JPH08298982A - 複合微生物製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 血中コレステロール降下作用、整腸作用、
免疫賦活作用、制癌作用、血圧降下作用、高血糖値の改
善、精神障害原因物質の腸内発生抑制などの種々の生理
作用に加えて、家畜の生産性の向上や糞便の悪臭消臭作
用およびその堆肥化促進作用、反芻動物のルーメン（第
１胃）内のメタン発生抑制作用などを有する新規な複合
微生物製剤を提供する。 【構成】 バチルス属、ラクトバチルス属、ストレプ
トコッカス属、サッカロミセス属及びカンディダ属に属
する少なくとも１３種の特定の土壌細菌あるいはそれら
に加えて硝化菌および硫黄細菌からなり、これら土壌細
菌をカルシウム含有基材に吸着発酵させた製剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、血中コレステロール降
下作用、整腸作用、免疫賦活作用、制癌作用、血圧降下
作用、高血糖値の低減正常化、精神障害原因物質の腸内
発生抑制などの種々の生理作用に加えて、糞便の悪臭消
臭作用およびその堆肥化促進作用、反芻動物のルーメン
（第１胃）内のメタン発生抑制作用などを有する新規な
複合微生物製剤に関する。更に詳しくは、少なくともあ
る特定の１３種の土壌細菌をカルシウム含有基材に吸着
発酵させた複合微生物製剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】家畜糞は生物循環の流れに沿い、作物収
穫物残渣等とともに堆肥化し、有機質肥料として土壌還
元されている。しかし、堆肥化の際にメタンや悪臭物質
が発生し、それらが地球温暖化や悪臭公害の元凶として
問題になっている。メタンは反芻家畜動物の第１胃（ル
ーメン）からも多く発生し、これらが地球大気の温暖化
の原因として注目されており、糞尿の悪臭と共に畜産公
害の源として問題となっている。また、未完熟堆肥の河
川への流亡が水質汚染問題として注目されている。この
ような状況において、家畜糞尿の堆肥化を促進し、悪臭
の発生を抑える目的で種々の微生物・酵素含有資材が開
発されている。例えば、特開昭５５−４８３８６号には
新規な微生物および糞便脱臭剤としてチオバシラス属又
はシュードモナス属に属する微生物が開示されている。
また、特開昭５９−１７９０６３号には亜硝酸菌、緑色
イオウ細菌、セルロース分解菌、糸状菌、放線菌などか
らなる混合土壌細菌を米ぬか、オガクズなどと混合発酵
させた消臭剤とその製法が開示されている。この混合土
壌細菌は、直接糞便、生ゴミなどの悪臭源に施用する
他、飼料に混合して家畜に給与することによって糞便の
悪臭を予防することが開示されている。

【０００３】微生物は、一方では家畜の発育促進、下痢
の予防・治療を目的として生菌入り飼料として家畜に給
与されている。例えば、特開昭６０−２２４４５１号に
は、無機セレン含有培地で増殖した微生物菌体を含む飼
料組成物が開示されている。また、特開昭６３−６３６
２０号には、乳酸菌、糖化菌、酪酸菌を有効成分とする
整腸剤が開示されている。また、特開平１−２３８５８
号には、バチルス・セレウスの栄養胞子からなり成長改
善効果のある動物用飼料が開示されている。

【０００４】上記の微生物資材の他にも、数多くの商品
が市販されているが、これら商品の効果と安全性につい
ての評価は定まっておらず、中には科学的裏付けの不明
瞭なものもある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者も、農畜産廃
棄物の有機質肥料化の促進と畜産公害や病虫害を防止す
るために微生物・酵素類の入った飼料添加物、中でも発
酵飼料を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、土壌中に存
在する微生物のうち、ある特定のセルロース分解菌、糸
状菌、放線菌、酵母、硝化細菌、硫黄細菌などを純粋培
養し、有機質基材に混合し再発酵させて固定したものを
飼料に加えて給与すると、家畜の腸内細菌が安定化し生
産性が向上するだけでなく、家畜糞尿の悪臭が低減し、
糞尿の堆肥化が促進され、また、その堆肥を土壌に還元
すると土壌中の植物病原性糸状菌の増殖を抑え病虫害を
防止することが認められた。また、反芻動物に給与する
とルーメン（第１胃）内におけるメタン発生を抑制する
ことが認められた。更に、生理作用について究明すべく
調べた結果、意外にも前述の種々の生理作用を示すこと
も発見した。また、これらの効果と構成微生物との関係
を究明すべく更に研究を行ったところ、上記の効果は構
成微生物単独では顕著には得られず、複合微生物にして
初めて相乗効果が得られることを発見した。

【０００６】更に、本発明者は、この発酵飼料の効果を
最大限に保持しながら大量に製造する方法について確立
するため鋭意研究を重ねた結果、各構成微生物の培養物
を基材に混合し発酵する際に、ある種のカルシウム含有
基材を用いて発酵させることによりこの目的が達成でき
るだけでなく、意外にも上記の効果が増強されることを
発見した。本発明はこれらの知見を基にして完成した。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、少なく
とも、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis ）、
バチルス・ナットー（bacillus natto）、バチルス・メ
ガテリウム（bacillusmegaterium ）、ラクトバチルス
・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus ）、ラ
クトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantaru
m ）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brev
is）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus case
i)、ストレプトコッカス・フェーカリス（Streptococcu
s faecalis）、ストレプトコッカス・ラクチス（Strept
ococcus lactis）、ストレプトコッカス・サーモフィラ
ス（Streptococcus thermophilus）、クロストリジウム
・ブチリカム（Clostridium butyricum ）、サッカロミ
セス・セレビシイ（Saccharomyces cerevisiae）および
カンディダ・ユティリス（Candida utilis）からなる微
生物群とそれら微生物群を吸着している基材からなり、
該基材が少なくともカルシウム含有基材を含んでおり、
該カルシウム含有基材のカルシウム成分の少なくとも一
部が該微生物群の作用により生体適合型有機カルシウム
化合物を構成していることを特徴とする複合微生物製剤
が提供される。

【０００８】本発明で使用する微生物群は、土壌中に存
在するものであって特殊なものではなく一般に試験研究
などでよく使用されるものであり、また、上記の種類の
ものであればよく菌株については特に限定されない。従
って、市販の菌株または微生物寄託機関、微生物保存機
関から当業者が容易に入手できるものを使用することが
できる。例えば、バチルス・スブチリス（Bacillus sub
tilis ）については、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（以下、ATCC）に寄託しているＡＴＣＣ
６０５１株、ＡＴＣＣ６６３３株などが使用できる。バ
チルス・ナットー（bacillus natto）については、ＡＴ
ＣＣ１５２４５株やインスティチュート・オブ・ファー
メンテーション、オオサカ（Institute for Fermentati
on,Osaka)(以下、IFO) に保存されているＩＦＯ３３３６
株などが使用できる。バチルス・メガテリウム（bacill
us megaterium ）については、ＡＴＣＣ１４５８１株や
ＡＴＣＣ１４９４５株などが使用できる。ラクトバチル
ス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus ）に
ついては、ＡＴＣＣ４３５６株、ＡＴＣＣ１１５０６
株、ＩＦＯ３２０５株及びドイッチェ・サミュルング・
フォン・ミクロオルガニズメン(Deutsche Sammulung vo
n Mikroorganismen)（以下、DSM)に保存されているＤＳ
Ｍ２００７７株などが使用できる。ラクトバチルス・プ
ランタルム（Lactobacillus plantarum ）については、
ＡＴＣＣ８０１４株、ＡＴＣＣ１４９１７株、ＤＳＭ２
０３１４株などが使用できる。ラクトバチルス・ブレビ
ス（Lactobacillus brevis）については、ＡＴＣＣ１４
８６９株、ＩＦＯ１２５２０株、ＡＨＵ１５０８株（Ａ
ＨＵは、北海道大学農学部：Faculty of Agriculture,H
okkaido Universityの略号）などが使用できる。ラクト
バチルス・カゼイ（Lactobacillus casei)については、
ＡＴＣＣ３９３株、ＤＳＭ２００２１株などが使用でき
る。ストレプトコッカス・フェーカリス（Streptococcu
s faecalis）については、ＡＴＣＣ１４４２９株、ＡＴ
ＣＣ１９４３３株などが使用できる。ストレプトコッカ
ス・ラクチス（Streptococcus lactis）については、Ａ
ＴＣＣ１９４３５株、ＩＦＯ１２５４６株などが使用で
きる。ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptoc
occus thermophilus）については、ＡＴＣＣ１９２５８
株、ＩＦＯ３８６３株などが使用できる。クロストリジ
ウム・ブチリカム（Clostridium butyricum ）について
は、ＡＴＣＣ１９３９８株、ＩＦＯ３８５２株などが使
用できる。サッカロミセス・セレビシイ（Saccharomyce
s cerevisiae）については、ＡＴＣＣ７７５２株、ＩＦ
Ｏ０２１６株などが使用できる。カンディダ・ユティリ
ス（Candida utilis）については、ＡＴＣＣ９２５６
株、ＩＦＯ０３９６株などが使用できる。

【０００９】これらの微生物の他に、悪臭物質の発生を
低減する目的で硝化菌および硫黄細菌を加えることもで
きる。硝化菌とは、アンモニアまたは亜硝酸をそれぞれ
亜硝酸または硝酸へと酸化することができる細菌であ
り、本発明に使用できる硝化菌としては、例えばニトロ
ソモナス・オイロパエ(Nitrosomonas europaea) 、ニト
ロバクター・ウイノグラディスキー(Nitorobacter wino
gradskyi) などが使用できる。一方、硫黄細菌とは、硫
黄または無機硫黄化合物を酸化しエネルギー生産する細
菌であり、本発明に使用できる硫黄細菌としては、例え
ば スルフォロバス・アシドカルダリウス(Sulfolobus
acidocaldarius) などが使用できる。これらの細菌に関
しては特に菌株についての限定はなく、当業者が通常入
手できるものを使用できる。例えば、ニトロソモナス・
オイロパエ(Nitrosomonas europaea) については、ＡＴ
ＣＣ２５９７８株などが使用できる。ニトロバクター・
ウイノグラディスキー(Nitorobacter winogradskyi) に
ついては、ＡＴＣＣ２５３９１株などが使用できる。ま
た、硫黄細菌については、ＡＴＣＣ３３９０９株などが
使用できる。

