JPH08308562A - 動物細胞培養器及びそれを用いる薬物代謝活性の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 培養される動物細胞の機能を高めて、生体内
と類似の環境に保つことにより、多数の実験動物を使う
ことなく、経済的に、効率良く、化学物質や医薬品の代
謝の評価に使用可能な培養器を提供する。 【構成】 テロペプチドを除去し、もしくは還元剤で処
理したタイプＩコラーゲンを主成分とするコラーゲンゲ
ルを培養面に被覆し、その上に動物細胞を播種して培養
することにより、薬物代謝酵素の活性を長期間維持させ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、培養される動物細胞の
機能を高めて、生体内と類似の環境に保つことにより、
従来動物で行われている新規の化学物質や医薬品の代
謝、代謝毒性、代謝による薬効試験等を、経済的に、効
率良く、かつ再現性良く行うための動物細胞培養器、及
びそれを用いる薬物代謝活性の測定方法に関するもので
ある。

【０００２】

【従来の技術】従来、新規の化学物質や医薬品の代謝薬
効や代謝毒性の試験は、動物の個体を使って行われてき
ているが、検査結果の定量化が困難、因果関係の判定が
困難等の欠点に加えて、一種類の物質に多数の動物個体
を必要とすることから、動物愛護の観点からも動物実験
に替わる方法が求められている。動物実験代替法は、使
用する実験動物の数を削減し、動物の飼育に伴う経済的
な負担を軽減すると共に、合理的で簡便な代謝薬効や代
謝毒性の評価に使用できる方法および材料を開発するこ
とを目的としている。

【０００３】動物実験代替法の一つとして、体外に取り
出した動物細胞を培養し、その薬物感受性や薬物代謝能
を調べる方法が考えられているが、一般的に用いられて
いる組織培養（ティッシュカルチャー）用ペトリ皿を用
いた単層培養方法では生体内の機能が直ぐに失われ、ま
た細胞自体もすぐに死んでしまい、再現性良く安定的に
薬物代謝を調べることは困難であり、動物実験の代替法
としては不十分である。

【０００４】一方、株化（不死化）した細胞を用いるこ
とも試みられているが、株化細胞は生体内正常細胞の持
つ本来の機能の大部分を喪失しており、その利用範囲は
限定される。また、主として初代培養肝細胞について、
生体内と類似の環境を保つための三次元培養法として、
スフェロイド培養法（日本動物実験代替法学会第５回大
会要旨集ｐ３０〜３３（ '９１））や、マトリゲル培養
法（日本動物実験代替法学会第５回大会要旨集ｐ３８〜
４１（ '９１））を利用した代替法も行われてきてい
る。しかしながら、スフェロイド培養法の場合、２〜３
週間以上の長期培養によるスフェロイド中心部の細胞壊
死や、内部の細胞への物質の浸透性に問題がある。ま
た、マトリゲル培養法の場合、マトリゲルの構成物が完
全には解明されておらず、添加した被検物質単独の効果
なのか明確でない部分がある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者ら
は、以上のような従来技術の問題点を解決するために、
以前に提案した動物細胞培養方法、即ち、基質材料とし
てテロペプチドを取り除いたタイプＩコラーゲンを使用
すると共に、培地中に特定の物質を添加する方法（特開
平３−４７８０号公報）や、還元剤で処理したタイプＩ
コラーゲンを使用する方法（特開平６−２９２５６５号
公報）を用いて、培養動物細胞を生体内と類似の環境に
保つことにより、細胞内の複雑な反応であり培養環境の
悪化により最も失われやすい機能の一つである、薬物代
謝能をも長期間維持できることを見い出し、本発明を完
成するに至った。

