JPS5959189A - 新規なアルカリプロテア−ゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、土壌から分離さイｔた紬凶、アクロモバクタ
−リティカス（ａｃｈｒｎｍｏｂａｃｔｅｒｌｙｔｉｃ
ｕｓ）によって産生され、リジル結合に特異性を有する
新規なアルカリプロテアーゼｌこ関するものである。本
細凶は溶固酵素およびアルカリプロテアーゼを産生じ、
溶耐酵素については峙′公昭４６−４２９５３に記載が
あり、又アルカリプロテアーゼは１本発明者らにより発
見され、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル
・ケミストリー４２巻１４４２頁（１９７８年）におい
て、アクロモバクタ−・プロテアーゼ■と命名されてい
る。

本発明者らは、更にアクロモバクタ−・リティカスの産
生ずる酵素糸、特にプロテアーゼ系について詳細に研究
の結果、ｐＨ３，５〜１０のアンフオライト（ＬＫＢ社
商社名品名よる等電点焦点電気泳動の分画により、プロ
テアーゼＩと明ら力１に異なるプロテアーゼが存在する
ことを見出した。更にこの区分から一＃現なプロテア−
ゼを４Ｌ醗することに成功しプロテアーゼＩａと昔名し
た（以下、本発明の新規なアルカリプロテアーゼをプロ
テアーゼＩａと称する。）本発明者らは本酵素の取得法
、方よび諸性質ならびに利用法（こついて研究を重ね本
発明を児成するζこ至った。

即ち１本発明は、下記の特性を有するプロテアーゼ、 （１）分子ｔ　：　３０．０００　（５ｅｐｈａｄｅｘ
　Ｇ−７５によるゲル濾過法）。

（１１）等電点：５．３、 曲１　　ｐＨ作用性：エステラーセ活性はｐＨ８，５に
、またアミダーゼ活性はｐＨ９，０にそれぞれ作用至適
ｐＨを有する、 （φ　基質作用性：　Ｌ　−リジンのカルボキシル基に
おけるエステル結合およびアミド結合を選択特異的に水
解する。

Ｍ　　阻害剤ニジイソプロピルフォスフオフロリド、ト
シル−Ｌ−リジンクロロメチルケトン及びフェニルメチ
ルスルホニルフロリドにより阻害を受ける。好ましくは
アクロ七バクター属により産生されるプロテアーゼ、で
ある。

以下に本発明の内容について詳細に述べる。

本酵系の生Ｐｆｆ＠が篩いアクロ七バクター・リティカ
スＭ　４９７−１は財団法人発酵研究所、アメリカン　
タイプ　カルナヤーコレクションならびに工業技術院倣
生物工業技術研梵所にそれぞれＩＦＯ１２７２５，ＡＴ
ＯＯ２１４５６゜倣工研寄此受理査芳４４２０の査号で
寄託されている。本酵素の生産は、アクロモバクタ−礪
に属すく、新プロテアーゼの生産面を培地に増養するこ
とにより行なイつれる。培地としては固体でも液体でも
よく、培養は静置でもよいが１通常は液体基地を用い、
糸面培養または１瓜気情拌培裏−など、好気的条件下に
行なうのかより有利である。培地組成としては、本菌の
生育およびプロテアーゼＩａの生産を促すものであれば
どのようなものを加えてもよい。すなわち炭素源として
はたとえはクルコース、サッカロース、デキスｌ−ＩＪ
ンなどの糖類、窒素源としてはペプトン、肉エキス、酵
母エキス、ＵＳ酵母、大兄粉。

カゼイン、カザミノ酸、アミノ酸類、アンモニウム鳩な
どの有機または無機室系官有化合物が用いられる。無機
塩としてはナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネ
シウムなどの金属を。

リン酸基、硫酸塩、炭酸塩、塩化物などの形で加えても
よい。場合により゛（は、凶の生育およびプロテアーゼ
Ｉａの生産を促進する目的で、ビタミン類、核酸および
それらの関連化合物などを添加してもよい。、 培地の液性、Ｊ＠養温度、通気量、培誉時間などの培養
条件は、使用する菌株、Ｊ＠地組成などによって一定し
ない１ｒ）ｂ　賛は目的とするプロテアーゼＩａの蓄積
量が最大となるように適宜選択調節される。多くの場合
、培地の液性は中性付近、培養温度は２０〜３５℃、好
ましくは２５〜３０℃通気重は培地１を当り毎分的０．
５〜１．５ｔ、培養時間はおよそ１〜２日間の条件が選
ばれる。