【００１０】なお、堆肥発酵などにおいて高温時にも発
酵を促す目的で耐熱性バチルス属細菌を加えることも可
能であり、例えば、バチルス・サーモフィラス(Bacillu
s thermophilus) を使用することができる。バチルス・
サーモフィラス(Bacillus thermophilus) については、
シャープら（R.Sharp,M.Munster,T.Atkinson(PHLS Cent
re for Applied Microbiology & Research,Salisbury);
A.Vivian(Bristol Polytechnic,Bristol);S.Ahmad(Tren
t Polytechnic,Nottingham)、英国) が、マイクロバクテ
リオロジー・エキストリーム エンバイアロンメント・
イッツ ポテンシャル バイオテクノロジー(Microbio
l.Extreme Environ.Its Potential Biotechnol.) 、第
６２〜８１頁、１９８９年（表題：バチルス・サーモフ
ィラスの分類学的及び遺伝学的研究（Taxonomic and ge
ngetic studies of Bacillus thermophilus)、ヨーロッ
パ微生物学会シンポジウム連盟、トロイア）に記載して
いる菌株が使用できる。

【００１１】本発明の複合微生物製剤に上記の微生物が
構成成分として含まれていることは、以下の方法によっ
て同定できる。すなわち、バチルス・スブチリス（Baci
llussubtilis ）、バチルス・ナットー（bacillus natt
o）、バチルス・メガテリウム（bacillus megaterium
）の場合は、ＰＥＥＳ寒天培地（栄研化学（株）製：
酵母エキス２．５ｇ，ペプトン１０ｇ，ゼラチン３０
ｇ，乳糖２ｇ、マンニット１０ｇ、塩化ナトリウム７５
ｇ、リン酸二カリウム５ｇ、寒天１５ｇ、水１０００ｍ
ｌ）を使用して単離する。ラクトバチルス・アシドフィ
ルス（Lactobacillus acidophilus ）、ラクトバチルス
・プランタルム（Lactobacillus plantarum)、ラクトハ゛チルス・フ゛
レヒ゛ス(Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・カゼイ
（Lactobacillus casei)の場合は、ＬＢＳ選択寒天培地
(Becton DickinsonCo.Ltd.,(BBL)製（米国）：Lab-lem
co powder(Oxoid) ８ｇ、トリプチケースペプトン１０
ｇ、酵母エキス５ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ６ｇ、クエン酸アン
モニウム２ｇ、ブドウ糖２０ｇ、ソルビタンモノオレエ
イト１ｇ、酢酸ナトリウム２５ｇ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂
Ｏ０．６ｇ、ＭｎＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．１ｇ、ＦｅＳＯ
₄ ・７Ｈ₂ Ｏ３４ｍｇ、寒天１５ｇ、水１０００ｍｌ）
で単離する。ストレプトコッカス・フェーカリス（Stre
ptococcus faecalis）、ストレプトコッカス・ラクチス
（Streptococcus lactis）、ストレプトコッカス・サー
モフィラス（Streptococcus thermophilus）の場合は、
ＫＦストレプトコッカル（Streptococcal)寒天培地（BB
L:ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、塩化ナトリ
ウム５ｇ、グリセロリン酸ナトリウム１０ｇ、マルトー
ス２０ｇ、乳糖１ｇ、窒化ナトリウム０．４ｇ、寒天２
０ｇ、水１０００ｍｌ）で単離する。クロストリジウム
・ブチリカム（Clostridium butyricum ）の場合は、Ｎ
Ｎクロストリジウム選択寒天培地（ペプトン４０ｇ、Ｎ
ａ₂ ＨＰＯ₄ ５ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ １ｇ、塩化ナトリウム
２ｇ、ＭｇＳＯ₄ ０．１ｇ、ブドウ糖２ｇ、寒天２５
ｇ、５０％卵黄溶液１００ｍｌ、２％硫酸ネオマイシン
１０ｍｌ、水１０００ｍｌ）で単離する。サッカロミセ
ス・セレビシイ（Saccharomyces cerevisiae）およびカ
ンディダ・ユティリス（Candida utilis）の場合は、ポ
テトデキストロース（ＰＤ）寒天培地（ポテトインフー
ジョンPoteto infusion)２００ｇ、ブドウ糖２０ｇ、寒
天１５ｇ、水１０００ｍｌ）で単離する。培養条件は、
各微生物によって異なるが、ストレプトコッカス属細
菌、バチルス属細菌、サッカロミセス属菌およびカンデ
ィダ属菌は好気的条件下で、ラクトバチルス属細菌およ
びクロストリジウム属細菌は嫌気的条件下、３７℃で１
２〜２４時間培養を行う。それぞれ本発明の複合微生物
製剤から分離培養後、ミニテック細菌同定システム（Be
cton Dickinson Co.Ltd.,(BBL)製、米国）、バージェイ
ズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリ
オロジー（Bergey's Manual of Determinative Bactrio
logy) 第８版、駒形和男編：微生物分類実験法、学会出
版センター刊（１９８２年）および中野益男：化学と生
物、第１８巻、第１５〜２４頁、学会出版センター発行
（１９８０年）に記載の細胞膜化学構造による化学分類
法および顕微鏡観察により同定できる。

【００１２】硝化細菌の分離については以下のようにし
て行うことができる。ニトロソモナス属細菌の場合は硝
化細菌選択分離培地として、Ａ液［（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄
１１．０ｇ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ１．４ｇおよびＦｅ
ＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．３ｇを蒸留水１００ｍｌに溶解し
たもの］およびＢ液（ＫＨ₂ ＰＯ₄ １．３６ｇを蒸留水
１００ｍｌに溶解したもの）を９：１の割合（容量比）
で混合し、０．１ＮＮａＯＨ溶液でｐＨ８．０〜８．２
に調整した培地を用いて培養後、シリカゲル平板上でコ
ロニーを分離し、上記のバージェイズ・マニュアルに従
って同定することができる。また、ニトロバクター属細
菌の場合は、Ａ液としてＫＮＯ₂ ２．５ｇ、ＭｇＳＯ₄
・７Ｈ₂ Ｏ１．４ｇおよびＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．３
ｇを蒸留水１００ｍｌに溶解したものを用いる以外は、
ニトロソモナス属細菌と同じ方法で同定できる。一方、
硫黄細菌の分離については、ＤＳＭ１２０変法培地（Ｋ
Ｈ₂ ＰＯ₄ ０．２２７ｇ、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０．３４８ｇ、
ＮａＣｌ ２．２５ｇ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．５
ｇ、ＣａＣｌ・２Ｈ₂ Ｏ２５０ｍｇ、ＭｎＳＯ₄ ・２Ｈ
₂ Ｏ０．０９ｍｇ、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ２ｍｇ、Ｃｏ
ＳＯ₄ ０．６ｍｇ、ＺｎＳＯ₄ ０．３ｍｇ、ＣｕＳＯ₄
・７Ｈ₂ Ｏ０．０３ｍｇ、Ｈ₃ ＢＯ₄ ０．９ｍｇ、Ｎａ
₂ ＭｏＯ₄ ・２Ｈ₂ Ｏ０．０９１ｍｇ、ＮｉＣｌ₂ ０．
０６ｍｇ、ＮａＨＣＯ₃ ０．８５ｇ、システイン塩酸塩
０．３ｇ、Ｎａ₂ Ｓ・９Ｈ₂ Ｏ０．３ｇ、酵母エキス２
ｇ、ビタミン溶液（ビオチン２ｍｇ、葉酸２ｍｇ、ピリ
ドキシン塩酸塩１０ｍｇ、チアミン塩酸塩５ｍｇ、リボ
フラビン５ｍｇ、ナイアシン５ｍｇ、ＤＬ−カルシウム
パントテン酸５ｍｇ、ビタミンＢ₁₂０．１ｍｇ、ｐ−ア
ミノベンゾイク酸５ｍｇ、リポ酸５ｍｇを蒸留水１００
０ｍｌ）１０ｍｌ、レサズリン(Resazurin) １ｍｇを蒸
留水１０００ｍｌに溶解したもの）を分離培地として用
いて４０〜４５℃で４〜６週間集積培養した後、上記の
バージェイズ・マニュアルに従い同定することができ
る。

【００１３】本発明の製剤は、上記の微生物群が少なく
ともカルシウム含有基材を含む基材に吸着されている。
カルシウム含有基材とは、主成分としてカルシウムを含
むものであればよく、無機物であってもよいし有機物で
あってもよい。カルシウム含有量は、２５重量％以上含
むものがよく、好ましくは２５〜８０重量％含むものが
適している。このカルシウム含有基材が、全基材のう
ち、カルシウム含量として２５重量％以上になるように
使用する。２５重量％未満では後述する生体適合型有機
カルシウム化合物の構成率が小さくなるので好ましくな
い。カルシウム含有基材の具体例としては、獣骨や魚骨
などのか焼骨粉、貝化石、珊瑚、合成アパタイト、リン
酸カルシウム、炭酸カルシウムなどが挙げられるが、こ
れに限定されるものではなく、その他のカルシウム含有
基材もカルシウム含量が２５重量％以上のものであれば
制限無く使用できる。これらのカルシウム含有基材は１
種類を使用してもよく、また複数種を混合使用してもよ
い。本発明で使用するカルシウム含有基材は粉末状など
の固体でもよいし、溶媒に溶解した液状のものでもよ
い。本発明では、カルシウム含有基材を他の基材と併用
することもできる。例えば、キチンまたはその誘導体、
アルギン酸、セルロースや、飼料用基材として使用され
る米ぬか、ふすま、大豆粕、オカラなどと混合して使用
することができる。

