JPH08298987A - 新規エンドペプチダーゼ - Google Patents
新規エンドペプチダーゼInfo
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- JPH08298987A JPH08298987A JP7245307A JP24530795A JPH08298987A JP H08298987 A JPH08298987 A JP H08298987A JP 7245307 A JP7245307 A JP 7245307A JP 24530795 A JP24530795 A JP 24530795A JP H08298987 A JPH08298987 A JP H08298987A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- endopeptidase
- gly
- ala
- peptide
- enzyme
- Prior art date
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- Granted
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lacto
bacillus helveticus)が産生し、アミノ酸残基 3〜34
個のペプチドを分解するが、たんぱく質を分解しないエ
ンドペプチダーゼ。この酵素は分子量約70kDa 、等電点
約4.8 、至適温度約30℃、至適pH約7.0 である。 【効果】 Ｎ末端アミノ酸配列を検索したところ相同性
を示すエンドペプチターゼは存在せず、この酵素は新規
である。基質特異性を利用して、プロティナーゼ、アミ
ノペプチダーゼなどのたんぱく質分解酵素と併用するこ
とによってたんぱく質を効率的に分解することができ
る。また単独使用によって特殊なペプチドを選択的に製
造できる。たんぱく分解物は飲食品、医薬などとして用
いることができる。
bacillus helveticus)が産生し、アミノ酸残基 3〜34
個のペプチドを分解するが、たんぱく質を分解しないエ
ンドペプチダーゼ。この酵素は分子量約70kDa 、等電点
約4.8 、至適温度約30℃、至適pH約7.0 である。 【効果】 Ｎ末端アミノ酸配列を検索したところ相同性
を示すエンドペプチターゼは存在せず、この酵素は新規
である。基質特異性を利用して、プロティナーゼ、アミ
ノペプチダーゼなどのたんぱく質分解酵素と併用するこ
とによってたんぱく質を効率的に分解することができ
る。また単独使用によって特殊なペプチドを選択的に製
造できる。たんぱく分解物は飲食品、医薬などとして用
いることができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、乳酸桿菌のラクト
バチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticu
s) から産生される新規なエンドペプチダーゼに関す
る。本発明のエンドペプチダーゼは、たんぱく質を分解
する性質を有せず、ペプチドのみを分解する性質を有す
るので、プロティナーゼやアミノペプチダーゼなどのた
んぱく質分解酵素と共に利用して、飲食品や医薬などに
用いるたんぱく質分解物を効率的に製造することができ
る。また、本発明のエンドペプチダーゼを単独で利用し
て、特殊なペプチドを選択的に製造することができる。
バチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticu
s) から産生される新規なエンドペプチダーゼに関す
る。本発明のエンドペプチダーゼは、たんぱく質を分解
する性質を有せず、ペプチドのみを分解する性質を有す
るので、プロティナーゼやアミノペプチダーゼなどのた
んぱく質分解酵素と共に利用して、飲食品や医薬などに
用いるたんぱく質分解物を効率的に製造することができ
る。また、本発明のエンドペプチダーゼを単独で利用し
て、特殊なペプチドを選択的に製造することができる。
【０００２】
【従来の技術】従来より、様々な起源のたんぱく質分解
酵素が知られており、それらの酵素が種々の分野で利用
されている。その中で乳酸球菌由来のたんぱく質分解酵
素は、安全性の面から食品加工などの分野で利用されて
いる。この中、乳酸球菌が産生するエンドペプチダーゼ
は、たんぱく質をアミノ酸に分解する過程でプロティナ
ーゼの作用により生じた長鎖のペプチドを短鎖のペプチ
ドに分解する作用を有しており、たんぱく質の分解を効
率良く進めるために大変重要な酵素であると考えられて
いる。また、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシ
イズ・クレモリス(Lactococcus lactis ssp. cremori
s) が産生するエンドペプチダーゼが精製されており、
その性質が明らかにされている [特開平5-268955号公
報] 。しかし、発酵乳やチーズなどの乳製品に含まれて
おり、産業界、特に、食品業界で極めて重要な役割を担
っている乳酸桿菌のラクトバチルス・ヘルベティカス(L
actobacillus helveticus) からは、未だ精製されたエ
ンドペプチダーゼが得られていない現状にある。
酵素が知られており、それらの酵素が種々の分野で利用
されている。その中で乳酸球菌由来のたんぱく質分解酵
素は、安全性の面から食品加工などの分野で利用されて
いる。この中、乳酸球菌が産生するエンドペプチダーゼ
は、たんぱく質をアミノ酸に分解する過程でプロティナ
ーゼの作用により生じた長鎖のペプチドを短鎖のペプチ
ドに分解する作用を有しており、たんぱく質の分解を効
率良く進めるために大変重要な酵素であると考えられて
いる。また、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシ
イズ・クレモリス(Lactococcus lactis ssp. cremori
s) が産生するエンドペプチダーゼが精製されており、
その性質が明らかにされている [特開平5-268955号公
報] 。しかし、発酵乳やチーズなどの乳製品に含まれて
おり、産業界、特に、食品業界で極めて重要な役割を担
っている乳酸桿菌のラクトバチルス・ヘルベティカス(L
actobacillus helveticus) からは、未だ精製されたエ
ンドペプチダーゼが得られていない現状にある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、このよ
うな現状を鑑み、乳酸桿菌のラクトバチルス・ヘルベテ
ィカス(Lactobacillus helveticus) が産生するたんぱ
く質分解酵素について鋭意研究を行っていたところ、各
種カゼインなどのたんぱく質には作用せず、ペプチドの
ペプチド鎖内部のペプチド結合に作用してペプチドを特
異的に分解する新規なエンドペプチダーゼをラクトバチ
ルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus) が
産生することを見出し、本発明を完成するに至った。し
たがって、本発明は、ラクトバチルス・ヘルベティカス
(Lactobacillus helveticus) が産生し、ペプチドを特
異的に分解するエンドペプチダーゼを提供することを課
題とする。
うな現状を鑑み、乳酸桿菌のラクトバチルス・ヘルベテ
ィカス(Lactobacillus helveticus) が産生するたんぱ
く質分解酵素について鋭意研究を行っていたところ、各
種カゼインなどのたんぱく質には作用せず、ペプチドの
ペプチド鎖内部のペプチド結合に作用してペプチドを特
異的に分解する新規なエンドペプチダーゼをラクトバチ
ルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus) が
産生することを見出し、本発明を完成するに至った。し
たがって、本発明は、ラクトバチルス・ヘルベティカス
(Lactobacillus helveticus) が産生し、ペプチドを特
