JPH08308580A - 組換え型ヒトｇｈｒｈレセプター蛋白質、その製造法および用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】ＧＨＲＨレセプターアゴニスト／アンタゴニス
トのスクリーニングに有用なヒトＧＨＲＨレセプター蛋
白質を大量発現する昆虫細胞およびＣＨＯ細胞、および
スクリーニング方法の提供。 【構成】ヒトＧＨＲＨレセプターＤＮＡを導入したバキ
ュロウイルスを感染させた昆虫細胞、該昆虫細胞から製
造される組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質、及び
該組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を含有するＣ
ＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞から製造される組換え型ヒトＧＨ
ＲＨレセプター蛋白質、及びＧＨＲＨレセプターアゴニ
スト／アンタゴニストのスクリーニング方法および該ス
クリーニング用キット、該アゴニストまたはアンタゴニ
ストを含有する医薬組成物。 【効果】ＧＨＲＨレセプターアゴニストまたはアンタゴ
ニストを有利に選択することができるので、巨人症もし
くは末端肥大症等に対する予防・治療剤、などの医薬品
を早期に開発することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＤＮＡ組換え技術を用
いて製造されたヒト成長ホルモン放出ホルモン（以下、
ヒトＧＨＲＨと略称する）レセプター蛋白質およびその
利用法に関する。さらに、本発明は、昆虫細胞に組換え
型バキュロウイルスを感染させることにより製造された
組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を含有する昆虫
細胞、該昆虫細胞から製造される組換え型ヒトＧＨＲＨ
レセプター蛋白質、ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコ
ードするＤＮＡを保持する発現ベクター、該発現ベクタ
ーを含有するＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分、該ＣＨ
Ｏ細胞から製造される組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター
蛋白質に関する。さらに詳しくは、上記昆虫細胞、ＣＨ
Ｏ細胞またはこれらの細胞から製造されるヒトＧＨＲＨ
レセプター蛋白質を用いるＧＨＲＨレセプターアゴニス
ト／アンタゴニストのスクリーニング方法、該スクリー
ニング方法で得られるアゴニストまたはアンタゴニスト
および該アゴニストまたはアンタゴニストを含有する医
薬組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】成長ホルモン放出ホルモン〔growth hor
mone releasing hormone〕（以下、ＧＨＲＨと略称す
る）は、主に視床下部組織で産生され、下垂体前葉に局
在する成長ホルモン分泌細胞（somatotroph）に作用
し、該細胞からの成長ホルモンの分泌を促進させる。そ
の作用機序は、ＧＨＲＨが標的細胞の細胞膜表面に存在
するＧＨＲＨレセプター蛋白質に結合後、Ｇ蛋白質（gu
anine nucleotide protein）を介してアデニレートシク
ラーゼ−サイクリックＡＭＰ−プロテインキナーゼ（ad
enylate cyclase−cyclic AMP−protein kinase）系を
活性化することによることが明らかにされている〔Labr
ie, F. et al., ライフサイエンス（Life Sci.） 33
巻、2229-2233頁、1983年〕。ＧＨＲＨは初め、末端肥
大症を呈した膵腫瘍から単離され、1982年にそのアミノ
酸配列が決定された〔Guillemin, R. et al., サイエン
ス（Science）218巻、585-587頁、1982年〕。ヒトＧＨ
ＲＨは、４４アミノ酸からなり消化管ペプチドであるグ
ルカゴン−セクレチンファミリーとアミノ酸配列に類似
性が存在する。また、ＧＨＲＨには種族差があり、ヒ
ト、ラット、ブタでは、アミノ酸配列が同一ではない。
一方、ＧＨＲＨにより分泌が刺激される成長ホルモン
は、ヒトでは１９１アミノ酸残基からなる、分子内にＳ
−Ｓ結合を２つ有する蛋白質で、プロラクチンや胎盤性
ラクトゲンと構造類似性が認められている。成長ホルモ
ンは極めて重要な同化ホルモンで蛋白合成の全ての段階
（細胞内へのアミノ酸摂取、リボソーム量、ｍＲＮＡ
量、酵素量）を促進増加させる。成長ホルモン欠損状態
では骨の発育が遅れたり、筋肉や体液量が減少し、正常
な発育ができなくなる。また、適正な新陳代謝ができな
いことから、老化が早まることも認められている。逆
に、成長ホルモン過剰状態では同化作用が亢進し、巨人
症や末端肥大症を引き起こす。このように成長ホルモン
の作用は多彩で、その分泌調節が適正に行われることが
正常な発育や健康体の維持のために不可欠である。