【０００６】即ち、本発明の目的は、テロペプチドを取
り除いたタイプＩコラーゲン、もしくは還元剤で処理さ
れたタイプＩコラーゲンを、ゲル化してなるコラーゲン
ゲルを培養用基質材料として使用し、薬物代謝能を長期
間維持できる動物細胞培養器を提供し、さらにはそれを
用いて動物細胞の薬物代謝の状態を調べることを可能に
することである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
を達成するために鋭意検討した結果、本発明を完成する
に至ったものである。即ち本発明は、タイプＩコラーゲ
ン、特にテロペプチドを取り除いたタイプＩコラーゲ
ン、もしくは還元剤で処理されたタイプＩコラーゲンを
ゲル化してなるコラーゲンゲルを、培養用基質材料とし
て培養面に被覆し、その上に動物細胞を播種し培養する
ことによって、薬物代謝酵素の活性を長期間安定的に維
持させることを特徴とする動物細胞培養器であり、さら
にはそれを利用した薬物代謝活性の測定方法である。

【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
使用される動物細胞培養用基質材料の主成分として使用
されるタイプＩコラーゲンとしては、その由来として仔
牛真皮、ブタ皮膚やラット尾腱等があるが、特に、由来
動物種や由来組織に限定されるものではなく、適宜の精
製タイプＩコラーゲンを使用することができる。

【０００９】テロペプチドを取り除く方法としては、生
体由来の酵素であるペプシンを使用する方法がある。ま
た、還元剤処理に使用できる還元剤としては、水素化ホ
ウ素ナトリウム等の水溶液で利用できるものであって、
エステルやアミド（ペプチド結合）の還元は起こさず、
アルデヒド基の還元を起こすものは全て使用可能であ
り、このような作用を有するものであればその種類を問
わず、適宜のものを使用することが出来る。

【００１０】本発明に使用される動物細胞培養用基質材
料は、上記のテロペプチドを取り除いたタイプＩコラー
ゲン、または還元剤で処理されたコラーゲンを主成分と
して含有するものであり、当該コラーゲンを単独使用す
るもの、もしくは適宜の他の基質材料を共存せしめたも
ののいずれであっても使用することが可能であり、その
主要成分であるコラーゲンを培養器表面でゲル化し被覆
させて、該コラーゲンゲル上で動物細胞を培養すること
を特徴とするものである。なお、コラーゲンの成分比率
は７０％以上、望ましくは９０％以上のものが使用でき
る。

【００１１】ゲル形成の方法は、テロペプチドを取り除
いたタイプＩコラーゲン、または還元剤で処理されたタ
イプＩコラーゲンを主成分とする、所望濃度のコラーゲ
ン溶液を調製し、当該溶液をリン酸緩衝液、Ｈｅｐｅｓ
（Ｎ−〔２ヒドロキシエチル〕ピペラジン−Ｎ′−〔２
エタンスルホン酸〕）水酸化ナトリウム水溶液等を用い
て中性にし、この溶液をシャーレやプレートのウエル中
に分注して、２０℃以上、望ましくは３７℃で静置する
と、数時間でゲル化し培養面が被覆される。得られたゲ
ル部分をリン酸緩衝液や培養液で十分洗浄し、動物細胞
培養器として用いる。これを長期に保存する場合は、約
４℃で保管することにより長期保存することが出来る。

【００１２】本発明の動物細胞培養器を用いて動物細胞
を培養する方法は、細胞をコラーゲンゲルの上に播くだ
けでよく、播種後、数時間〜１日で細胞はコラーゲンゲ
ルの上面に接着する。動物細胞については、肝細胞、乳
腺細胞、腎臓細胞、その他適宜の動物細胞に適用可能で
あり、その種類は特に限定されるものではない。

【００１３】これらの動物細胞をコラーゲンゲル上で定
期的に培地交換を繰り返して、３〜１４日間、好ましく
は７〜１４日間培養して生体内と類似の環境に保った
後、培地中に薬物等の被検物質を添加して動物細胞の機
能を測定することにより、各種の毒性試験評価を行うこ
とが可能となる。培地交換の間隔としては１〜４日毎、
短い方が好ましいが、作業量の点から通常は２〜３日毎
に行う。また、培養を行う期間は特に限定する必要はな
く、３日程度でも使用可能であるが、動物細胞の薬物代
謝能は、使用する培地にもよるが１〜２週間安定してお
り、培地成分によっては４週間以上代謝能を維持でき
る。