異的に分解するエンドペプチダーゼを提供することを課
題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明のエンドペプチダ
ーゼは、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacill
us helveticus) を通常行われているような培養法に従
って培養し、その培養液から菌体を回収した後、この菌
体を破砕し、通常行われているような酵素の精製法に従
ってこの酵素を採取精製することにより得ることができ
る。
ーゼは、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacill
us helveticus) を通常行われているような培養法に従
って培養し、その培養液から菌体を回収した後、この菌
体を破砕し、通常行われているような酵素の精製法に従
ってこの酵素を採取精製することにより得ることができ
る。
【０００５】本発明のエンドペプチダーゼは、以下のよ
うな性質を有している。 （１）分子量：ＳＤＳ電気泳動法による測定で約 70kDa
を示す （２）等電点：約 4.8 （３）至適温度：約 30 ℃ （４）至適pH：約 7.0 （５） Km 値及び Vmax 値：基質Try-Gly-Gly-Phe-Met
の分解において、ミカエリス定数(Km 値）が約0.20mM、
最大速度(Vmax 値）が約56μmol/min/mg （６）基質特異性：ペプチドのペプチド鎖内部のペプチ
ド結合に作用し、ペプチドは分解するが、たんぱく質を
分解しない。 （７）酵素阻害剤の影響： 1,10-Phenanthroline、エチ
レンジアミン四酢酸(EDTA)、p-Chloromercuribenzenesu
lfonic acid(p-CMBS) により活性が阻害される。 （８）金属イオンの影響：Cu2+、Zn2+及びFe2+により活
性が阻害される。 また、本発明のエンドペプチダーゼは、乳酸球菌のラク
トコッカス・ラクチス・サブスピーシイズ・クレモリス
(Lactococcus lactis ssp. cremoris) Wg２株が産生す
るエンドペプチダーゼに対するポリクローナル抗体と免
疫反応を起こさないため、Wg２株が産生するエンドペプ
チダーゼとは免疫的に異なる。さらに、本発明のエンド
ペプチダーゼのＮ末端からのアミノ酸配列はVal-Arg-Gl
y-Gly-Ala-Gly-Asp-Ile-Thr-Glu-Ala-Asp-Leu-Ser-Ala-
Arg-Pro-Gln-Asp-Asn-Leu-Tyr-Leu-Ala-Val-Asn-である
(配列表配列番号１参照）。本配列は既知の文献および
インターネット中のＢＬＡＳＴプログラムにある全ての
たんぱく質、ＤＮＡのデータベースとホモロジー（相同
性）検索を行ったが、相同性の高い酵素は見つからず、
全く新規の酵素であると判断される。
うな性質を有している。 （１）分子量：ＳＤＳ電気泳動法による測定で約 70kDa
を示す （２）等電点：約 4.8 （３）至適温度：約 30 ℃ （４）至適pH：約 7.0 （５） Km 値及び Vmax 値：基質Try-Gly-Gly-Phe-Met
の分解において、ミカエリス定数(Km 値）が約0.20mM、
最大速度(Vmax 値）が約56μmol/min/mg （６）基質特異性：ペプチドのペプチド鎖内部のペプチ
ド結合に作用し、ペプチドは分解するが、たんぱく質を
分解しない。 （７）酵素阻害剤の影響： 1,10-Phenanthroline、エチ
レンジアミン四酢酸(EDTA)、p-Chloromercuribenzenesu
lfonic acid(p-CMBS) により活性が阻害される。 （８）金属イオンの影響：Cu2+、Zn2+及びFe2+により活
性が阻害される。 また、本発明のエンドペプチダーゼは、乳酸球菌のラク
トコッカス・ラクチス・サブスピーシイズ・クレモリス
(Lactococcus lactis ssp. cremoris) Wg２株が産生す
るエンドペプチダーゼに対するポリクローナル抗体と免
疫反応を起こさないため、Wg２株が産生するエンドペプ
チダーゼとは免疫的に異なる。さらに、本発明のエンド
ペプチダーゼのＮ末端からのアミノ酸配列はVal-Arg-Gl
y-Gly-Ala-Gly-Asp-Ile-Thr-Glu-Ala-Asp-Leu-Ser-Ala-
Arg-Pro-Gln-Asp-Asn-Leu-Tyr-Leu-Ala-Val-Asn-である
(配列表配列番号１参照）。本配列は既知の文献および
インターネット中のＢＬＡＳＴプログラムにある全ての
たんぱく質、ＤＮＡのデータベースとホモロジー（相同
性）検索を行ったが、相同性の高い酵素は見つからず、
全く新規の酵素であると判断される。
【０００６】本発明のエンドペプチダーゼを産生する菌
株は、市販の発酵乳から次のような方法で得ることがで
きる。まず、発酵乳1gを滅菌した生理食塩水に懸濁し、
さらに滅菌した生理食塩水で菌数が106 〜107 /ml とな
るよう希釈した懸濁液を調製する。そして、この懸濁液
１mlを市販のＭＲＳ培地に寒天を 1.5％となるように加
えたＭＲＳ寒天培地に塗抹し、37℃で２日以上培養す
る。さらに出現したコロニーを採取してＭＲＳ培地に接
種し、37℃で１日間培養して菌株を得る。なお、ＭＲＳ
培地の組成は、次の通りである。 ペプトン 10 (g/リットル) 肉エキス 5 酵母エキス 5 グルコース 20 第二リン酸カリウム 2 ツィーン80 1 クエン酸二アンモニウム 2 酢酸ナトリウム 5 硫酸マグネシウム 0.1 硫酸マンガン 0.05
株は、市販の発酵乳から次のような方法で得ることがで
きる。まず、発酵乳1gを滅菌した生理食塩水に懸濁し、
さらに滅菌した生理食塩水で菌数が106 〜107 /ml とな
るよう希釈した懸濁液を調製する。そして、この懸濁液
１mlを市販のＭＲＳ培地に寒天を 1.5％となるように加
えたＭＲＳ寒天培地に塗抹し、37℃で２日以上培養す
る。さらに出現したコロニーを採取してＭＲＳ培地に接
種し、37℃で１日間培養して菌株を得る。なお、ＭＲＳ
培地の組成は、次の通りである。 ペプトン 10 (g/リットル) 肉エキス 5 酵母エキス 5 グルコース 20 第二リン酸カリウム 2 ツィーン80 1 クエン酸二アンモニウム 2 酢酸ナトリウム 5 硫酸マグネシウム 0.1 硫酸マンガン 0.05
【０００７】このようにして得られた菌株の菌学的特徴
を次に示す。 Ａ 形態的性状 （１）細胞の形： 桿菌 （２）運動性： なし （３）胞子の有無： なし （４）グラム染色性： 陽性 Ｂ 培地上の生育状態 （１）培養温度15℃： 生育しない （２）培養温度45℃： 生育する Ｃ 生理学的性質 （１）カタラーゼ： 陰性 （２）グルコースよりガスを産生しない。 （３）グルコン酸よりガスを産生しない。 （４）グルコースより乳酸発酵によりDL乳酸を産生す
る。 （５）各種炭水化物の分解性 １． リボース − ２． アラビノース − ３． キシロース − ４． ラムノース − ５． マンニトール − ６． ソルビトール − ７． リビトール − ８． グリセロール − ９． フラクトース − １０．マンノース ＋ １１．ガラクトース ＋ １２．グルコース ＋ １３．ラクトース ＋ １４．マルトース − １５．シュクロース − １６．トレハロース − １７．セロビオース − １８．ラフィノース − １９．メリビオース − ２０．メレチトース − ２１．サリシン − ２２．グルコナート − （＋は分解することを示し、−は分解しないことを示
す。） この菌学的性質から、Bergey's manual of systematic
bacteriology, Vol.2,pp.1222-1224 (1986)の記載を参
酌して検索すると、この菌株はラクトバチルス・ヘルベ
ティカス(Lactobacillus helveticus) と同定された。
そして、得られた菌株をラクトバチルス・ヘルベティカ
