナル抗体作製法に基づいて、本発明のモノクローナ
ル抗体を製造することができる。モノクローナル抗体
は、上記非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスＣＯＲＥ構造蛋白質で
免疫したマウスから誘導されるリンパ球とミエローマ細
胞とを融合することにより産生したハイブリドーマ細胞
系から得られ、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス構造蛋白質の検
出ならびに定量のためのイムノアッセイおよび検査キッ
トに使用し得る。

【００１９】従って、本発明は、このようなハイブリド
ーマ細胞系、イムノアッセイおよび検査キットをも提供
する。

【００２０】さらに本発明は、配列番号２〜５に示され
るアミノ酸配列またはその部分配列を特異的に認識する
モノクローナル抗体、この抗体を用いることを特徴とす
る非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス構造蛋白質の検出ならびに定
量のためのイムノアッセイ、およびこのイムノアッセイ
を実施するための検査キットを提供する。

【００２１】イムノアッセイは、（ａ）検体中の非Ａ非
Ｂ型肝炎ウイルス又はその関連抗原をポリエチレングリ
コールと共に遠心濃縮し、次いでアルカリで処理する段
階、（ｂ）該検体と本発明のモノクローナル抗体を接触
させて抗原−抗体複合体を形成させる段階、（ｃ）該抗
原−抗体複合体の存在、およびこれにより非Ａ非Ｂ型肝
炎ウイルス関連抗原の存在を検出ならびに定量する段階
を包含する。

【００２２】このアッセイにおいては、検体をポリエチ
レングリコールと共に遠心して濃縮し、沈殿物を水酸化
ナトリウム等のアルカリ剤で処理することによりウイル
ス粒子を分解するとともに共存する抗体を失活させる前
処理法を含むことを特徴とする。さらに、非Ａ非Ｂ型肝
炎ウイルス構造蛋白質と免疫複合体を形成する結合定数
Ｋ_Aが５×１０⁷［Ｍ^-1］以上、好ましくは５×１０⁸
［Ｍ^-1］以上、さらに好ましくは７×１０⁸［Ｍ^-1］以
上であるモノクローナル抗体を使用することが好まし
い。

【００２３】以下、本発明についてさらに詳細に説明す
る。

【００２４】本発明でいう非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの構
造蛋白質遺伝子断片とは、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの構
造蛋白質遺伝子のＣＯＲＥ領域を含む遺伝子断片であ
り、少なくとも非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスのＮ末端の１番
目から１２３番目のアミノ酸配列を含むポリペプチドを
コードする塩基配列を有するＤＮＡ断片である。具体的
には、配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列
を含む遺伝子断片である。

【００２５】このような非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの構造
蛋白質遺伝子断片を得るには、輸血後非Ａ非Ｂ型肝炎患
者の血清からウイルス遺伝子を分離して作製したｃＤＮ
Ａライブラリーから調製するか、または公知の非Ａ非Ｂ
型肝炎ウイルス遺伝子の塩基配列（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：９５２４−９５
２８，１９９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，８８：２４５１−２４５５，１９９１）か
らＤＮＡプローブを合成し、上記のｃＤＮＡライブラリ
ーを常法に従ったＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーショ
ン、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーションを行
ない、スクリーニングをして目的の遺伝子断片を得るこ
とも可能である。

【００２６】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの構造蛋白質遺伝
子断片とＴｒｐＥ遺伝子を融合することによって作製さ
れる融合遺伝子は、常法の遺伝子組換え手法によって、
この２つのＤＮＡを連結することによって作製できる。
非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの構造蛋白質遺伝子断片は、ｃ
ＤＮＡライブラリー作製時に付加されたリンカー由来の
制限酵素部位もしくは該遺伝子断片が挿入されたプラス
ミド由来の制限酵素部位などを利用し、ＴｒｐＥ遺伝子
は、該遺伝子が挿入されたプラスミド由来の制限酵素部
位もしくは遺伝子内部の制限酵素部位などを利用して両
者を連結することが可能である。

【００２７】本発明の融合遺伝子を含む組換えベクター
は、通常の遺伝子組換え手法によって、例えばプラスミ
ドベクターに挿入することによっても作製される。ベク
ターとしては、プラスミド、ファージなどの慣用のベク
ターの他に、ワクシニアウイルスやバキュロウイルスな
どのウイルスも使用できる。

【００２８】宿主として例えば大腸菌、枯草菌もしくは
放線菌などの原核生物を用いることができ、また、プロ
モーターとしては例えばトリプトファン合成酵素オペロ
ン（ｔｒｐ），ラクトースオペロン（ｌａｃ），λファ
ージＰＬ，ＰＲなどを用いることができる。この場合に
は一般に他のぺプチドとの融合体として得ることにより
効率の良いリコンビナント（ポリ）ぺプチドの産生が期
待される。

【００２９】また、酵母、昆虫細胞、植物細胞もしくは
動物細胞などの真核生物を宿主として用いることも可能
である。この時のプロモーターとしては、酵母などに慣
用のプロモーターである３−ホスホグリセレートキナー
ゼ，エノラーゼなどの解糖系酵素に対するプロモーター
やアルコールデヒドロゲナーゼに対するプロモーター、
哺乳動物細胞で使用され得るウイルスプロモーター、例
えばポリオーマウイルス、アデノウイルス，サルウイル
スＳＶ−４０，ワクシニアウイルスもしくはサイトメガ
ロウイルスなど由来のプロモーターが挙げられる。

【００３０】ベクターはさらに、形質転換された細胞の
表現型選択を可能にするマーカー配列、例えばアンピシ
リン，テトラサイクリン耐性遺伝子などや複製開始点、
ターミネーター，リボソーム結合部位などを適宜含み得
る。

【００３１】組換え非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの構造蛋白
質の製造方法は、具体的には本発明の前述の核酸断片を
適当な宿主細胞内で発現させ得る複製可能な発現ベクタ
ーを構築する工程、前記発現ベクターを宿主細胞内に導
入して形質転換体を得る工程、前記核酸断片を発現させ
得る条件下で前記形質転換体を培養して前記リコンビナ
ント（ポリ）ぺプチドを発現させる工程、および前記リ
コンビナント（ポリ）ぺプチドを回収する工程をも包含
する。以下、宿主細胞として大腸菌を用いる場合を例に
とり、形質転換体を得る工程より記載する。

【００３２】形質転換体の方法は、塩化カルシウム法な
どの通常の形質転換方法を適用すればよい。例えば、後
述の実施例に記載のように、組換えベクターＴｒｐ・Ｔ
ｒｐＥＣＯＲＥ１４０で適当な宿主大腸菌を形質転換
することにより組換え大腸菌が得られる。

【００３３】形質転換大腸菌を培養する方法は、通常用
いられるＬ培地、ＹＴ培地、Ｍ９−ＣＡ培地などの栄養
豊富な大腸菌用培地で培養すればよい。上記のように作
製された組換えベクターは、薬剤耐性遺伝子を有してお
り、その形質転換大腸菌を培養する場合には、それに対
応する薬剤を適当な濃度になるように添加しておくこと
が望ましい。例えば宿主大腸菌としてＨＢ１０１株を用
いて組換えベクターＴｒｐ・ＴｒｐＥＣＯＲＥ１４０
で形質転換することにより得られた組換え大腸菌ＨＢ１
０１［Ｔｒｐ・ＴｒｐＥＣＯＲＥ１４０］を培養する
場合には、アンピシリンを２０〜２００μｇ／ｍｌの濃
度になるように培地に添加しておけばよい。

