JPH08308567A - ヒトプロテアソームサブユニットｐ４０ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明はヒト２６Ｓプロテアソームの構成成
分のサブユニットＰ４０の同定および機能を明らかに
し、さらに該サブユニットＰ４０のポリペプチドのアミ
ノ酸配列を提供することを目的とし、さらにサブユニッ
トＰ４０のポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列
を提供することを目的とするものである。さらに該遺伝
子と相補的なポリヌクレオチドを用いてｍＲＮＡの発現
量を定量することによる免疫疾患等の診断方法、該サブ
ユニットＰ４０に対する抗体を用いて該サブユニットを
免疫測定することによる免疫疾患等の診断方法を可能に
することを目的とするものである。 【構成】 ヒト２６Ｓプロテアソームの構成成分のサブ
ユニットＰ４０を同定し、生化学的機能を明らかにす
る。さらに該サブユニットＰ４０のポリペプチドのアミ
ノ酸配列を決定する。さらに上記ヒトプロテアソームの
構成成分のうちサブユニットＰ４０のポリペプチドをコ
ードする遺伝子の塩基配列を決定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト２６Ｓプロテアソ
ームに関するものであり、さらに詳しくは該プロテアソ
ームのサブユニットＰ４０のポリペプチド、および該サ
ブユニットの各ポリペプチドをコードする遺伝子に関す
るものである。

【０００２】

【従来の技術】プロテアソームは、別名、多機能性プロ
テアーゼと呼ばれ、不活性型で細胞内に局在し、エネル
ギー依存性蛋白質分解系を構成する主要酵素である。本
酵素は、酵母からヒトに至る真核生物に広く存在してお
り、またすべての組織に存在し、なかでも肝臓では、全
可溶性蛋白質の１％も占める。該酵素は同一分子内に複
数の触媒活性部位を持ち、トリプシン型酵素の基質であ
る塩基性アミノ酸、キモトリプシン型酵素の基質である
中性アミノ酸、そしてプロテアーゼとしては稀な酸性ア
ミノ酸を含む合成ペプチドのカルボキシ末端のペプチド
結合を切断する活性がある。

【０００３】しかしながら、種々の既知の阻害剤の中で
特異的で有効に作用するものがないことから、該酵素
は、既知のプロテアーゼとは異なる触媒活性部位を持つ
と推定されている。またプロテアソームは、非リソゾー
ム系蛋白質分解経路における主要酵素であり、蛋白質の
修飾による機能制御や蛋白質の代謝回転の調節など多彩
な生理作用を有していると推定される。

【０００４】さらに、最近、プロテアソームが内在性抗
原のプロセシング酵素であると考えられており、注目さ
れている。これは、クラスI MHC 抗原の提示に欠陥をも
つB細胞変異株が分離され、それらがクラスII MHC領域
約200kb に欠失のあることが判明したことによる。この
領域には、TAP1,TAP2 とよばれるペプチドを細胞質から
小胞体へ移送させるトランスポーター蛋白質の遺伝子が
コードされており、その近傍には、LMP2,LMP7 とよばれ
るプロテアソームのサブユニットをコードする遺伝子が
存在することが判明し、プロテアソームの内在性抗原の
プロセシングにおける重要性が高まっている(Trends in
Cell Biol., 2, 81,1992)。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】プロテアソームは、こ
のような２０Ｓ型複合体として見いだされた。本発明者
らは、多数の制御因子群がこの２０Ｓプロテアソームに
可逆的に結合し、分子量約２００万、沈降係数２６Ｓの
巨大な複合体を形成していることを見いだし、２６Ｓプ
ロテアソームと命名した( 特開平5-292964、特開平6-02
2759）。しかしながら、ヒトプロテアソームを構成する
サブユニットのうち、この制御因子群の詳細は明かにさ
れておらず、そのサブユニットの詳細を明かにし、各種
病態の診断、および治療法を確立することが強く要望さ
れている。

【０００６】そこで、本発明者らは、このような状況を
踏まえ、上記２６Ｓプロテアソームについて、その構成
成分である個々のサブユニットの構造、機能等について
鋭意研究を重ねた結果、新規な多機能プロテアーゼ、す
なわち、ヒトのプロテアソームの構成成分であるサブユ
ニットＰ４０について解明し、本発明を完成するに至っ
た。すなわち、本発明はヒト２６Ｓプロテアソームの構
成成分のサブユニットＰ４０を明らかにし、さらに該サ
ブユニットＰ４０のポリペプチドのアミノ酸配列を提供
することを目的とするものである。

【０００７】また、本発明は該プロテアソームの構成成
分のうちサブユニットＰ４０のポリペプチドをコードす
る遺伝子の塩基配列を提供することを目的とするもので
ある。

【０００８】さらに、本発明は、該プロテアソームの酵
素機能の解明に使用可能な方法および、免疫疾患をはじ
め各種病態の診断治療の方法を提供することを目的とす
るものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】そこで、本願発明者ら
は、上記目的を達成可能とするため、該プロテアソーム
について、その構成成分である個々のサブユニットの構
造、機能等について詳細に研究を重ねた結果、該プロテ
アソームの構成成分であるサブユニットＰ４０について
解明した。さらに、上記の知見に基づき、各種病態の診
断、および治療法を提供することが可能となった。

【００１０】すなわち、本発明は、上記サブユニットＰ
４０を同定すること、上記サブユニットＰ４０のポリペ
プチドのアミノ酸配列を決定すること、および上記サブ
ユニットＰ４０のポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドの塩基配列を決定することからなる。さらに本発
明においては、各種ヒト臓器での該サブユニットのｍＲ
ＮＡ発現量を定量可能とする。また、本発明においては
サブユニットＰ４０の抗体を作製可能とし、各種細胞に
おけるこれらのサブユニットを上記抗体を用いて定量可
能とする。

【００１１】より詳しくは、本発明は、上記の目的を達
成するため、本発明者等の方法( 特開平5-292964、特開
平6-022759）等を用いて、該プロテアソームサブユニッ
トＰ４０を電気泳動法で分離同定し、得られるポリペプ
チドのフラグメントのアミノ酸配列からサブユニットＰ
４０のアミノ酸配列のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドの全塩基配列を決定し、さらに上記の知見に
基づき、サブユニットＰ４０の全アミノ酸配列を推定す
るものである。さらに本発明は、サブユニットＰ４０の
ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオ
チドの相補的ポリヌクレオチドを作製可能とし、これを
用いて各種ヒト臓器におけるプロテアソームｍＲＮＡの
発現量を定量することを可能にし、免疫疾患等の診断方
法に使用可能とするものである。

【００１２】さらに本発明においては、ヒトプロテアソ
ームサブユニットＰ４０に対する抗体を作成可能とし、
これらの抗体を用いて、各種細胞中のサブユニットＰ４
０を免疫的測定法により定量することを可能にし、免疫
疾患等の診断方法に使用可能とするものである。なお、
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略
号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ- ＩＵＢ、による略号あ
るいは当該分野における慣用の略号を使用した。なお、
アミノ酸は３文字表記または１文字表記した。

【００１３】 Ａｌａ （Ａ） アラニン Ａｒｇ （Ｒ） アルギニン Ａｓｎ （Ｎ） アスパラギン Ａｓｐ （Ｄ） アスパラギン酸 Ｃｙｓ （Ｃ） システイン Ｇｌｎ （Ｑ） グルタミン Ｇｌｕ （Ｅ） グルタミン酸 Ｇｌｙ （Ｇ） グリシン Ｈｉｓ （Ｈ） ヒスチジン Ｉｌｅ （Ｉ） イソロイシン Ｌｅｕ （Ｌ） ロイシン Ｌｙｓ （Ｋ） リジン Ｍｅｔ （Ｍ） メチオニン Ｐｈｅ （Ｆ） フェニルアラニン Ｐｒｏ （Ｐ） プロリン Ｓｅｒ （Ｓ） セリン Ｔｈｒ （Ｔ） スレオニン Ｔｒｐ （Ｗ） トリプトファン Ｔｙｒ （Ｙ） チロシン Ｖａｌ （Ｖ） バリン

【００１４】以下本発明を詳細に説明する。 （ヒト２６ＳプロテアソームのサブユニットＰ４０のポ
リペプチド）以下で説明する方法により塩基配列が決定
されたヒト２６ＳプロテアソームのサブユニットＰ４０
のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから推定
される、サブユニットＰ４０のポリペプチドのアミノ酸
配列は配列番号１に記載されている。本発明に係るサブ
ユニットＰ４０は、上記のアミノ酸配列のＮ末端にメチ
オニンが結合していないポリペプチド、および上記アミ
ノ酸配列のＮ末端にヒトプロテアソームのサブユニット
Ｐ４０のためのシグナルペプチドの部分もしくは全部が
結合または、欠損した中間体も含包する。