ス(Lactobacillus helveticus) SBT 2171 (FERM P-143
81) として工業技術院生命工業技術研究所に寄託した。
を次に示す。 Ａ 形態的性状 （１）細胞の形： 桿菌 （２）運動性： なし （３）胞子の有無： なし （４）グラム染色性： 陽性 Ｂ 培地上の生育状態 （１）培養温度15℃： 生育しない （２）培養温度45℃： 生育する Ｃ 生理学的性質 （１）カタラーゼ： 陰性 （２）グルコースよりガスを産生しない。 （３）グルコン酸よりガスを産生しない。 （４）グルコースより乳酸発酵によりDL乳酸を産生す
る。 （５）各種炭水化物の分解性 １． リボース − ２． アラビノース − ３． キシロース − ４． ラムノース − ５． マンニトール − ６． ソルビトール − ７． リビトール − ８． グリセロール − ９． フラクトース − １０．マンノース ＋ １１．ガラクトース ＋ １２．グルコース ＋ １３．ラクトース ＋ １４．マルトース − １５．シュクロース − １６．トレハロース − １７．セロビオース − １８．ラフィノース − １９．メリビオース − ２０．メレチトース − ２１．サリシン − ２２．グルコナート − （＋は分解することを示し、−は分解しないことを示
す。） この菌学的性質から、Bergey's manual of systematic
bacteriology, Vol.2,pp.1222-1224 (1986)の記載を参
酌して検索すると、この菌株はラクトバチルス・ヘルベ
ティカス(Lactobacillus helveticus) と同定された。
そして、得られた菌株をラクトバチルス・ヘルベティカ
ス(Lactobacillus helveticus) SBT 2171 (FERM P-143
81) として工業技術院生命工業技術研究所に寄託した。
【０００８】粗酵素液は、前記菌体の培養物から菌体を
集菌し、これをリゾチームなどを用いた酵素処理、超音
波処理、凍結乾燥処理、ポールミル処理、フレンチプレ
スなどの機械的処理、有機溶媒などを用いた化学的処理
など、通常行なわれているような菌体の破砕手段によっ
て菌体を破砕し、その破砕菌体を除去した上清などを用
いることができる。また、精製菌体は、得られた前記粗
酵素液を各種クロマトグラフィー、塩析、電気泳動、イ
ムノブロット法などたんぱく質分解酵素の精製単離に通
常用いられている方法の中から適宜選択して用いること
ができる。そして、本発明のエンドペプチダーゼはこれ
らの精製段階のいずれの段階においても用いることがで
きる。このようにして得られたエンドペプチダーゼは、
前記したような性質を有している。本発明のエンドペプ
チダーゼは、粗酵素液あるいは精製酵素液または単離さ
れたエンドペプチダーゼのいずれの形でも使用すること
ができる。
集菌し、これをリゾチームなどを用いた酵素処理、超音
波処理、凍結乾燥処理、ポールミル処理、フレンチプレ
スなどの機械的処理、有機溶媒などを用いた化学的処理
など、通常行なわれているような菌体の破砕手段によっ
て菌体を破砕し、その破砕菌体を除去した上清などを用
いることができる。また、精製菌体は、得られた前記粗
酵素液を各種クロマトグラフィー、塩析、電気泳動、イ
ムノブロット法などたんぱく質分解酵素の精製単離に通
常用いられている方法の中から適宜選択して用いること
ができる。そして、本発明のエンドペプチダーゼはこれ
らの精製段階のいずれの段階においても用いることがで
きる。このようにして得られたエンドペプチダーゼは、
前記したような性質を有している。本発明のエンドペプ
チダーゼは、粗酵素液あるいは精製酵素液または単離さ
れたエンドペプチダーゼのいずれの形でも使用すること
ができる。
【０００９】これらのエンドペプチダーゼをアミノペプ
チダーゼなどと共にチーズの製造工程において原料に添
加したり、たんぱく質やペプチドなどに添加したりする
ことにより、効率的にその苦味を除去し、風味を改善す
ることができる。また、プロティナーゼや特異性の高い
ペプチダーゼと共に使用することにより、ペプチドの鎖
長をアミノ酸２〜10個にコントロールすることもでき
る。したがって、飲食品や医薬品の素材として用いるた
んぱく質やペプチドの加水分解物を製造する際に有用で
ある。
チダーゼなどと共にチーズの製造工程において原料に添
加したり、たんぱく質やペプチドなどに添加したりする
ことにより、効率的にその苦味を除去し、風味を改善す
ることができる。また、プロティナーゼや特異性の高い
ペプチダーゼと共に使用することにより、ペプチドの鎖
長をアミノ酸２〜10個にコントロールすることもでき
る。したがって、飲食品や医薬品の素材として用いるた
んぱく質やペプチドの加水分解物を製造する際に有用で
ある。
【００１０】以下に実施例を示し、本発明を詳しく説明
する。
する。
【実施例１】ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactoba
cillus helveticus) SBT 2171 (FERM P-14381) を次の
組成を有する改変ＭＲＳ培地10リットル（１リットル×
10本）に接種し、37℃で一晩（10〜16時間）静置培養
し、 650nmにおいて光路長１cmのセルで測定した時の培
養液の濁度が 1.0である対数増殖期後期の菌体を遠心分
離(7,500×ｇ、10分、４℃）によって集菌した。得られ
た菌体を、15mMの塩化カルシウムを含む50mM 4-(2-ヒド
ロキシエチル)-1-ピペラジン−エタンスルホン酸(HEPE
S) 緩衝液(pH 7.0) 100mlで２回洗浄後、 120mlの同緩
衝液に懸濁した。この菌体懸濁液各60mlを−10℃の冷媒
で冷却しながら、出力10、パルス20％（１秒間に 0.2秒
間のみ出力）で、40分間、超音波破砕を行った。この操
作により、試料の濁度は超音波破砕前の20％以下となっ
た。次いで、この破砕物を遠心分離（30,000×ｇ、10
分、４℃）し、得られた上清を粗酵素液とした。培養液
10リットルより得られた粗酵素液のたんぱく質量は、ウ
シ血清アルブミン換算で 10.3gであった。なお、改変Ｍ
ＲＳ培地の組成は、次の通りである。 ペプトン 10 (g/リットル) 肉エキス 5 酵母エキス 5 グルコース 20 βグリセロリン酸 2 ツィーン80 1 クエン酸三アンモニウム 2 酢酸ナトリウム 3 塩化マグネシウム 0.1 塩化カルシウム 2.2
cillus helveticus) SBT 2171 (FERM P-14381) を次の
組成を有する改変ＭＲＳ培地10リットル（１リットル×
10本）に接種し、37℃で一晩（10〜16時間）静置培養
し、 650nmにおいて光路長１cmのセルで測定した時の培
養液の濁度が 1.0である対数増殖期後期の菌体を遠心分
離(7,500×ｇ、10分、４℃）によって集菌した。得られ
た菌体を、15mMの塩化カルシウムを含む50mM 4-(2-ヒド
ロキシエチル)-1-ピペラジン−エタンスルホン酸(HEPE
S) 緩衝液(pH 7.0) 100mlで２回洗浄後、 120mlの同緩
衝液に懸濁した。この菌体懸濁液各60mlを−10℃の冷媒
で冷却しながら、出力10、パルス20％（１秒間に 0.2秒
間のみ出力）で、40分間、超音波破砕を行った。この操
作により、試料の濁度は超音波破砕前の20％以下となっ
た。次いで、この破砕物を遠心分離（30,000×ｇ、10
分、４℃）し、得られた上清を粗酵素液とした。培養液
10リットルより得られた粗酵素液のたんぱく質量は、ウ
シ血清アルブミン換算で 10.3gであった。なお、改変Ｍ
ＲＳ培地の組成は、次の通りである。 ペプトン 10 (g/リットル) 肉エキス 5 酵母エキス 5 グルコース 20 βグリセロリン酸 2 ツィーン80 1 クエン酸三アンモニウム 2 酢酸ナトリウム 3 塩化マグネシウム 0.1 塩化カルシウム 2.2
【００１１】
【実施例２】ファースト プロテイン リキッド クロ
マトグラフィー (Fast Protein Liquid Chromatograph
y、 Pharmacia社製) に、以下に示すカラムを設置し、