【００３４】融合ポリペプチド遺伝子を発現させる場合
には、その上流のプロモーターを適当な方法で働かせて
発現誘導を行なえばよい。例えば前述のベクターの場合
には、適当な培地である程度の菌体量に達するまで培養
した後、ＩＡＡ（インドールアクリル酸）を添加して、
遺伝子発現を開始させる方法がとられる。効率的な遺伝
子発現を行なうためには、対数増殖期の初期ないし中期
にＩＡＡを添加することが望ましい。発現誘導後、さら
に培養を継続して融合ポリペプチドを菌体内に蓄積させ
る。例えば組換え大腸菌ＨＢ１０１［Ｔｒｐ・ＴｒｐＥ
ＣＯＲＥ１４０］の場合には、アンピシリンを添加し
たＭ９−ＣＡ培地で、３７℃で１３〜１６時間培養する
ことにより多くの菌体量が得られ、かつ融合ポリペプチ
ドを高収量で得ることができる。

【００３５】培養によって得られた菌体から融合ポリペ
プチドを採取、精製する方法は慣用の技術、例えば細胞
の超音波破砕、可溶化抽出、硫安分画、各種クロマトグ
ラフィーなどの操作により達成し得る。

【００３６】すなわち、上記のような方法で融合ポリペ
プチドを効率よく発現させた場合、産生される融合ポリ
ペプチドは菌体内で不溶性顆粒を形成する。該不溶性顆
粒は、菌体を生理食塩水などの生理的条件の緩衝液に懸
濁した後、超音波処理などの方法で細胞を破砕し、この
菌体破砕物を遠心分離することにより沈殿物として回収
される。

【００３７】回収された不溶性顆粒を、低濃度の尿素ま
たは塩酸グアニジン、あるいはＴｒｉｔｏｎＸ−１００
などの界面活性剤を含む緩衝液で洗浄することにより高
純度の融合ポリペプチドが得られ、さらに不溶性顆粒を
形成している該融合ポリペプチドに６Ｍ〜８Ｍの尿素も
しくは同濃度の塩酸グアニジンを含む緩衝液を加えるこ
とにより可溶化することができる。可溶化された融合ポ
リペプチドは、生理食塩水などの緩衝液に対して透析あ
るいは希釈して、尿素あるいは塩酸グアニジンを適当な
濃度以下に下げることにより、該融合ポリペプチドを免
疫原として利用できる。さらに該融合ポリペプチドは、
公知の蛋白質の精製方法、例えば塩析、イオン交換、ゲ
ル濾過およびアフィニティーカラムクロマトグラフィー
による分離法や高速液体クロマトグラフィー、電気泳動
などによる分画法を適宜組み合わせて用いることによ
り、高純度の融合ポリペプチドとした後、免疫原として
利用することもできる。

【００３８】また、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス構造蛋白質
遺伝子断片とＴｒｐＥ遺伝子の間に、化学的切断法ある
いは酵素的切断法によって切断されるアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列を挿入しておけば、上記の如く産生さ
れた融合ポリペプチドを、適当な方法で処理することに
より非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス構造蛋白質遺伝子断片にコ
ードされる、配列番号１のアミノ酸配列を含む非Ａ非Ｂ
型肝炎ウイルス抗原活性ポリペプチドをＴｒｐＥ部分を
含まない形で得ることが可能となる。尚、配列番号１に
示されるアミノ酸配列の一部の領域について、置換ある
いは挿入、欠損した配列が存在したとしても、そのポリ
ペプチドの抗原活性が、本配列を含むポリペプチドと実
質的に同等である場合には、本発明に包含される。

【００３９】本発明でいう非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原
活性を有するポリペプチドとは、抗非Ａ非Ｂ型肝炎ウイ
ルス抗体と免疫学的に反応するポリペプチドもしくは融
合ポリペプチドを意味し、本発明のハイブリドーマなら
びにそれから得られるモノクローナル抗体の作製に利用
するための抗原として用いられる。具体的には、配列番
号１のアミノ酸配列を含む非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原
活性を有する融合ポリペプチドもしくは配列番号１のア
ミノ酸配列の一部を含む非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原活
性を有するポリペプチドであり、そのＮ末端あるいはＣ
末端に余分なアミノ酸配列が付加されたものであっても
よい。配列番号１のアミノ酸配列の部分配列としては、
例えば配列３〜５に示される配列が好適である。

【００４０】本発明の上記融合ポリペプチドならびに配
列番号３〜５に示されるアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドに対するモノクローナル抗体類は、当業者により
容易に調製することができる。ハイブリドーマによるモ
ノクローナル抗体の作製は良く知られている。例えば、
ＢＡＬＢ／ｃマウスなどの腹腔内あるいは皮内に、上記
融合ポリペプチドもしくはポリペプチド（以下、本抗
原）を単独もしくはＢＳＡ、ＫＬＨなどと結合させた抗
原として、フロイント完全アジュバントと混合して定期
的に免疫する。血中の抗体価が上昇した時点で、追加免
疫として本抗原を尾静脈内に投与し、無菌的に脾臓を摘
出した後、適当なマウス骨髄腫細胞株と細胞融合し、ハ
イブリドーマを得る。本方法は、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌ
ｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４
９７，１９７５）に従って行なうことができる。

【００４１】したがって、本発明はまた、非Ａ非Ｂ型肝
炎ウイルスＣＯＲＥ構造蛋白質上の抗原決定部位に対す
る結合特異性を有するモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマ細胞系を提供する。より特定的には、ハイ
ブリドーマ細胞系はＨＣ１１−５Ｅ３（ＦＥＲＭＰ−
１４４１５）、ＨＣ１１−５Ｆ１１（ＦＥＲＭＰ−１
４４１６）、ＨＣ１１−５１５Ｓ（ＦＥＲＭＰ−１４
４０３）及びＨＣ１１−１０８０Ｓ（ＦＥＲＭＰ−１
４４０２）から選択され得る。

【００４２】上記方法により得られたハイブリドーマ細
胞株を適当な培養液中で培養し、その後、本抗原に対し
て特異的な反応を示す抗体産生ハイブリドーマ細胞株を
選択してクローン化する。抗体産生ハイブリドーマのク
ローニングには限界希釈法のほか軟寒天法（Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９，１９７
６）などを利用することができる。そして、産生された
モノクローナル抗体をプロテインＡなどを用いたカラム
クロマトグラフィーなどの方法により精製する。

【００４３】したがって、本発明はさらに、上記ハイブ
リドーマ細胞系によって産生される、非Ａ非Ｂ型肝炎ウ
イルスＣＯＲＥ構造蛋白質上の抗原決定部位に対し結合
特異性を有するモノクローナル抗体を提供する。

【００４４】このような抗原決定部位の具体例として
は、配列番号１，３，４又は５に示されるアミノ酸配列
のうち、少なくとも３個の連続するアミノ酸から構成さ
れる配列が挙げられる。本発明のモノクローナル抗体
は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスＣＯＲＥ構造蛋白質との抗
原−抗体複合体の結合定数Ｋ_Aが５×１０⁷［Ｍ^-1］以
上であるものが好適に使用される。具体的には、モノク
ローナル抗体は、上記特定のハイブリドーマ細胞系が分
泌する５Ｅ３，５Ｆ１１，５１５Ｓ及び１０８０Ｓから
選択され得る。

【００４５】本発明はさらにまた、このようなモノクロ
ーナル抗体の製造方法をも提供し、該方法は、非Ａ非Ｂ
型肝炎ウイルスＣＯＲＥ構造蛋白質で免疫したマウスか
ら誘導されるリンパ球とミエローマ細胞とを融合するこ
とにより上記定義のハイブリドーマ細胞系を作製し、こ
の細胞系を培養して非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスＣＯＲＥ構
造蛋白質上の抗原決定部位と特異的に結合するモノクロ
ーナル抗体を分泌させ、これを精製することを包含す
る。