【０００３】ＧＨＲＨは、下垂体での成長ホルモンの産
生と分泌を促進することから、臨床的には、成長ホルモ
ンの低下に対してＧＨＲＨが非経口的に投与されてい
る。一般に、内因性生理活性物質に対する拮抗薬（アン
タゴニスト）や作動薬（アゴニスト）は、内因性生理活
性物質の異常に起因するさまざまな病気に対する医薬と
して利用することができる。これらアンタゴニストやア
ゴニストを開発しようとするとき、一般には最初に膨大
な数の化合物、発酵生産物、天然物などから特定のレセ
プター蛋白質に親和性を持つ物質をスクリーニングし
て、リード化合物を選び出すことが行われている。ＧＨ
ＲＨレセプター蛋白質としては、ウシあるいはブタの下
垂体膜画分が用いられ得るが、動物種が異なるため、こ
れらのＧＨＲＨレセプター蛋白質を用いたスクリーニン
グで選択された化合物がヒトにも同様に効くという保証
はない。最近、ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質ｃＤＮＡ
がクローニングされ、ＣＯＳ細胞での発現〔Gaylinn,
B. D. et al., モレキュラー・エンドクリノロジー（Mo
l. Endocrinol.） 7巻、77-84頁、1993年、ＥＰ５９１
６９７〕や、ヒト・腎２９３細胞での発現〔Mayo, K.
E., モレキュラー・エンドクリノロジー（Mol. Endocri
nol.） 6巻、1734-1744頁、1992年、ＷＯ９４／０７９
１５〕が報告されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ＣＯＳ細胞の発現系は
一過性の発現であるため、スクリーニングに用いるため
のレセプター蛋白質標品を得るためには不十分であっ
た。また、腎２９３細胞は、癌ウイルスによる形質転換
細胞であるため、大量に取り扱う場合の安全性に問題が
あった。さらに、今までのＧＨＲＨアゴニストやアンタ
ゴニストのスクリーニング方法は、ＧＨＲＨの性質から
大量処理に不向きな方法が取られていた。すなわち、Ｇ
ＨＲＨは４４個のアミノ酸残基からなる比較的分子量の
大きいペプチドホルモンであるため、結合実験の際の反
応容器、ピペット、ガラスフィルターなどに非常に吸着
しやすく、大量処理に適さない遠心法や、生細胞に対す
る結合実験のみが行われていた。これらのことから、よ
り実用的なヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質の産生方法お
よびそれを用いた効率的なスクリーニング方法の確立が
望まれていた。ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を使用し
てＧＨＲＨレセプターのアゴニスト／アンタゴニストを
スクリーニングすることができれば、実験動物を用いる
ことの欠点（例えば、種が異なることにより、ヒトに対
して効果を発揮できない化合物が得られる可能性がある
ことなど）を克服することができ、ヒトに対して有効な
医薬の開発が効率よく行えるようになると期待される。
しかしながら、ＧＨＲＨレセプターアゴニスト／アンタ
ゴニストのスクリーニングに有効なヒトＧＨＲＨレセプ
ター蛋白質を高発現する実用的な細胞については、未だ
報告されていない。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題に鑑み、ヒトに有効なＧＨＲＨレセプターアゴニスト
／アンタゴニストをスクリーニングする方法につき鋭意
研究した結果、バキュロウイルスにヒトＧＨＲＨレセプ
ター蛋白質をコードするＤＮＡを導入し、これを昆虫細
胞に感染させることにより組換え型ヒトＧＨＲＨレセプ
ター蛋白質を高発現する昆虫細胞を製造することに成功
し、該昆虫細胞または該昆虫細胞から製造される組換え
型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を用いて極めて効率よ
くスクリーニングする方法を作成した。また、ヒトＧＨ
ＲＨレセプター蛋白質を高発現するＣＨＯ細胞株を製造
することに成功し、そして該ＣＨＯ細胞株または該ＣＨ
Ｏ細胞株から製造される組換え型ヒトＧＨＲＨレセプタ
ー蛋白質を用いることにより、効率よく正確にＧＨＲＨ
レセプター蛋白質アゴニスト／アンタゴニストをスクリ
ーニングできることを見いだした。さらに、本発明者ら
は、ＧＨＲＨレセプターアゴニスト／アンタゴニストの
スクリーニング方法の至適条件を明らかにすることに成
功した。本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに
研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は、 （１）ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードするＤＮ
Ａを導入したバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞、 （２）ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードするＤＮ
Ａを導入したバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞を
ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードするＤＮＡの発
現が可能な条件下で培養することにより製造されること
を特徴とする組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を
含有する昆虫細胞またはその細胞膜画分、 （３）第（２）項記載の昆虫細胞から単離される天然型
のヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質と実質的に同質の活性
を有する組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質、その
部分ペプチドまたはそれらの塩、 （４）ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードするＤＮ
Ａを導入したバキュロウイルスを昆虫細胞に感染させ、
該ＤＮＡの発現が可能な条件下で昆虫細胞を培養するこ
とを特徴とする第（３）項記載のヒトＧＨＲＨレセプタ
ー蛋白質またはその塩の製造法、 （５）第（２）項記載の組換え型ヒトＧＨＲＨレセプタ
ー蛋白質を含有する昆虫細胞またはその細胞膜画分を用
いることを特徴とするＧＨＲＨレセプターアゴニストま
たはアンタゴニストのスクリーニング方法、