【００１５】また、自然の変異により、または人工の変
異（例えばＰＣＲによるランダム変異法）によりポリペ
プチドの主たる活性に変化を与えることなく、ポリペプ
チドをコードするＤＮＡの構造の一部を変化させること
が可能である。本発明のヒトプロテアソームのサブユニ
ットＰ４０のポリペプチドは、前記アミノ酸配列を有す
る相同変異体に相当する構造を有するポリペプチドも含
包する。

【００１６】（ヒトプロテアソームサブユニットＰ４０
の精製）本発明に係る２６Ｓプロテアソームは本発明者
等の方法( 特開平5-292964) に準じ、ヒト株化細胞、組
織細胞等をはじめ各種動物細胞から、バイオゲルーＡ、
Ｑーセファロス、ハイドロキシアパタイトを吸着体とし
たクロマトグラフィー、グリセロール密度勾配遠心法等
の操作で単一に精製することが可能である。さらに、２
６Ｓプロテアソーム制御因子群のみの精製は、例えば以
下の方法、すなわち、ヒト株化細胞、組織細胞等をはじ
め各種動物細胞から出発物質を調製し、バイオゲル、ハ
イドロキシアパタイト、グリセロールグラディエント等
の方法により調製可能である。

【００１７】以下、その調製法を順に説明する。 （１）ヒト細胞や組織等を25mM Tris-HCl (ph7.5), 10m
M β- メルカプトエタノール, 2mM ATP, 250mM, Sucros
e を用いてホモジナイズし、さらに8000 rpm, 30分間遠
心する。 （２）上記遠心で得られた上澄をさらに70000 ｘｇで１
時間遠心する。 （３）得られた上澄をさらに70000 ｘｇで５時間遠心す
る。 （４）得られた沈殿物を25mM Tris-HCl (pH7.5), 10mM
β- メルカプトエタノール, 0.5mM ATP, 20%グリセロー
ルの緩衝液（緩衝液Ａとする）に懸濁する。

【００１８】（５）得られた懸濁サンプルを緩衝液Ａで
平衡化したBio-Gel A （バイオラッド社） 1.5m カラム
により２６Ｓプロテアソーム画分を集める。該画分の分
画にはプロテアーゼ活性としてキモトリプシン様活性、
トリプシン様活性、Ｖ８プロテアーゼ様活性、ユビキチ
ン分解活性（特開平５ー２９２９６４）を指標とするこ
とが可能である。 （６）上記画分を濃縮し、10mMリン酸緩衝液(pH7.0), 1
0mM β- メルカプトエタノール, 0.5mM ATP, 20%グリセ
ロールで平衡化したハイドロキシアパタイトカラムによ
り、10-300 mM リン酸緩衝液(pH7.0) のグラジエント
（10mM β- メルカプトエタノール, 0.5mM ATP, 20%グ
リセロール）により精製する。 （７）得られた各分画を２６Ｓプロテアソーム抗体（徳
島大学酵素科学研究センターより入手可能）を用いて、
イムノブロッティング法（Antibodies, A Laboratory M
anual, Ed., Harlow et al., p471-510, Cold Spring H
arbor Laboratory,1988 ）により同定し、反応画分を分
離回収した後濃縮する。 （８）さらに１０ー３０％のグリセロールグラディエン
ト（25mM Tris-HCl (pH7.5), 10mM β- メルカプトエタ
ノール, 2mM ATP ）で25000 回転で２２時間遠心による
分画後、２６Ｓプロテアソーム制御因子群を含む画分を
（７）と同様にイムノブロッティング法により同定し、
制御因子群を分離精製することが可能である。

【００１９】以上説明した方法の他にも、各種クロマト
グラフィーを組み合わせることにより、サブユニットＰ
４０を含むプロテアソームの精製は可能である。例えば
牛赤血球細胞からは、J. Biol.Chem.269,3539-3547,199
4 に記載の方法に準じて、硫酸アンモニウムによる沈殿
の後、セファクリルＳー３００、DEAE Fractogel, ハイ
ドロキシアパタイトカラム等による分離精製が可能であ
る。なお、これら精製した２６Ｓプロテアソーム制御因
子画分は２０Ｓプロテアソームのプロテアーゼの活性を
アクチベートする活性がある。

【００２０】精製したサブユニットＰ４０を含む２６Ｓ
プロテアソーム制御因子画分を、ＳＤＳ−ポリアクリル
アミド電気泳動法（ＳＤＳーＰＡＧＥ, Antibodies A L
aboratory Manual，Harlow David lane 著、Cold Sprin
g Harbor laboratory ，636-640 ，1988）や、O'Farrel
l 等による２次元電気泳動（J.Biol.Chem.250,4007-402
1,1975）により分離した後、ゲルをクマシー染色する
と、分子量21-32 kDa の十数個の２０Ｓプロテアソーム
によるバンドとともに、分子量30-110kDa の制御因子群
が含まれたバンドが観察される。また精製しサブユニッ
トＰ４０を含む制御因子群はＳＤＳ−ＰＡＧＥや２次元
電気泳動により、分子量30-110kDa の制御因子群のみの
バンドとして観察される。

【００２１】（サブユニットＰ４０の単離）上記ＳＤＳ
−ＰＡＧＥや２次元電気泳動によるバンドからサブユニ
ットＰ４０を単離するには、分子量約４０kDa のバンド
を選ぶことにより可能である。

【００２２】（プローブの作成）電気泳動法より分離同
定されたサブユニットＰ４０はポリビニリデンジフルオ
ロダイド（ＰＶＤＦ）等にトランスファーすることが可
能である。上記の処理後、リジルエンドペプチダーゼな
どによる各種酵素処理によりポリペプチドフラグメント
の混合物とし、得られたペプチドフラグネントの混合物
を高速液体クロマトグラフィーで分離する。上記得られ
たポリペプチドフラグメントのいくつかのフラグメント
のアミノ酸配列を自動アミノ酸シークエンサー等を用い
て決定することが可能である。

【００２３】上記の解析によって得られたアミノ酸配列
の一部の情報をもとにポリヌクレオチドの検索に必要な
プローブは、得られたポリペプチドフラグメントのうち
縮重頻度の低いものを選択し、これに対応する相補的ポ
リヌクレオチドとして合成して作成することにより可能
である。また、複数のアミノ酸配列が得られた場合は、
対応する相補的ポリヌクレオチドを組み合わせて、ヒト
のｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法（例えば、Michael A.
Innis et al., ed.,斎藤隆 監訳、ＰＣＲ実験マニュア
ル、ＨＢＪ出版局、１９９１年）により、より長い断片
のＤＮＡプローブを得ることが可能である。以上のよう
にして、ヒトプロテソームのサブユニットＰ４０をスク
リーニングするためのＤＮＡプローブが得られる。

【００２４】（相補鎖ＤＮＡライブラリーの作製および
スクリーニング）本発明においてポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドをスクリーニングするためのｃＤ
ＮＡライブラリーの作製は、一般的な方法が使用可能で
あり例えば次のステップにより可能である。

【００２５】すなわち、（ｉ）ヒトプロテアソーム産生
細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、
（ｉｉ）該ｍＲＮＡから、単鎖の相補鎖ポリヌクレオチ
ド（ｃＤＮＡ）を、次いで２重鎖ポリヌクレオチドを合
成し、（ｉｉｉ）２重鎖ポリヌクレオチドをプラスミド
またはファージに組み込み、（ｉｖ）得られた組換えプ
ラスミドまたはファージにより適当な宿主細胞を形質転
換し、（ｖ）得られた形質転換体を培養後、形質転換体
から、適当な方法、例えばコロニーハイブリダイゼーシ
ョンまたはプラークハイブリダイゼーションにより、目
的とするポリヌクレオチドを含有するプラスミドまたは
ファージを単離し、（ｖｉ）そのプラスミドまたはファ
ージから目的とするポリヌクレオチドを切り出し、（ｖ
ｉｉ）該クローン化ポリヌクレオチドを適当なプラスミ
ドにサブクローニングする、というステップである。