【００４６】免疫原の具体例としては、配列番号１，
２，３，４又は５に示されるアミノ酸配列又はその部分
配列を有する（ポリ）ペプチドが挙げられる。

【００４７】あるいは、上記の方法以外にもモノクロー
ナル抗体はファージ表面提示系を用いても作製すること
ができる（Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４，１
９９０；Ｎａｔｕｒｅ，３４９：２９３−２９９，１９
９１）。すなわち、免疫されたマウスの脾臓を摘出し、
そこから慣用の方法（例えばグアニジンチオシアネート
法、フェノール抽出法等）によりＲＮＡを調製し、常法
によりｍＲＮＡを含む分画であるｐｏｌｙＡＲＮＡを
調製する。ここで上記の方法で樹立したハイブリドーマ
細胞を脾臓のかわりに用いることも可能である。調製し
たｍＲＮＡを鋳型にｃＤＮＡを合成し、免疫グロブリン
の長鎖及び短鎖の可変領域を増幅できるような適当なプ
ライマーを用い、ＰＣＲリアクションによりそれぞれの
可変領域を取り出す。増幅されたＤＮＡ断片は遺伝子工
学的手法を用いて結合した後、例えばｐＣＡＮＴＡＢ５
Ｅ（ファルマシア社製）のようなファージ表面提示を可
能にする発現ベクターに組み込み大腸菌を宿主として発
現させることが可能となる。可変領域の提示されたファ
ージの内、ポリペプチドに結合するもののみを選択する
ことにより、マウス細胞で作られるものと同等のペプチ
ドに結合する能力を持つモノクローナル抗体を作製する
ことができる。

【００４８】本発明に従って調製されたモノクローナル
抗体は、検体中の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス構造蛋白質の
検出および定量用に、エンザイム−リンクイムノソルベ
ントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素イムノドットアッセ
イ、ラジオイムノアッセイ、凝集に基づいたアッセイ、
あるいは他のよく知られているイムノアッセイ法で検査
試薬として用いることができる。また、検出にはほとん
どの場合、標識化抗体が使用され、このために標識化を
行なう際、標識化合物としては例えば当分野で公知の酵
素、蛍光物質、化学発光物質、放射性物質、染色物質な
どが使用される。

【００４９】検体としては、全血、血清、血漿などの生
物学的体液及び肝臓組織などが含まれる。

【００５０】本発明は、上記イムノアッセイを実施する
ための、すなわち、検体中の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス又
はその関連抗原を検出又は定量するための検査キットを
提供する。キットには、少なくとも上記定義の本発明の
モノクローナル抗体が含まれる。また、抗体は標識化第
二抗体として含まれてもよい。

【００５１】例えば、検体中の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス
由来構造蛋白質を検出するために二抗体サンドイッチ反
応系を用いる場合、使用すべき検査キットは、固体支持
体（例えばマイクロタイターウェルの内壁）に被覆され
た本発明のモノクローナル抗体および第二抗体としての
標識したモノクローナル抗体またはそのフラグメントを
含む。モノクローナル抗体としては、前記定義のものが
挙げられ、好ましくは、５Ｅ３、５Ｆ１１、５１５Ｓ及
び１０８０Ｓから選択される。固体支持体に固相化する
モノクローナル抗体および標識するモノクローナル抗体
の組み合わせは自由であり、高感度の得られる組み合わ
せを選択できる。

【００５２】使用できる固体支持体としてはポリスチレ
ンやポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリビニール
製のマイクロタイタープレート、試験管、キャピラリ
ー、ビーズ（ラテックス粒子や赤血球、金属化合物な
ど）、膜（リポソームなど）、フィルターなどが挙げら
れる。

【００５３】本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス構造蛋白
質の検出または定量のためのイムノアッセイは、検体を
物理的および化学的処理により前処理を施すことを含
む。すなわち、測定検体にポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）を添加して溶解後、遠心分離を行ない、沈殿物に
アルカリ溶液を加えて変性させ、検体中の非Ａ非Ｂ型肝
炎ウイルス由来構造蛋白質を濃縮・分解することにより
測定の高感度化が図られる。ここで血清の処理に用いる
ＰＥＧの平均分子量、およびその使用濃度は多様であ
る。一般によく用いられるＰＥＧの平均分子量は、１０
００，１５００，２０００，４０００および６０００で
あり、またその濃度は３％〜５％（重量％）の範囲で使
用される。平均分子量１０００〜２０００までのＰＥＧ
はゲル状であり、使用する際には加熱により液状にして
からでないと取扱い難い。これに対してＰＥＧ４０００
と６０００は結晶状であるため取扱いが簡単であり本発
明の好ましい態様の一つである。また、アルカリ剤とし
ては、限定されないが、例えばアルカリ金属又はアルカ
リ土類金属の水酸化物が挙げられる。変性処理時の溶液
はｐＨ１０以上、好ましくはｐＨ１２〜１４である。

【００５４】

【実施例】以下の実施例は本発明を具体的に説明するも
のであるが、これによって本発明の範囲を制限するもの
ではない。

【００５５】実施例１非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス由来ポリペプチドの発現プラス
ミドの発現および精製（Ａ）発現プラスミドの構築ＨＣＶのＣＯＲＥ領域に相当する発現プラスミドは以下
の方法で構築した。Ｃ１１−Ｃ２１クローンおよびＣ１
０−Ｅ１２クローン（特開平６−３８７６５号）をｐＵ
Ｃ１１９に組み込んで得られたプラスミドｐＵＣ・Ｃ１
１−Ｃ２１およびｐＵＣ・Ｃ１０−Ｅ１２の各ＤＮＡ１
μｇを制限酵素反応液２０μｌ［５０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭＭｇＣｌ₂，１ｍＭ
ＤＴＴ，１００ｍＭＮａＣｌ，１５単位のＥｃｏＲ
Ｉおよび１５単位のＣｌａＩ酵素］中、および［１０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭＭｇ
Ｃｌ₂，１ｍＭＤＴＴ，５０ｍＭＮａＣｌ，１５単
位のＣｌａＩおよび１５単位のＫｐｎＩ酵素］中で各々
３７℃１時間消化し、その後０．８％アガロースゲル電
気泳動を行ない、約３８０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ
断片および約９２０ｂｐのＣｌａＩ−ＫｐｎＩ断片を精
製した。この２つのＤＮＡ断片とｐＵＣ１１９をＥｃｏ
ＲＩおよびＫｐｎＩで消化したベクターに１０×リガー
ゼ用緩衝液［６６０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５），６６ｍＭＭｇＣｌ₂，１００ｍＭジチオスレト
ール、１ｍＭＡＴＰ］５μｌ，Ｔ４リガーゼ１μｌ
（３５０単位／μｌ）に水を加えて５０μｌとし、１６
℃で一晩保温し、連結反応を行なった。このプラスミド
を用い大腸菌ＪＭ１０９を形質転換させ、プラスミドｐ
ＵＣ・Ｃ２１−Ｅ１２を得た。