【０００７】（６）第（３）項記載の組換え型ヒトＧＨ
ＲＨレセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩
を用いることを特徴とするＧＨＲＨレセプターアゴニス
トまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、 （７）第（２）項記載の組換え型ヒトＧＨＲＨレセプタ
ー蛋白質を含有する昆虫細胞またはその細胞膜画分を含
有することを特徴とするＧＨＲＨレセプター蛋白質アゴ
ニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用キッ
ト、 （８）第（３）項記載の組換え型ヒトＧＨＲＨレセプタ
ー蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩を含有するこ
とを特徴とするＧＨＲＨレセプターアゴニストまたはア
ンタゴニストのスクリーニング用キット、 （９）ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードするＤＮ
Ａを保持することを特徴とするｐＡＣ０３で標示される
ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質発現ベクター、 （１０）ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードするＤ
ＮＡを保持するｐＡＣ０３で標示されるヒトＧＨＲＨレ
セプター蛋白質発現ベクターを含有することを特徴とす
るＣＨＯ細胞、 （１１）ＣＨＯ細胞がジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を欠
損しているＣＨＯ細胞である第（１０）項記載のＣＨＯ
細胞、 （１２）第（１０）項記載のＣＨＯ細胞を、ヒトＧＨＲ
Ｈレセプター蛋白質をコードするＤＮＡの発現が可能な
条件下で培養することを特徴とする組換え型ヒトＧＨＲ
Ｈレセプター蛋白質の製造法、

【０００８】（１３）第（１０）項記載のＣＨＯ細胞
を、ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードするＤＮＡ
の発現が可能な条件下で培養することによって製造され
ることを特徴とする組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋
白質を含有するＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分、 （１４）第（１３）項記載のＣＨＯ細胞から単離され得
る天然型のヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質と実質的に同
質の活性を有する組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白
質、その部分ペプチドまたはそれらの塩、 （１５）第（１３）項記載のＣＨＯ細胞またはその細胞
膜画分を用いることを特徴とするＧＨＲＨレセプターア
ゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、 （１６）第（１４）項記載の組換え型ヒトＧＨＲＨレセ
プター蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩を用
いることを特徴とするＧＨＲＨレセプターアゴニストま
たはアンタゴニストのスクリーニング方法、 （１７）第（１３）項記載のＣＨＯ細胞またはその細胞
膜画分を含有することを特徴とするＧＨＲＨレセプター
アゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用キ
ット、

【０００９】（１８）第（１４）項記載の組換え型ヒト
ＧＨＲＨレセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはそ
らの塩を含有することを特徴とするＧＨＲＨレセプター
アゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用キ
ット、 （１９）第（５）項、第（６）項、第（１５）項もしく
は第（１６）項記載のスクリーニング方法または第
（７）項、第（８）項、第（１７）項もしくは第（１
８）項記載のスクリーニング用キットを用いて得られる
ＧＨＲＨレセプターアゴニストまたはその塩、 （２０）第（５）項、第（６）項、第（１５）項もしく
は第（１６）項記載のスクリーニング方法または第
（７）項、第（８）項、第（１７）項もしくは第（１
８）項記載のスクリーニング用キットを用いて得られる
ＧＨＲＨレセプターアンタゴニストまたはその塩、 （２１）第（１９）項記載のＧＨＲＨレセプターアゴニ
ストまたはその塩を含有することを特徴とする医薬組成
物、および （２２）第（２０）項記載のＧＨＲＨレセプターアンタ
ゴニストまたはその塩を含有することを特徴とする医薬
組成物を提供する。