実施例１で得られた、ウシ血清アルブミン換算で 991mg
のたんぱく質を含有する粗酵素液70mlを次の方法で精製
した。なお、各精製段階は全て４℃で行い、供する試料
は全てポアサイズ0.22μm のフィルターで濾過した。ま
た、たんぱく質量は 280nm又は 214nmの吸光度で表し
た。精製段階での酵素活性は、50mM HEPES(pH 7.0)に溶
解した0.5mM MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA を基質溶液と
し、その基質溶液 200μl に被検酵素液５μl 及び市販
のロイシンアミノペプチダーゼを加え、30℃で15分間反
応後、 405nmにおける反応液の吸光度を Microplate Re
ader Model 3550-UV (Bio-Rad Laboratories社製) を用
いて測定した。一方、酵素の特性把握及び各精製段階で
の酵素活性の正確な測定には、 0.1％トリフルオロ酢酸
中のアセトニトリル濃度を直線的に増加させる（０〜40
％）逆相クロマトグラフィーを用い、Tyr-Gly-Gly-Phe-
Met が分解される速度又はTyr-Gly-Gly-Phe-Met の分解
により生じたTyr-Gly-Gly の生成量を測定した。
マトグラフィー (Fast Protein Liquid Chromatograph
y、 Pharmacia社製) に、以下に示すカラムを設置し、
実施例１で得られた、ウシ血清アルブミン換算で 991mg
のたんぱく質を含有する粗酵素液70mlを次の方法で精製
した。なお、各精製段階は全て４℃で行い、供する試料
は全てポアサイズ0.22μm のフィルターで濾過した。ま
た、たんぱく質量は 280nm又は 214nmの吸光度で表し
た。精製段階での酵素活性は、50mM HEPES(pH 7.0)に溶
解した0.5mM MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA を基質溶液と
し、その基質溶液 200μl に被検酵素液５μl 及び市販
のロイシンアミノペプチダーゼを加え、30℃で15分間反
応後、 405nmにおける反応液の吸光度を Microplate Re
ader Model 3550-UV (Bio-Rad Laboratories社製) を用
いて測定した。一方、酵素の特性把握及び各精製段階で
の酵素活性の正確な測定には、 0.1％トリフルオロ酢酸
中のアセトニトリル濃度を直線的に増加させる（０〜40
％）逆相クロマトグラフィーを用い、Tyr-Gly-Gly-Phe-
Met が分解される速度又はTyr-Gly-Gly-Phe-Met の分解
により生じたTyr-Gly-Gly の生成量を測定した。
【００１２】Ｑ−セファロース(Sepharose) クロマトグ
ラフィー Ｑ−セファロース(Sepharose)HP 26/10 カラム(Pharmac
ia社製) を20mMトリス−塩酸緩衝液(pH 8.0)で平衡化し
た後、粗酵素液を供した。次いで、流速 2.0ml/minで同
緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を直線的に増加(0〜１M)
させることにより溶出を行い、溶出液を４mlずつ分画し
た。得られた活性画分は使用するまで−50℃で凍結保存
した。
ラフィー Ｑ−セファロース(Sepharose)HP 26/10 カラム(Pharmac
ia社製) を20mMトリス−塩酸緩衝液(pH 8.0)で平衡化し
た後、粗酵素液を供した。次いで、流速 2.0ml/minで同
緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を直線的に増加(0〜１M)
させることにより溶出を行い、溶出液を４mlずつ分画し
た。得られた活性画分は使用するまで−50℃で凍結保存
した。
【００１３】フェニル セファロース(Phenyl Sepharos
e)クロマトグラフィー Ｑ−セファロース(Sepharose) クロマトグラフィーで得
られた活性画分に同体積の3.4M硫酸アンモニウム溶液を
滴下し、最終濃度1.7Mの硫酸アンモニウムを含む試料を
調製した。フェニル セファロース(Phenyl Sepharose)
HP 26/10カラム(Pharmacia社製) を1.7M硫酸アンモニウ
ムを含む20mMトリス−塩酸緩衝液(pH 7.5)で平衡化した
後、調製した試料を供した。次いで、流速 2.0ml/minで
同緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を直線的に減じるこ
とにより溶出を行い、溶出液を４mlずつ分画した。得ら
れた活性画分は、分画分子量10,000の限外濾過膜で脱塩
及び濃縮し、使用するまで−50℃で凍結保存した。
e)クロマトグラフィー Ｑ−セファロース(Sepharose) クロマトグラフィーで得
られた活性画分に同体積の3.4M硫酸アンモニウム溶液を
滴下し、最終濃度1.7Mの硫酸アンモニウムを含む試料を
調製した。フェニル セファロース(Phenyl Sepharose)
HP 26/10カラム(Pharmacia社製) を1.7M硫酸アンモニウ
ムを含む20mMトリス−塩酸緩衝液(pH 7.5)で平衡化した
後、調製した試料を供した。次いで、流速 2.0ml/minで
同緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を直線的に減じるこ
とにより溶出を行い、溶出液を４mlずつ分画した。得ら
れた活性画分は、分画分子量10,000の限外濾過膜で脱塩
及び濃縮し、使用するまで−50℃で凍結保存した。
【００１４】モノ(Mono)-Qクロマトグラフィー モノ(Mono)-Q 5/5カラム(Pharmacia社製) を20mMトリス
−塩酸緩衝液(pH 7.5)で平衡化した後、フェニル セフ
ァロース(Phenyl Sepharose)クロマトグラフィーで得ら
れた活性画分を供した。次いで、流速 0.5ml/minで同緩
衝液中の塩化ナトリウム濃度を直線的に増加(0〜１M)さ
せることにより溶出を行い、溶出液を 0.5mlずつ分画し
た。得られた活性画分は、分画分子量10,000の限外濾過
膜で脱塩及び濃縮し、使用するまで−50℃で凍結保存し
た。
−塩酸緩衝液(pH 7.5)で平衡化した後、フェニル セフ
ァロース(Phenyl Sepharose)クロマトグラフィーで得ら
れた活性画分を供した。次いで、流速 0.5ml/minで同緩
衝液中の塩化ナトリウム濃度を直線的に増加(0〜１M)さ
せることにより溶出を行い、溶出液を 0.5mlずつ分画し
た。得られた活性画分は、分画分子量10,000の限外濾過
膜で脱塩及び濃縮し、使用するまで−50℃で凍結保存し
た。
【００１５】ヒドロキシアパタイト(Hydroxylapatite)
クロマトグラフィー ヒドロキシアパタイト スーパーフォーマンス(Hydroxy
lapatite Superformance)5/7.5カラム(Merck社製) を５
mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)で平衡化した後、モノ
(Mono)-Qクロマトグラフィーで得られた活性画分を供し
た。次いで、流速0.25ml/minでリン酸カリウム緩衝液(p
H 7.0)の濃度を直線的に増加(5〜500mM)させることによ
り溶出を行い、溶出液を 0.5mlずつ分画した。得られた
活性画分は、分画分子量10,000の限外濾過膜で脱塩及び
濃縮し、使用するまで−50℃で凍結保存した。以上のよ
うな操作を行うことにより、ＳＤＳ電気泳動法で単一な
本発明の精製酵素0.32mgを回収率 3.1％で得た。
クロマトグラフィー ヒドロキシアパタイト スーパーフォーマンス(Hydroxy
lapatite Superformance)5/7.5カラム(Merck社製) を５
mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)で平衡化した後、モノ