５− このようにし−Ｃ１プロテアーゼＩａの生産−かｌｘさ
れ、その培養液中にプロテアーゼＩａが分泌畜槓される
。

本酵素の取得ｌこは、公知の分Ｍ精衷手段を適宜に利用
し、任意純度の標品に導きうる。即ち遠心分離又は濾過
などの方法によって菌体を除去した上消液やＦ＃に硫酸
アンモニウムのような塩を加えて塩析したり、あるいは
アルコール類、アセトンのような親水性有機浴剤を添刀
口しで、目的物を分画沈澱させることが出来る。更に１
例えば、アルミナ、ベントナイト、リン酸カルシウムゲ
ル、活性炭などによる吸着および脱着、各種のイオン交
換体を用いるクロマトグラフ法、セファデックス、バイ
オゲル等を用いる分子節法などを単独または適宜に組み
合わせて行なうことにより梢製度を高めることが出来る
。この他１等電点沈皺法、透析法、電気泳動法１重金属
イオンによる沈叔法なども場合に応じて用いられる。こ
のようにして、任意の純度のプロテアーゼＩａを分、離
することが出来る。

６一 本酵素の取得法（こついＣは、１咬記実施例をもって更
に具体的に説明する。なおアミダーゼ活性およびエステ
ラーゼ活性の力価は次のような方法で単位が定められる
。

アミダーゼ活性の測定法および単位 ０．２Ｍ２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジ
オール媛衝液（ｐＨ９，５）　１．３ｍ／に。

２．５ｍＭベンゾイル−ＤＬ−リジン−ｐ−’−トロア
ニリ・ド（以下Ｂｚ−１ｙｓ　　　ｐ　−Ｎ　Ａと略称
する。）水浴液０．１５＋＋＋ｌを加え５３０℃にて予
備加温後、酵素Ｄ０．０５１ｎｌを添加し正確に２５分
間反応させた。反応１女４５％（Ｖ／Ｖ　）酢酸水溶液
Ｑ、　５　ｍｌを加えて反応を停止させ、次いでその反
応液を４０５ｎｍにて比色測定し、その吸光度を求める
。酵素単位としては、３０℃において１分間当り１μｍ
ｏｌｅのｐニトロアニリンを生成する酵素Ｌ１を１単位
（Ｉ　Ｌｌ　）とする。酵素力価の算出方法は１次式に
従った。

ｍｆｆＥ　（ｕ／ｍ）＝ΔＯＤ／ｍ１ｎＸユ×旦×９．
６２　　（Ｊ、ＵＳ 希釈倍率 エステラーゼ活性の測定法および単位 ］、　ｍ　Ｍ　トシル−Ｌ−リシンメチルエステル（Ｔ
　Ｌ　Ｍ　Ｅと略称する。）含有４０ｍＭトリス−塩酸
酸ＶｉＩｉ（ｐＨ８，０）　３．０ｍｇを３０℃にて予
備加温後、酵素浴ｉ　０．２　ｍを加え、３０℃におけ
る２　４７ｎｎ１の吸光度変化（Δ○Ｄ）を測定する。

ｐ　Ｈ８，０，３０℃において１分間当り１μｍｏｌｅ
のＴＬＭＥ８加水分解する酵素量を１単位とする。酵素
力価の算出方法は１次式に従った。

活性（ｕ　７ｍｇ　）　＝　Δ○Ｄ　／　ｍ　ｉ　ｘ　
、Ｘ−’−Ｘ−”ＸＯ，９６０，２ 希釈倍率 次に本発明のプロテアーゼＩａの酵素化学的特性につい
て述べる。

（１）分子量：　３０，０００　（５ｅｐｈａｄｅｘ　
　（）−７５によるゲル沖過法）。

（１１］　　等電点（アンフオライン等電分画法による
）：ｐＨ５，３゜ ０！！ｌ　　ｐＨ作用性：　Ｂｚ−Ｌｙｓ　　ｐ　ＮＡ
　　に対するアミダーゼ活性はｐ　Ｈ９，０に（第１図
参照。）、ＴＬＭＢに対するエステラーゼ活性はｐ　Ｈ
８，５に（第２図参照。）、それぞれ作用至：ｌｌ１ｐ
　Ｈを有する。