【００５６】このプラスミドｐＵＣ・Ｃ２１−Ｅ１２
ＤＮＡ１ｎｇを２つのプライマー（５’−ＧＡＡＴＴＣ
ＡＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＴＣＣＴＡＡＡ−３’，５’−
ＴＴＡＧＴＣＣＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＧＧＡＣ−３’）
を用いＰＣＲを行なう。ＰＣＲはＧｅｎｅＡｍｐ^TM（Ｄ
ＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔＫ
ｉｔ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ製）のキ
ットを用いＤＮＡ変性９５℃ １．５分、アニーリング
５０℃２分、ＤＮＡ合成７０℃３分の条件で行ない、得
られたＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲル電気泳動に
より分解し、グラスパウダー法（ＧｅｎｅＣｌｅａ
ｎ）で精製した。一方、ｐＵＣ１９を制限酵素ＳｍａＩ
で消化し、ＰＣＲ法によって得られたＤＮＡ断片を１０
×リガーゼ用緩衝液［６６０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、６６ｍＭＭｇＣｌ₂、１００ｍＭ
ジチオスレトール、１ｍＭＡＴＰ］５μｌ，Ｔ４リガ
ーゼ１μｌ（３５０単位／μｌ）に水を加えて５０μｌ
とし、１６℃で一晩保温し、連結反応を行なった。この
プラスミドを用い大腸菌ＪＭ１０９を形質転換させ、プ
ラスミドｐＵＣ１９・Ｃ２１−Ｅ１２・ＳｍａＩを得
た。このプラスミドＤＮＡ１μｇを制限酵素反応液２０
μｌ［１５０ｍＭＮａＣｌ，６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５），６ｍＭＭｇＣｌ₂，１５単位のＥ
ｃｏＲＩおよび１５単位のＢａｍＨＩ酵素］中で３７℃
１時間消化反応を行ない、その後０．８％アガロースゲ
ル電気泳動を行ない、約４９０ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩ断片を分離し、これをグラスパウダー法で精製し
た。

【００５７】次に発現ベクターであるＴｒｐ・ＴｒｐＥ
（特開平５−８４０８５号）のＤＮＡ１μｇを制限酵素
反応液２０μｌ［１５０ｍＭＮａＣｌ，６ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），６ｍＭＭｇＣｌ₂，１
５単位のＥｃｏＲＩおよび１５単位のＢａｍＨＩ酵素］
中で３７℃で１時間消化し、その反応液に水３９μｌを
加え、７０℃で５分間熱処理した後にバクテリアアルカ
リ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）１μｌ（２５０単位／μ
ｌ）を加えて３７℃で１時間保温した。この反応液にフ
ェノールを加えてフェノール抽出を行ない、得られた水
層をエタノール沈殿し、沈殿物を乾燥した。得られたＥ
ｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ処理ベクターＤＮＡ１μｇと上述
のＣＯＲＥ１４０断片を１０×リガーゼ用緩衝液［６６
０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），６６ｍＭＭ
ｇＣｌ₂，１００ｍＭジチオスレトール、１ｍＭＡ
ＴＰ］５μｌ，Ｔ４リガーゼ１μｌ（３５０単位／μ
ｌ）に水を加えて５０μｌとし、１６℃で一晩保温し、
連結反応を行なった。

【００５８】この反応液の１０μｌを用いて大腸菌１０
１株を形質転換した。形質転換に用いる感受性大腸菌株
は塩化カルシウム法［Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．とＨｉｇａ，
Ａ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９−１６２
（１９７０）］により作られる。形質転換大腸菌を２５
μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート（１％ト
リプトン，０．５％ＮａＣｌ，１．５％寒天）上に
塗布し、３７℃に一晩保温した。プレート上に生じた菌
のコロニーを１白金耳取り、２５μｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含むＬＢ培地に移し、一晩３７℃で培養した。
１．５ｍｌの菌培養液を遠心して集菌し、プラスミドＤ
ＮＡのミニプレパレーションをアルカリ法［Ｍａｎｎｉ
ａｔｉｓら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，（１９８
２）］により行なった。得られたプラスミドＤＮＡ１μ
ｇを制限酵素反応液２０μｌ［１５０ｍＭＮａＣｌ，
６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６ｍＭＭｇ
Ｃｌ₂，１５単位のＥｃｏＲＩおよび１５単位のＢａｍ
ＨＩ酵素］中で３７℃、１時間消化し、アガロースゲル
電気泳動を行なって、約４９０ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩ断片が生じるＴｒｐ・ＴｒｐＥＣＯＲＥ１４０
発現プラスミドを選別した。

【００５９】（Ｂ）クローンＣＯＲＥ１４０でコードさ
れるポリペプチドの発現および精製発現プラスミドＴｒｐ・ＴｒｐＥＣＯＲＥ１４０をも
つ大腸菌ＨＢ１０１株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリン
を含む３ｍｌの２ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１
％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）に接種し、３７
℃で９時間培養する。この培養液１ｍｌを５０μｇ／ｍ
ｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＭ９−ＣＡ培地
（０．６％Ｎａ₂ＨＰＯ₄，０．５％ＫＨ₂Ｐ
Ｏ₄，０．５％ＮａＣｌ、０．１％ＮＨ₄Ｃｌ，０．
１ｍＭＣａＣｌ₂，２ｍＭＭｇＳＯ₄，０．５％カ
ザミノ酸，０．２％グルコース）に植え継ぎ、３７℃
で培養した。ＯＤ₆₀₀＝０．３の時に終濃度４０ｍｇ／
ｌになるようにインドールアクリル酸を加え、さらに１
６時間培養した。この培養液を遠心分離して菌体を集め
た。

【００６０】菌体に２０ｍｌの緩衝液Ａ［５０ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ，３
０ｍＭＮａＣｌ］を加えて懸濁し、再び遠心分離を行
なって発現菌体２．６ｇを得た。得られた菌体を緩衝液
Ａ１０ｍｌ中に懸濁し、超音波破砕により大腸菌膜を
破砕した後に遠心分離を行ない、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイル
スｃＤＮＡでコードされるポリペプチドとＴｒｐＥの融
合ポリペプチドを含む不溶性画分を得た。その画分に１
０ｍｌの６Ｍ尿素を含む緩衝液Ａを加えて融合ポリペプ
チドを可溶化抽出した。可溶化した抽出物をＳ−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅを用いたイオン交換カラムクロマトグラフ
ィーにかけてＮａＣｌの０Ｍ〜０．５Ｍまでの濃度勾配
によりカラムから溶出させ、融合ポリペプチドの精製を
行なった。

【００６１】実施例２ハイブリドーマの作製法前記方法により調製した融合ポリペプチド（ＴｒｐＣ１
１）を生理食塩水に終濃度が１．０ｍｇ／ｍｌとなるよ
うに溶解し、等量のフロインド完全アジュバンドと混和
し、ＴｒｐＣ１１懸濁液とした。ＴｒｐＣ１１濃度が
０．０１〜０．０５ｍｇ／ｍｌとなるように調製した該
懸濁液を４〜６週令のＢＡＬＢ／ｃ系マウスに腹腔内投
与した。さらに約８週間後、免疫化動物にＴｒｐＣ１１
濃度が０．００５〜０．０３ｍｇ／ｍｌとなるように調
製した生理食塩水溶液を尾静脈内に投与した。最終追加
免疫後３日目に、この免疫動物より無菌的に脾臓を摘出
し、ハサミで切片としてさらにメッシュを用いて脾臓を
個々の細胞にほぐし、ＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗
浄した。８−アザグアニジン存在下で数日間培養し、復
帰突然変異体を完全に除いた対数増殖期のマウス骨髄腫
細胞株ＰＡＩを前記と同様に洗浄後、該細胞１．８×１
０⁷個と脾臓細胞１．０×１０⁸個を５０ｍｌ容の遠心
管に入れ混合した。２００×ｇ、５分間遠心分離を行な
い、上清を除去し、３７℃に保温した５０％ポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ）４０００（メルク社製）を含
むＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍｌを加えて細胞融合させ
た。融合細胞は、遠心分離（２００×ｇ，５分間）によ
ってＰＥＧを除いた後、９６ウエルプレートを用いて、
ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（以
下、ＨＡＴと略す）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で
１〜２週間培養してハイブリドーマのみを増殖させた。
その後、ＨＡＴを含まない培地で成育させ、約２週間後
目的の抗体を産生するクローンをＥＬＩＳＡ法により検
索し、所望の反応特異性を有する本発明のモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマを得た。