(Mono)-Qクロマトグラフィーで得られた活性画分を供し
た。次いで、流速0.25ml/minでリン酸カリウム緩衝液(p
H 7.0)の濃度を直線的に増加(5〜500mM)させることによ
り溶出を行い、溶出液を 0.5mlずつ分画した。得られた
活性画分は、分画分子量10,000の限外濾過膜で脱塩及び
濃縮し、使用するまで−50℃で凍結保存した。以上のよ
うな操作を行うことにより、ＳＤＳ電気泳動法で単一な
本発明の精製酵素0.32mgを回収率 3.1％で得た。
【００１６】各精製段階における酵素活性の回収率及び
比活性などを表１に示す。
比活性などを表１に示す。
【表１】
【００１７】
【試験例１】実施例２の各精製段階における精製度につ
いて、 Laemmliの方法[Nature, vol.227, pp.680-685
(1970)]に従い、ＳＤＳ電気泳動法により確認した。そ
の結果を図１に示す。なお、図中ａ〜ｅは表１の各精製
段階の、またｆはマーカー（ホスホリラーゼb 97.4kDa
、ウシ血清アルブミン 66.2kDa、卵白アルブミン 45kD
a) のＳＤＳ電気泳動を示す。本発明のエンドペプチダ
ーゼは、ヒドロキシアパタイト(Hydroxylapatite) クロ
マトグラフィー後、分子量 66.0kDaの牛血清アルブミン
のバンドより若干高分子側に染色され、約 70kDaの明確
で単一のバンドを示した。
いて、 Laemmliの方法[Nature, vol.227, pp.680-685
(1970)]に従い、ＳＤＳ電気泳動法により確認した。そ
の結果を図１に示す。なお、図中ａ〜ｅは表１の各精製
段階の、またｆはマーカー（ホスホリラーゼb 97.4kDa
、ウシ血清アルブミン 66.2kDa、卵白アルブミン 45kD
a) のＳＤＳ電気泳動を示す。本発明のエンドペプチダ
ーゼは、ヒドロキシアパタイト(Hydroxylapatite) クロ
マトグラフィー後、分子量 66.0kDaの牛血清アルブミン
のバンドより若干高分子側に染色され、約 70kDaの明確
で単一のバンドを示した。
【００１８】
【試験例２】実施例２で得られた精製エンドペプチダー
ゼの等電点を、等電点電気泳動により測定した。装置は
自動電気泳動装置Phast System(Pharmacia社製) を用
い、ゲルはPhastGel IEF 3-9およびPhastGel IEF 4-6.5
(それぞれPharmacia 社製) を使用して、精製エンドペ
プチダーゼを各等電点のマーカーとともに泳動した。泳
動後のゲル中のたんぱく質は、上記装置によって自動的
に銀染色され、検出できる。その結果、等電点は4.8 と
測定された。
ゼの等電点を、等電点電気泳動により測定した。装置は
自動電気泳動装置Phast System(Pharmacia社製) を用
い、ゲルはPhastGel IEF 3-9およびPhastGel IEF 4-6.5
(それぞれPharmacia 社製) を使用して、精製エンドペ
プチダーゼを各等電点のマーカーとともに泳動した。泳
動後のゲル中のたんぱく質は、上記装置によって自動的
に銀染色され、検出できる。その結果、等電点は4.8 と
測定された。
【００１９】
【試験例３】pH 7.0において Tyr-Gly-Gly-Phe-Metを基
質とし、10〜70℃の温度範囲で本発明のエンドペプチダ
ーゼの温度特性を測定した。精製エンドペプチダーゼ(5
μg/ml) 10μl に50mM HEPES緩衝液(pH7.0) 70μl を加
えた酵素液を各温度に５分間保持し、10mM Tyr-Gly-Gly
-Phe-Metを20μl 加えて20分反応後、30％酢酸50μlを
加えて反応を停止させた。活性の測定は実施例２で示し
た逆相クロマトグラフィー法に従って行った。その結果
を図２に示す。本発明のエンドペプチダーゼ活性は30℃
で最大となり、30〜45℃の温度範囲で最大活性の70％の
活性を維持していた。
質とし、10〜70℃の温度範囲で本発明のエンドペプチダ
ーゼの温度特性を測定した。精製エンドペプチダーゼ(5
μg/ml) 10μl に50mM HEPES緩衝液(pH7.0) 70μl を加
えた酵素液を各温度に５分間保持し、10mM Tyr-Gly-Gly
-Phe-Metを20μl 加えて20分反応後、30％酢酸50μlを
加えて反応を停止させた。活性の測定は実施例２で示し
た逆相クロマトグラフィー法に従って行った。その結果
を図２に示す。本発明のエンドペプチダーゼ活性は30℃
で最大となり、30〜45℃の温度範囲で最大活性の70％の
活性を維持していた。
【００２０】
【試験例４】30℃において Tyr-Gly-Gly-Phe-Metを基質
とし、pH４〜10の範囲で本発明のエンドペプチダーゼの
pH特性を測定した。精製エンドペプチターゼ(5μg/ml)
１０μl に各pHに調整した緩衝液 (リンゴ酸、ＭＥＳ、
ＨＥＰＥＳ及びほう酸を各20mMとなるように混合した緩
衝液) 70μl を加えた酵素液を５分間、30℃に保持し、
10mM Tyr-Gly-Gly-Phe-Metを20μl 加えて20分反応後、
30％酢酸50μl を加えて反応を停止させた。活性の測定
は実施例２で示した逆相クロマトグラフィー法に従って
行った。その結果を図３に示す。本発明のエンドペプチ
ダーゼの最大活性はpH７付近に認められ、pH 4.5以下の
酸性域及びpH 9.0以上のアルカリ域において活性は殆ど
認められなかった。
とし、pH４〜10の範囲で本発明のエンドペプチダーゼの
pH特性を測定した。精製エンドペプチターゼ(5μg/ml)
１０μl に各pHに調整した緩衝液 (リンゴ酸、ＭＥＳ、
ＨＥＰＥＳ及びほう酸を各20mMとなるように混合した緩
衝液) 70μl を加えた酵素液を５分間、30℃に保持し、
10mM Tyr-Gly-Gly-Phe-Metを20μl 加えて20分反応後、
30％酢酸50μl を加えて反応を停止させた。活性の測定
は実施例２で示した逆相クロマトグラフィー法に従って
行った。その結果を図３に示す。本発明のエンドペプチ
ダーゼの最大活性はpH７付近に認められ、pH 4.5以下の
酸性域及びpH 9.0以上のアルカリ域において活性は殆ど
認められなかった。
【００２１】
【試験例５】Tyr-Gly-Gly-Phe-Met に対する本発明のエ
ンドペプチダーゼの酵素反応の最大速度(Vmax 値) 及び
ミカエリス定数(Km 値) を測定した。精製エンドペプチ
ダーゼ(5μg/ml) 10μl に50mM HEPES緩衝液(pH7.0) 70
μl を加えた酵素液を30℃で５分間保持し、各濃度の T
yr-Gly-Gly-Phe-Metを20μl 加えて20分反応後、30％酢
酸50μl を加えて反応を停止させた。活性の測定は実施
例２で示した逆相クロマトグラフィー法に従って行い、
得られた結果よりラインウィーバー・バークプロットを
作成した。その結果を図４に示す。それによると、 Km
値は0.20mM、 Vmax 値は56μmol/min/mgであった。
ンドペプチダーゼの酵素反応の最大速度(Vmax 値) 及び
ミカエリス定数(Km 値) を測定した。精製エンドペプチ
ダーゼ(5μg/ml) 10μl に50mM HEPES緩衝液(pH7.0) 70
μl を加えた酵素液を30℃で５分間保持し、各濃度の T
yr-Gly-Gly-Phe-Metを20μl 加えて20分反応後、30％酢
酸50μl を加えて反応を停止させた。活性の測定は実施
例２で示した逆相クロマトグラフィー法に従って行い、
得られた結果よりラインウィーバー・バークプロットを
作成した。その結果を図４に示す。それによると、 Km
値は0.20mM、 Vmax 値は56μmol/min/mgであった。
【００２２】
【試験例６】本発明のエンドペプチダーゼの基質特異性
について測定した。測定に用いる基質濃度が２〜５mMと
なるよう50mM HEPES緩衝液(pH 7.0)で溶解した基質溶液
200μl に、50mM HEPES緩衝液(pH 7.0)に５μg/mlの濃
度になるように調製した本発明のエンドペプチダーゼ10