【００１４】本発明では、カルシウム含有基材のカルシ
ウム成分の少なくとも一部が微生物群の作用により生体
に吸収されやすい生体適合型有機カルシウム化合物を構
成している。生体適合型有機カルシウム化合物とは、乳
酸カルシウム、フマル酸カルシウム、リンゴ酸カルシウ
ムやクエン酸カルシウムなどの有機酸カルシウム、ある
いはカルシウム結合蛋白のカゼインホスホペプチドなど
のペプチド−カルシウム化合物などが挙げられる。これ
らは、上記のカルシウム含有基材そのものにはほとんど
存在しないが、本発明で使用する微生物群の作用により
そのカルシウムの少なくとも一部がこのような生体適合
型有機カルシウム化合物に変換されることにより存在す
るものである。本発明の製剤が、この生体適合型有機カ
ルシウム化合物を含有していることは、これらの有機化
合物を分析することにより確認できる。例えば、ビュー
レンら（Rolf H.O.Buhlen and Jeremias H.R.Kagi:FEBS
Letters,39(2),229-233(1974)) 記載の方法に参照した
方法で分析同定することができる。詳細には、試料を１
０ｍＭトリス塩酸（Tris-HCl) 緩衝液（pH8.6)に懸濁し
て抽出し、遠心分離により上清を得、これをセファデッ
クスＧ−２５又はＧ−７５カラム、及びＤＥＡＥ−セフ
ァデックスＡ−２５カラムを使用し、１０ｍＭトリス塩
酸（Tris-HCl) 緩衝液でゲルろ過して分画する。各画分
のＣａ、Ｍｇ等のミネラルは原子吸光法で分析し、有機
酸はガスクロマトグラフィーで分析して有機カルシウム
の存在を同定することができる。しかしながら、単に微
生物群に上記のような有機酸カルシウムを混合しただけ
では微生物群の作用を増強する効果は十分ではなく、カ
ルシウム含有基材を微生物群とともに発酵させることに
より本発明の複合微生物がもたらす効果をより顕著に向
上し種々の生理活性を示すことから、ここでいう生体適
合型有機カルシウム化合物とは、カルシウムと微生物群
とが複合体を形成したものと考えられる。

【００１５】本発明の製剤は、上記の微生物群及びその
吸着基材の合計重量１ｇ当たり、上記の微生物群の各菌
株の菌数がそれぞれ１０⁴ cfu （コロニー形成単位）以
上、好ましくは１０^6-8 cfu 含有する。１０⁴ cfu ／ｇ
よりも少ないと所望の効果が顕著に現れない。

【００１６】本発明は、上記複合微生物製剤の製造方法
も提供する。製造方法としては、各構成微生物をそれぞ
れ純粋培養した後、それらを吸着基材と混合し発酵させ
る方法と、構成微生物群を最初から吸着基材と混合して
培養する方法の２種類が考えられる。

【００１７】即ち、本発明によれば、少なくとも、バチ
ルス・スブチリス（Bacillus subtilis ）、バチルス・
ナットー（bacillus natto）、バチルス・メガテリウム
（bacillus megaterium ）、ラクトバチルス・アシドフ
ィルス（Lactobacillus acidophilus ）、ラクトバチル
ス・プランタルム（Lactobacillus plantarum ）、ラク
トバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラク
トバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei)、ストレプ
トコッカス・フェーカリス（Streptococcus faecali
s）、ストレプトコッカス・ラクチス（Streptococcus l
actis）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Strep
tococcus thermophilus）、クロストリジウム・ブチリ
カム（Clostridium butyricum ）、サッカロミセス・セ
レビシイ（Saccharomyces cerevisiae）およびカンディ
ダ・ユティリス（Candida utilis）をそれぞれ液体純粋
培養した後、得られる各微生物培養物をカルシウム含有
基材と混合し、得られる混合物を発酵させることからな
る前記複合微生物製剤の製造方法が提供される。

【００１８】更にまた、本発明によれば、少なくとも、
バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis ）、バチル
ス・ナットー（bacillus natto）、バチルス・メガテリ
ウム（bacillus megaterium ）、ラクトバチルス・アシ
ドフィルス（Lactobacillusacidophilus ）、ラクトバ
チルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum ）、
ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、
ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei)、スト
レプトコッカス・フェーカリス（Streptococcus faecal
is）、ストレプトコッカス・ラクチス（Streptococcus
lactis）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Stre
ptococcus thermophilus）、クロストリジウム・ブチリ
カム（Clostridium butyricum ）、サッカロミセス・セ
レビシイ（Saccharomyces cerevisiae）およびカンディ
ダ・ユティリス（Candida utilis）からなる混合微生物
群を、少なくともカルシウム含有基材を含む吸着基材と
混合し培養することからなる前記複合微生物製剤の製造
方法が提供される。

【００１９】前者の方法について具体的に説明すると、
第１の工程として本発明の複合微生物の構成微生物をそ
れぞれ液体純粋培養する。各微生物の培養用液体培地に
ついては特に限定されないが、通常、ストレプトコッカ
ス属細菌、バチルス属細菌、ラクトバチルス属細菌、サ
ッカロミセス属菌およびカンディダ属菌は好気的条件下
で、また、クロストリジウム属細菌は嫌気的条件下で、
ニュートリエントブロス（Nutrient broth) 培地（BBL:
ゲリセートペプトン５ｇ、牛肉エキス３ｇ、水１０００
ｍｌ）とＤＳＭ１ブロス（DSM 1 broth)培地（Ｋ₂ ＨＰ
Ｏ₄ １．４ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ４ｇ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂
Ｏ１６０ｍｇ、ＣａＣｌ₂ ・６Ｈ₂ Ｏ８０ｍｇ、ＭｎＳ
Ｏ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ８ｍｇ、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ８ｍｇ、
クエン酸水素二アンモニウム４ｇ、酢酸ナトリウム４
ｇ、肉ペプトン２０ｇ、酵母エキス５ｇ、ブドウ糖３０
ｇ、蒸留水１０００ｍｌ）を用いて、３７℃で対数増殖
期まで培養を行う。通常７〜１４時間で対数増殖期に達
する。

【００２０】また、硝化菌および硫黄細菌を微生物群に
加える場合は、その液体純粋培養を以下のようにして行
う。即ち、ニトロソモナス属細菌の場合は（ＮＨ₄ ）₂
ＳＯ₄ ０．５ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．０７ｇ、ＭｇＳＯ₄
・７Ｈ₂ Ｏ０．０５ｇおよびＣａＣｌ₂ ・２Ｈ₂ Ｏ０．
０５ｇを蒸留水１０００ｍｌに溶解したものを５％Ｎａ
₂ ＣＯ₃ 溶液でｐＨ８．０に調整した培地を硝化菌培養
培地として用いて培養することができる。また、ニトロ
バクター属細菌の場合は、（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄０．５ｇ
の代わりにＫＮＯ₂ ０．２ｇを使用する以外はニトロソ
モナス属細菌で使用した培地と同じ培地を用い同じ培養
条件で培養することができる。培養条件はいずれも嫌気
条件下３７℃で培養することができる。また、硫黄細菌
の場合は、前記ＤＳＭ１２０変法培地を用いて４０〜４
５℃で大量純粋培養することができる。

【００２１】硝化菌及び硫黄細菌を培養する培地として
は、ＡＴＣＣ寄託細菌を使用する場合はＡＴＣＣ寄託リ
ストに記載されている培地を使用することができる。具
体的には、ニトロソモナス・オイロパエの場合はＡＴＣ
Ｃ１５７３培地を、ニトロバクター・ウイノグラディス
キーの場合はＡＴＣＣ４８０培地を、スルフォロバス・
アシドカルダリウスの場合はＡＴＣＣ１７２３培地をそ
れぞれ使用することができる。

【００２２】得られた各微生物の純粋培養物から連続遠
心によりそれぞれ集菌しリン酸緩衝液で洗浄し凍結乾燥
する。

【００２３】第２の工程として、殺菌した１００メッシ
ュの米ヌカ粉体１ｋｇに対し、凍結乾燥した各菌体２〜
５ｍｇを後述のミネラル水１ｍｌにそれぞれ懸濁したも
のを接種し、これに後述の酵素液２重量％、廃糖蜜５重
量％、ミネラル水３０重量％を加え、３８℃で２４〜４
８時間好気的条件下で静置発酵する。ミネラル水として
は、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ １．４ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ４ｇ、ＭｇＳ
Ｏ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ１６０ｍｇ、ＣａＣｌ₂ ・６Ｈ₂ Ｏ８０
ｍｇ、ＭｎＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ８ｍｇ、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ
₂ Ｏ８ｍｇを水１０００ｍｌに溶解したものを使用する
ことができる。また酵素液としては、以下のようにして
調製したものを使用できる。すなわち、自然乾燥を充分
にした生大豆を粗砕する。この生大豆粗砕粉の重量比３
０％に対し、米糠を７０％加え攪拌混合し、この混合物
１ｋｇに対し、２０重量％Ｎａ₂ＣＯ₃ 溶液１０００ｍ
ｌを加えよく攪拌し、湿度８０％、温度４０〜５０℃の
条件下で５日間発酵させる。その後、これを煮沸釜に移
して、この原料１ｋｇに対し、ミネラル水２０００ｍ
ｌ、粗製ブドウ糖（たとえば、廃糖蜜など）１００ｇ
（１０％濃度）を加えて攪拌しながら徐々に加熱し、煮
沸、沸騰させる。この間液面の浮遊物はすべて除去す
る。沸騰後約１時間煮沸した後、加熱を停止し自然放冷
により室温まで冷却した後、遠心分離機にかけ、上清を
ろ過して黄褐色の透明液を酵素液として得る。

【００２４】静置発酵により発酵温度が６０〜７０℃ま
で上昇した後、培養物を攪拌し、以後２４時間毎に攪拌
して５日間培養し元菌とする。この元菌１ｋｇに対しカ
ルシウム含有基材を含む基材６０ｋｇを混合し、前述の
酵素液２重量％、廃糖蜜５重量％、ミネラル水３０重量
％を加え、３８℃で２４時間静置発酵させる。発酵終了
後攪拌し、６〜１２時間さらに発酵させ、発酵温度が５
５〜６５℃に上昇してから水分１２％以下に低温冷風乾
燥して本発明の複合微生物製剤が得られる。上記の方法
で通常、各微生物の最終菌数は１０⁴ 生菌数（ｃｆｕ）
／ｇ以上、好ましくは１０^6-8 ｃｆｕ／ｇになる。必要
に応じて、それぞれ上記元菌の調製方法で純粋培養され
た各構成微生物を発酵終了微生物に混合することによっ
て、すべての微生物の菌数がそれぞれ上記の範囲になる
ように調整してもよい。