【００１０】より具体的には、本発明は、 （２３）ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードするＤ
ＮＡが配列番号：１で表される塩基配列を有するＤＮＡ
である第（１）項記載の昆虫細胞、 （２４）ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードするＤ
ＮＡを導入したバキュロウイルスが核多角体病ウイルス
（nuclear polyhedrosis virus；ＮＰＶ）である第
（１）項記載の昆虫細胞、 （２５）核多角体病ウイルス（nuclear polyhedrosis v
irus；ＮＰＶ）がキンウワバ亜科のAutographa califor
nica ＮＰＶ（ＡｃＮＰＶ）またはカイコのBombyx mori
ＮＰＶ（ＢｍＮＰＶ）である第（２４）項記載の昆虫
細胞、 （２６）ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードするＤ
ＮＡを導入したバキュロウイルスがｖＢａｃ１５で標示
される組換えウイルスである第（１）項記載の昆虫細
胞、 （２７）昆虫細胞が、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は夜
盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cel
l；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細
胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh Five^TM細胞（以
下、ＴＭは登録商標を示す。）、Mamestra brassicae由
来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞であり、ウ
イルスがＢｍＮＰＶの場合は蚕由来株化細胞（Bombyx m
ori N；ＢｍＮ）またはカイコ幼虫個体である第（１）
項記載の昆虫細胞、 （２８）Ｓｆ細胞がＳｆ９細胞またはＳｆ２１細胞、好
ましくはＳｆ２１細胞である第（２７）項記載の昆虫細
胞、 （２９）昆虫細胞が、ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を
コードするＤＮＡを導入したｖＢａｃ１５で標示される
組換えバキュロウイルスを感染したＳｆ２１細胞である
第（１）項記載の昆虫細胞、

【００１１】（３０）ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を
コードするＤＮＡが配列番号：１で表される塩基配列を
有するＤＮＡである第（１）項または第（２）項記載の
昆虫細胞、 （３１）組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質が、配
列番号：２で表されるアミノ酸配列、配列番号：２で表
わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましく
は、１個以上４０個以下）のアミノ酸が欠失したアミノ
酸配列、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列に１ま
たは２個以上（好ましくは、１個以上４０個以下）のア
ミノ酸が付加したアミノ酸配列、あるいは配列番号：２
で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ま
しくは、１個以上４０個以下）のアミノ酸が他のアミノ
酸で置換されたアミノ酸配列を含有する蛋白質である第
（３）項記載の組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白
質、その部分ペプチドまたはそれらの塩、 （３２）活性がリガンド結合活性である第（３）項記載
の組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質またはその
塩、 （３３）ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードするＤ
ＮＡが配列番号：１で表される塩基配列を有するＤＮＡ
である第（４）項記載の製造法、 （３４）ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードするＤ
ＮＡが配列番号：１で表される塩基配列を有するＤＮＡ
である第（９）項記載の発現ベクター、 （３５）ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードするＤ
ＮＡが配列番号：１で表される塩基配列を有するもので
ある第（１２）項記載の製造法、 （３６）ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードするＤ
ＮＡが配列番号：１で表される塩基配列を有するもので
ある第（１３）項記載のＣＨＯ細胞またはその細胞膜画
分、

【００１２】（３７）組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター
蛋白質が、配列番号：２で表されるアミノ酸配列、配列
番号：２で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以
上のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：２で
表わされるアミノ酸配列に１または２個以上のアミノ酸
が付加したアミノ酸配列、あるいは配列番号：２で表わ
されるアミノ酸配列中の１または２個以上のアミノ酸が
他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有する蛋白
質である第（１４）項記載の組換え型ヒトＧＨＲＨレセ
プター蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩、 （３８）ＣＨＯ細胞がＣＨＯ／ＨＧ７−５、ＣＨＯ／Ｈ
Ｇ９−３またはＣＨＯ／ＨＧ１３−３で標示されるＣＨ
Ｏ細胞である第（１０）項または第（１３）項記載のＣ
ＨＯ細胞またはその細胞膜画分、 （３９）（ｉ）標識したＧＨＲＨを、第（２）項記載の
昆虫細胞もしくはその細胞膜画分に接触させた場合と、
（ii）標識したＧＨＲＨおよび試験化合物を、第（２）
項記載の昆虫細胞もしくはその細胞膜画分に接触させた
場合における、該昆虫細胞もしくはその細胞膜画分に対
する標識したＧＨＲＨの結合量を測定し、比較すること
を特徴とする第（５）項記載のＧＨＲＨレセプターアゴ
ニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、