μl を加え、30℃で 5.0時間反応させた。次いで、その
反応液を 0.1％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル濃
度を直線的に増加させる(0〜60％）逆相クロマトグラフ
ィーを用い、 214nmにおける基質のピークが酵素反応後
に減少したか否かにより酵素活性の有無を検出した。そ
の結果を表２に示す。
について測定した。測定に用いる基質濃度が２〜５mMと
なるよう50mM HEPES緩衝液(pH 7.0)で溶解した基質溶液
200μl に、50mM HEPES緩衝液(pH 7.0)に５μg/mlの濃
度になるように調製した本発明のエンドペプチダーゼ10
μl を加え、30℃で 5.0時間反応させた。次いで、その
反応液を 0.1％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル濃
度を直線的に増加させる(0〜60％）逆相クロマトグラフ
ィーを用い、 214nmにおける基質のピークが酵素反応後
に減少したか否かにより酵素活性の有無を検出した。そ
の結果を表２に示す。
【００２３】
【表２】
【００２４】本発明のエンドペプチダーゼは、試験例６
で基質として用いたペプチドの範囲ではアミノ酸が３〜
34個結合したペプチドを分解することはできるが、カゼ
インなどの各種たんぱく質を分解することはできないこ
とが判った。
で基質として用いたペプチドの範囲ではアミノ酸が３〜
34個結合したペプチドを分解することはできるが、カゼ
インなどの各種たんぱく質を分解することはできないこ
とが判った。
【００２５】
【試験例７】本発明のエンドペプチダーゼの酵素阻害剤
による影響について測定した。本発明のエンドペプチダ
ーゼを40mM HEPES緩衝液(pH 7.0)中に 0.5μg/mlの濃度
になるように調製し、この酵素液に各酵素阻害剤を 0.0
01〜2.0mM となるように加え、４℃で30分間放置した。
次いで、予めこの酵素液を５分間、30℃に保った後、Ty
r-Gly-Gly-Phe-Metを最終濃度が１mMとなるように加え
て反応を開始し、20分後に30％酢酸を最終濃度10％とな
るよう加えて酵素反応を停止させた。そして、酵素活性
の測定を逆相クロマトグラフィーで行った。その結果、
前記した通り、1,10-Phenanthroline、エチレンジアミ
ン四酢酸(EDTA)、p-Chloromercuribenzenesulfonic aci
d(p-CMBS) により酵素活性は阻害されたが、Phenylmeth
ylsulfonyl fluoride(p-CMBS) 、Iodoacetic acid によ
り酵素活性は全く阻害されなかった。
による影響について測定した。本発明のエンドペプチダ
ーゼを40mM HEPES緩衝液(pH 7.0)中に 0.5μg/mlの濃度
になるように調製し、この酵素液に各酵素阻害剤を 0.0
01〜2.0mM となるように加え、４℃で30分間放置した。
次いで、予めこの酵素液を５分間、30℃に保った後、Ty
r-Gly-Gly-Phe-Metを最終濃度が１mMとなるように加え
て反応を開始し、20分後に30％酢酸を最終濃度10％とな
るよう加えて酵素反応を停止させた。そして、酵素活性
の測定を逆相クロマトグラフィーで行った。その結果、
前記した通り、1,10-Phenanthroline、エチレンジアミ
ン四酢酸(EDTA)、p-Chloromercuribenzenesulfonic aci
d(p-CMBS) により酵素活性は阻害されたが、Phenylmeth
ylsulfonyl fluoride(p-CMBS) 、Iodoacetic acid によ
り酵素活性は全く阻害されなかった。
【００２６】
【試験例８】本発明のエンドペプチダーゼの金属イオン
の影響についても、試験例７と同様の方法で測定した。
その結果、前記した通り、Cu2+、Zn2+及びFe2+により酵
素活性が阻害された。
の影響についても、試験例７と同様の方法で測定した。
その結果、前記した通り、Cu2+、Zn2+及びFe2+により酵
素活性が阻害された。
【試験例９】実施例２で得られた精製エンドペプチダー
ゼをアミノ酸シークエンサー model476A(Applied Biosy
stems 社) を用いて同定したところ、この精製酵素は、
Ｎ末端からのアミノ酸配列が、配列表配列番号１に示す
ように、Val-Arg-Gly-Gly-Ala-Gly-Asp-Ile-Thr-Glu-Al
a-Asp-Leu-Ser-Ala-Arg-Pro-Gln-Asp-Asn-Leu-Tyr-Leu-
Ala-Val-Asn-であることが判明した。
ゼをアミノ酸シークエンサー model476A(Applied Biosy
stems 社) を用いて同定したところ、この精製酵素は、
Ｎ末端からのアミノ酸配列が、配列表配列番号１に示す
ように、Val-Arg-Gly-Gly-Ala-Gly-Asp-Ile-Thr-Glu-Al
a-Asp-Leu-Ser-Ala-Arg-Pro-Gln-Asp-Asn-Leu-Tyr-Leu-
Ala-Val-Asn-であることが判明した。
【００２７】
【発明の効果】本発明のエンドペプチダーゼは、適宜、
プロティナーゼやアミノペプチダーゼなどと併用するこ
とにより、飲食品、飼料、化粧品及び医薬品などの素材
として用いるたんぱく質やペプチドを加水分解する際に
利用することができる。また、たんぱく質を分解しない
でペプチドのみを分解するという本発明のエンドペプチ
ダーゼの性質を利用して、特殊なペプチドを選択的に生
産する際に利用することもできる。さらに、本発明のエ
ンドペプチダーゼは、酪農乳酸菌の産生する酵素であ
り、安全の面でも優れているといえる。
プロティナーゼやアミノペプチダーゼなどと併用するこ
とにより、飲食品、飼料、化粧品及び医薬品などの素材
として用いるたんぱく質やペプチドを加水分解する際に
利用することができる。また、たんぱく質を分解しない
でペプチドのみを分解するという本発明のエンドペプチ
ダーゼの性質を利用して、特殊なペプチドを選択的に生
産する際に利用することもできる。さらに、本発明のエ
ンドペプチダーゼは、酪農乳酸菌の産生する酵素であ
り、安全の面でも優れているといえる。
【００２８】
配列番号：１ 配列の長さ：２６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配 列 Val Arg Gly Gly Ala Gly Asp Ile Thr Glu Ala Asp Leu Ser Ala Arg 1 5 10 15 Pro Gln Asp Asn Leu Tyr Leu Ala Val Asn 20 25
【図１】実施例２の各精製段階における本発明のエンド
ペプチダーゼのＳＤＳ電気泳動の状態を示す。
ペプチダーゼのＳＤＳ電気泳動の状態を示す。
【図２】本発明のエンドペプチダーゼの温度特性を示
す。
す。
【図３】本発明のエンドペプチダーゼのpH特性を示す。
【図４】本発明のエンドペプチダーゼの Tyr-Gly-Gly-P
he-Metを基質とした酵素反応のミカエリス定数(Km 値)
及び最大速度(Vmax 値) を示すライン・ウィーバー・バ
ークプロットを示す。
he-Metを基質とした酵素反応のミカエリス定数(Km 値)
及び最大速度(Vmax 値) を示すライン・ウィーバー・バ
ークプロットを示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成８年７月１２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００７】このようにして得られた菌株の菌学的特徴
を次に示す。 Ａ 形態的性状 （１）細胞の形： 桿菌 （２）運動性： なし （３）胞子の有無： なし （４）グラム染色性： 陽性 Ｂ 培地上の生育状態 （１）培養温度１５℃： 生育しない （２）培養温度４５℃： 生育する Ｃ 生理学的性質 （１）カタラーゼ： 陰性 （２）グルコースよりガスを産生しない。 （３）グルコン酸よりガスを産生しない。 （４）グルコースより乳酸発酵によりＤＬ乳酸を産生す