【００２５】後者の方法では、前記の１３種，またはこ
れらと前記の硝化菌及び硫黄細菌を含む微生物群を最初
から混合したものを吸着基材と共に培養する方法であ
る。微生物群としては、例えば、発明者が腐植土及び自
然湖底質から分離・継代して保有する混合微生物（識別
のための表示：ＥＧ）（工業技術院生命工学工業技術研
究所の寄託拒否により自己寄託）を使用することができ
る。

【００２６】培養は、通常表１に示す培地を用いて行う
ことができるが、より効率的に培養するためには前述の
酵素液を使用することが好ましい。

【００２７】

【表１】

【００２８】培養条件は限定的ではないが通常２０〜３
０℃で２４時間培養した後、同じ培地でスケールアップ
してさらに２０〜３０℃で培養することによって増殖す
ることができる。培養は通常通性嫌気性条件下で行う。
得られた培養物から連続遠心により集菌し、前記と同様
の方法でミネラル水１ｍｌに懸濁し、これを米ヌカ粉体
１ｋｇに接種し、これに前記の酵素液２重量％、廃糖蜜
５重量％、ミネラル水３０重量％を加え、３８℃で２４
〜４８時間好気条件下で静置発酵する。発酵温度が６０
〜７０℃まで上昇した後攪拌し、以後２４時間毎に攪拌
して５日間培養する。この培養物１ｋｇに対しカルシウ
ム含有基材を含む基材６０ｋｇを混合し、前述の酵素液
２重量％、廃糖蜜５重量％、ミネラル水３０重量％を加
え、３８℃で２４時間静置発酵させる。発酵終了後攪拌
し、６〜１２時間さらに発酵させ、発酵温度が５５〜６
５℃に上昇してから水分１２％以下に低温冷風乾燥し
て、本発明の複合微生物製剤が得られる。

【００２９】上記の方法で通常、各微生物の最終菌数は
１０⁴ ｃｆｕ／ｇ以上、好ましくは１０^6-8 ｃｆｕ／ｇ
になるが、いずれかの微生物の菌数が所望のレベルまで
行かない場合は、その菌の純粋培養物を前述の方法で調
製して追加混合し補充してもよい。

【００３０】いずれの方法においても、微生物の吸着基
材は少なくともカルシウム含有基材を含んでいることが
必要である。本発明の方法で使用できるカルシウム含有
基材およびその他の基材としては、前記のものが挙げら
れる。この方法において、該カルシウム含有基材に含ま
れるカルシウムの少なくとも一部が微生物群の培養発酵
過程で前述の生体適合型有機カルシウム化合物に変換さ
れる。この生体適合型有機カルシウム化合物が、本発明
で使用する複合微生物群の示す後述する種々の生理活性
を増強するものと推測される。

【００３１】

【作用】本発明の複合微生物製剤は、後述するように種
々の有益な生理作用を示すので医薬用途として使用する
ことができる。その場合、本発明の複合微生物製剤はそ
のまま投与することもできるが、種々の経口投与用剤形
にして投与することもできる。例えば、顆粒剤、錠剤、
丸剤、カプセル剤などのように医薬組成物として用いら
れる形状にすることもできる。その場合、本発明の複合
微生物製剤に通常の医薬に用いられる構成成分を混合し
製剤化することができる。医薬用構成成分としては、例
えば顆粒剤の場合、乳糖、炭酸水素ナトリウム、塩化ナ
トリウム、蔗糖、マンニトール、デンプン、結晶性セル
ロース、硫酸カルシウム、沈降炭酸カルシウム、リン酸
カルシウムなどの賦形剤、デンプン、結晶性セルロース
などの崩壊剤、１０〜２０％アラビアゴム水溶液、５〜
１０％デンプン糊液、ＰＶＰの５〜１０％水溶液または
エタノール溶液、セルロース誘導体の１〜２％水溶液あ
るいはエタノール溶液などの結合剤が挙げられる。錠剤
の場合は、乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、結晶性セ
ルロースなどの賦形剤、５〜１０％デンプン糊液、ヒド
ロキシプロピルセルロース液、カルボキシメチルセルロ
ース液、アラビアゴム液、ゼラチン液、ブドウ糖液、白
糖液、トラガント液、アルギン酸ナトリウムなどの結合
剤、デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム
などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、精製タル
ク、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウムなどの滑沢
剤などが挙げられる。また、丸剤およびカプセル剤では
上記の賦形剤、結合剤などの他にコーティング剤が構成
成分として挙げられる。コーティング剤としては、丸剤
では白糖、デンプン、タルクなどが、カプセル剤ではゼ
ラチン、グリセリン、ソルビトールなどが挙げられる。
これらの組成物は、通常の動物用医薬品製造の方法によ
って製造することができる。また、必要に応じて通常の
酸化防止剤などの安定化剤を配合してもよい。

【００３２】また、本発明の複合微生物製剤は糞便の悪
臭低減作用およびその堆肥化促進作用、反芻動物のルー
メン内メタン発生抑制作用を有するので、上記の医薬用
途のほかに家畜用飼料添加物として使用することもでき
る。飼料用として使用する場合、本発明の複合微生物製
剤をそのまま家畜に給与することもできるが、飼料用基
材と混合して給与することもできる。飼料用基材として
は、通常飼料として用いられるトウモロコシや、大麦、
小麦、ライ麦およびえん麦などの麦類、ふすま、糠など
の糟糠類、大豆粕などの油粕類、ルーサンミール、小麦
粉などが挙げられるが、これらに限定されるものではな
い。その場合の形状も限定的ではなく、粉状、ペレット
状などの通常の飼料の形状にすることができる。成形に
ついては、通常の配合飼料や混合飼料の製造に用いられ
る方法と同様の方法で製造することができる。製造方法
については、例えば、チクサン出版社刊、「配合飼料講
座（下巻）」、１５〜２７頁に記載されている。

【００３３】本発明の複合微生物製剤は、前述したよう
に通常経口投与で給与することができる。投与量はヒト
および牛、豚などの家畜の場合は通常３〜８ｇ／日が適
量である。また、小動物の場合は、摂取食餌量の０．０
５〜０．２重量％を給与することができる。

【００３４】

【実施例】

実施例１ （本発明の製剤の製造例） 本発明の複合微生物製剤は以下のようにして調製した。
構成微生物はそれぞれ西日本及び北日本地域の褐色森林
土壌から単離した。単離方法は前述の分離培地を用いて
以下の方法によって行った。すなわち、バチルス属菌は
ＰＥＥＳ培地（栄研化学（株）製）を用いて、ラクトバ
チルス属菌はＬＢＳ選択寒天培地（ Becton Dickinson
Co. Ltd.,(BBL ）製及びＴＯＳ寒天培地（前述）を用い
て、ストレプトコッカス属菌はＫＦストレプトコッカス
寒天培地（前述）を用いて、クロストリジウム属菌はＮ
Ｎクロストリジウム選択寒天培地を用いて、酵母（サッ
カロミセス属菌およびカンディダ属菌）はポテトデキス
トロース（ＰＤ）寒天培地（前述）を用いて単離した。
培養条件は、ストレプトコッカス属細菌、バチルス属細
菌、ラクトバチルス属細菌およびサッカロミセス属菌
（酵母）、カンディダ属菌は好気的条件下で、クロスト
リジウム属細菌は嫌気的条件下で、３７℃で培養を行っ
た。また、ニトロソモナス属菌およびニトロソバクター
属菌は前述の硝化細菌選択分離培地を用いて、好気条件
下３７℃で培養し単離した。また、硫黄細菌は前述のＤ
ＳＭ１２０変法培地を用いて嫌気条件下４０〜４５℃で
培養し単離した。それぞれ分離培養後、ミニテック細菌
同定システム（ Becton Dickinson Co. Ltd.,(BBL ）
製、米国）、バージェイズ・マニュアル・オブ・デター
ミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of
Determinative Bactriology）第８版、駒形和男編：微
生物分類実験法、学会出版センター刊（１９８２年）お
よび中野益男：化学と生物、第１８巻、第１５〜２４
頁、学会出版センター発行（１９８０年）に記載の細胞
膜化学構造による化学分類法および顕微鏡観察により同
定した。その結果、以下の最近を分離同定した。即ち、
バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis ）、バチル
ス・ナットー（bacillus natto）、バチルス・メガテリ
ウム（bacillus megaterium ）、ラクトバチルス・アシ
ドフィルス（Lactobacillus acidophilus ）、ラクトバ
チルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum ）、
ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、
ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei)、スト
レプトコッカス・フェーカリス（Streptococcus faecal
is）、ストレプトコッカス・ラクチス（Streptococcus
lactis）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Stre
ptococcus thermophilus）、クロストリジウム・ブチリ
カム（Clostridium butyricum ）、サッカロミセス・セ
レビシイ（Saccharomyces cerevisiae）、カンディダ・
ユティリス（Candida utilis）、ニトロソモナス・オイ
ロパエ(Nitrosomonas europaea),ニトロバクター・ウイ
ノグラディスキー(Nitorobacter winogradskyi) 、スル
フォロバス・アシドカルダリウス(Sulfolobus acidocal
darius) を同定した。

【００３５】同定した構成微生物のコロニーを分離しそ
れぞれ液体純粋培養した。ストレプトコッカス属細菌、
バチルス属細菌、ラクトバチルス属細菌、サッカロミセ
ス属菌およびカンディダ属菌は好気的条件下で、クロス
トリジウム属細菌は嫌気的条件下で前述のニュートリエ
ントブロス（Nutrient broth）培地とＤＳＭ１ブロス
（DSM1 broth）培地を用いて、３７℃で対数増殖期まで
培養を行った。また、硝化菌（ニトロソモナス属細菌、
ニトロバクター属細菌）は前述の硝化菌培養培地を用い
て好気条件下３７℃で１２〜２４時間培養した。硫黄細
菌は前述のＤＳＭ１２０変法培地を用いて嫌気条件下４
０〜４５℃で４〜６週間培養した。得られた各微生物の
純粋培養物から連続遠心によりそれぞれ集菌した後、リ
ン酸緩衝液で洗浄し凍結乾燥した。