【００６２】得られたハイブリドーマについて、常法の
限界希釈法に従い、目的とする抗体の産生株の検索およ
び単一クローン化を行ない、得られたハイブリドーマを
ＨＣ１１−５Ｅ３，ＨＣ１１−５Ｆ１１，ＨＣ１１−５
１５ＳおよびＨＣ１１−１０８０Ｓと命名した。該４種
類のハイブリドーマに関しては、工業技術院生命工学工
業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託し、それぞ
れ受託番号ＦＥＲＭＰ−１４４１５、ＦＥＲＭＰ−１
４４１６、ＦＥＲＭＰ−１４４０３及びＦＥＲＭＰ
−１４４０２を得た。なお、前二者は平成６年７月５日
付けで、また後二者は平成６年６月２９日付けで寄託さ
れた。

【００６３】実施例３モノクローナル抗体の作製法実施例２に記載の方法により得られたハイブリドーマを
プリスタン等で処理したマウス腹腔に移植し、腹水中に
産生されてくるモノクローナル抗体を取得した。該モノ
クローナル抗体の精製は常法に従い、硫安沈殿を行な
い、リン酸緩衝液等により透析した後、プロテインＡを
結合させたセファロースカラムによりＩｇＧフラクショ
ンを分離した。前記４種類のハイブリドーマから産生さ
れたそれぞれのモノクローナル抗体、５Ｅ３、５Ｆ１
１、５１５Ｓおよび１０８０Ｓのイソタイプは、ウサギ
抗マウスＩｇ各イソタイプ抗体（Ｚｙｍｅｄ社製）を用
いた二重免疫拡散法により、５Ｅ３および５Ｆ１１がＩ
ｇＧ２ａ、５１５Ｓおよび１０８０ＳがＩｇＧ１である
ことが明らかとなった。得られた４種類のモノクローナ
ル抗体について、ＨＣＶ・ＣＯＲＥ領域由来の配列によ
って合成した２０のペプチドを用いてエピトープ解析を
行なった結果、表１に示す如くＣＯＲＥ領域の一部を特
異的に認識するモノクローナル抗体であることがわかっ
た。

【００６４】

【表１】実施例４ウエスタン・ブロッテイング法による抗体の反応特異性
の証明ＨＣＶ・ＣＯＲＥ領域由来のポリペプチド粗精製物を、
ドデシル硫酸ナトリウムを用いる電気泳動法（ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ法）により電気泳動後、ゲルをポリビニリデン
フルオリド膜（ＰＶＤＦ膜、ミリポア社製）と密着さ
せ、ゲル側を陰極、ＰＶＤＦ膜側を陽極としてトランス
ファーし、ゲルに泳動された蛋白質をＰＶＤＦ膜に転写
した。転写されたＰＶＤＦ膜を４％ブロックエース
（雪印乳業社製）、２％ＢＳＡを含む０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７．４）に４℃で一晩浸してブロッキン
グを行ない、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むｐＨ
７．０のトリス塩酸緩衝液（以下ＴＢＳ）で洗浄後、一
次抗体として実施例３で得られたモノクローナル抗体を
室温で１時間反応させた。反応後、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ
でよく洗浄し、２％ポリビニルピロリドン、０．０５
％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−）で５０００倍希
釈した酵素標識抗マウスＩｇＧ＋Ｍ抗体を二次抗体とし
て室温で１時間反応させた。次いで、ＰＶＤＦ膜をＴＢ
Ｓで洗浄し、０．１％４クロロ１ナフトール溶液およ
び０．２％過酸化水素溶液により発色させた。尚、陽
性対照として非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清を用い、陰性対照
として抗マウスＩｇＧ抗体に代えて、抗ヒトＩｇＧ抗体
を用いて試験した。

【００６５】モノクローナル抗体と非Ａ非Ｂ型肝炎患者
血清（陽性ならびに陰性検体）によるウエスタンブロッ
ト像を図１に示した。モノクローナル抗体および陽性検
体にのみ強い反応が見られ、モノクローナル抗体はＴｒ
ｐＣ１１を特異的に認識していることが示された。

【００６６】実施例５ β−ガラクトシダーゼ標識モノクローナル抗体の作製法（Ａ）５Ｅ３Ｆ（ａｂ’） ₂の調製法抗ＨＣＶ・ＣＯＲＥ抗体（マウスモノクローナル抗
体：５Ｅ３ＩｇＧ）を標識用に用いるため、該抗体１０
ｍｇを０．２ＭＮａＣｌを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ４．０）で透析後、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ
１０（アミコン社製）を用いて、容量が１ｍｌになるよ
うに遠心濃縮した。この抗体溶液に、０．２ＭＮａＣ
ｌを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）
で懸濁したペプシン（シグマ社製）をＩｇＧ量に対して
４％になるように添加し、３７℃で１．５時間反応させ
た。反応終了後、０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ８．０）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１
５０（φ１．６×６０ｃｍファルマシア社製）を通すこ
とによりＦ（ａｂ’）₂のフラクションを分画した。得
られたフラクションを１ｍＭＥＤＴＡを含む０．１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で透析後、Ｃｅ
ｎｔｒｉｃｏｎ１０を用いて、容量が１ｍｌになるよう
に遠心濃縮し、５Ｅ３Ｆ（ａｂ’）₂として標識体の作
製に用いた。この方法により１０ｍｇの５Ｅ３ＩｇＧ
から約５ｍｇのＦ（ａｂ’）₂を調製した。

【００６７】（Ｂ）５Ｅ３−β−ガラクトシダーゼ標識
体の作製法前記の方法で調製した５Ｅ３Ｆ（ａｂ’）₂５ｍｇに１
ｍＭＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ６．０）で溶解した０．１Ｍ２−メルカプトエ
チルアミン塩酸塩（キシダ化学社製）溶液を０．１ｍｌ
添加し、３７℃で９０分反応させた。１ｍＭＥＤＴＡ
を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．
０）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５（φ１．
５×２０ｃｍファルマシア社製）を用いＦａｂ’を精製
した。Ｆａｂ’フラクションを分画し、Ｃｅｎｔｒｉｃ
ｏｎ１０を用いて、容量が１ｍｌになるように遠心濃縮
した。一方、β−ガラクトシダーゼ（ベーリンガー社
製）は、蛋白質量として１０ｍｇを秤量し、１ｍｌの
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶
解した。

【００６８】この溶液に、終濃度が５０ｍｇ／ｍｌにな
るようにＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（キシダ化学社
製）で溶解したＮ，Ｎ’−（１，２−フェニレン）ビス
マレイミド（和光純薬社製）１０μｌ添加し、３０℃２
０分反応させることによってβ−ガラクトシダーゼのＳ
Ｈ基をマレイミド化した。０．１Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ−２５（φ１．５×２０ｃｍ）を用いてβ−ガラクト
シダーゼのフラクションを精製し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ
１０を用いて遠心濃縮した。

【００６９】このようにして得られた５Ｅ３Ｆａｂ’
とβ−ガラクトシダーゼをモル比で約４：１になるよう
に混合し、４℃で１５〜２４時間反応させた。その後、
２−メルカプトエチルアミン塩酸塩を反応液中２ｍＭに
なるように添加し、３７℃で２０分反応することによっ
て、未反応のマレイミド基のブロックを行なった。次
に、０．１ＭＮａＣｌ，０．１％ＢＳＡ，１ｍＭＭ
ｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ，０．１％ＮａＮ₃を含む１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．７）、以下緩衝
液Ａ、で平衡化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ（φ１．
６×６５ｃｍファルマシア社製）で溶出する事によって
未反応の５Ｅ３Ｆａｂ’を除去し、５Ｅ３−β−ガラク
トシダーゼ標識体の精製を行なった。