【００２６】各ステップについてさらに詳しく説明す
る。 ステップ（ｉ）：ヒトプロテアソームのサブユニットＰ
４０のポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、ヒトの組
織、器官、産生細胞から、より具体的には、肝臓、腎
臓、心臓、脳、肺、胸腺、肝臓癌細胞株、腎臓癌細胞株
などから得ることができる。また該酵素産生細胞から全
ＲＮＡを調製する方法としては、グアニジウム／セシウ
ムクロライド法(Guanidium/Cesium Chloride method,
Maniatis, T., Fritsch E. F., and Sambrook, J., Mo
lecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss, 194-196, 1982)やグアニジウムチオシアネート法
(Chomczynski,P. et al., Analytical Biochemistry, 1
62, 156-159, 1987) 等が一般に用いられる。

【００２７】上記操作により得られる全ＲＮＡからのｍ
ＲＮＡの分離、精製は例えば、オリゴｄＴーセルロース
（コラボレイティブ リサーチ社（Collaborative Rese
arch社））やオリゴテックスーｄＴ３０（タカラ社）等
を用いて吸着カラム法またはバッチ法により実施でき
る。 ステップ（ｉｉ）：このようにして得られたｍＲＮＡを
鋳型として逆転写酵素を用いて、例えばオカヤマーバー
グ法 (Okayama, H. and Berg, P., Molecularand Cellu
lar Bology, 3, 280, 1983)やグブラーとホフマンの方
法 (Gubler ,V.and Hoffman, B.J., Gene, 25, 263-26
9, 1983)等に従いｃＤＮＡを合成する。

【００２８】ステップ（ｉｉｉ）：得られたｃＤＮＡを
プラスミドやファージに組み込み、ｃＤＮＡのライブラ
リーを調製する。ｃＤＮＡを組み込むプラスミドベクタ
ーとしては、例えば、PBR322 (Gene, 2,95,1977) 、PBR
325 (Gene, 4, 121, 1978), PUC12 (Gene, 19, 259, 19
82), PUC13 (Gene,19,259,1982), PUC18 (Gene, 33, 10
3, 1985), PUC19 (Gene, 33,103,1985), PUC118 (Metho
ds in Enzymology, 153, 3, 1987), PUC119 (Methods
in Enzymology, 153, 3, 1987), Bluescript II(Nuclei
c Acids. Res.,17,9494,1989 ）、などが挙げられる
が、その他のものであっても、宿主内で複製保持される
ものであれば、いずれも用いることができる。

【００２９】また、ｃＤＮＡを組み込むファージベクタ
ーとしては、例えば、λｇｔ１０(Huynh,T.V., Young,
R.A. and Davis, R.W.,DNA cloning, A Practical Appr
oach, IRL Press, Oxford, 1, 49, 1985) 、λｇｔ１１
(Proc. Natl. Acad. Sci.,U.S.A., 80, 1194, 1983)ま
たはλZAPII (Nucleic Acids. Res.,17,9494,1989)、な
どが使用可能であるが、その他のベクターであっても、
適当な宿主内で増殖できるものであれば良い。

【００３０】プラスミドにｃＤＮＡを組み込む方法とし
ては、例えば、サンブルーク(Sambrook, J.)らの方法(M
olecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1.53-1.73, 1989)などが挙
げられる。また、ファージベクターにｃＤＮＡを組み込
む方法としては、例えば、Hyunh,T.V. 等の方法 ( DNA
cloning, A Practical Approach, IRL Press, Oxford,
1, 49, 1985) などが使用可能である。

【００３１】ステップ（ｉｖ）：上記の方法により得ら
れたプラスミドやファージベクターは、これを適当な宿
主たとえば、エシェリヒア コリ(Escherichia Coli)、
バチルススブチリス(Bacillus subtilis) 、サッカロミ
セス セレビシアエ (Saccharomyces cerevisiae) 等に
導入して、これを形質転換できる。プラスミドベクター
で宿主を形質転換する方法としては、例えば、Molecula
rCloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.7
4-1.84 （1989）に記載のエレクトロポーレーション法
あるいはカルシウムクロライド法などが挙げられる。ま
た、ファージ. ベクターにはたとえば、増殖させた大腸
菌にイン. ビトロパッケージング法を用いて導入するこ
とができる。

【００３２】ステップ（ｖ）：上記方法によるｃＤＮＡ
から目的のヒトプロテアソームのサブユニットＰ４０の
ｃＤＮＡを選択するには、例えばラベル化したプローブ
を用いたコロニーハイブリダイゼーション法または、プ
ラークハイブリダイゼーション法 (Molecular Cloning,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.85-1.104or
2.112-2.120, 1989)などが使用可能である。上記のハ
イブリダイゼーションにおけるプローブとして用いるポ
リヌクレオチドとしては、サブユニットＰ４０とハイブ
リダイズする少なくとも１２の塩基からなるポリヌクレ
オチドであれば、何でもよく、例えばサブユニットＰ４
０のアミノ酸配列に基づいて化学合成したオリゴヌクレ
オチド，あるいはプロテアソームの他のコンポーネント
をコードするｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮ
Ａ、およびこれらの部分ＤＮＡ等が使用可能である。以
上のようにして、ヒトプロテアソームのサブユニットＰ
４０をコードするポリヌクレオチドが調製可能となる。

【００３３】（塩基配列の決定）上記に従い得られたｃ
ＤＮＡの塩基配列の決定は、例えば、マキサムーギルバ
ート(Maxiam-Gilbert)法 (Methods in Enzymology, 65,
499-560, 1980) 、ジデオキシ法 (Messing, J. et a
l., Nucleic Acids Research, 9, 309, 1981)、蛍光色
素を用いたTaq サイクルシークエンシング法等(Biotech
niques,7,494-499,1989)により可能である。決定された
ヒトプロテアソームのサブユニットＰ４０のポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列の全部また
は一部を含有するポリヌクレオチドは、配列番号２で表
される。

【００３４】本発明に係る上記ポリヌクレオチドは、配
列番号２の５’末端にＡＴＧが結合していない塩基配列
からなるポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレ
オチドはまた、ヒトプロテアソームのサブユニットＰ４
０のシグナルペプチドの部分または全部をコードする
５’フランキングポリヌクレオチドを含むＤＮＡも含
む。さらに、自然の変異により、または人工的変異によ
り、主たる活性に変化を与えることなく、ポリヌクレオ
チドの構造およびそれから演繹されるポリペプチドの構
造の一部を変異せしめることが可能である。

【００３５】従って、本発明に係るポリヌクレオチド
は、前述のすべてのポリペプチドの相同異性体に相当す
る構造を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含
有することも可能である。さらに、遺伝暗号の縮重に従
い、ポリヌクレオチドから生産されるポリペプチドのア
ミノ酸配列を変えることなくそのポリヌクレオチドの塩
基配列の少なくとも一つの塩基を他の種類の塩基に置換
することができる。従って、本発明のポリヌクレオチド
はまた、遺伝暗号の縮重に基づく置換によって、変換さ
れた塩基配列を含有することも可能である。 この場
合、上記置換により得られた塩基配列より、演繹される
アミノ酸配列は配列番号１のアミノ酸配列と一致する。

【００３６】本発明のヒトプロテアソームサブユニット
Ｐ４０のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含むポリ
ヌクレオチドは、上記の方法の他に、ヒト、ラット、マ
ウスなどのゲノムＤＮＡのライブラリーからのクローニ
ングによっても得ることができる。これら、サブユニッ
トＰ４０をコードするｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡは、
目的により、そのままあるいは制限酵素で切断して使用
することが可能である。

【００３７】本発明により得られたサブユニットＰ４０
のｃＤＮＡの構造は図１に示されるように、９７２残基
からなり、オープンリーディングフレームは1218残基で
あり、３２４アミノ酸をコードする。計算上の分子量
は、37020 であり、等電点は、6.03である。

【００３８】（免疫疾患等の診断用測定方法）上記得ら
れたポリヌクレオチドをプローブとして用いることは、
各種疾患の診断等にも有効な手段を与える。さらにヒト
プロテアソームサブユニットＰ４０の遺伝的多型性を調
べることにより、各種疾患との関連も明らかにでき、ポ
リヌクレオチド診断に有効に使用可能となる。また、本
発明で得られたプロテアソームサブユニットＰ４０の相
補鎖ポリヌクレオチドをプローブとして用いることによ
り、各種ヒト臓器のｍＲＮＡ発現量を例えばノザンブロ
ット解析やＲＴ−ＰＣＲ解析（例えば、Michael A.Inni
s et al., ed.,斎藤隆 監訳、ＰＣＲ実験マニュアル、
ＨＢＪ出版局、１９９１年）を行うことにより定量的に
測定可能となり、上記各種疾患の診断手段を与えるもの
である。