１ψ　ｐＨ安定性：第３図に示すように、低温において
はｐ　Ｈ５，０〜１１．０の広いｐＨ範囲で安定である
（４℃、２０時間処理。）。

位）温度安定性：ｐＨ９，０で、１５分間加温・では、
４０℃まで安定である（第４図参罠）。

（Ｖ９　　基質作用性：　Ｂｚ　Ｌｙｓ　　ｐ　ＮＡｖ
）　Ｎ−ペンソイルーＬ−アルギニン−ｐ−ニトロアニ
リド（以下Ｂｚ　　Ａｒｇ　　ｐ　　ＮＡ　と略称する
。）、Ｌ−リジン−ｐ−ニトロアニリド（以下、Ｌｙｓ
　　ｐ　　ＮＡと略称する。）及びＬ−アルギニン−ｐ
−ニトロアニリド（以下、Ａｒｇ−ｐ−ＮＡと略称する
。）に対するアミダーゼ作用並びにＴＬＭｇＳＮ−トシ
ル−Ｌ−アルギニンメチルエステル（以下、ＴＡＭＥと
略称する。）に対するエステラーゼ作用をｐ）（８〜９
．５．３０℃９− で測定して各基質に対する酵素のミカエリス定数（Ｋｍ
）と分子量９　（Ｋｃ　ａ　ｔ　）　　とを求め１表−
１に示す結果を得た。この表−１から明らかなように、
本酵素はきわめて高い基質特異性を有し　Ｉ、　−ＩＪ
リシンはＬ−アルギニンのカルボキシル基におけるアミ
ド結合は、リジンに対しては作用するが、アルキニンは
水解しなかった。リジン又はアルギニンのカルボキシル
基におけるエステル結合を水解するが、その作用はリジ
ンに対して強く働くが、一方アルギニンに対しては極め
てわずかしか作用しなかった。

１０− ＆ｌｌ　　阻害剤及び各種金属塩の影響Ｂｚ　　Ｌｙｓ
　　ｐ−ＮＡに対するアミダーゼ活性に及ぼす各種阻害
剤の影響を表−２に示した。又各種音域イオンが％Ｂｚ
−Ｌｙｓ−ｐ−ＮＡに対するアミダーゼ活性に及ぼす影
１３− 六一２に示されるように、本酵素はジイソブロピルフオ
スフオフロライド、フッ化フェニルメチルスルボニル及
びトシル−Ｌ　　ＩＪジンクロロメチルケトンによって
阻害を受ける一糧のセリンプロテアーゼである。

表　−３ １４− 表−３から明らかなように５本酵素は［１４！鉛イオン
により阻害される。

前述のように１本酵素はＬ　−ＩＪリシンカルボキシル
基におけるアミド結合およびエステル結合を特異的に水
解する性質を有する為１食品化学、医桑品５臨床化学及
び生化学などの分野への応用が期待され、利用すること
ができる。

本酵素の使用に自りては本酵素七ツマ−の溶液をそのま
＼使用しても良く、又、グルタルアルデヒド、ジイソシ
アナート等の架橋剤により本酵素を架橋し、水溶性又は
水不溶性プロテアーゼＩａポリマーとしても良く、ある
いは水不溶性の担体へ、共有結合させたり、又はイオン
結合させたり、又は包括させて水に不溶性な状態となし
固定化酵素として、それぞれの用途や目的にかなった型
態で、適宜１便利に使用出来ることはいうまでもない。

本発明により得られた新規酵素は、リシンのカルボキシ
基側のペプチド結合のみ特異的に作用し、これを加水分
解するという％似ある基質特異性を有しているため、具
体的（こはアミノ酸配列順序決定の際のペプチドあるい
はプロティンの酵素分解、並びにリシルペプチドの分解
および合成の目的に利用出来る。

具体的な本酵素の利用例としてブタインスリンからヒト
インスリンを合成する例が挙げられる。即ち、ブタイン
スリンとヒトインスリンの異いは３０位のアミノ酸が前
者においてアラニン、後者においてスレオニンであるこ
とで、その他のアミノ酸配列は全く共通であり、しかも
３０位に隣接する２９位のアミノ酸はリジンである。こ
のことから本酵素とブタインスリンをｐＨ８〜９でイン
キュベートし、リジル結合を切断して、３０位のアラニ
ンを除去したデスアラニンインスリン（ＤＡＩ　）を作
製し、更にＤＡＩをスレオニン又はスレオニン誘導体（
例えばスレオニンブトキサイド）８本酵素により縮合し
てインスリン誘導体へ導く。この様ζコシて得たインス
リン誌導体の揚台は常法により修飾基を除去して最終的
にヒトインスリンとすることがり能である。