【００７０】（Ｃ）β−ガラクトシダーゼ活性測定法 β−ガラクトシダーゼ活性の測定は、０．３ｍｌの１０
ｍＭＭｇＣｌ₂と、終濃度が５．９ｍｇ／ｍｌになる
ように５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）
に懸濁した２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド（和光純薬社製）０．４ｍｌと１０Ｍメルカプ
トエタノール（和光純薬社製）３０μｌを含む５０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）２．９３ｍｌの
混液に標識体５０μｌを加えて合計２．９８ｍｌとし、
３７℃で５分間、４０５ｎｍにおける吸光度の差（ΔＡ
ｂｓ）を測定することによってＲａｔｅＡｓｓａｙを
行なった。

【００７１】実施例６固相作製法抗ＨＣＶ・ＣＯＲＥ抗体（マウスモノクローナル抗
体：５Ｆ１１ＩｇＧ）を終濃度が２．５μｇ／ｍｌに
なるように０．１％ＮａＮ₃を含む０．１Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈し、固相用チュー
ブ（ヌンク社製、スターチューブ）１本につき３００μ
ｌずつ分注した。４℃で一晩静置後、０．１５ＭＮａ
Ｃｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭリン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、以下洗浄液、２ｍ
ｌを用いて２回洗浄し、０．５％カゼイン−Ｎａ、１％
ショ糖を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）、以下ブロッキング液、２ｍｌを添加し、さ
らに４℃で一晩静置した。これを５Ｆ１１固相担体とし
て以下の測定に用いた。

【００７２】実施例７血清処理法血清１ｍｌをマイクロ遠心チューブ（エッペンドルフ社
製）に分注し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０
００（和光純薬社製）を４０ｍｇ添加した。転倒混和に
より十分に溶解した後、４℃で３時間静置した。４００
０×ｇ、４℃で１時間遠心分離を行ない、上清を除去し
た。沈澱物を０．５％ＮａＣｌと０．５％クエン酸
ナトリウム混液１００μｌに懸濁し、０．５Ｎ水酸化
ナトリウム溶液を１００μｌ加え、３７℃で３０分間変
性反応させた後、５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含
む０．５ＭＮａＨ₂ＰＯ₄ １００μｌを添加するこ
とによって中和した。

【００７３】実施例８モノクローナル抗体（５Ｆ１１、５Ｅ３）による非Ａ非
Ｂ型肝炎ウイルス構造領域ＣＯＲＥ蛋白質の検出および
定量実施例６（固相作製法）に従い、マイクロプレートにモ
ノクローナル抗体（５Ｆ１１）を感作し、ブロッキング
液を添加して４℃で一晩静置することにより５Ｆ１１固
相担体を作製した。これに０．５ＭＮａＣｌ，２．５
ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ，１％ＢＳＡ，０．５％カ
ゼイン−Ｎａ，５％マウス血清，０．２５％Ｔｗｅ
ｅｎ８０を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．０）、以下反応緩衝液、１００μｌと実施
例１で得られたＴｒｐＣ１１蛋白質を０〜１００ｎｇ／
ｍｌの濃度範囲で含む溶液５０μｌをそれぞれのウェル
に加え攪拌し、室温で１時間反応させ、洗浄液３００μ
ｌで６回洗浄し、さらにペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標
識したモノクローナル抗体（５Ｅ３）１００μｌを添加
して室温で１時間反応させた。

【００７４】反応後、上記洗浄液３００μｌで６回洗浄
し、基質（オルトフェニレンジアミン、以下ＯＰＤ）溶
液１００μｌを加え室温で３０分間反応させた後、２Ｎ
硫酸溶液からなる反応停止液１００μｌを添加し、波
長６９０ｎｍの吸光度を対照として波長４９２ｎｍにお
ける吸光度（Ａ₄₉₂）を測定することによりＴｒｐＣ１
１蛋白質を測定した。図２に示す如く、ＴｒｐＣ１１蛋
白質が濃度依存的に測定されることがわかった。すなわ
ち、本発明のモノクローナル抗体を用いることにより、
非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス構造領域ＣＯＲＥ蛋白質を検出
または定量できることが明らかとなった。

【００７５】実施例９モノクローナル抗体（１０８０Ｓ、５１５Ｓ）による非
Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス構造領域ＣＯＲＥ蛋白質の検出お
よび定量実施例８に記載の固相化担体にモノクローナル抗体１０
８０Ｓを用い、ＰＯＤ標識用にモノクローナル抗体５１
５Ｓを用いること以外、実施例８と同様の操作によりＴ
ｒｐＣ１１蛋白質の測定を行なった。図３に示す如く、
実施例Ａと同様にＴｒｐＣ１１蛋白質が濃度依存的に測
定されることがわかった。すなわち、本発明のモノクロ
ーナル抗体を用いることにより、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイル
ス構造領域ＣＯＲＥ蛋白質を検出または定量できること
が明らかとなった。

【００７６】実施例１０各種標識酵素による非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス構造領域Ｃ
ＯＲＥ蛋白質の測定感度の比較二次抗体の酵素標識用としてＰＯＤ、アルカリフォスフ
ァターゼ、β−ガラクトシダーゼを用い、基質にＯＰ
Ｄ，ＨＰＰＡ，ｐＮＰＰ，ＮＡＤＰ，ＡＭＰＰＤ，４Ｍ
ＵＧを使用した以外、実施例８と同様の操作によりＴｒ
ｐＣ１１蛋白質の測定を行なった。モノクローナル抗体
として１０８０Ｓならびに５１５Ｓの組み合わせで検討
を行なった結果、表２に示す如く、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイ
ルス構造領域ＣＯＲＥ蛋白質を検出する方法として、二
次抗体の酵素標識にはβ−ガラクトシダーゼを用い、基
質に４ＭＵＧを用いた場合に最も高感度測定が可能であ
ることが示された。また、モノクローナル抗体との組み
合わせとしては、５Ｆ１１を固相担体として、β−ガラ
クトシダーゼを結合した５Ｅ３を二次抗体として用いた
場合、もしくは１０８０Ｓを固相担体として、β−ガラ
クトシダーゼを結合した５１５Ｓを二次抗体として用い
た場合に最も高い測定感度が得られた（図４，５）。

【００７７】

【表２】実施例１１モノクローナル抗体（５Ｆ１１、５Ｅ３）を用いた非Ａ
非Ｂ型肝炎ウイルス構造領域ＣＯＲＥ蛋白質の検出限界
の検討実施例６の方法で作製した５Ｆ１１固相担体のブロッキ
ング液を除き、反応緩衝液２００μｌを添加した。これ
に、実施例１で得られたＴｒｐＣ１１蛋白質を０〜５１
２０ｐｇ／ｍｌの濃度範囲で含む溶液１００μｌをそれ
ぞれのウェルに加え攪拌し、３７℃で１０分間撹拌しな
がら反応させた。洗浄液２ｍｌで２回洗浄した後、緩衝
液Ａで４０ｍＵ／ｍｌ濃度になるように希釈した５Ｅ３
−βガラクトシダーゼ標識体の溶液を３００μｌ加え、
３７℃で９分間撹拌しながら反応させた。洗浄液２ｍｌ
で洗浄後、洗浄液２ｍｌを添加したままの状態で３７℃
１分間撹拌し、洗浄液を吸引除去後、再度洗浄液２ｍｌ
で洗浄した。