【００３９】さらに本発明において得られたサブユニッ
トＰ４０に対するポリクローナルまたはモノクローナル
抗体を作成することが可能である（例えば、Antibodie
s, ALaboratory Manual, Ed., Harlow et.al., Cold Sp
ring Harbor Laboratory,1988 に記載の方法に準じて可
能である）。なお、モノクローナル抗体を作成するとき
の抗原とするポリペプチドは少なくとも４個のアミノ酸
から成ればよい。得られた抗体を用いた免疫的測定法に
より、各種細胞中の該サブユニットの変化を定量的に測
定する手段が与えられる。

【００４０】（ヒトプロテアソ−ムサブユニットＰ４０
の利用について）本発明において、２６Ｓプロテアソー
ムのサブユニットの一つであるＰ４０が同定されたこと
により、以下の利用方法が考えられる。すなわち、現在
までにわかっている２６Ｓプロテアソームサブユニット
である、Ｓ４、MSS-1, TBP-1, TBP-7 の機能についての
知見から、Ｐ４０の機能および利用を推察することがで
きる。

【００４１】より詳細に述べれば以下のようなる。酵母
については、２６Ｓプロテアソームサブユニットが細胞
周期のG2-M期の進行に必須であることが知られている。
すなわち分裂酵母の染色体分配異常によって細胞周期が
Ｍ期で停止している細胞の変異を相補する遺伝子MTS2
(出芽酵母YTA5、ヒトＳ４のホモローグ）を分離する
と、これが２６Ｓプロテアソームの調節サブユニット群
を構成するATPaseであることが判明した（Nature,366,3
55-357,1993)。一方、Ｇ２ーＭ期の転移異常を示す変異
型出芽酵母の解析からCIM5（ヒトMSS-1 のホモローグ）
とCIM3と名付けた２種の遺伝子を単離したところ、これ
も２６Ｓプロテアソームを構成するATPaseであることが
判明し、またMTS2やCIM5の変異細胞株ではユビキチン依
存性の蛋白分解システムに異常があることがわかり（(N
ature, 366, 358-362, 1993)これらの遺伝子変異に伴う
細胞周期の停止には２６Ｓプロテアソームの蛋白分解機
能の異常が関係していると考えられる。

【００４２】また、ヒトＴＢＰ（Tat binding protein)
ー１と７（ＴＢＰー１、ＴＢＰー７）はヒト免疫不全症
侯群（エイズ）ウイルスＨＩＶ(human immunodeficienc
y virus)転写因子Tat に結合する蛋白である。従ってこ
れらの蛋白は、エイズウイルスの発現調節に密接に関連
する。これらの蛋白と同じ２６Ｓプロテアソ−ム制御因
子群であるヒトサブユニットＰ４０は遺伝子の転写ある
いは、細胞増殖にも関与していることが示唆され、これ
よりＰ４０は、ヒトの転写調節因子の異常による炎症
や、ウィルス感染および代謝異常等の疾患の診断法、治
療法に適用可能となる。

【００４３】さらに、プロテアソームの遺伝子はヒト肝
癌細胞、ヒト腎癌細胞(Cancer Res., 51, 6677-6685, 1
991) 、ヒト白血病細胞などの悪性腫瘍細胞 (Proc. Nat
l.Acad. Sci. U.S.A., 88, 139-143, 1990) において正
常細胞に比較して異常に高く発現し、さらに、これらの
腫瘍細胞の核にプロテアソームが、異常蓄積することが
知られており、従って本発明に係るプロテアソームのサ
ブユニットＰ４０はヒトの癌化のメカニズムの解明や癌
の診断および治療に有効に使用可能となる。

【００４４】さらに、アルツハイマー病患者の脳内には
ユビキチンが異常蓄積し、少なくともこの疾患の原因の
一つに細胞内における蛋白質分解系の異常のあることが
示唆されており、さらにこの疾患の発現にかかわる遺伝
子の機能ドメインにはプロテアーゼ阻害剤がコードされ
ていることが知られており(Nature, 331, 530-532, 198
8)、非リソソーム系の蛋白分解に関与すると考えられる
プロテアソームがアルツハイマー病に本質的に関係して
いることが示唆されている。従って、本発明に係るヒト
プロテアソームのサブユニットＰ４０は、その機能およ
び阻害メカニズムの解明、およびアルツハイマー病と本
酵素との関係や異常の生じるメカニズムの解明、および
治療に有効に使用可能となる。

【００４５】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。 （実施例１） ヒトプロテアソームのサブユニットＰ４
０遺伝子配列の決定 （１）プローブの調製 （１ー１）出発物質の調製 牛赤血球細胞の２６Ｓプロテアソーム制御因子群は以下
に記載の方法に準じて精製可能である。牛血液をヘパリ
ン存在下で収集し、2000xgで１時間遠心し赤血球細胞を
集めた後、得られた沈殿を４倍体積のリン酸緩衝液に懸
濁し、再沈殿することにより洗浄した。 この操作を４
回繰り返した。

【００４６】なお、以下のステップは特に述べない限り
４℃で行った。赤血球細胞に３倍体積の溶解バッファー
（バッファーＨ：20mMTris-HCl, pH7.6, 20mM NaCl, 1m
M EDTA, 1mM βーメルカプトエタノール）を加えて１０
分間撹拌して溶解した。 これを13,000g で６０分間遠
心し、上清を除去して、保存した。沈殿は再度バッファ
ーＨに懸濁し、遠心した後上清を最初の上清に加えた。
この上清画分を20mM Tris-HCl, pH7.6, 20mM NaCl, 0.5
mM MgCl ₂ , 0.1mM EDTA, 5mMβーメルカプトエタノー
ル、10% グリセロールに対して透析処理を行った。

【００４７】（１ー２）ＤＥ５２による調製 上記の透析画分5ml に対し、バッファーＨで平衡化した
ＤＥ５２（Whatman 社）1ml を添加した。該レジンに結
合している蛋白を0.5M NaCl を含むバッファーＨ（What
man 社）で１０分間緩やかに撹拌することにより溶出し
た（レジン：0.5M NaCl/バッファーＨ＝１：１）。 さ
らに少量の0.5M NaCl を含むバッファーＨで溶出し、ヘ
モグロビンを含まない赤血球細胞からの抽出画分を得
た。

【００４８】（１ー３）硫安沈殿 上記得られた画分に38% 飽和になるまで３０分間ゆっく
りと撹拌しながら硫安（硫酸アンモニウム）を添加し
た。さらに３０分間撹拌して沈殿した蛋白を遠心により
集めた。

【００４９】この沈殿をダンス（DOUNCE) ホモジナイザ
ーを用いて大量のバッファーで再懸濁し、さらに遠心し
沈殿蛋白を得た。沈殿は少量のバッファーＨに溶解し、
100mM になるようにNaClを添加し、100mM NaCl/ バッフ
ァーＨに対して１６時間透析した。透析後、不溶物を3
0,000xg、３０分間遠心して除き、上清画分を得た。

【００５０】（１ー４）セファクリルＳ−３００ セファクリルＳ−３００（Pharmacia 社、100x5 cm) カ
ラムをバッファーＨで平衡化後、（１ー３）で得た画分
をアプライし、100mM NaClを含むバッファーＨで溶出
し、11mlずつフラクションを集めた。フラクションのう
ち２０Ｓプロテアーゼ活性促進の高い画分を集めた。
活性画分の測定は（１ー７）に記載した。

【００５１】（１ー５）ＤＥＡＥ Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ （１ー４）の活性画分はバッファーＨで平衡化したＤＥ
ＡＥ Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（EM Separation, 10x2.5 c
m) にアプライし100mM-300mM NaCl/ バッファーＨによ
るリニアグラジエントで溶出し、11mlずつフラクション
を集めた。得られたフラクションのうち、活性画分の高
い画分を集め20mMリン酸緩衝液(pH 7.6)に対して透析を
行った。

【００５２】（１ー６）ハイドロキシアパタイト （１ー５）で得られた画分をバッファーＨで平衡化した
ハイドロキシアパタイト(BioRad 社、7x25cm) にアプラ
イし、リン酸緩衝液(20-200ml)のリニアグラジエントに
より8ml ずつ各フラクションを溶出し集めた。上記各フ
ラクションの活性画分を集め、バッファーＨで透析し、
1mg/mlの濃度になるまでアミコンＰＭ１０メンブランで
濃縮した。