る。 （５）各種炭水化物の分解性 １． リボース − ２． アラビノース − ３． キシロース − ４． ラムノース − ５． マンニトール − ６． ソルビトール − ７． リビトール − ８． グリセロール − ９． フラクトース − １０．マンノース ＋ １１．ガラクトース ＋ １２．グルコース ＋ １３．ラクトース ＋ １４．マルトース − １５．シュクロース − １６．トレハロース − １７．セロビオース − １８．ラフィノース − １９．メリビオース − ２０．メレチトース − ２１．サリシン − ２２．グルコナート − （＋は分解することを示し、−は分解しないことを示
す。） この菌学的性質から、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓｍａｎｕａｌ
ｏｆ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ，Ｖｏｌ．２，ｐｐ．１２２２−１２２４（１９８
６）の記載を参酌して検索すると、この菌株はラクトバ
チルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）と同定された。そして、得ら
れた菌株をラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔ
ｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２
１７１（ＦＥＲＭ Ｐ−１４３８１）として工業技術院
生命工学工業技術研究所に寄託した。そして、後にブタ
ペスト条約による寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−５４４５が付された。
を次に示す。 Ａ 形態的性状 （１）細胞の形： 桿菌 （２）運動性： なし （３）胞子の有無： なし （４）グラム染色性： 陽性 Ｂ 培地上の生育状態 （１）培養温度１５℃： 生育しない （２）培養温度４５℃： 生育する Ｃ 生理学的性質 （１）カタラーゼ： 陰性 （２）グルコースよりガスを産生しない。 （３）グルコン酸よりガスを産生しない。 （４）グルコースより乳酸発酵によりＤＬ乳酸を産生す
る。 （５）各種炭水化物の分解性 １． リボース − ２． アラビノース − ３． キシロース − ４． ラムノース − ５． マンニトール − ６． ソルビトール − ７． リビトール − ８． グリセロール − ９． フラクトース − １０．マンノース ＋ １１．ガラクトース ＋ １２．グルコース ＋ １３．ラクトース ＋ １４．マルトース − １５．シュクロース − １６．トレハロース − １７．セロビオース − １８．ラフィノース − １９．メリビオース − ２０．メレチトース − ２１．サリシン − ２２．グルコナート − （＋は分解することを示し、−は分解しないことを示
す。） この菌学的性質から、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓｍａｎｕａｌ
ｏｆ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ，Ｖｏｌ．２，ｐｐ．１２２２−１２２４（１９８
６）の記載を参酌して検索すると、この菌株はラクトバ
チルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）と同定された。そして、得ら
れた菌株をラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔ
ｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ２
１７１（ＦＥＲＭ Ｐ−１４３８１）として工業技術院
生命工学工業技術研究所に寄託した。そして、後にブタ
ペスト条約による寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−５４４５が付された。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１０】以下に実施例を示し、本発明を詳しく説明
する。
する。
【発明の実施形態】
【実施例１】ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃ
ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ
２１７１（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４４５）を次の組成を有
する改変ＭＲＳ培地１０リットル（１リットル×１０
本）に接種し、３７℃で一晩（１０−１６時間）静置培
養し、６５０ｎｍにおいて光路長１ｃｍのセルで測定し
た時の培養液の濁度が１．０である対数増殖期後期の菌
体を遠心分離（７，５００×ｇ、１０分、４℃）によっ
て集菌した。得られた菌体を、１５ｍＭの塩化カルシウ
ムを含む５０ｍＭ ４−（２−ヒドロキシエチル）−１
−ピペラジン−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液
（ｐＨ７．０）１００ｍｌで２回洗浄後、１２０ｍｌの
同緩衝液に懸濁した。この菌体懸濁液各６０ｍｌを−１
０℃の冷媒で冷却しながら、出力１０、パルス２０％
（１秒間に０．２秒間のみ出力）で、４０分間、超音波
破砕を行った。この操作により、試料の濁度は超音波破
砕前の２０％以下となった。次いで、この破砕物を遠心
分離（３０，０００×ｇ、１０分、４℃）し、得られた
上清を粗酵素液とした。培養液１０リットルより得られ
た粗酵素液のたんぱく質量は、ウシ血清アルブミン換算
で１０．３ｇであった。なお、改変ＭＲＳ培地の組成
は、次の通りである。 ペプトン １０ （ｇ／リットル） 肉エキス ５ 酵母エキス ５ グルコース ２０ βグリセロリン酸 ２ ツィーン８０ １ クエン酸三アンモニウム ２ 酢酸ナトリウム ３ 塩化マグネシウム ０．１ 塩化カルシウム ２．２
ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ
２１７１（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４４５）を次の組成を有
する改変ＭＲＳ培地１０リットル（１リットル×１０
本）に接種し、３７℃で一晩（１０−１６時間）静置培
養し、６５０ｎｍにおいて光路長１ｃｍのセルで測定し
た時の培養液の濁度が１．０である対数増殖期後期の菌
体を遠心分離（７，５００×ｇ、１０分、４℃）によっ
て集菌した。得られた菌体を、１５ｍＭの塩化カルシウ
ムを含む５０ｍＭ ４−（２−ヒドロキシエチル）−１
−ピペラジン−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液
（ｐＨ７．０）１００ｍｌで２回洗浄後、１２０ｍｌの
同緩衝液に懸濁した。この菌体懸濁液各６０ｍｌを−１
０℃の冷媒で冷却しながら、出力１０、パルス２０％
（１秒間に０．２秒間のみ出力）で、４０分間、超音波
破砕を行った。この操作により、試料の濁度は超音波破
砕前の２０％以下となった。次いで、この破砕物を遠心
分離（３０，０００×ｇ、１０分、４℃）し、得られた
上清を粗酵素液とした。培養液１０リットルより得られ
た粗酵素液のたんぱく質量は、ウシ血清アルブミン換算
で１０．３ｇであった。なお、改変ＭＲＳ培地の組成
は、次の通りである。 ペプトン １０ （ｇ／リットル） 肉エキス ５ 酵母エキス ５ グルコース ２０ βグリセロリン酸 ２ ツィーン８０ １ クエン酸三アンモニウム ２ 酢酸ナトリウム ３ 塩化マグネシウム ０．１ 塩化カルシウム ２．２
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:225） (72)発明者 高藤 愼一 埼玉県川越市小堤62−32 (72)発明者 岩崎 泰介 オランダ国、9752 エヌエー ハーレン、 ヘムスターハウスラーン 17