【００１４】被検物質が代謝に及ぼす影響の評価は、培
地中に被検物質を添加し、一定時間経過後に動物細胞中
および培地中の代謝物を測定することにより可能とな
る。細胞機能の特性（種類）によっては、被検物質の添
加から１時間程度で変化が現れるものもあるが、通常は
１〜４日経過後に測定するのがよい。また、被検物質の
代謝産物による慢性毒性の評価は、被検物質を比較的低
濃度で添加した培地を用いて、定期的に培地交換を繰り
返しながら培養を続け、１〜２ケ月以上の長期間に亘っ
て動物細胞の機能の経時変化を測定することにより可能
となる。測定を続ける期間は特に限定されるものではな
いが、動物細胞の機能が必要なレベルに保たれる期間が
限度となる。

【００１５】その他にも、例えば、代謝産物による癌原
性の評価は、慢性毒性評価の場合と同様に低濃度の被検
物質を培地中に添加し続けた後、発癌マーカー酵素等の
細胞内発現の有無を見ることにより可能となる。さら
に、生体内では摂取された物質は最初に肝臓で代謝され
ることから、本発明の培養器を用いて肝細胞の代謝機能
を応用して、被検物質の肝細胞による代謝後の、各種動
物細胞に対する影響の評価を行うことも可能である。具
体的には、肝細胞と標的細胞の共培養により、もしく
は、本発明の培養器を用いて肝細胞に代謝物を分泌さ
せ、その培養上清を標的細胞に接触させることにより調
べることができる。

【００１６】

【実施例】以下、実施例により本発明について更に具体
的に説明するが、用いる細胞の種類、測定する代謝活性
は本実施例に限定されない。 ［実施例１］仔牛真皮よりＰＨ３の塩酸水溶液中に溶出
してくる成分の内、中性（ＰＨ７〜８）の生理食塩水中
でゲル化する成分を回収し、無処理タイプＩコラーゲン
を得た。得られたタイプＩコラーゲンをＰＨ３の塩酸液
に０．３％濃度で溶解させ、同溶液に１０倍濃度のリン
酸緩衝生理食塩水と再構成用緩衝液（２．２％ＮａＨＣ
Ｏ₃、４．７７％Ｈｅｐｅｓ、０．０５％ＮａＯＨ溶
液）とを８：１：１の割合で混合し、プラスチックシャ
ーレの培養面に１ないし２ｍｍの厚さに敷いた後、３７
℃のインキュベータ中でゲル化させ、動物細胞培養器を
作製した。

【００１７】［実施例２］仔牛真皮よりＰＨ３の塩酸で
溶出したテロペプチドを有するタイプＩコラーゲン（無
処理コラーゲン）０．３％溶液（ＰＨ３）と、ペプシン
３％溶液（ＰＨ３）とを、９：１の割合で混合し、４℃
で約１日間攪拌を行った。この反応溶液に１０倍濃度の
リン酸緩衝生理食塩水と再構成用緩衝液（２．２％Ｎａ
ＨＣＯ₃ 、４．７７％Ｈｅｐｅｓ、０．０５％ＮａＯＨ
溶液）を８：１：１の割合で混合し、３７℃に加温して
約１日静置し、コラーゲンをゲル化させた後、遠心分離
にてコラーゲンゲルのみを分離、洗浄し、１ｍＭ（ミリ
モル）塩酸に溶解させてペプシン処理コラーゲン溶液を
得た。

【００１８】得られたペプシン処理コラーゲンの０．３
％溶液（ＰＨ３）に、１０倍濃度のリン酸緩衝生理食塩
水と再構成用緩衝液（２．２％ＮａＨＣＯ₃、４．７７
％Ｈｅｐｅｓ、０．０５％ＮａＯＨ溶液）とを８：１：
１の割合で混合し、プラスチックシャーレの培養面に１
ないし２ｍｍの厚さに敷いた後、３７℃のインキュベー
タ中でゲル化させ、動物細胞培養器を作製した。