【００１３】（４０）（ｉ）ＧＨＲＨを、第（２）項記
載の昆虫細胞もしくはその細胞膜画分に接触させた場合
と、（ii）ＧＨＲＨおよび試験化合物を、第（２）項記
載の昆虫細胞もしくはその細胞膜画分に接触させた場合
における、組換え型ヒトＧＨＲＨレセプターを介した細
胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリ
ン遊離、細胞内Ｃａ²⁺濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生
成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細
胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの
活性化、ｐＨの低下、細胞遊走活性、ホルモンの分泌、
Ｇ蛋白質の活性化、細胞増殖などを促進する活性または
抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とす
る第（５）項記載のＧＨＲＨレセプターアゴニストまた
はアンタゴニストのスクリーニング方法、 （４１）（ｉ）標識したＧＨＲＨを、第（３）項記載の
組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質、その部分ペプ
チドもしくはその塩に接触させた場合と、（ii）標識し
たＧＨＲＨおよび試験化合物を、第（３）項記載の組換
え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質、その部分ペプチド
もしくはその塩に接触させた場合における、該組換え型
ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質、その部分ペプチドもし
くはその塩に対する標識したＧＨＲＨの結合量を測定
し、比較することを特徴とする第（６）記載のＧＨＲＨ
レセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリー
ニング方法、 （４２）（ｉ）標識したＧＨＲＨを、第（１３）項記載
のＣＨＯ細胞もしくはその細胞膜画分に接触させた場合
と、（ii）標識したＧＨＲＨおよび試験化合物を、第
（１３）項記載のＣＨＯ細胞もしくはその細胞膜画分に
接触させた場合における、該ＣＨＯ細胞もしくはその細
胞膜画分に対する標識したＧＨＲＨの結合量を測定し、
比較することを特徴とする第（１５）項記載のＧＨＲＨ
レセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリー
ニング方法、

【００１４】（４３）（ｉ）ＧＨＲＨを、第（１３）項
記載のＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分に接触させた場
合と、（ii）ＧＨＲＨおよび試験化合物を、第（１２）
項記載のＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分に接触させた
場合における、組換え型ヒトＧＨＲＨレセプターを介し
た細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチル
コリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ
生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、
細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ
の活性化、ｐＨの低下、細胞遊走活性、ホルモンの分
泌、Ｇ蛋白質の活性化、細胞増殖などを促進する活性ま
たは抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴
とする第（１５）項記載のＧＨＲＨレセプターアゴニス
トまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、 （４４）（ｉ）標識したＧＨＲＨを、第（１４）項記載
の組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質、その部分ペ
プチドもしくはその塩に接触させた場合と、（ii）標識
したＧＨＲＨおよび試験化合物を、第（１４）項記載の
組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質、その部分ペプ
チドもしくはその塩に接触させた場合における、該組換
え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質、その部分ペプチド
もしくはその塩に対する標識したＧＨＲＨの結合量を測
定し、比較することを特徴とする第（１６）記載のＧＨ
ＲＨレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスク
リーニング方法、 （４５）医薬組成物が小人症、骨粗鬆症、腎不全、慢性
炎症性疾患および貧血に対する予防・治療剤、下垂体の
機能検査薬、または老化防止薬である第（２１）項記載
の医薬組成物、および （４６）医薬組成物が巨人症もしくは末端肥大症に対す
る予防・治療剤である第（２２）項記載の医薬組成物を
提供する。

【００１５】本発明の昆虫細胞は、ヒトＧＨＲＨレセプ
ター蛋白質をコードするＤＮＡを導入したバキュロウイ
ルスを感染させた昆虫細胞である。本発明において、ヒ
トＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードするＤＮＡを導入
したバキュロウイルスを作製する場合、ヒトＧＨＲＨレ
セプター蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えば、
ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡや
ゲノムＤＮＡなどが用いられているが、ヒトＧＨＲＨレ
セプター蛋白質またはヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質と
実質的に同等のリガンド結合活性を有する部分ペプチド
をコードする塩基配列を有するものであれば、必ずしも
これに制約されるものではない。例えば、公知のヒトＧ
ＨＲＨレセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡやゲノム
ＤＮＡなどを用いることができるが、合成ＤＮＡなどで
あってもよい。具体的には、配列番号：２で表わされる
アミノ酸配列を有するヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を
コードするＤＮＡが挙げられ、具体的には、配列番号：
１で表わされる塩基配列を有するｃＤＮＡ〔図１〕など
が挙げられる。これらのＤＮＡは、それ自体公知の遺伝
子工学的手法を用いてクローニングすることができる
し、あるいはヌクレオチド合成装置を用いて製造するこ
ともできる。例えば、後述する参考例１の方法あるいは
それに準ずる方法に従ってクローニングすることもでき
る。