以下に参考例と実施例を挙げて更に詳細に説明するか、
これらの参考例及び実施例は本発明を何ら限定するもの
ではない。

参考例 ペプトン１％、　ミルクカゼイン０．５　％　、サッカ
ロース１．θ％、に言ＨＰＯ４０，０１％、　Ｍ　ｇ　
８０ａ・７　ＨｍＯＯ，０１％を含む液体培地（ｐＨ７
，２）を％　５００耐容坂ロフラスコに１００１ずつ分
注、戯画したのち、アクロモバクターリティクスＭ４９
７−１を接種し、２８℃で２４時間培養して種培養液を
調製した。この植ｆ＠養液１，５ｔを同じ培地組成３０
ｔを仕込んだ発酵タンクに移植し、２８℃で毎分１５ｔ
の空気を送りながら通気攪拌培養を４日間行なった。得
られた培養液３０ｔを約１５℃まで冷却後、遠心分離機
を用いて除菌し、上清液約２６１を得た。この上清液に
、４％ベンザルコニウムクロライド溶液２６０１をゆる
く攪拌しながら、徐々に滴下し、４℃に１時間放置後、
生じた沈叔を遠心−１７＝ 分離機を用いて除き、約２５．５１の上清液を得た。こ
＼に得られた上清液（４℃）に、ゆるく攪拌しながら一
５℃に冷却したアセトン８０ｔを徐々に加え、さらに冷
所に一夜放前後、生じた沈峨を遠心分離機を用いて採取
、冷アセトンで洗浄して湿沈澱約４０ｇを得た。この屡
沈誠を風乾したのち、シリカゲルを敷いたデシケータ−
中、減圧下で２日間乾燥し、灰白色粉末状の粗酵素標品
を約１４ｇ得た。この粗酵素標品の、　Ｂｚ−Ｌｙｓ　
　ｐ　ＮＡ）こ対するアミダーゼ活性は、Ｉｇ当り２１
．６単位であった。このアセトン粉末１０ｇを１０ｍＭ
ト’Ｊスー塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解し、得られ
た粗酵素液５００ゴに、前もって１０ｍＭト’Ｊスー塩
酸緩衝液（ｐＨ８，０）で平衡化したカルボキシメチル
セルロース（ブラウン社製）２００ｇ（湿重ｔ）を加え
て、４℃にて、おだやかに約１時間攪拌後、ガラスフィ
ルターを用いて濾過した。フィルター上のイオン交換セ
ルロースは適Ｉｔの同緩衝液で洗浄し、先のろ液と一緒
にし酵素液１８− ７２！Ｍｔを得た。次に得られた酵素液７２５ｍ１に、
あらかじめ同緩衝液で平衡化したジエチルアミンエチル
セルロース（ブラウン社ＰＪ）４６０ｇ、（湿重〜就）
を／＋ｎえて、４℃にて１時間攪拌後、上記と同様に、
濾過洗浄を行なった。得られたＦ液をダイアフローメン
ブレンＵＭ−１０を用いて濃縮後、４℃で２ｍＭ）’Ｊ
ス塩酸緩衝１１ｉＪ（ｐＨ８，０）に対して充分透析し
、酵素液４９２ｔＲ２を得た。この酵素液を、２　ｍ　
Ｍ　トリス塙酸緩衝欣（ｐＨ８，０）で平衡化としたＡ
Ｈ−セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）カラム（ｍ
４Ｘ２１ｃｒｎ）に添加成層させ、充分同緩衝液で洗浄
後１食塩濃度を０からＩＭまで直線的に一ヒ昇させた同
緩衝液２ｔで溶出を行なった。

食塩濃度的０．３Ｍから０．５Ｍ付近で溶出されるアミ
ダーゼ活性部分を採取した。本酵素液を２ｍＭトリス鳩
酸緩衝液（ｐＨ８，０）で充分透析後、ダイアフローメ
ンブレンＵＭ−１０を用いて濃縮し、濃縮液１０−を得
た。この濃Ｆａ液は、プロテアーゼＩａの他に、プロテ
アーゼＩを含む、この液のアミターゼ゛γ占性は１ｄ当
り１４，４単位でめった。

実施例１ 参考例で得られた酵素敵１　（Ｊｕ１９．ｐ　Ｈ３，５
〜１０のアンフオライト（ＬＫＢ社製）を充填した焦点
低気泳動装置ｔ（内容積１５（１／）に注入し４℃にて
６００ｖで４８時間、等電点分画に付した。眠気泳動完
了後、１．６　ｌ１１７！ずつ分画し。