【００３６】次に、凍結乾燥した各菌体５ｍｇを前述の
ミネラル水１ｍｌにそれぞれ懸濁したものを殺菌した１
００メッシュの米ヌカ粉体１ｋｇに接種し、これに前述
の酵素液２重量％、廃糖蜜５重量％、ミネラル水３０重
量％を加え、３８℃で４８時間好気条件下で静置発酵し
た。発酵温度が６５℃まで上昇した後攪拌し、以後２４
時間毎に攪拌して５日間培養し、硝化菌と硫黄細菌を含
む上記１７種の細菌からなる複合微生物の元菌（識別番
号：ＥＧ）を得た（工業技術院生命工学工業技術研究所
寄託拒否により自己寄託）。この元菌１ｋｇに対しカル
シウム含有基材として貝化石７０重量％および米ヌカ３
０重量％を含む基材６０ｋｇを混合し、前述の酵素液２
重量％、廃糖蜜５重量％、ミネラル水３０重量％を加
え、３８℃で２４時間静置発酵させる。発酵終了後攪拌
し、１２時間さらに発酵させ、発酵温度が６０℃に上昇
してから水分１２％以下に低温冷風乾燥して本発明の複
合微生物製剤を得た（製剤１）。

【００３７】一方、硝化細菌と硫黄細菌を含まない本発
明の複合微生物を調製した。即ち、前記の方法で調製し
た複合微生物の元菌から下記の１３種の細菌を分離し
た。分離は、バチルス・スブチリス（Bacillus subtili
s ）、バチルス・ナットー（bacillus natto）、バチル
ス・メガテリウム（bacillus megaterium ）はＰＥＥＳ
培地（栄研化学（株）製）を用いて、ラクトバチルス・
アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus ）、ラク
トバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum
）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevi
s）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei)
はＬＢＳ選択寒天培地（ Becton DickinsonCo. Ltd.,(B
BL ）製）を用いて、ストレプトコッカス・フェーカリ
ス（Streptococcus faecalis）、ストレプトコッカス・
ラクチス（Streptococcus lactis）、ストレプトコッカ
ス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）は
ＫＦストレプトコッカス寒天培地を用いて、クロストリ
ジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum ）はＮＮ
クロストリジウム選択寒天培地を用いて、サッカロミセ
ミセス・セレビシイ（Saccharomyces cerevisiae）およ
びカンディダ・ユティリス（Candida utilis）はポテト
デキストロース寒天培地を用いて単離した。培養条件
は、ストレプトコッカス属細菌、バチルス属細菌および
ラクトバチルス属細菌、サッカロミセス属菌（酵母）、
カンディダ属菌は好気的条件下で、クロストリジウム属
細菌は嫌気的条件下で、３７℃で培養を行った。培養
後、前述の同定方法でそれぞれ同定確認した。同定した
構成微生物のコロニーを分離しそれぞれ液体純粋培養し
た。ストレプトコッカス属細菌、バチルス属細菌、ラク
トバチルス属細菌、サッカロミセス属菌およびカンディ
ダ属菌は好気的条件下で、クロストリジウム属細菌は嫌
気的条件下で前述のニュートリエントブロス（Nutrient
broth）培地とＤＳＭ１ブロス（DSM1 broth）培地を用
いて、３７℃で対数増殖期まで培養を行った。得られた
各微生物の純粋培養物から連続遠心によりそれぞれ集菌
した後、リン酸緩衝液で洗浄し凍結乾燥した。

【００３８】得られた各細菌の凍結乾燥菌体を表１に示
す培地を用いて２５℃で２４時間通気嫌気的条件下で培
養した後、同じ培地でスケールアップしてさらに２５℃
で培養することによって増殖した。得られた培養物から
連続遠心により集菌し、前記と同様の方法でミネラル水
１ｍｌに懸濁し、これを米ヌカ粉体１ｋｇに接種し、こ
れに前記の酵素液２重量％、廃糖蜜５重量％、ミネラル
水３０重量％を加え、３８℃で４８時間好気的条件下で
静置発酵した。発酵温度が６５℃まで上昇した後攪拌
し、以後２４時間毎に攪拌して５日間培養する。この培
養物１ｋｇに対しカルシウム含有基材として貝化石７０
重量％および米ヌカ３０重量％を含む基材６０ｋｇを混
合し、前述の酵素液２重量％、廃糖蜜５重量％、ミネラ
ル水３０重量％を加え、３８℃で２４時間静置発酵させ
る。発酵終了後攪拌し、１２時間さらに発酵させ、発酵
温度が６０℃に上昇してから水分１２％以下に低温冷風
乾燥して本発明の複合微生物製剤を得た（製剤２）。

【００３９】実施例２、３及び比較例１、２ （血中コ
レステロール低下作用） 日本クレア社（東京）から購入したＦ３４４雄ラットに
１％コレステロール含有高脂肪飼料（表２）を４週間与
え、高コレステロールラットを得た。なお、供試ラット
には試験中自由摂餌摂水させた。

【００４０】このようにして得たラット（８週齢）を８
頭ずつ２群に分け、一方には実施例１で調製した本発明
の複合微生物製剤（製剤２）１５％を含む高コレステロ
ール含有飼料を給与し（実施例２）、他方には１５％の
米ぬかを含有する高コレステロール含有飼料を給与した
（比較例１）。また、別の同じ供試ラット群から１０頭
選び、５頭ずつ２群に分けて、一方には実施例１で調製
した本発明の複合微生物製剤（製剤２）１５％を含む基
本飼料（表２）を給与し（実施例３）、他方には１５％
の米ぬかを含有する基本飼料を給与した（比較例２）。
給与は８週間行い、排泄した糞を１週間おきに２４時間
分を回収した。また、週に一度ラットを固定しないで頚
静脈から採血し、抗凝固剤入り遠心チューブに入れ遠心
分離して血清試料を得た。８週間後、供試ラットをエー
テル麻酔により殺し、肝臓を摘出し、０．９％生理食塩
水で洗浄した後、秤量し凍結保存した。

【００４１】血清試料中の総コレステロール含量を市販
の測定キット（米国アボット社製、ＴＤＸシステム分析
キット）を用いて測定した。また、肝臓中の中性ステロ
ール類を、摘出肝臓試料から全脂質をクロロホルム−メ
タノール混合溶媒（容量比２：１）で抽出した後、松原
ら（Agricultural and Biological Chemistry ５４巻、
１１４３〜１１４８頁、１９９０年）の方法でアセチル
化しガスクロマトグラフィー（島津製作所製、Shimadzu
14A GLC ）で分析定量した。

【００４２】結果を図１、２及び３に示す。図３におい
て斜線は本発明の製剤投与群のデータを示し、黒印は対
照群のデータを示す。投与群と非投与群の測定データは
スチューデントｔ検定で有意差を検定した。結果から明
らかなように本発明の複合微生物製剤は血中のコレステ
ロール値を有意に下げる作用があることがわかる。

【００４３】

【表２】

【００４４】実施例４、比較例３ （整腸作用） 整腸作用を示す指標として、糞中の大腸菌に対する有用
細菌の比率を調べた。即ち、実施例３及び比較例２で集
めたラット糞便中の細菌数を測定し比較した。糞便中の
細菌数は以下のようにして測定した。大腸菌（Escheric
hia coli）及びストレプトコッカスは腸内に常在する細
菌であり、これらは糞便試料をデスオキシコレート寒天
培地およびＫＦストレプトコッカル寒天培地（米国ベク
トンディキンソン社製）をそれぞれ用いて３７℃で２日
間培養しコロニー数を計測した。腸内細菌として有用な
細菌としては、ビフィドバクテリウム（Bifidobacteriu
m）属細菌、ユウバクテリウム(Eubacterium) 属細菌、
およびラクトバチルス(Lactobacillus) 属細菌などの乳
酸菌について糞便試料をＢＳ寒天培地、ＥＳ寒天培地及
びＬＢＳ寒天培地（米国ベクトンディキンソン社製）を
用いてガスパック法によりそれぞれ３７℃で５日間培養
した後、コロニー数を計測した。得られたコロニー数か
ら大腸菌に対するその他の細菌の比率を求め経時的に示
した（図４）。図４から明らかなように本発明の複合微
生物製剤投与群（実施例４）は、対照群（比較例３）に
比較して整腸作用に有用とされる乳酸菌およびビフィダ
ス菌の増殖を助長する作用があると考えられる。

【００４５】実施例５、比較例４ （制癌作用） 本発明の複合微生物製剤の制癌作用は、ヌードマウスを
用いて評価した。なお、制癌作用については本発明の微
生物の細胞膜物質が作用していると推測されこと及びヌ
ードマウスに生菌剤を投与することによる影響を排除す
る理由で、本発明の複合微生物製剤はその菌体成分を投
与して行った。菌体成分は以下の方法で調製した。

【００４６】実施例１で調製した複合微生物（製剤２）
の培養菌体を集菌しクロロホルム−メタノール（１：
２）混液で３回抽出し脱脂した。脱脂菌体はアスピレー
ターで溶媒を除去した後、脱脂菌体６０ｍｇに対し、１
ｍｌの割合で超純水に懸濁し、同量の８０％フェノール
を加えて７５℃の水浴中で加温、６０〜７０℃に達して
から５分間攪拌し、速やかに氷浴中で１０℃まで冷却し
た。これを２０００ｒｐｍ、６０分間遠心分離し、水層
とフェノール層に分けた。フェノール層はさらに同量の
超純水を加えて上記の操作を繰り返した。得られた水層
は超純水に対して４８時間透析後、適量まで減圧濃縮し
た。濃縮された水層に０．１Ｍ Tris −HCl 緩衝液（ｐ
Ｈ７．８）を等量加えた。次にRNase ２ｍｇ及びDNase
３ｍｇを添加し、３７℃で２４時間酵素処理をして結合
した核酸を分離した。この酵素処理液を適量まで濃縮
し、等量の８０％フェノールを加え、４０分間４℃で攪
拌後、２０００ｒｐｍ、６０分間遠心分離し得られた水
層を超純水に対して４℃で４８時間透析後、凍結乾燥
し、粗菌体成分を得た。粗菌体成分を０．０１％アジ化
ナトリウムを含む０．２Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液に溶
かしセファロース６Ｂカラム（ファーマシア社製）（分
画可能範囲：分子量１０⁴ 〜１０⁶ ）に充填し、溶出速
度９ｍｌ／時間で６ｍｌずつ分画し精製した。