【００１６】ヒトＧＨＲＨレセプターをコードするＤＮ
Ａ断片を昆虫細胞に導入し、それらを効率よく発現させ
るためには、該ＤＮＡ断片を昆虫細胞を宿主とするバキ
ュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（nuclear po
lyhedrosis virus；ＮＰＶ）などのポリヘドリンプロモ
ーターの下流に組み込むのが好ましい。ベクターとして
は、キンウワバ亜科のAutographa californica ＮＰＶ
（ＡｃＮＰＶ）とカイコのBombyx mori ＮＰＶ（ＢｍＮ
ＰＶ）などのウイルスが用いられる。バキュロウイルス
は、環状の２本鎖ＤＮＡ（１３０ｋｂ）を持ち、脊椎動
物及び植物にはまったく感染性を示さない。ウイルスＤ
ＮＡは１３０ｋｂもあるので、発現させたいＤＮＡ断片
を直接に多角体プロモーターの下流に挿入するのは不可
能である。そこで、実際にはまずプロモーター部分を含
むポリヘドリン遺伝子部分をウイルスから切り出し、こ
れをｐＵＣ１８などの大腸菌を宿主とするベクターに組
み込みトランスファーベクターを作製する。次いで、目
的とするＤＮＡ断片をトランスファーベクターのポリヘ
ドリンプロモーターの下流へ挿入し、これをバキュロウ
イルスＤＮＡと共に昆虫細胞に同時に感染させて培養
し、昆虫細胞の中で相同組換えをおこさせて組換えバキ
ュロウイルスを得る。組換えウイルスは、多角体を作る
かわりに新しく導入された目的産物を作るようになる。

【００１７】昆虫細胞を宿主細胞とするバキュロウイル
スとしては、例えば、核多角体病ウイルス（nuclear po
lyhedrosis virus；ＮＰＶ）などが挙げられる。昆虫細
胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、
ヨトウガの幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda
cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ
１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh Five^TM細胞、
Mamestrabrassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由
来の細胞などが挙げられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場
合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N；ＢｍＮ細胞）
などの他、カイコ幼虫個体などが挙げられる。該Ｓｆ細
胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓ
ｆ２１細胞〔以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィトロ
（In Vitro）,13, 213-217,(1977)〕などが挙げられ
る。バキュロウイルスの昆虫細胞への感染方法として
は、ｍ.ｏ.ｉ.（multiplicity of infection）が約０.
１〜１００、望ましくは約１〜１０になるようにバキュ
ロウィルスを昆虫細胞の培養液に添加する方法が用いら
れる。宿主としては、ウイルスがＡｃＮＰＶの時は、ヨ
トウガの幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda ce
ll；Ｓｆ細胞）を用いるのが望ましい。特に、Ｓｆ９細
胞やＳｆ２１細胞〔Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィトロ
（In Vitro）,13, 213-217,(1977)〕は、静置培養と浮
遊培養ができ、また、これまでに多くの研究に使用され
ており、宿主細胞としての情報が蓄積していることから
好適である。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株
化細胞（Bombyx mori N；ＢｍＮ細胞）などを用いるの
が好ましい。

【００１８】本発明の組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター
を含有する昆虫細胞を製造するには、前述のヒトＧＨＲ
ＨレセプターをコードするＤＮＡを昆虫細胞で発現させ
ることにより行うことができる。バキュロウイルスおよ
び昆虫細胞を用いたヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質の発
現系としては、例えば、市販されているもの（例えば、
Invitrogen社 MAXBAC^TMなど）を使用することができ、
手段についても、市販品に添付されている実験書や文献
〔バイオテクノロジー（Bio／Technology)，6，47−5
5，(1988)〕などに記載されているものを採用すること
ができる。発現したレセプター蛋白質の量と質の検査
は、それ自体公知の方法で行うことができる。例えば、
文献〔Nambi,P.ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー（J. Biol. Chem.)，267，19555−1
9559，(1992)〕に記載の方法に従って行うことができ
る。本発明のヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードす
るＤＮＡを導入したバキュロウイルスを感染させた昆虫
細胞の具体例としては、例えば、後述する実施例１で得
られるｖＢａｃ１５で標示される組換え体ウイルスを感
染させた昆虫細胞などが挙げられる。以下に、本発明の
ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードするＤＮＡを導
入したバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞から、組
換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を含有する昆虫細
胞を製造する方法を具体的に説明する。