【００７８】次に、０．１ｍＭ濃度になるように０．１
５ＭＮａＣｌ，１ｍＭＭｇＣｌ₂，０．１％Ｎａ
Ｎ₃を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）、以下４ＭＵＧ希釈液、で希釈した４−メチル
ウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（モレキ
ュラープローブ社製）、以下４ＭＵＧ、を基質液とし
て３００μｌ添加した。３７℃で９分間撹拌反応後、
０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ１０．３）、以下
反応停止液、１ｍｌを添加することによって反応を停止
した。ウェル中の５Ｅ３−βガラクトシダーゼ標識体
は、４ＭＵＧの開裂を引き起こし、蛍光性クマリン生成
物を誘導する。従って、該蛍光性クマリン生成物の相対
蛍光強度を測定することにより、ＴｒｐＣ１１蛋白質の
濃度を間接的に測定した。

【００７９】蛍光強度の測定は励起波長３６０ｎｍ、放
射波長４５０ｎｍで行なった。蛍光標準液としては、１
０ｎＭ４−メチルウンベリフェロン（ナカライ社
製）、０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ１０．３）
溶液を相対蛍光強度１００とし、０．１Ｍグリシン−
ＮａＯＨ（ｐＨ１０．３）溶液を０として用いた。その
結果、図６および図７に示す如く５〜２０ｐｇ／ｍｌの
濃度範囲に検出限界が存在することが示された。

【００８０】実施例１２血清試料中の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス構造領域ＣＯＲＥ
蛋白質の測定法非Ａ非Ｂ型肝炎第２世代診断薬（国際試薬社製）で陰性
ならびに陽性と判定され、ＲＴ（リバース・トランスク
リプターゼ）−ＰＣＲ法でＰＣＲ−Ｔｉｔｅｒが１０⁴
〜１０⁶／ｍｌと測定された血清を用い、血清中の非Ａ
非Ｂ型肝炎ウイルス構造領域ＣＯＲＥ蛋白質の定量を行
なった。実施例６の方法で作製した５Ｆ１１固相担体の
ブロッキング液を除き、反応緩衝液２００μｌを添加し
た。これに、実施例７に記載の方法で前処理を行なった
血清１００μｌを加え、３７℃で１０分間撹拌しながら
反応させた。洗浄液２ｍｌで２回洗浄した後、緩衝液Ａ
で４０ｍＵ／ｍｌ濃度になるように希釈した５Ｅ３−β
ガラクトシダーゼ標識体の溶液を３００μｌ加え、３７
℃で９分間撹拌しながら反応させた。洗浄液２ｍｌで洗
浄後、洗浄液２ｍｌを添加したままの状態で３７℃１分
間撹拌し、洗浄液を吸引除去後、再度洗浄液２ｍｌで洗
浄した。

【００８１】次に、４ＭＵＧ希釈液で希釈した４ＭＵＧ
を基質液として３００μｌ添加した。３７℃で９分間撹
拌反応後、反応停止液１ｍｌを添加することによって反
応を停止し、相対蛍光強度を測定した。蛍光強度の測定
は励起波長３６０ｎｍ、放射波長４５０ｎｍで行なっ
た。蛍光標準液としては、１０ｎＭ４−メチルウンベ
リフェロン（ナカライ社製）、０．１Ｍグリシン−Ｎ
ａＯＨ（ｐＨ１０．３）溶液を相対蛍光強度１００と
し、０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ１０．３）溶
液を０として用いた。また、標準抗原には実施例１で発
現させたリコンビナント抗原（ＴｒｐＣ１１蛋白質）を
用い、これを８ＭＵｒｅａを含む０．１Ｍリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７．５）にて１ｍｇ／ｍｌ濃度に溶
解した後、反応緩衝液にて目的濃度に調製したものを標
準抗原として用いた。図８に示すように、非Ａ非Ｂ型肝
炎第２世代診断薬で判定された結果とよく一致した。

【００８２】実施例１３モノクローナル抗体（５Ｆ１１，５Ｅ３，１０８０Ｓ，
５１５Ｓ）の反応速度定数の測定反応速度定数の測定は表面プラズモン共鳴の原理に基づ
いた生体特異的相互作用分析装置である表面プラズモン
共鳴分析装置（ＢＩＡｃｏｒｅ^TM，ファルマシア社製）
により行なった。ＴｒｐＣ１１蛋白質を、カルボキシデ
キストラン層をもつセンサーチップＣＭ５へアミンカッ
プリング法で固定化し、ＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭＨＥ
ＰＥＳ，３．４ｍＭＥＤＴＡ，１５０ｍＭＮａＣ
ｌ，０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．４）で適
当な濃度に希釈したモノクローナル抗体を２５分間流し
た。このとき、抗体がセンサーチップ上のＴｒｐＣ１１
蛋白質へ結合することによって上昇する共鳴シグナル値
を３０秒毎に経時的に測定し、同時に共鳴シグナル変化
率も計算して記録した。１種類の抗体について濃度の異
なる５〜１０種類の試料について同様の測定を繰り返
し、親和速度定数を求めた。

【００８３】一方、解離速度定数の測定は、ＴｒｐＣ１
１蛋白質を固定化したセンサーチップに、ＨＢＳ緩衝液
で１００μｇ／ｍｌに希釈したモノクローナル抗体を１
５分間流して抗体をセンサーチップ上のＴｒｐＣ１１蛋
白質へ結合させた。これに、ＨＢＳ緩衝液を５０分間流
し、抗体がセンサーチップ上のＴｒｐＣ１１蛋白質から
解離することによって生ずる共鳴シグナル変化を６０秒
毎に経時的に測定した。測定により求められた親和速度
定数と解離速度定数との比を計算して結合定数を算出し
た（表３）。

【００８４】表３から明らかなように、試験したモノク
ローナル抗体は１０⁸（Ｍ^-1）オーダー以上の結合定数
をもち、目的抗原との高親和性を示す。

【００８５】

【表３】

【００８６】

【発明の効果】本発明により非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス構
造蛋白質上の抗原決定基に対する結合特異性を有したモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系が得
られる。また本発明により得られた有用なモノクローナ
ル抗体は、非Ａ非Ｂ型肝炎の患者血清中の非Ａ非Ｂ型肝
炎ウイルス構造蛋白質を特異的に認識するため、非Ａ非
Ｂ型肝炎の各種免疫学的診断薬の抗体として広く応用す
ることができる。さらに、本発明により得られたモノク
ローナル抗体を用いた非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの検出な
らびに定量方法を利用することにより非Ａ非Ｂ型肝炎の
確定診断が行なえる。

【００８７】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：１４０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Lys Gly Ser Leu Asp Arg Asp Pro Glu 1 5 10 15 Phe Met Gly Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr 20 25 30 Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val 35 40 45 Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg 50 55 60 Ala Thr Arg Lys Thr Ser Lys Arg Ser Gln Pro Arg Gly Gly Arg Arg 65 70 75 80 Pro Ile Pro Lys Asp Arg Arg Ser Thr Gly Lys Ser Trp Gly Lys Pro 85 90 95 Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly 100 105 110 Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp 115 120 125 Pro Arg His Arg Ser Arg Asn Val Gly Lys Val Ile 130 135 140 配列番号：２配列の長さ：１２３配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Gly Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 Thr Arg Lys Thr Ser Lys Arg Ser Gln Pro Arg Gly Gly Arg Arg Pro 50 55 60 Ile Pro Lys Asp Arg Arg Ser Thr Gly Lys Ser Trp Gly Lys Pro Gly 65 70 75 80 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro 100 105 110 Arg His Arg Ser Arg Asn Val Gly Lys Val Ile 115 120 配列番号：３配列の長さ：１１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr 1 5 10 配列番号：４配列の長さ：２１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly 1 5 10 15 Val Arg Ala Thr Arg 20 配列番号：５配列の長さ：１０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Lys Thr Ser Lys Arg Ser Gln Pro Arg Gly 1 5 10