【００４７】ヌードマウスは近交系ＢＡＬＢ／ｃ（nu/n
u)、４〜５週齢のものを使用した。このヌードマウスに
ヒト由来のヌードマウス可移植性腫瘍であるヒト原発性
肝癌ＰＬＣ−３０３Hepatoma細胞を移植した。移植は無
菌的に行い、２〜３ｍｍ角に細切した腫瘍片をヌードマ
ウス左右腋窩部皮下へ移植して投与実験を行った。

【００４８】投与は、上記菌体成分を生理食塩水で１ｍ
ｇ／ｍｌの濃度に溶解したものをバイアル瓶にとり、オ
ートクレイブで高圧滅菌したものを使用した（実施例
５）。対照群（比較例４）には同様にして滅菌した生理
食塩水を投与した。投与方法は腫瘍移植日を０日目とし
て３６日目まで１日１回腹腔内投与した。移植０日目よ
り４日間隔でマウスの体重と腫瘍の大きさを計測した。
腫瘍の大きさはノギスを用いて長径と短径を測定し、次
式、腫瘍体積＝（長径ｘ短径）² ｘ１／２により腫瘍体
積を算出した。移植０日目の腫瘍体積を１．０とし、そ
れに対する腫瘍体積の比率を求めた。移植３６日目の菌
体成分投与群（実施例５）と対照群（比較例４）の腫瘍
体積率を図５に示す。図５から明らかなように対照群の
腫瘍体積は移植時から変化していないが、本発明の微生
物製剤の菌体成分投与群（実施例５）では腫瘍体積が半
分以下に縮小した。この差異はスチューデントｔ検定で
有意差が認められた。なお、試験中のマウスの体重には
変化は認められなかった。

【００４９】実施例６、比較例５ （免疫賦活化作用） 実施例５及び比較例４と同様の方法でヌードマウスに癌
細胞片を移植し、本発明の微生物群の菌体成分（実施例
６）及び生理食塩水（比較例５）を投与した。移植３６
日目に以下の方法でマウス腹腔マクロファージの活性を
測定した。マクロファージ活性化の指標として、パーオ
キシダーゼ−抗パーオキシダーゼ可溶性複合体（PAP)を
標識免疫複合体としてマウス腹腔マクロファージを反応
させ、その取り込み量を酵素免疫定量法の原理により微
量定量した。

【００５０】すなわち、マウスをエーテル麻酔し、７０
％エーテル綿で腹壁を消毒する。冷ＨＢＳＳ^ー （ハンク
ス平衡塩液：Hank's Balanced Salt Solution)を５〜６
ｍｌシリンジに取り、下腹部中央の腹筋部分より腹腔内
に急速に注入する。７０％エタノール綿で３０秒間腹壁
をマッサージした後、シリンジで腹腔滲出細胞（PEC)を
含むＨＢＳＳ^ー を回収する。これをポリプロピレン製遠
心チューブに移し、１０００ｒｐｍで１分間、４℃遠心
分離によりＨＢＳＳ^ー で２回洗浄した後１０％ウシ胎児
血清（ＦＢＳ）−１０ｍＭ N - 2-hydroxyethylpiperi
zine-N'-2-ethanesulfonic acid （以下、HEPES と略称
する）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁して６穴平底
プラスチックシャーレに分注し、５％炭酸ガスインキュ
ベーター内で３７℃、６０分間培養する。培養後、シャ
ーレをよく振盪し非付着細胞を浮遊させ、吸引除去す
る。同様に温ＨＢＳＳ^ー で３回洗浄後、２．５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ／生理食塩水を２ｍｌ加え２０分間氷冷後、付着
細胞をラバーポリスマンで物理的に剥ぎ取り、再び遠心
チューブで１０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心洗浄
後、血球計算盤を用いて５ｘ１０⁴ ／ｍｌとなるように
１０％ＦＢＳ−１０ｍＭＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ１６
４０培地に懸濁した。

【００５１】このようにして調製したマクロファージ浮
遊液を９６穴平底マイクロプレートに２００μｌずつ３
反復で分注し、３７℃、５％炭酸ガスインキュベーター
で一晩培養する。培養後、培養液を吸引除去し、ウシ血
清アルブミン（BSA ) 含有ＨＢＳＳで希釈したＰＡＰ溶
液を各穴に１００μｌ分注する。プレートには細胞は播
き込まれているがＰＡＰは分注されていないブランクの
穴も用意する。このプレートを５％炭酸ガスインキュベ
ーターで３７℃、６０分間保温し、免疫複合体と反応さ
せる。反応後、各穴のＰＡＰ溶液を吸引除去し直ちに各
穴を氷冷しておいた１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むＨＢＳ
Ｓで洗浄する。洗浄の終わった穴からＨＢＳＳを吸引除
去し、細胞溶解液として１％ＮＰ−４０（乳化剤 Nonid
et-P-40)を含むリン酸緩衝食塩液（以下、NP40-D'PBSと
略称する）を１００μｌ分注する。分注したプレートか
ら各穴当たり５０μｌずつ発色用プレートに移し、これ
に１５０μｌの発色基質（2,2'-azino-di-[3-ethyl-ben
zthiazoline sulfate]を０．２ｍｇ／ｍｌの濃度でクエ
ン酸−リン酸緩衝液に溶かし０．０３％過酸化水素を使
用直前に等量混合したもの）を各穴に加え、アルミホイ
ルで遮光して室温で５０分間放置した。各穴内の気泡を
とるためプレートごと１０００ｒｐｍで５分間遠心分離
し、マイクロプレートレコーダーにて波長４０５ｎｍで
吸光度を測定した。対照群のマクロファージ活性を１．
０として本発明の微生物製剤投与群のマクロファージ活
性を求めた。結果を図６に示す。結果から明らかなよう
に本発明の複合微生物製剤は非投与群に比較してスチュ
ーデントｔ検定で有意に活性が高かった。

【００５２】実施例７、比較例６ （血圧降下作用） 高血圧自然発症ラットＳＨＲ／Ｎｃｒｉ（日本チャール
ズリバー社）を使用して本発明の複合微生物製剤の血圧
降下作用を評価した。対照として正常血圧のウイスター
系ラットＷＫＹ／Ｎｃｒｉ（日本チャールズリバー社）
を使用した。動物はＳＰＦ環境下において室温２２±１
℃、湿度５０〜６０％、明暗周期１４〜１０時間の長日
周期にて１週間予備飼育した。動物を無作為に３群７匹
に分け、実験に供した。１群は本発明の微生物製剤（製
剤２）投与群（実施例７）、１群は非投与群（比較例
６）、残りの１群は正常血圧ラットに非投与の対照群と
した。同じ投与群の動物を同じケージに入れ排泄物で影
響がないよう工夫した。実験前及び実験中は飼料（日本
クレア社製CE 2、オートクレーブ滅菌済み）と水を自由
に摂取させた。複合微生物製剤の投与は生後６週齢より
６週間にわたって行った。投与方法は経口ゾンデを用
い、投与量はラット体重２５０ｇ当たり飼料平均摂取量
２０ｇの３重量％を０．９％生理食塩水１．０ｍｌ／体
重１００ｇにて希釈して投与した。比較例と対照群は生
理食塩水を上記と同じ容量投与した。投与は毎日午前１
０時から同じ個体順に行ったが、血圧測定日はゾンデ使
用投与によるストレスの影響を除くため測定後投与し
た。血圧測定は投与開始後週１回行った。測定は、ラッ
ト尾静脈より非観血式血圧測定ＮＡＲＣＯ，ＰＥ３００
（東海作理機製）を使用して行った。投与群と非投与群
の測定データはスチューデントｔ検定で有意差を検定し
た。結果を図７に示す。図７から明らかなように本発明
の複合微生物製剤は非投与群に比較して有意に血圧を降
下させた。

【００５３】実施例８ （血糖値低下作用） 実施例１で調製した本発明の複合微生物製剤（製剤１）
を５人の糖尿病患者（女性２名、男性３名、年齢構成４
５〜５３才）に投与した。投与は１９９０年４月に開始
し、１日５ｇずつ経口投与を行った。血糖値は投与前の
１９８８年７月、１９８９年７月及び投与開始後の１９
９０年１０月の３回、朝食時の食前、食後１時間後及び
２時間後に採血し測定した。測定は、グルコースをヘキ
ソキナーゼによりグルコース−６−リン酸（G-6-P)に
し、Ｇ−６−ＰデヒドロゲナーゼによりＮＡＤＰをＮＡ
ＤＰＨ₂ に還元した後、波長３３４ｎｍで紫外部の吸光
度を測定する酵素法（ベルグマイヤー（Bergmeyer,H.
U.) ら、酵素分析法（Methodender enzymatischen Anal
yse) 、第２版、第ＩＩ巻、第１１６３〜１１６５頁、
フェアラーグ・ヘミー（Verlag Chemie)発行（ヴァイン
ハイム／ベルグシュトラーセ））により行い、５人の平
均値を算出した。結果を図８に示す。結果から明らかな
ように、本発明の複合微生物製剤を投与すると血糖値が
顕著に低下し正常値の範囲に入った。