【００１９】本発明の組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター
蛋白質を含有する昆虫細胞は、前述のヒトＧＨＲＨレセ
プター蛋白質をコードするＤＮＡを導入したバキュロウ
イルスを感染させた昆虫細胞を、ヒトＧＨＲＨレセプタ
ー蛋白質をコードするＤＮＡの発現が可能な条件下で培
養することにより製造され得る。すなわち、ヒトＧＨＲ
Ｈレセプター蛋白質をコードするＤＮＡを導入したバキ
ュロウイルスを感染させた昆虫細胞を静地培養または浮
遊培養することにより、該細胞にヒトＧＨＲＨレセプタ
ー蛋白質を大量発現させることができる。昆虫細胞を培
養するための培地としては、グレース昆虫細胞用培地サ
プリメント入り、ＩＰＬ−４１昆虫細胞用培地、Ｓｆ−
９００昆虫細胞用無血清培地、ＴＣ−１００昆虫細胞用
培地（いずれも GIBCO-BRL社）などが挙げられる。また
これらの培地に約５％〜２０％の牛胎児血清、ペニシリ
ンＧ、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンなどの抗生
物質、約０.１％のプルロニックＦ−６８（GIBCO-BRL
社）などを添加してもよい。培養は約２０℃から３０
℃、望ましくは約２６℃から２７℃で、約１２時間から
１４４時間、望ましくは約２４時間から９６時間行い、
シャーレやフラスコの中で静置してもよいし、スピナー
フラスコを用いて約５０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍで撹拌し
てもよい。以上の方法で製造された昆虫細胞は、天然の
ＧＨＲＨレセプター蛋白質を含有する組織（例えば、ヒ
ト下垂体前葉など）に比べて、膜蛋白質１ｍｇ当たり同
等以上（例えば、約１００〜３００倍、好ましくは約１
００倍〜２００倍）のレセプター蛋白質活性（例えば、
リガンド結合活性など）を有するものである。

【００２０】次に、本発明の組換え型ヒトＧＨＲＨレセ
プター蛋白質を含有する昆虫細胞の細胞膜画分として
は、前述した組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を
含有する昆虫細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で
得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞
の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザ
ーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリ
トロン（Kinematica社）による破砕、超音波による破
砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズ
ルから噴出させることによる破砕などが用いられる。細
胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法
などの遠心力による画分法が主として用いられる。例え
ば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３,０００ｒｐ
ｍ）で短時間（約１〜１０分）遠心し、上清をさらに高
速（１５,０００ｒｐｍ〜３０,０００ｒｐｍ）で３０分
〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画
分中には、発現した組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋
白質と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多
く含まれる。該組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質
を含有する昆虫細胞やその膜画分中のレセプター蛋白質
濃度は、１細胞当たり１０³〜１０⁷分子または膜蛋白１
ｍｇ当たり０.１pmole〜１nmoleであり、発現量が多い
ほど比活性が高くなり、高感度なスクリーニング系の構
築が可能になるばかりでなく、単一ロットで大量の試料
を測定できるようになる。

【００２１】次に、本発明のＣＨＯ細胞は、ヒトＧＨＲ
Ｈレセプター蛋白質をコードするＤＮＡを保持するヒト
ＧＨＲＨレセプター蛋白質発現ベクターを含有するＣＨ
Ｏ細胞である。そして、このＣＨＯ細胞をヒトＧＨＲＨ
レセプター蛋白質をコードするＤＮＡの発現が可能な条
件下で培養することによって、組換え型ヒトＧＨＲＨレ
セプター蛋白質を含有するＣＨＯ細胞を製造することが
できる。本発明のヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコー
ドするＤＮＡを保持するヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質
発現ベクターを含有するＣＨＯ細胞を製造するために
は、まず、ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質発現ベクター
を作製する。発現ベクターとしては、例えば、ｐＡＫＫ
Ｏ−１１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳ
Ｖ、ｐｃＤＮＡＩＮｅｏなどが用いられ、なかでもｐＡ
ＫＫＯ−１１１などが好ましい。プロモーターとして
は、宿主となる細胞で効率よく機能するものであれば何
でもよく、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモータ
ー、ＨＳＶ-ＴＫプロモーター、ＳＲαプロモーター、
ＲＳＶプロモーターなどが挙げられ、なかでもＣＭＶプ
ロモーター、ＳＲαプロモーター、ＲＳＶプロモーター
などが好ましく、特にＳＲαプロモーターが好ましい。
発現ベクターには、以上の他にエンハンサー、スプライ
シングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー等
を含有しているものを用いるのが好ましい。選択マーカ
ーとしては、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ＤＨＦＲと
略称する場合がある）遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子
〔Ｇ４１８耐性〕などが挙げられ、なかでもＤＨＦＲ遺
伝子などが好ましい。特に、ＤＨＦＲ遺伝子が欠損して
いるＣＨＯ細胞を用いて、ＤＨＦＲ遺伝子を選択マーカ
ーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によっ
ても選択できる。