【００５３】（１ー７）活性画分の測定方法 ２６Ｓプロテアソーム制御因子群の活性の測定は、２０
Ｓプロテアソームと制御因子群を混合して２０Ｓプロテ
アソームのペプチダーゼ活性を測定する方法により可能
である。 反応は、5mM Tris-HCl(pH8.0), 5mMジチオス
レイトール(DTT), 60 μM ATP, 10mM MgCl₂ 中、0.3 μ
g ２０Ｓプロテアソームと精製各段階の制御因子群を添
加して最終容積 50 μl で行った。この反応液を、３７
℃で４５分間プレインキュベートし、50mM Tris-HCl(pH
8.0), 5mM βーメルカプトエタノール、50μM ２０Ｓプ
ロテアソーム、Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC ( キモトリプ
シン様活性を測定するための合成基質）に添加し１０分
間インキュベートして、蛍光を測定した。制御因子群に
アクチベート活性があれば、２０Ｓプロテアソームによ
る合成基質の分解活性が上昇することから、活性画分を
同定可能となる。

【００５４】（２）Ｐ４０サブユニットのアミノ酸配列
の決定 （２ー１）Ｐ４０サブユニットの単離 （１）の処理で得られた２６Ｓプロテアソーム制御因子
群蛋白を逆相高速液体クロマトグラフィー(Shodex RS P
ak D4-613 カラム 6x150mm) を使用し以下の条件で分離
した。 分離条件： 流速 0.75ml/min、 温度５０℃、 溶媒Ａ、0.06% トリフルオロ酢酸（TFA)；溶媒Ｂ，0.05
%TFA/70%アセトニトリル/30%水。 64% Ａ，36% Ｂによりカラムを平衡化し、36-70%のＢ溶
媒を用いたグラジエントで溶出した。214nm の波長で検
出し、ピーク画分をスピードバックコンセントレータ
（Savant Instruments社) で乾燥した。

【００５５】（２ー２）電気泳動による分離 上記得られた乾燥サンプルはＳＤＳサンプルバッファー
に溶解し、10% ＳＤＳーＰＡＧＥ（ Antibodies A Labo
ratory Manual ，Harlow David lane 著、ColdSpring H
arbor laboratory ，636-640 ，1988）により分離し
た。電気泳動が終わったゲルは、イモビロン−ＰＶＤＦ
メンブラン（ミリポア社製）にセミドライエレクトロブ
ロティング装置ザルトブロットＩＩ−Ｓ（ザルトリウス
社製）を用いてトランスファーした。蛋白質をブロット
した膜フィルターは、蒸留水で洗浄した後、クマシーブ
ルー染色液（0.2 ％クマシーブリリアントブルーＲ250
を含む40％メタノール、１０％酢酸溶液）で染色後、脱
色液（６０％メタノール溶液）に浸し、振とうしてバッ
クグラウンドを脱色した。このメンブラン上の40kDa の
位置のスポットを切出し、in situ でL-1-tosylamido-2
-phenyl chloromethyl ketone 処理トリプシン(Worthin
gton Enzymes社）、またはLys-C プロテアーゼ（ベーリ
ンガーマンハイム社）により酵素処理した。生成したペ
プチドはHPLC（パーキンエルマー社製）によって分離精
製した（流速50μl/min, 0.1%TFAを溶媒とし0-70% のア
セトニトリルによるグラジエント、RP300 カラム(2.1x1
00mm))。得られたポリペプチドフラグメントのいくつか
をペプチドシークエンサー（パーキンエルマー社製プロ
テインシークエンサー４９７型分析装置）により解析を
行った。

【００５６】以上のアミノ酸解析により次の6 種類のプ
プチドフラグメントのアミノ酸配列を決定した。 フラグメント１(a) ；XVGVLLGSXQK, フラグメント２(b) ；XYHTGPK, フラグメント３(c) ； DLGLPTEAYISVEEV, フラグメント４(d) ；XFEHVTSEIGAEEAEEVGVV, フラグメント５(e) ；DTTVGTLSQRITNQVHGLK, フラグメント６(f); LLQIRGYLEK, （ここで、Ｘは決定できなかったアミノ酸を示す）。

【００５７】（３）ｃＤＮＡプローブの作製 （３ー１）プライマーの合成 得られた以上のペプチドフラグメントの配列から、ホモ
ロジー検索の結果、マウスMov-34蛋白と相同性が高いこ
とが判明した。そこで、マウスMov-34蛋白およびフラグ
メント１から６までの配列をいくつかをの縮重度が低く
なるように組み合わせて検討した。その結果、フラグメ
ント１およびマウスMov-34蛋白からＫＲＶＶＧＶＬＬ
（図１の３３番目から４０番目）、ＫＬＰＩＮＨＱＩ
（図１の２１９番目から２２５番目）の配列を選択し
た。

【００５８】次に、これら選択したポリペプチドに対応
する相補的オリゴヌクレオチドとして、フォワードプラ
イマーとして5'- ＡＡＧＣＧＴＧＴＡＧＴＴＧＧＴＧＴ
ＧＣＴＴ-3' を選び, リバースプライマーとして5'- Ｃ
ＴＧＧＴＧＧＴＴＧＡＴＧＧＧＣＡＧＣＴＴ-3' をＤＮ
Ａ合成機３８０Ｂ（アプライド. バイオシステムズ社
製）で合成した。得られたオリゴヌクレオチドをオリゴ
ヌクレオチド. カートリッジ（アプライド. バイオシス
テムズ社製）を使用して精製した。

【００５９】（３ー２）ＰＣＲ用ｍＲＮＡ調製 ヒト肝細胞癌株HEPG2 （ＡＴＣＣから入手可能）、１０
cmシャーレ１０枚分の細胞をグアニジンチオシアネイト
溶液（sol.D 溶液; 6Mのグアニジンチオシアネート、0.
5%のザルコシル、 10mM のクエン酸ナトリウム（pH7),
100mM の２ーメルカプトエタノール, 0.1%のアンチフォ
ームＡ）中で超音波処理し、変性させた後遠心して上澄
を得た。これに(1/10)量の 2M 酢酸および等量のエタノ
ール、(1/5) 量のクロロフォルムーイソアミルアルコー
ル（49:1 vol/vol) を加え、氷上で１５分間静置して、
10,000g で１５分間４℃にて遠心して沈殿を得た。

【００６０】水相を別の試験管に移し、等量のイソプロ
パノールを添加し、ー２０℃で１時間静置し、10,000g
で２０分間４℃において遠心した。得られた沈殿を so
l.D溶液に溶解し等量のイソプロパノールを添加し、遠
心して沈殿を 75%エタノールで洗浄した。次にこの沈殿
をsol.D 溶液に懸濁し、等量のイソプロパノールを再度
添加し、−２０℃で１時間冷却した後、遠心処理を行っ
た。遠心分離により沈殿を集め、７５％エタノールで洗
浄し、遠心処理後、上清を除去し、これをＤＥＰＣ処理
（ジエチルピロカーボネート0.1%で５時間処理後、オー
トクレーブ処理）した超純水に溶解し、５４mgの全ｍＲ
ＮＡを得た。

【００６１】上記の処理により得られた全ＲＮＡから、
オリゴ（dT）−テックス（タカラ社；oligotex-dT30)を
用いてｍＲＮＡを得た。すなわち全ＲＮＡ１mgに対して
反応緩衝液(10mM Tris-HCl(pH7.5), 1mMエチレンジアミ
ン四酢酸(EDTA), 0.1%SDS ）を加えて全量で1ml とし
た。次に、これにOligotex-dT30 １mlを加え、65℃で５
分間熱変性し、氷上で３分間急冷した。

【００６２】5M NaCl 0.2ml を加え撹拌後、３７℃で１
０分間インキュベートし、15,000rpm １０分間遠心した
後上清を除去した。ペレットを洗浄液（10mM Tris-HCl
(pH7.5), 1mM EDTA, 0.1%SDS, 100mM NaCl)2.5ml に懸
濁し、３７℃で１０分間放置した。これを15,000rpm,１
０分間遠心分離した。得られたペレットをTE緩衝液（10
mM Tris-HCl(pH8.0)、 EDTA 1mM ）1ml に懸濁し、６５
℃、５分間加熱し、ｍＲＮＡをOligotex-dT30 から溶出
した。さらに15,000rpm,１０分間遠心し、上清を回収
し、エタノール沈殿を行うため3M NaOAc（酢酸ナトリウ
ム、pH5.6)100 μl と冷エタノール2ml を加え、ー８０
℃で３０分間放置した。15,000rpm,１０分間遠心分離
し、得られたペレットを７０％エタノールで洗浄し、TE
緩衝液50μl に溶解した。本実施例により、10mgの全Ｒ
ＮＡから４３μg のｍＲＮＡを得ることができた。