【００５４】実施例９ （精神障害原因物質の腸内発生
抑制） 腸内微生物のバランスがストレスなどにより崩壊すると
腐敗菌が優勢となり、腐敗菌の活動によりアミン、アン
モニア、フェノールや硫化水素、メルカプタンなどの硫
黄化合物などいわゆる悪臭物質が発生し、これが肝臓を
通して脳に入り、各種脳障害をもたらすと考えられてい
る。即ち、ストレスなどによる精神障害の一因として腸
内の悪臭物質の発生が考えられる。この悪臭物質を低減
させると精神ストレスは急速に回復される。本発明の複
合微生物製剤は腸内の悪臭物質の発生抑制作用を示す。
このことを５人の腸内悪臭物質の発生抑制で確認した。
即ち、任意に５人の神経症経歴のボランティアを選び、
本発明の複合微生物製剤（製剤１）を１日一人５ｇずつ
経口で服用させ、この投与直前及び投与後８日目、１６
日目、２４日目に午前定時に検便チューブで５ｇ採取
し、バイアル瓶に移して３７℃で２４時間インキュベー
トした。バイアル瓶中のアンモニア濃度は日本工業規格
ＪＩＳ Ｋ０１０２ ４２に記載の方法およびケルダー
ルの微量定量法で測定した。また、硫化水素、メチルメ
ルカプタン、硫化メチルおよび二硫化メチルの硫黄化合
物はガスクロマトグラフィーで測定し、５人のデータの
平均値を求めグラフに示した（図９）。結果から明らか
なように本発明の複合微生物製剤の投与により前記悪臭
物質の発生が抑制された。また、悪臭物質の低減と共に
症状も軽減した。

【００５５】実施例１０、比較例７ （乳質改善） １群５頭の乳牛に通常の飼料給与の加えて実施例１で調
製した本発明の複合微生物製剤（製剤２）５ｇ／頭／日
給与し、乳質に対する影響を調べた。対照として、別の
牛群に実施例１で使用した微生物基材を同量与えて比較
した。給与前１週間、給与時、給与後１、５、７、９、
１１、１３、１５、１７週間後の搾乳した生乳１００ｇ
を秤量し、凍結乾燥させて得られた粉末試料にクロロホ
ルム−メタノール（２：１）混液約１５０ｍｌを加えて
３０分間超音波処理した。これを吸引ろ過し、得られた
ろ液は分液ロートに移し、残渣には５０ｍｌクロロホル
ム−メタノール（２：１）混液を加え３０分間超音波処
理後、吸引ろ過してろ液を先の分液ロートに移した。こ
の操作を再度行った。次に、分液ロート中のろ液に１／
５量の１％ＢａＣｌ₂ を加えて振盪攪拌後、一晩暗所に
放置してクロロホルム層と水層に分配した。得られたク
ロロホルム層を３０℃の水浴中で減圧濃縮し全脂質を得
た。これにクロロホルム−メタノール（２：１）混液を
加え、２００ｍｇ／ｍｌ濃度に溶解し、−２０℃で保存
した。得られた全脂質試料を脂肪酸メチルエステル化し
ガスクロマトグラフィー（島津製作所製、LC-6A)及びガ
スクロマトグラフィー質量分析計（島津製作所製、QP-1
000)で分析し、全脂質含量、不飽和脂肪酸、飽和脂肪
酸、多価不飽和脂肪酸及びコレステロール含量を定量し
た。不飽和脂肪酸と多価不飽和脂肪酸については飽和脂
肪酸との比率を求めた。結果を図１０〜１３に示す。図
１０に示すように全脂質含量は対照群と差異がないが、
飽和脂肪酸に対する不飽和脂肪酸量、多価不飽和脂肪酸
量は本発明の複合微生物製剤投与群では対照群に比較し
て上昇した（図１１、１２）。一方、コレステロール含
量は逆に低下した（図１３）。不飽和脂肪酸、多価不飽
和脂肪酸は固まりにくい脂肪で動脈硬化の予防効果があ
るといわれており、本発明の複合微生物製剤の投与によ
り、この脂肪酸組成が増加することが確認された。

【００５６】実施例１１、比較例８ （肉質改善） ２４９頭の褐毛雄牛に通常の飼料給与に加えて実施例１
で調製した本発明の複合微生物製剤（製剤１）５ｇ／頭
／日給与し、肉質に対する影響を調べた。対照として、
別の牛群２９０頭に実施例１で使用した基材を同量与え
て比較した。肥育終了後、通常の屠殺により得られたカ
ーカスから赤身及び白身をそれぞれ１００ｇずつサンプ
リングし、実施例１０と同様の方法で脂質の分析定量を
行った。結果を図１４〜１６に示す。図１４に示すよう
に、本発明の複合微生物製剤の投与によりコレステロー
ルは赤身、白身ともに顕著に減少した。一方、不飽和脂
肪酸、特に脳血栓の防止に有効なパルミトオレイン酸の
含量が増加した。

【００５７】実施例１２、１３、比較例９ （卵質改
善） １群２５０羽の採卵鶏３群を用意し、２群に実施例１で
調製した本発明の複合微生物製剤（製剤１）を給与飼料
にそれぞれ０．３％及び１．０％混合したものを給与
し、ステロール類含量に対する影響を調べた。対照とし
て残りの１群には飼料に本発明の複合微生物製剤を添加
しないで飼育しその卵質を比較した。投与群と非投与群
の測定データはスチューデントｔ検定で有意差を検定し
た。結果を図１７に示す。図１７に示すように本発明の
複合微生物製剤を給与することにより無添加と比較して
ステロール類の含量が有意に低減した。

【００５８】実施例１４ （生産性向上） １群５０頭の乳牛群に本発明の複合微生物製剤を投与す
る前及び投与後の牛群年間乳量を比較し乳生産に与える
影響を調べた。試験は１９８９年に開始し、１９８９年
及び１９９０年の２年間投与しないで年間乳量を記録
し、１９９１年２月から継続して、実施例１で調製した
本発明の複合微生物製剤（製剤１）を１日５ｇ／頭、通
常の飼料に加えて投与し年間乳量を記録した。結果を図
１８に示す。図１８から明らかなように、本発明の複合
微生物製剤投与後、年間乳量は約６６％増加した（１９
９０年と１９９３年の比較）。

【００５９】実施例１５、比較例１０ （魚脂質組成向
上とコレステロール低減） 養殖魚ハマチに本発明の複合微生物製剤（製剤１）を投
与し、その脂質に対する作用を調べた。１群３０００尾
のハマチに養殖用飼料にその０．２％量、実施例１で調
製した本発明の複合微生物製剤を添加して給与し、給与
開始日、開始後９０日目、１８０日目にそれぞれ１２尾
ずつ捕らえ、腹側及び背側の肉および肝臓を取り、それ
ぞれ実施例１０と同様の方法で脂質の分析を行った。比
較例として実施例１で使用した基材を同量給与して同様
の試験を行った。投与群と非投与群の測定データはスチ
ューデントｔ検定で有意差を検定した。結果を図１９、
２０、２１に示す。図１９から明らかなように本発明の
製剤投与により不飽和脂肪酸および多価不飽和脂肪酸の
比率が有意に上昇し、図２１に示すようにコレステロー
ルの含量が有意に低下した。

【００６０】実施例１６、比較例１１ （糞便の悪臭低
減と堆肥化促進） １群５０頭の乳牛に通常の飼料給与に加えて実施例１で
調製した本発明の複合微生物製剤（製剤１）５ｇ／頭／
日給与し、糞便の悪臭低減と堆肥化促進作用を調べた。
対照として、別の牛群５０頭に実施例１で使用した微生
物製剤調製用基材を同量与えて比較した。牛舎には敷料
としておが屑を敷いた。投与３週間後、牛舎の糞便をロ
ーダーで集め山積みし堆肥化させた。山積み直後から毎
日堆肥温度、湿度、ｐＨを測定した。堆肥は２２日後、
３６日後、７３日後の３回切り返しを行った。また、１
０日に一度堆肥をサンプリングし堆肥腐熟度の指標とな
るＣ／Ｎ比を高感度ＮＣ−アナライザー、スミグラフモ
デルＮＣ−８０型（住友化学（株）販売）を用いて求め
た。堆肥温度、湿度、ｐＨの測定結果を図２２に示す。
また、Ｃ／Ｎ比を図２３に示す。図２２から明らかなよ
うに本発明の方が発酵温度が高く微生物の活性が高いこ
とを示している。本発明の堆肥化促進作用はＣ／Ｎ比の
急激な低下からも明らかである（図２３）。

【００６１】上記とは別に堆肥山積み時から８日後、１
６日後及び２４日後に悪臭物質の測定を行った。測定
は、アンモニアについては日本工業規格ＪＩＳ Ｋ１０
２ ４２に記載の方法および環境庁告示第４７号（平成
元年）に準拠した方法で行い、硫化水素、メチルメルカ
プタンおよび硫化メチルについては炎光光度検出器（Ｆ
ＰＤ）付ガスクロマトグラフィーを用いて測定した。結
果を図２４に示す。図２４から明らかなように硫化水
素、メチルメルカプタン、硫化メチルは顕著に減少し、
アンモニアも約１／３に減少した。

【００６２】実施例１７、比較例１２ （堆肥過程メタ
ン発生抑制） 実施例１６と同様の方法を繰り返して堆肥の山積みを行
った。直後から経時的に発生するメタンの量を測定し
た。測定は、堆肥試料５０ｍｌを１００ｍｌ容器（バイ
アル瓶）に入れて密栓し、３７℃で２４時間振盪加温
後、気体部分を熱伝導度検出器（ＴＣＤ）付ガスクロマ
トグラフィー分析により行った。結果を図２５に示す。
図から明らかなように、本発明の複合微生物製剤を投与
した牛群の堆肥は非投与群に比較して顕著にメタン発生
が少なかった。

【００６３】実施例１８、比較例１３ （ルーメン内メ
タン発生抑制） 実施例１６で本発明の複合微生物製剤を投与した乳牛の
うち、６頭からルーメン（第１胃）内胃液（ルーメンジ
ュース）を採取し、３７℃でインキュベートし経時的に
発生するメタン濃度を実施例１７と同様の方法で測定し
た。結果を図２６に示す。図から明らかなように、本発
明の複合微生物製剤の投与によりルーメン内のメタン発
生を抑制した。