【図面の簡単な説明】

【図１】非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清検体を用いたウエスタ
ンブロットのテスト結果を示す写真である。図中１，
２，３，４は検体のレーンを示す。

【図２】本発明のモノクローナル抗体５Ｆ１１，５Ｅ３
を用いたサンドイッチ反応系による非Ａ非Ｂ型肝炎ウイ
ルス由来構造蛋白質（ＴｒｐＣ１１）の検量線図であ
る。バーは２ＳＤを示す。

【図３】本発明のモノクローナル抗体１０８０Ｓ，５１
５Ｓを用いたサンドイッチ反応系による非Ａ非Ｂ型肝炎
ウイルス由来構造蛋白質（ＴｒｐＣ１１）の検量線図で
ある。バーは２ＳＤを示す。

【図４】本発明のモノクローナル抗体５Ｆ１１を固相化
し、β−ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）標識した５Ｅ３を
用いたサンドイッチ反応系による非Ａ非Ｂ型肝炎ウイル
ス由来構造蛋白質（ＴｒｐＣ１１）の検量線図である。
バーは２ＳＤを示す。

【図５】本発明のモノクローナル抗体１０８０Ｓを固相
化し、β−ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）標識した５１５
Ｓを用いたサンドイッチ反応系による非Ａ非Ｂ型肝炎ウ
イルス由来構造蛋白質（ＴｒｐＣ１１）の検量線図であ
る。バーは２ＳＤを示す。

【図６】本発明のモノクローナル抗体５Ｆ１１と５Ｅ３
を用いたサンドイッチ反応系による非Ａ非Ｂ型肝炎ウイ
ルス由来構造蛋白質（ＴｒｐＣ１１）の検出限界を示す
図である。濃度範囲０〜６０００ｐｇ／ｍｌ。

【図７】本発明のモノクローナル抗体５Ｆ１１と５Ｅ３
を用いたサンドイッチ反応系による非Ａ非Ｂ型肝炎ウイ
ルス由来構造蛋白質（ＴｒｐＣ１１）の検出限界を示す
図である。濃度範囲０〜４００ｐｇ／ｍｌ。

【図８】血清試料中の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス由来構造
蛋白質の測定結果を示す図である。検体番号にＮがつい
ている検体は、非Ａ非Ｂ型肝炎第２世代診断薬で陰性と
判定された検体を示し、Ｐは陽性と判定された検体を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者長谷川明埼玉県入間郡大井町西鶴ケ岡一丁目３番１号東燃株式会社総合研究所内 (72)発明者梶田忠宏兵庫県神戸市西区室谷１丁目１番２国際試薬株式会社研究センター内 (72)発明者太田陽介兵庫県神戸市西区室谷１丁目１番２国際試薬株式会社研究センター内 (72)発明者森浩之兵庫県神戸市西区室谷１丁目１番２国際試薬株式会社研究センター内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスＣＯＲＥ構造蛋
白質上の抗原決定部位に対する結合特異性を有するモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系。
【請求項２】ＨＣ１１−５Ｅ３，ＨＣ１１−５Ｆ１
１，ＨＣ１１−５１５Ｓ及びＨＣ１１−１０８０Ｓから
成る群から選択される請求項１に記載のハイブリドーマ
細胞系。
【請求項３】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスＣＯＲＥ構造蛋
白質上の抗原決定部位に対する結合特異性を有する請求
項１又は２に記載のハイブリドーマ細胞系により産生さ
れるモノクローナル抗体。
【請求項４】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスＣＯＲＥ構造蛋
白質上の抗原決定部位として配列番号１に示されるアミ
ノ酸配列のうち、少なくとも３個の連続するアミノ酸配
列を認識する請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスＣＯＲＥ構造蛋
白質上の抗原決定部位として配列番号３に示されるアミ
ノ酸配列のうち、少なくとも３個の連続するアミノ酸配
列を認識する請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス構造蛋白質上の
抗原決定部位として配列番号４に示されるアミノ酸配列
のうち、少なくとも３個の連続するアミノ酸配列を認識
する請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスＣＯＲＥ構造蛋
白質上の抗原決定部位として配列番号５に示されるアミ
ノ酸配列のうち、少なくとも３個の連続するアミノ酸配
列を認識する請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスＣＯＲＥ構造蛋
白質との抗原−抗体複合体の結合定数Ｋ_Aが５×１０⁷
［Ｍ^-1］以上である請求項３〜７のいずれか一項に記載
のモノクローナル抗体。
【請求項９】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスＣＯＲＥ構造蛋
白質で免疫したマウスから誘導されるリンパ球とミエロ
ーマ細胞とを融合することにより請求項１記載のハイブ
リドーマ細胞系を作製し、この細胞系を培養して非Ａ非
Ｂ型肝炎ウイルスＣＯＲＥ構造蛋白質上の抗原決定部位
と特異的に結合するモノクローナル抗体を分泌させ、こ
れを精製することを包含する、請求項３〜８のいずれか
一項に記載のモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１０】ハイブリドーマ細胞系がＨＣ１１−５
Ｅ３，ＨＣ１１−５Ｆ１１，ＨＣ１１−５１５Ｓ及びＨ
Ｃ１１−１０８０Ｓから成る群から選択される請求項９
記載の方法。
【請求項１１】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスＣＯＲＥ構造
蛋白質が配列番号１に示されるアミノ酸配列またはその
部分配列を有する請求項９に記載の方法。
【請求項１２】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスＣＯＲＥ構造
蛋白質が配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその
部分配列を有する請求項９に記載の方法。
【請求項１３】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスＣＯＲＥ構造
蛋白質が配列番号３に示されるアミノ酸配列またはその
部分配列を有する請求項９に記載の方法。
【請求項１４】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスＣＯＲＥ構造
蛋白質が配列番号４に示されるアミノ酸配列またはその
部分配列を有する請求項９に記載の方法。
【請求項１５】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスＣＯＲＥ構造
蛋白質が配列番号５に示されるアミノ酸配列またはその
部分配列を有する請求項９に記載の方法。
【請求項１６】検体中の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス関連
抗原のイムノアッセイであって、（ａ）前記検体中の非
Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス又はその関連抗原をポリエチレン
グリコールと共に遠心濃縮し、次いでアルカリで処理す
る段階、（ｂ）該検体と請求項３〜８のいずれか一項に
記載のモノクローナル抗体を接触させて抗原−抗体複合
体を形成させる段階、（ｃ）該抗原−抗体複合体の存
在、およびこれにより前記非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス関連
抗原の存在を検出ならびに定量する段階、を含む前記イ
ムノアッセイ。
【請求項１７】さらに、モノクローナル抗体を標識す
ることを含む請求項１６記載のイムノアッセイ。
【請求項１８】請求項１６又は１７に記載のイムノア
ッセイを実施するための検査キット。
【請求項１９】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスＣＯＲＥ構造
蛋白質上の抗原決定部位に対し結合特異性を有する５Ｅ
３，５Ｆ１１，５１５Ｓ及び１０８０Ｓから成る群から
選択される少なくとも１種のモノクローナル抗体と、標
識された５Ｅ３，５Ｆ１１，５１５Ｓ及び１０８０Ｓか
ら成る群から選択される第二抗体との組み合わせで構成
される請求項１８に記載の検査キット。
【請求項２０】請求項３〜８のいずれか一項に記載の
モノクローナル抗体を含む請求項１８に記載の検査キッ
ト。