【００６３】（３ー３）ＰＣＲ用ｃＤＮＡ合成 得られたｍＲＮＡを鋳型としてpoly dT をプライマーと
して相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した（ファルマシ
ア社製、ｃＤＮＡ合成キット）。 （３ー４）ＰＣＲによるｃＤＮＡプローブの調製 上記（３ー１）で得られたフォワードプライマーととも
にリバースプライマーを用い上記（３ー３）で得られた
ヒト肝細胞癌株HEPG2 のmRNAから合成されたｃＤＮＡを
鋳型としＰＣＲを行った（例えば、Michael A.Innis et
al., ed.,斎藤隆 監訳、ＰＣＲ実験マニュアル、ＨＢ
Ｊ出版局、１９９１年）。各プライマー濃度は20pm/ μ
l, TaqDNA ポリメラーゼは0.025U/ μl 、cDNA 1ng/ μ
l で３０サイクル、パーキンエルマー（シータス）社製
ＤＮＡサーマルサイクラーを用いて増幅し、約６００ｂ
ｐのcDNAプローブを得た。

【００６４】（４）ｃＤＮＡライブラリーの調製 （４ー１）ｃＤＮＡの調製 上記の（３ー３）の方法によって得られたヒト肝細胞癌
HEPG2 のｃDNA 合成キットを用いてｃＤＮＡを得た。よ
り詳しくは、オリゴｄＴプライマーを上記ｍＲＮＡのポ
リＡ部分にアニールさせ、逆転写酵素（Murine Reverse
Transcriptase)により、１本鎖ＤＮＡを合成し、Ｅ.
ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ１により、２本鎖ｃＤＮ
Ａとして合成した。得られた上記ｃＤＮＡの両端にNotI
／EcoR Iアダプターを付加するため、Ｔ４ＤＮＡライゲ
ース処理およびポリヌクレオチドキナーゼ処理を行な
い、両端にEcoR I制限酵素切断部位をもつｃＤＮＡを得
た。

【００６５】（４ー２）インビトロパッケージング反応 得られた両端にEcoR I制限酵素切断部位をもつｃＤＮＡ
をクローニングベクターであるλＺＡＰＩＩ（Stratage
ne社製、EcoRI/CIAP処理λＺＡＰＩＩを含むλＺＡＰＩ
Ｉクローニングキット）のＥｃｏＲＩ間にＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて挿入した。ライゲーション反応溶液 1ml
をGigapackII Gold packaging extract (Stratagene
社）によりパッケージングを行った。パッケージングし
た組換えバクテリオファージを含むパッケージング溶液
と大腸菌 XL-1 Blueを３７℃で１５分間培養した。これ
を 2〜3 mlのトップアガー（４８℃）に加えＮＺＹアガ
ープレートへプレーティングして、３７℃で１夜培養し
た。150mm NZY プレートには約 50,000 個のプラークを
培養し、10枚のプレートにまいて、約 5x10 ⁵ /個のプ
ラークをスクリーニング用に用いた。

【００６６】（５）クローンの単離 （５ー１）スクリーン用フィルタの調製 NZY プレートを４℃で２時間冷却し、このプレート上に
ナイロンフィルター（アマシャム社、ハイボンドＮ＋）
をのせ、２分間放置した。これをはがしてフィルターペ
ーパ上で乾燥し、紫外線照射により固定してスクリーニ
ング用フィルターを調製した。これを用いて以下のハイ
ブリダイゼーションを行った。

【００６７】（５ー２）ハイブリダイゼーションのため
のプローブは（１）で得られたＤＮＡプローブを、ラン
ダムプライムラベリング法（タカラ社；ランダムプライ
マＤＮＡラベリングキットVer.2 ）で³²Ｐ-dCTP （アマ
シャム社）標識したものを使用した。プレハイブリダイ
ゼーション溶液として、５ｘＳＳＣ（NaCl 0.15M, クエ
ン酸ナトリウム（pH7.0)0.015M），５０％フォルムアミ
ド、1 ｘｄｅｎｈａｒｄｔ（ウシ血清アルブミン（Frac
tion V） 0.2%,ポリビニルピロリドン0.2%, Ficoll400
0.2%）溶液、０．１％ＳＤＳ，２００μｇ／ｍｌサーモ
ンスパームＤＮＡを用いた。

【００６８】フィルターは４２℃、３時間、プレハイブ
リダイゼーション溶液でインキュベートし、続いて標識
プローブを加えたハイブリダイゼ−ション溶液（１０％
ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅを含むプレハイブリダ
イゼーション溶液）で４２℃、１６時間、インキュベー
トしてハイブリダイゼーションを行った。以上の操作に
より３個のポジティブクローンが得られた。

【００６９】（６）in vivo excision（インビボきりだ
し）による大腸菌組換え体の作成 （５ー２）で得られたアガープレート中のポジティブZA
P ファージクローンのプラークの中心を竹くしでつき、
500 μl のＳＭ緩衝液と20μl のクロロフォルム混合液
中に溶出し、ボルテックスをした後、一夜放置した。大
腸菌XL-1 Blue 200 μl とポジティブファージクローン
200 μl(>1x10⁵ファージパーティクル）、ヘルパーファ
ージ R408 1 μl(>1x106 pfu/ml) を50mlチューブにて
混合し３７℃、１５分間で、ＺＡＰとヘルパーファージ
を感染させた。5ml の２x ＹＴ培地(10g NaCl, 10g Bac
to Yeast Extract, 16g Bactotryptone/1l) を加え、３
７℃で３時間振とう培養し、大腸菌よりファージミドを
分泌させた。７０℃で２０分間熱処理した後、4000g で
５分間遠心し、菌体を死滅させた。上清のファージミド
を別の試験管に移した。この上清にはpBluescriptSK(-)
粒子が含まれており、この上清200 μl あるいは１００
倍に希釈した溶液20μl とXL-1 Blue 200 μl(OD600 =
1.0) を混合し３７℃で１５分間混合し感染させた。1
〜100 μl の培養液をLB/Ampプレートにプレーティング
した後、３７℃で一晩培養した。表れたコロニーはイン
サートＤＮＡを含む２本鎖のpBluescriptSK(-)をもった
大腸菌（ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ）形質転換体である。３個
のポジティブクローンの大腸菌からプラスミドを QIApr
epPlasmid キット(Qiagen 社) を用いて調製し、制限酵
素 NotI で切断して、そのうち最も長いインサート（約
1.6 ｋｂのインサート）をもつクローンについて以下の
ＤＮＡ塩基配列の決定を行った。

【００７０】（７）塩基配列の決定 上記で得られた1.6 ｋｂのクローンの塩基配列を、パー
キンエルマー社製DNAシークエンサー373Aを用い、Taq
サイクルシークエンシング法により決定した。得られた
サブユニットＰ４０のｃＤＮＡの塩基配列の解析結果を
図１に示す。決定した塩基数は1580残基で、オープンリ
ーディングフレームは972 残基であり、324 個のアミノ
酸がコードされている。計算上の分子量は37020 であ
り、等電点は、6.03である。

【００７１】図２の下線部 a-fは、（２ー２）記載の牛
赤血球より精製したＰ４０から決定されたペプチドシー
クエンスと相同性のある部分を示すものである。下線部
のうち点線部分は、（２ー２）記載のポリペプチドと異
なっている部分を示す。また、黒いボックスで囲んだ部
分は、リジン(K) とグルタミン酸(E) に富んだKEKEモチ
ーフに相当する部分である。

【００７２】実施例２ ヒトプロテアソームサブユニットＰ４０に反応するポリ
クローナル抗体の作製 （１）サブユニットＰ４０の他のサブユニットおよびKE
KEモチーフを含まない部分である１５アミノ酸(MQKDSEK
NMSIKKLWK ）を選択し、このペプチドのＮ末端にシステ
インを付加したペプチドをＦ−Ｍｏｃ法（Solid Phase
Peptide synthesis,A practical approach, IRL Press
,Oxford,1989, Atherton,E., Sheppard,R.C.著）によ
り、パーキンエルマー社製ペプチド合成機４３３Ａを用
いて合成した。合成したポリペプチドの脱保護および精
製は、抗ペプチド抗体実験プロトコール、大海忍 他
著、秀潤社、２５- ４６ページに記載の方法で行った。
なお脱保護後のペプチドの精製はＣ₁₈ＯＤＳカラム（島
津 Syn ProPep カラム、4.6x150mm, 0.1%TFA, 0-80% ア
セトニトリルグラジエント）を用いた。