各両分のアミダーゼ活性を測定し第５図に示すような結
果が得られた。第５図から明らかなように、アミダーゼ
活性のピークが２つ存在する。

その内、後の大きなアミダーゼ活性ピークはプロテアー
ゼエに相当するものである。溶出分画数で約４６番目に
最大のアミダーゼ活性を有するピーク即ち２つの活性ピ
ークの内、前のピークは決して無視出来ないピークであ
る事が判る。

目的とする酵素は、このピーク部分に含まれており、こ
の区分１２．６１１１Ａをプールした。アミダーゼ活性
１８．９ｕ、比活性（Ｌ１１０Ｄ２８０）１２．９、収
率８．７％（アセトン粉末より）実施例２ 実施例１て得られた酵素液ｋ　２　ｍ　Ｍ　ト’）ス、
塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）Ｔ透析後、濃縮ケ行ない、な
お微量に存在する不純タンパク金除去するために、アン
フオライン（Ｐ　Ｈ４〜６）（１１−用いて実施例１と
同じ条件下で電気泳動ｒ繰り返し、第６図に示す結果を
得た。分画番号６５〜７６に相当する両分勿集め、この
酵素液に共存するアンフオライトを除くため［，２ｍＭ
）リス塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ８，０）で平衡化したセフ了
デツクスＧ−５０カラム（φ２×５０ｃｍ）に付し、ア
ミダーゼ活性画分ケ採取後、濃縮４行ない精製酵素溶液
５．４．　ｍｅ　ｋ得た。アミダーゼ活性１６１単位。

比活性（ｕｌｏＤ　２８０）　２．２４、収率７．４％
（アセトン粉末より）。このようにして精製された本発
明のプロテアーゼＩａはディスク電気泳動法による解析
で単一の蛋白質として泳動σれた。

なお、本細菌了クロモバクター・リティカスＭ４９７−
１は工業技術院微生物工業技術研究所に保管？委託致し
ました。その寄託番号は、微工研菌寄第６７１８号（Ｆ
ＥＲＭ　　Ｐ−６７１８）であり、その事実全証明する
書面（受託証）を願書に添付致します。

【図面の簡単な説明】

第１図は、アミダーゼ活性に及ぼすｐＨ変化の影響ケ示
すグラフ、第２図は、エステラーゼ活性に及ぼすｐ　Ｈ
変化の影゛響乞示すグラフ、第３図は、ＰＨ安定性？示
すグ、ラフである。第３図において、−〇−は０．１　
Ｍ酢酸カルシウムｂｕｆｆｅｒ　−・−は０．１　Ｍ　
ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ　　ｂｕｆｆｅｒ　＋−△−は０．１
　Ｍ　ｄｉｏｌ　Ｈｃｌ　ｂｕｆｆｅｒ＋−入−は０．
１．　Ｍリン酸二ナトリウム−ＮａｏＨｂ　ｕ　ｆ　ｆ
　ｅ　ｒｆ用いて行なったものであ゛る。第４図は、熱
安定性ケ示すクラン、第５図は、１回目焦点電気泳動　
アンフオライン（ｐ　Ｈ３，５〜１０）？示すグラフ、
第６図は、２回目焦点電気泳動　アンフオライン（ｐＨ
４〜６）を示すグラフである。 特許出願人　和光純薬工業株式会社 第　　１　　図 ＰＨ 第　　２　　図 第　　３　　図 Ｈ 第　　４　　図 ’ｒｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ 第　　５　　図 第　　６　　図 ？

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｉｌｌ　　下記の特性を封するプロテアーゼ。 （ｉ＋　　分子ｉｔ　：　３０．０００　（８ｅｐｈａ
   ｄｅｘ　Ｇ−７５によるゲル濾過法） （１１）等電点：５．３ （曲　ｐＨ作用性：エステラーゼ活性はｐＨ８，５に、
   またアミダーゼ活性はｐＨ９，０にそれぞれ作用至４ｐ
   Ｈを有する。 鴫ψ　基質作用９：ｂ−＋Ｊジンのカルボキシル基にお
   けるエステル結合およびアミド結合を選択特異的に水解
   する。 （Ｖ）ｌｆｆｉ害剤ニジイソプロピルフォスフオフロリ
   ド、トシル−Ｌ−リジンクロロメチルケトン及びフェニ
   ルメチルスルホニルフロリドにより阻害を受ける。 （２）アクロモバクタ−属により産生される特許請求の
   範囲第１項記載のプロテアーゼ。