Claims (4)
- 【請求項１】 ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lacto
bacillus helveticus) が産生し、以下の性質を有する
エンドペプチダーゼ。 （１）分子量：ＳＤＳ電気泳動法による測定で約 70kDa
を示す。 （２）等電点：約 4.8 （３）至適温度：約 30 ℃ （４）至適pH：約 7.0 （５）基質特異性：ペプチドのペプチド鎖内部のペプチ
ド結合に作用し、ペプチドは分解するが、たんぱく質は
分解しない。 （６）酵素阻害剤の影響： 1,10-Phenanthroline、エチ
レンジアミン四酢酸(EDTA)、p-Chloromercuribenzenesu
lfonic acid(p-CMBS) により活性が阻害される。 （７）金属イオンの影響：Cu2+、Zn2+及びFe2+により活
性が阻害される。 - 【請求項２】 ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lacto
bacillus helveticus) が、ラクトバチルス・ヘルベテ
ィカス(Lactobacillus helveticus) SBT 2171 (FERM P
-14381) である請求項１記載のエンドペプチダーゼ。 - 【請求項３】 基質Try-Gly-Gly-Phe-Met の分解におい
て、ミカエリス定数(Km 値) が約0.20mM、最大速度(V
max 値) が約56μmol/min/mgである請求項１記載のエン
ドペプチダーゼ。 - 【請求項４】 Ｎ末端からのアミノ酸配列がVal-Arg-Gl
y-Gly-Ala-Gly-Asp-Ile-Thr-Glu-Ala-Asp-Leu-Ser-Ala-
Arg-Pro-Gln-Asp-Asn-Leu-Tyr-Leu-Ala-Val-Asn- (配列
表配列番号１）である請求項１記載のエンドペプチダー
ゼ。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24530795A JP3516318B2 (ja) | 1995-03-07 | 1995-08-30 | 新規エンドペプチダーゼ |
| US08/611,395 US6168939B1 (en) | 1995-03-07 | 1996-03-06 | Endopeptidase produced by Lactobacillus helveticus |
| EP96103529A EP0733703A3 (en) | 1995-03-07 | 1996-03-07 | Endopeptidase from Lactobacillus helveticus |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7-74650 | 1995-03-07 | ||
| JP7465095 | 1995-03-07 | ||
| JP24530795A JP3516318B2 (ja) | 1995-03-07 | 1995-08-30 | 新規エンドペプチダーゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08298987A true JPH08298987A (ja) | 1996-11-19 |
| JP3516318B2 JP3516318B2 (ja) | 2004-04-05 |
Family
ID=26415821
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24530795A Expired - Fee Related JP3516318B2 (ja) | 1995-03-07 | 1995-08-30 | 新規エンドペプチダーゼ |
Country Status (3)
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|---|---|
| US (1) | US6168939B1 (ja) |
| EP (1) | EP0733703A3 (ja) |
| JP (1) | JP3516318B2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| AU755387B2 (en) | 1997-12-16 | 2002-12-12 | Japan Tobacco Inc. | Polypeptides having aminopeptidase activity and nucleic acids encoding same |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58126797A (ja) | 1982-01-22 | 1983-07-28 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | ジサツカライドトリペプチド及びジサツカライドテトラペプチドの製法 |
| ATE103141T1 (de) | 1989-07-07 | 1994-04-15 | Nestle Sa | Protein-hydrolyse. |
| EP0522203A1 (en) | 1991-05-16 | 1993-01-13 | Probicom Research B.V. | Protein from lactic acid bacteria |
| WO1994016082A1 (en) | 1992-12-30 | 1994-07-21 | Communaute Economique Europeenne (Cee) | X-prolyl-dipeptidyl-aminopeptidase from lactobacillus delbrückii ssp. lactis, nucleic acids coding for the same and its use in fermented foodstuff preparation processes |
| AU6926694A (en) | 1993-05-18 | 1994-12-12 | Unilever Plc | Proline iminopeptidase, process for its preparation and its use in the flavouring of food compositions |
| GB9313586D0 (en) | 1993-07-01 | 1993-08-18 | Europ Economic Community | Lys-aminopeptidase pepn from lactobacillus delbrukii ssp.lactis,nucleic acids coding for it,and its use in fermentation processes |
-
1995
- 1995-08-30 JP JP24530795A patent/JP3516318B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-03-06 US US08/611,395 patent/US6168939B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-03-07 EP EP96103529A patent/EP0733703A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0733703A2 (en) | 1996-09-25 |
| EP0733703A3 (en) | 1996-10-16 |
| US6168939B1 (en) | 2001-01-02 |
| JP3516318B2 (ja) | 2004-04-05 |
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