【００１９】［実施例３］実施例１と同様にして、仔牛
真皮よりＰＨ３の塩酸で溶出したテロペプチドを有する
タイプＩコラーゲンの０．３％溶液（ＰＨ３）と、１０
倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水と１％水素化ホウ素ナト
リウム水溶液とを１０：１．２：１の割合で混合し、４
℃で約１日間攪拌を行った。その後、３７℃に加温して
約１日静置し、コラーゲンをゲル化させた後、遠心分離
にてコラーゲンゲルのみを分離、洗浄し、１ｍＭ塩酸に
溶解させ還元処理コラーゲン溶液を得た。これを実施例
１と同様に処理して、動物細胞培養器を作製した。

【００２０】実施例１〜３の精製コラーゲンの純度は、
電気泳動ゲルの蛋白質染色、およびデンシトメトリーで
の測定の結果、８０〜９５％であった。 ［比較例１］シャーレの培養面に、タイプＩコラーゲン
を１μｇ／ｃｍ²の割合でコートした。

【００２１】［血清入り培地による動物細胞の培養試
験］肝細胞をラットよりコラゲナーゼ灌流法にて分離
し、実施例１，２，３および比較例１の細胞培養器に、
５×１０⁵／ｃｍ²の濃度で播種し、３７℃、５％炭酸ガ
スインキュベータ内で培養した。培養液はＬ−１５培地
に、牛胎児血清１０％、インシュリン１０-⁷Ｍ、デキサ
メサゾン１０-⁷Ｍ、ＥＧＦ（Ｅpidemal Ｇrowth Ｆacto
r)１０ｎｇ／ｍｌ、プロリン３０μｇ／ｍｌ、およびジ
メチルスルフォキシド２％を加えたものを用い、ゲル層
の上面に１ないし２ｍｍ以上の高さまで培養液を加え、
２〜３日毎に培地交換をしながら培養を続けた。

【００２２】そして、培養しながら、肝細胞内の代謝酵
素の一つであるＰ−４５０について、活性の維持状況を
評価した。即ち、培養３日、７日、１４日、２１日、及
び２８日の各試料の培地中に、Ｐ−４５０活性誘導物質
として３−メチルコラントレン１μｇ／ｍｌを加えて、
さらに２４時間培養し、これに７−エトキシクマリンを
加え、Ｐ−４５０の働きによって代謝され生成した７−
ヒドロキシクマリンの量を測定することにより、Ｐ−４
５０活性（モノオキシゲナーゼ活性）の維持状況を測定
した。また同時に、３−メチルコラントレンを添加しな
い場合の、Ｐ−４５０活性も測定した。

【００２３】［無血清培地による動物細胞の培養試験］
肝細胞をラットよりコラゲナーゼ灌流法にて分離し、実
施例１，２，３および比較例１の細胞培養器に、５×１
０⁵／ｃｍ²の濃度で播種し、３７℃、５％炭酸ガスイン
キュベータ内で培養した。培養液はＬ−１５培地に、イ
ンシュリン１０-⁷Ｍ、デキサメサゾン１０-⁷Ｍ、ＥＧＦ
１０ｎｇ／ｍｌ、およびプロリン３０μｇ／ｍｌを加
えたものを用い、ゲル層の上面に１ないし２ｍｍ以上の
高さまで培養液を加え、２〜３日毎に培地交換をしなが
ら培養を続けた。そして培養しながら、前記と同様にし
て、Ｐ−４５０活性誘導物質３−メチルコラントレンを
添加した場合と、添加しない場合についてＰ−４５０活
性の維持状況を測定した。