【００７３】（２）上記ペプチドにヘモシアニン（ＫＬ
Ｈ）をイムジェクトアクチベイテッドイムノグロビンコ
ンジュゲイションキット（PIERCE社）を用いて結合さ
せ、ペプチドとＫＬＨとの複合体を上記のキット中のカ
ラムにより調製した。 （３）初回約１５０μg をフロインドの完全アジュバン
ト（FCA 、キャペル社)とともにエマルジョンにし、ラ
ビット（ジャパニーズホワイト）の背中に免疫した。そ
の後２週間おきに３回不完全アジュバント（FIA)により
同様に免疫した。初回免疫後、７、８、９週目にELISA
法により抗体価を測定し、後抗体価の上昇を確認後全採
血を行なった。 （４） ウサギ血液は、室温で３時間静置後、セパラピ
ッドチューブ（積水化学）にアプライし、3000回転で３
０分間の遠心によりサブユニットＰ４０に対する抗血清
を得た。

【００７４】（５）また、ヒト腎臓から精製したヒト２
０Ｓ（図２Ａレーン１）および２６Ｓプロテアソーム
（図２Ａレーン２）( 特開平5-292964、特開平6-02275
9）をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（Antibodie
s A Laboratory Manual，Harlow David lane 著、Cold
Spring Harbor laboratory ，636-640 ，1988）で分離
し、これをクマシー染色した。その結果、２０Ｓプロテ
アソームは、分子量 20kDa〜30kDa のバンド（図２Aレ
ーン１）として観察され、２６Ｓプロテアソームは２０
Ｓプロテアソームと 30 〜110 kDa の制御因子が結合し
た複合体（図２A レーン２）であることがわかる。

【００７５】また図２Ｂは２６Ｓヒトプロテアソーム制
御因子群のみを精製し、SDS-PAGE後クマシー染色（図２
Ｂレーン３）したものとＰ４０の抗体を用いてイムノブ
ロットした結果を示したものである（図２Ｂレーン
４）。イムノブロットの結果から、Ｐ４０抗体が分子量
約４０ｋＤａのバンドを認識して反応することが明かと
なった。従って、Ｐ４０サブユニットから作成される抗
体を用いれば、ヒトの組織でもＰ４０の発現を解析する
ことが可能である。

【００７６】（実施例３）プロテアソームサブユニット
Ｐ４０のｍＲＮＡの発現解析 プロテアソームサブユニットＰ４０の相補鎖ポリヌクレ
オチドをプローブに用いて、各種ヒト臓器でのｍＲＮＡ
発現量のノザンブロット解析を行った。プローブとして
は、実施例１（４）で得られた組み換え体を使用し、プ
ラスミドＤＮＡを大腸菌XL-1Blueより、ＱＩＡｗｅｌｌ
Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓ
ｔｅｍ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて調製した。このプラスミ
ドを制限酵素Not1（タカラ社）で処理後、２％アゲロー
スゲル電気泳動で分離して、1.６kbp のサブユニットＰ
４０のプローブをＱＩＡ ｑｕｉｃｋ ＧＥＩExtracti
on Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）で調製した。

【００７７】これをマルチプライムＤＮＡ標識システム
（アマシャム社）で³²Ｐ標識してプローブとして用い
た。フィルターは、各種ヒト臓器（心臓、脳、胎盤、
肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓）より抽出したｍＲＮＡ
( ２μg)がブロットされたポジチィブチャージドナイロ
ンフィルター（Human Multi Tissue Northern Blot, ク
ローンテック社）を用いた。プレハイブリダイゼーショ
ン溶液として、５ｘＳＳＣ（NaCl 0.15M, クエン酸ナト
リウム（pH7.0 、0.015M），５０％フォルムアミド、1
ｘｄｅｎｈａｒｄｔ（ウシ血清アルブミン（Fraction
V） 0.2%,ポリビニルピロリドン0.2%,Ficoll400 0.2%）
溶液、０．１％ＳＤＳ，２００μｇ／ｍｌサーモンスパ
ームＤＮＡを用いた。

【００７８】フィルターは４２℃、３時間、プレハイブ
リダイゼーション溶液でインキュベートし、続いて標識
プローブを加えたハイブリダイゼ−ション溶液（１０％
dextran sulfateを含むプレハイブリダイゼーション溶
液）で４２℃、１６時間、インキュベートしてハイブリ
ダイゼーションを行った。フィルターは２ｘＳＳＣ，
０．１％ＳＤＳで４２℃、１５分間で４回洗浄し、さら
に１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで３０分間１回洗浄し
た。オートラジグラフィーは、ＫｏｄａｋＸＡＲ−５フ
ィルムを用いて、−７０℃で行った。

【００７９】オートラジオグラフィーの結果を図３に示
す。プロテアソームサブユニットＰ４０は、主として約
1.8 ｋｂと1.4 ｋｂのｍＲＮＡと反応し、その発現量
は、心臓、骨格筋で高く、脳、胎盤、肺、肝臓、膵臓で
は低い発現であることが明確に定量可能であった。この
際に、他のプロテアソームサブユニットＸ、Ｙについて
も（免疫応答プロテアソームサブユニット、Science, 2
65,1231-1234, 1994）同様の傾向が見られた。従って、
本発明のプローブを用いることにより、Ｐ４０のｍＲＮ
Ａ発現量を測定することが可能である。なお、コントロ
ールプローブとして、EF1 α, G3PDH,β-actinを用いた
結果もあわせてしめす。

【００８０】

【発明の効果】ヒトプロテアソームを構成する個々のサ
ブユニット特にサブユニットＰ４０のポリペプチドのア
ミノ酸配列、およびサブユニットＰ４０のポリペプチド
のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配
列を決定することにより、抗体による免疫反応による方
法、さらに相補的ポリヌクレオチドを利用する方法で、
各種免疫疾患等の診断および治療が可能となる。

【００８１】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３２４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Pro Glu Leu Ala Val Gln Lys Val Val Val His Pro Leu Val Leu 5 10 15 Leu Ser Val Val Asp His Phe Asn Arg Ile Val Lys Val Gly Asn Gln 20 25 30 Lys Arg Val Val Gly Val Leu Leu Gly Ser Trp Gln Lys Lys Val Leu 35 40 45 Asp Val Ser Asn Ser Phe Ala Val Pro Phe Asp Glu Asp Asp Lys Asp 50 55 60 Asp Ser Val Trp Phe Leu Asp His Asp Tyr Leu Glu Asn Met Tyr Gly 65 70 75 80 Met Phe Lys Lys Val Asn Ala Arg Glu Arg Ile Val Gly Trp Tyr His 85 ９０
９５ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｉｌｅ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｍｅｔ １００ １０５
１１０ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ １１５ １２０
１２５ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ａｌａ
Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ １３０ １３５
１４０ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ １４５ １５０
１５５ １６０ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｕ
Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ １６５
１７０ １７５ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｙ
Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｈｒ １８０ １８５
１９０ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ １９５ ２００
２０５ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｈｒ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｈｉｓ ２１０ ２１５
２２０ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｖａｌ
Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｖａｌ ２２５ ２３０
２３５ ２４０ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ
Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｇｌｎ ２４５
２５０ ２５５ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ ２６０ ２６５
２７０ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｌａ
Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ ２７５ ２８０
２８５ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ ２９０ ２９５
３００ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ
Ａｓｐ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ ３０５ ３１０
３１５ ３２０ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ

【００８２】配列番号：２ 配列の長さ：９７２ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ＡＴＧ ＣＣＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＧＣＡ ＧＴＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＧＴＧ
ＧＴＧ ＧＴＣ ＣＡＣ ＣＣＣ ＣＴＧ ＧＴＧ ４５ ＣＴＧ ＣＴＣ ＡＧＴ ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＡＴ ＣＡＴ ＴＴＣ ＡＡＣ
ＣＧＡ ＡＴＣ ＧＴＣ ＡＡＧ ＧＴＴ ＧＧＡ ９０ ＡＡＣ ＣＡＧ ＡＡＧ ＣＧＴ ＧＴＡ ＧＴＴ ＧＧＴ ＧＴＧ ＣＴＴ
ＴＴＧ ＧＧＧ ＴＣＡ ＴＧＧ ＣＡＡ ＡＡＧ １３５ ＡＡＡ ＧＴＡ ＣＴＴ ＧＡＴ ＧＴＡ ＴＣＧ ＡＡＣ ＡＧＴ ＴＴＴ
ＧＣＡ ＧＴＴ ＣＣＴ ＴＴＴ ＧＡＴ ＧＡＡ １８０ ＧＡＴ ＧＡＣ ＡＡＡ ＧＡＣ ＧＡＴ ＴＣＴ ＧＴＡ ＴＧＧ ＴＴＴ
ＴＴＡ ＧＡＣ ＣＡＴ ＧＡＴ ＴＡＴ ＴＴＧ ２２５ ＧＡＡ ＡＡＣ ＡＴＧ ＴＡＴ ＧＧＡ ＡＴＧ ＴＴＴ ＡＡＧ ＡＡＡ
ＧＴＣ ＡＡＴ ＧＣＣ ＡＧＧ ＧＡＡ ＡＧＡ ２７０ ＡＴＡ ＧＴＴ ＧＧＣ ＴＧＧ ＴＡＣ ＣＡＣ ＡＣＡ ＧＧＣ ＣＣＴ
ＡＡＡ ＣＴＡ ＣＡＣ ＡＡＧ ＡＡＴ ＧＡＣ ３１５ ＡＴＴ ＧＣＣ ＡＴＣ ＡＡＣ ＧＡＡ ＣＴＣ ＡＴＧ ＡＡＡ ＡＧＡ
ＴＡＣ ＴＧＴ ＣＣＴ ＡＡＴ ＴＣＣ ＧＴＡ ３６０ ＴＴＧ ＧＴＣ ＡＴＣ ＡＴＴ ＧＡＴ ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＣＧ ＡＡＧ
ＧＡＣ ＣＴＡ ＧＧＧ ＣＴＧ ＣＣＴ ＡＣＡ ４０５ ＧＡＡ ＧＣＧ ＴＡＣ ＡＴＴ ＴＣＡ ＧＴＧ ＧＡＡ ＧＡＡ ＧＡＣ
ＣＡＡ ＧＡＴ ＧＡＴ ＧＧＡ ＡＣＴ ＣＣＡ ４５０ ＡＣＣ ＴＣＧ ＡＡＡ ＡＣＡ ＴＴＴ ＧＡＡ ＣＡＣ ＧＴＧ ＡＣＣ
ＡＧＴ ＧＡＡ ＡＴＴ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＡＧ ４９５ ＧＡＡ ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＡＡ ＧＴＴ ＧＧＡ ＧＴＴ ＧＡＡ ＣＡＣ
ＴＴＧ ＴＴＡ ＣＧＡ ＧＡＴ ＡＴＣ ＡＡＡ ５４０ ＧＡＣ ＡＣＧ ＡＣＧ ＧＴＧ ＧＧＣ ＡＣＴ ＣＴＧ ＴＣＣ ＣＡＧ
ＣＧＧ ＡＴＣ ＡＣＡ ＡＡＣ ＣＡＧ ＧＴＣ ５８５ ＣＡＴ ＧＧＴ ＴＴＧ ＡＡＧ ＧＧＡ ＣＴＧ ＡＡＣ ＴＣＣ ＡＡＧ
ＣＴＴ ＣＴＧ ＧＡＴ ＡＴＣ ＡＧＧ ＡＧＣ ６３０ ＴＡＣ ＣＴＧ ＧＡＡ ＡＡＡ ＧＴＣ ＧＧＣ ＡＣＡ ＧＧＣ ＡＡＧ
ＣＴＧ ＣＣＣ ＡＴＣ ＡＡＣ ＣＡＣ ＣＡＧ ６７５ ＡＴＣ ＡＴＣ ＴＡＣ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＡＣ ＧＴＣ ＴＴＣ
ＡＡＣ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＣＡ ＧＡＴ ＧＴＣ ７２０ ＡＧＣ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＡＧ ＴＴＣ ＧＴＣ ＡＡＧ ＧＣＣ ＴＴＴ
ＴＡＣ ＣＴＧ ＡＡＧ ＡＣＣ ＡＡＴ ＧＡＣ ７６５ ＣＡＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＧＴＡ ＧＴＧ ＴＡＣ ＴＴＧ ＧＣＣ ＴＣＧ
ＣＴＧ ＡＴＣ ＣＧＴ ＴＣＣ ＧＴＧ ＧＴＣ ８１０ ＧＣＣ ＣＴＧ ＣＡＣ ＡＡＣ ＣＴＣ ＡＴＣ ＡＡＣ ＡＡＣ ＡＡＧ
ＡＴＴ ＧＣＣ ＡＡＣ ＣＧＧ ＧＡＴ ＧＣＡ ８５５ ＧＡＧ ＡＡＧ ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＡＧ ＡＡＡ ＧＡＡ
ＧＡＧ ＡＧＣ ＡＡＡ ＡＡＧ ＧＡＴ ＡＧＧ ９００ ＡＡＡ ＧＡＧ ＧＡＣ ＡＡＧ ＧＡＧ ＡＡＡ ＧＡＴ ＡＡＡ ＧＡＴ
ＡＡＧ ＧＡＡ ＡＡＧ ＡＧＴ ＧＡＴ ＧＴＡ ９４５ ＡＡＧ ＡＡＡ ＧＡＧ ＧＡＧ ＡＡＡ ＡＡＧ ＧＡＧ ＡＡＡ ＡＡＧ
９７２

【００８３】

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得られたヒトプロテアソームのサブ
ユニットＰ４０の決定された塩基配列と塩基配列から推
定されたアミノ酸配列（Ｐ４０の１次構造）を示し、下
線は、ペプチドシークエンスの結果得たアミノ酸配列と
相同性のある部分を示す図である。

【図２】［Ａ］は、ヒト２０Ｓプロテアソーム（レーン
１）と２６Ｓプロテアソーム（レーン２）を電気泳動後
クマシー染色したものであり、［Ｂ］は、ヒト２６Ｓ制
御因子群を電気泳動後クマシー染色したもの（レーン
３）と、これをＰ４０の抗体を用いてイムノブロットし
たもの（レーン４）の電気泳動パターンを示す図であ
る。

【図３】ヒトプロテアソームサブユニットＰ４０の相補
鎖ポリヌクレオチドをプローブに用いた各種ヒト臓器で
のｍＲＮＡ発現量のノザンブロット解析の結果を示す図
である。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 分子中に少なくとも、配列番号１に記載
   のアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチド。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のアミノ酸配列をコード
   するポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 分子中に少なくとも、配列番号２に記載
   の塩基配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 変異した、または変異せしめた請求項１
   に記載のポリペプチドのアミノ酸配列であって、該ポリ
   ペプチドを含むプロテアソームがプロテアーゼ活性を実
   質的に有するアミノ酸配列のポリペプチド。
5. 【請求項５】 請求項１に記載のポリペプチドとの相同
   異性体であって、該ポリペプチドを含むプロテアソーム
   がプロテアーゼ活性を実質的に有するアミノ酸配列のポ
   リペプチド。
6. 【請求項６】 変異した、または変異せしめた請求項１
   に記載のポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の相
   同性を有し、該ポリペプチドを含むプロテアソームがプ
   ロテアーゼ活性を実質的に有するアミノ酸配列のポリペ
   プチド。
7. 【請求項７】 請求項４〜６のいずれかに記載のポリペ
   プチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
8. 【請求項８】 請求項１記載のポリペプチドを構成する
   アミノ酸配列であって、連続する少なくとも４のアミノ
   酸からなるポリペプチド。
9. 【請求項９】 請求項２、３または７に記載のポリヌク
   レオチドを構成する塩基配列であって、連続する少なく
   とも１２の塩基からなるポリヌクレオチドまたは相補的
   ポリヌクレオチド。
10. 【請求項１０】 プロテアソームサブユニットＰ４０
    を、該サブユニットとその抗体との特異的反応を利用し
    て測定することを特徴とする疾患診断用キット。
11. 【請求項１１】 プロテアソームサブユニットＰ４０の
    相補鎖ポリヌクレオチドを用いてｍＲＮＡを測定するこ
    とを特徴とする疾患診断用キット。