【００６４】実施例１９、比較例１４、１５ （単一微
生物との比較） 実施例１で調製した本発明の複合微生物製剤（製剤２）
のコレステロール低減作用をラクトバチルス属細菌およ
びストレプトコッカス属細菌のそれぞれの作用と比較し
た。これらの菌はそれぞれコレステロール低下作用があ
ると報告されている細菌である（グリルランドら、Appl
ied and Environmental Microbiology49、377-381(198
5) ；イシハラら、Intestinal bacteria on cholestero
l metabolism 、121-144(1989) Japan Scientific Pres
s；スズキら、Animal Science and Technology 62、565
-571(1991))。ラクトバチルス属細菌としては、ラクト
バチルス・アシドフィルスＡＴＣＣ１１５０６株（比較
例１４）を用い、ストレプトコッカス属細菌としてはス
トレプトコッカス・フェーカリスＡＴＣＣ１４４２９株
を用いた（比較例１５）。それぞれ、実施例１に記載の
培地で培養し試験に供した。試験方法は、これらの供試
試料をそれぞれ使用する以外は実施例２と同じ方法で行
った。結果を図２７に示す。結果から明らかなように、
本発明の複合微生物製剤はコレステロール低減作用を示
す細菌単独よりも効果が高く複合微生物により相乗効果
が得られた。

【００６５】

【発明の効果】本発明の複合微生物製剤は、血中コレス
テロール降下作用、整腸作用、免疫賦活作用、制癌作
用、血圧降下作用、高血糖値の低下正常化作用、精神障
害原因物質の腸内生産抑制作用などの種々の生理作用、
および家畜の生産性向上、家畜糞便の悪臭消臭作用とそ
の堆肥化促進、更に反芻動物のルーメン内及び堆肥のメ
タン発生抑制などに非常に優れた効果を示す。

【００６６】これらの効果については、本発明の複合微
生物製剤に含まれるどの菌が働いているのか概ね示すこ
とはできる。例えば、血中コレステロール降下作用に
は、バチルス・メガテリウム、ストレプトコッカス・フ
ェーカリス、ストレプトコッカス・ラクチスが関与して
いると考えられる。また、整腸作用には主にラクトバチ
ルス属菌が関与していると考えられる。また、免疫賦活
作用にはバチルス属菌が関与していると考えられる。し
かしながら、これらの細菌のみを使用しても得られるそ
れぞれの効果は、本発明の複合微生物製剤が示す効果よ
りも小さく、各作用に関与しないと思われている他の菌
との相乗作用が働いているものと推測される。また、吸
着基材としてカルシウム含有基材を使用し微生物群とと
もに発酵させることでその作用が増強されていることが
特徴である。

【図面の簡単な説明】

【図１】高コレステロール含有飼料給与ラットの血清コ
レステロール値の経時変化を比較した図である。

【図２】基本飼料給与ラットの血清コレステロール値の
経時変化を比較した図である。

【図３】高コレステロール含有飼料給与および基本飼料
給与ラットの肝臓中のコレステロール値を比較した図で
ある。

【図４】ラット糞中の大腸菌数に対する有用乳酸菌数の
比率の経時変化を比較した図である。

【図５】人為的に癌細胞を移植したヌードマウスに本発
明の製剤を３６日間投与した後の癌細胞の大きさを比較
した図である。

【図６】人為的に癌細胞を移植したヌードマウスに本発
明の製剤を３６日間投与した後のマクロファージ活性を
比較した図である。

【図７】高血圧自然発生ラットに本発明の製剤を投与し
た場合の血圧の経時変化を比較した図である。

【図８】糖尿病患者における本発明の製剤を投与前及び
後の血糖値の変化を示す図である。

【図９】神経症患者における本発明の製剤を投与前及び
後の糞中悪臭成分含量の変化を示す図である。

【図１０】本発明の製剤給与による牛乳中の脂肪含量の
経時変化を比較した図である。

【図１１】本発明の製剤給与による牛乳中の飽和脂肪酸
量に対する不飽和脂肪酸量の比率の経時変化を比較した
図である。

【図１２】本発明の製剤給与による牛乳中の飽和脂肪酸
量に対する多価不飽和脂肪酸量の比率の経時変化を比較
した図である。

【図１３】本発明の製剤給与による牛乳中のコレステロ
ール含量の経時変化を比較した図である。

【図１４】本発明の製剤給与による牛肉中のコレステロ
ール含量を比較した図である。

【図１５】本発明の製剤給与による牛肉中のパルミトオ
レイン酸含量を比較した図である。

【図１６】本発明の製剤給与による牛肉中の飽和脂肪酸
量に対する不飽和脂肪酸量の比率を比較した図である。

【図１７】本発明の製剤給与による鶏卵卵黄中のコレス
テロール含量の経時変化を比較した図である。

【図１８】本発明の製剤給与前及び後の年間乳量の変化
を示す図である。

【図１９】本発明の製剤給与による養殖魚の飽和脂肪酸
に対する不飽和脂肪酸比率の変動を示す図である。

【図２０】本発明の製剤給与による養殖魚の多価飽和脂
肪酸に対する不飽和脂肪酸比率の変動を示す図である。

【図２１】本発明の製剤給与による養殖魚のコレステロ
ール含量の変動を示す図である。

【図２２】本発明の製剤を給与した乳牛の糞尿を堆肥化
した場合の温度、湿度、ｐＨの経時変化を示す図であ
る。

【図２３】本発明の製剤を給与した乳牛の糞尿を堆肥化
した場合のＣ／Ｎ比の経時変化を非給与の場合と比較し
た図である。

【図２４】本発明の製剤を給与した乳牛の糞尿を堆肥化
した場合の悪臭成分含量の経時変化を示す図である。

【図２５】本発明の製剤を給与した乳牛の糞尿を堆肥化
した場合のメタン発生量の経時変化を非給与の場合と比
較した図である。

【図２６】本発明の製剤を給与した乳牛のルーメン液の
メタン発生量の経時変化を非給与の場合と比較した図で
ある。

【図２７】本発明の製剤を投与した場合のラットのコレ
ステロール含量の経時変化をコレステロール低減作用を
有する細菌単独を投与した場合と比較した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 35/56 ＡＤＮ Ａ６１Ｋ 35/56 ＡＤＮ 35/70 ＡＤＵ 35/70 ＡＤＵ 35/74 ＡＣＪ 35/74 ＡＣＪＡ ＡＤＱ ＡＤＱ ＡＥＶ ＡＥＶ ＡＥＸ ＡＥＸ ＡＦＣ ＡＦＣ //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:125 1:11 1:23 1:25 1:24 1:245 1:46 1:145 1:865 1:72）

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも、バチルス・スブチリス（Ba
   cillus subtilis ）、バチルス・ナットー（bacillus n
   atto）、バチルス・メガテリウム（bacillusmegaterium
   ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus
   acidophilus ）、ラクトバチルス・プランタルム（Lac
   tobacillus plantarum ）、ラクトバチルス・ブレビス
   （Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・カゼイ
   （Lactobacillus casei)、ストレプトコッカス・フェー
   カリス（Streptococcus faecalis）、ストレプトコッカ
   ス・ラクチス（Streptococcus lactis）、ストレプトコ
   ッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilu
   s）、クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium but
   yricum ）、サッカロミセス・セレビシイ（Saccharomyc
   es cerevisiae）およびカンディダ・ユティリス（Candi
   da utilis）からなる微生物群とそれら微生物群を吸着
   している基材からなり、該基材が少なくともカルシウム
   含有基材を含んでおり、該カルシウム含有基材のカルシ
   ウム成分の少なくとも一部が該微生物群の作用により生
   体適合型有機カルシウム化合物を構成していることを特
   徴とする複合微生物製剤。
2. 【請求項２】 微生物群が更に硝化菌および硫黄細菌を
   含む請求項１記載の製剤。
3. 【請求項３】 カルシウム含有基材が、骨粉、貝化石、
   合成アパタイト、リン酸カルシウム、炭酸カルシウムか
   ら選ばれる少なくとも１種を含有している請求項１また
   は２記載の製剤。
4. 【請求項４】 少なくとも、バチルス・スブチリス（Ba
   cillus subtilis ）、バチルス・ナットー（bacillus n
   atto）、バチルス・メガテリウム（bacillusmegaterium
   ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus
   acidophilus ）、ラクトバチルス・プランタルム（Lac
   tobacillus plantarum ）、ラクトバチルス・ブレビス
   （Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・カゼイ
   （Lactobacillus casei)、ストレプトコッカス・フェー
   カリス（Streptococcus faecalis）、ストレプトコッカ
   ス・ラクチス（Streptococcus lactis）、ストレプトコ
   ッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilu
   s）、クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium but
   yricum ）、サッカロミセス・セレビシイ（Saccharomyc
   es cerevisiae）およびカンディダ・ユティリス（Candi
   da utilis）をそれぞれ液体純粋培養した後、得られる
   各微生物培養物をカルシウム含有基材と混合し、得られ
   る混合物を発酵させることからなる請求項１記載の複合
   微生物製剤の製造方法。
5. 【請求項５】 純粋培養する微生物として更に硝化菌お
   よび硫黄細菌を含む請求項４記載の製造方法。
6. 【請求項６】 カルシウム含有基材が、骨粉、貝化石、
   珊瑚、合成アパタイト、リン酸カルシウム、炭酸カルシ
   ウムから選ばれる少なくとも１種を含有している請求項
   ４または５記載の製造方法。
7. 【請求項７】 少なくとも、バチルス・スブチリス（Ba
   cillus subtilis ）、バチルス・ナットー（bacillus n
   atto）、バチルス・メガテリウム（bacillusmegaterium
   ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus
   acidophilus ）、ラクトバチルス・プランタルム（Lac
   tobacillus plantarum ）、ラクトバチルス・ブレビス
   （Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・カゼイ
   （Lactobacillus casei)、ストレプトコッカス・フェー
   カリス（Streptococcus faecalis）、ストレプトコッカ
   ス・ラクチス（Streptococcus lactis）、ストレプトコ
   ッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilu
   s）、クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium but
   yricum ）、サッカロミセス・セレビシイ（Saccharomyc
   es cerevisiae）およびカンディダ・ユティリス（Candi
   da utilis）からなる混合微生物群を、少なくともカル
   シウム含有基材を含む吸着基材と混合し培養することか
   らなる請求項１記載の複合微生物製剤の製造方法。
8. 【請求項８】 微生物群が更に硝化菌および硫黄細菌を
   含む請求項７記載の製造方法。
9. 【請求項９】 カルシウム含有基材が、骨粉、貝化石、
   珊瑚、合成アパタイト、リン酸カルシウム、炭酸カルシ
   ウムから選ばれる少なくとも１種を含有している請求項
   ７または８記載の製造方法。