【００２４】結果は、図１（３−メチルコラントレンを
添加した場合）、及び図２（３−メチルコラントレンを
添加しない場合）に示したとおりで、図１と図２を比較
すると、コラーゲンゲル培養の肝細胞、特にペプシン処
理と還元処理を施したコラーゲンゲル培養の肝細胞で、
Ｐ−４５０活性誘導物質を添加することによって、Ｐ−
４５０の代謝能が活性化され、生体内と同様に肝細胞が
人工合成物を代謝していることが分かる。また、図１か
らは、ペプシン処理、および還元処理コラーゲンゲル上
での培養においては、培養３週間目以降もＰ−４５０活
性が認められるのに対して、従来の培養器であるコラー
ゲンコート培養器では、Ｐ−４５０活性は培養開始直後
から低レベルであり、７日目以降は活性は殆ど消失し、
薬物代謝活性を維持することはできないことが分かる。

【００２５】以上のごとく、タイプＩコラーゲンをコー
トした細胞培養器では、薬物代謝活性が低いため、薬物
代謝毒性や薬効等の評価試験には役立たないのに対し
て、ペプシン処理、および還元処理コラーゲンゲルを培
養面に被覆した培養器中で培養した初代肝細胞は、最も
喪失しやすい機能の一つである、Ｐ−４５０に代表され
る薬物代謝活性を長期間維持することが可能で、動物実
験の代替としての薬物代謝毒性や、薬物代謝物の薬効の
評価試験への応用が可能性なことが確認された。

【００２６】

【発明の効果】本発明によれば、多数の実験動物を犠牲
にすることなく、化学物質や医薬品の代謝試験を行うこ
とができ、多数の実験動物の飼育のための経済的な負担
を軽減すると共に、合理的で簡便な代謝物の評価方法を
提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】３−メチルコラントレンを添加した場合の、各
培養器中におけるＰ−４５０活性の経時変化を示す図
で、（ａ）は血清入り培地使用時、（ｂ）は無血清培地
使用時である。

【図２】３−メチルコラントレンを添加しない場合の、
各培養器中におけるＰ−４５０活性の経時変化を示す図
で、（ａ）は血清入り培地使用時、（ｂ）は無血清培地
使用時である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 中嶋 裕人 神奈川県横浜市栄区田谷町１番地 住友電 気工業株式会社横浜製作所内 (72)発明者 新原 直樹 神奈川県横浜市栄区田谷町１番地 住友電 気工業株式会社横浜製作所内

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ゲル化タイプＩコラーゲンを主成分とす
   るコラーゲンゲル（培養用基質）を培養面に被覆し、該
   コラーゲンゲル上に動物細胞を播種し培養することによ
   って、薬物代謝酵素の活性を維持させることを特徴とす
   る動物細胞培養器。
2. 【請求項２】 タイプＩコラーゲンが、テロペプチドを
   取り除いたタイプＩコラーゲン、もしくは還元剤で処理
   されたタイプＩコラーゲンであることを特徴とする、請
   求項(１)記載の動物細胞培養器。
3. 【請求項３】 初代培養肝細胞を培養の対象とすること
   を特徴とする、請求項(１)もしくは請求項(２)記載の動
   物細胞培養器。
4. 【請求項４】 請求項(１)ないし請求項(３)のいずれか
   に記載された動物細胞培養器を用いて動物細胞の培養を
   行い、さらにその培養液中に薬物を加えて、動物細胞の
   薬物代謝の状態を調べることを特徴とする薬物代謝活性
   の測定方法。
5. 【請求項５】 請求項(１)ないし請求項(３)のいずれか
   に記載された動物細胞培養器に動物細胞を播種し、定期
   的に培地交換を繰り返しながら３〜１４日間培養した
   後、培養液中に薬物等の被検物質を添加し、さらに一定
   時間経過した後、培養液中もしくは細胞中の代謝物質を
   測定することを特徴とする薬物代謝活性の測定方法。
6. 【請求項６】 動物細胞が初代培養肝細胞であり、代謝
   物質が代謝酵素Ｐ−４５０により代謝される物質である
   ことを特徴とする、請求項(５)記載の薬物代謝活性の測
   定方法。