【００２２】本発明のヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を
コードするＤＮＡを保持する発現ベクターとしては、具
体的には、ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードする
ＤＮＡの上流に前記のプロモーター（特に、ＣＭＶプロ
モーター、ＳＲαプロモーター、ＲＳＶプロモーターな
ど）を挿入し、ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコード
するＤＮＡの下流にポリＡ付加シグナルを挿入し、その
下流にＤＨＦＲ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などの
選択マーカーを挿入し、さらにその下流にアンピシリン
耐性遺伝子を挿入したものなどが好ましい。より具体的
には、例えばヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードす
るＤＮＡの上流にＳＲαプロモーターを挿入し、ヒトＧ
ＨＲＨレセプター蛋白質をコードするＤＮＡの下流にポ
リＡ付加シグナルを挿入し、その下流にＤＨＦＲ遺伝子
を挿入し、さらにその下流にアンピシリン耐性遺伝子を
挿入したｐＡＣ０３で標示される発現ベクター〔図
６〕、ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードするＤＮ
Ａの上流にＣＭＶプロモーターを挿入し、ヒトＧＨＲＨ
レセプター蛋白質をコードするＤＮＡの下流にポリＡ付
加シグナルを挿入し、その下流にネオマイシン耐性遺伝
子を挿入し、さらにその下流にアンピシリン耐性遺伝子
を挿入したｐＡＣ０３−ＣＭＶで標示される発現ベクタ
ー〔図７〕、ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードす
るＤＮＡの上流にＲＳＶプロモーターを挿入し、ヒトＧ
ＨＲＨレセプター蛋白質をコードするＤＮＡの下流にポ
リＡ付加シグナルを挿入し、その下流にネオマイシン耐
性遺伝子を挿入し、さらにその下流にアンピシリン耐性
遺伝子を挿入したｐＡＣ０３−ＲＳＶで標示される発現
ベクター〔図８〕などが好ましく、なかでもｐＡＣ０３
で標示される発現ベクター〔図６〕などが好適である。

【００２３】このようにして作製したヒトＧＨＲＨレセ
プター蛋白質をコードするＤＮＡを保持する発現ベクタ
ーをＣＨＯに導入することによって、ヒトＧＨＲＨレセ
プター蛋白質をコードするＤＮＡを高発現できるＣＨＯ
細胞を作製することができる。宿主細胞としては、ＣＨ
Ｏ細胞に限らず、他の動物細胞を用いることができる。
例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｌ細胞、ミエロー
マ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞、Ｓｐ
-２／Ｏ細胞などが挙げられる。これらの宿主細胞のな
かでも、ＣＨＯ細胞、Ｓｐ-２／Ｏ細胞などが好まし
く、特にＣＨＯ細胞〔ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ント・オブ・メディソン（Ｊ．ＥＸＰ．Ｍｅｄ．）、１
０８、９４５（１９５８）〕などが好適である。さら
に、ＣＨＯ細胞のなかでも、特にＤＨＦＲ遺伝子が欠損
しているＣＨＯ細胞（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞
と略称する場合がある）〔プロシージングス・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエ
スエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ）、７７、４２１６−４２２０（１９８０）〕、ＣＨ
Ｏ Ｋ−１細胞〔プロシージングス・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、
６０、１２７５（１９６８）〕などが好ましい。特に、
発現ベクター中にＤＨＦＲ遺伝子を選択マーカーとして
挿入する場合は、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞が好適であ
る。発現ベクターと宿主細胞の組み合わせとしては、適
宜好ましい組み合わせを選択することができるが、例え
ば、ｐＡＣ０３で標示される発現ベクター〔図６〕の宿
主細胞としてはＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞などが好適で
あり、ｐＡＣ０３−ＣＭＶで標示される発現ベクター
〔図７〕およびｐＡＣ０３−ＲＳＶで標示される発現ベ
クター〔図８〕の宿主細胞としてはＣＨＯ Ｋ−１細胞
などが好適である。発現ベクターの宿主細胞への導入方
法としては、公知の方法、例えばリン酸カルシウム法
〔Graham, F. L. and van der Eb, A. J. ヴィロロジー
(Virology) 52, 456-467 (1973)〕、電気穿孔法〔Neuma
nn, E. et al. エンボ・ジャーナル(EMBO J.) 1, 841-8
45 (1982)〕等が用いられる。

【００２４】ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を高発現で
きるＣＨＯ細胞は、上記の発現ベクターが染色体に組込
まれたＣＨＯ細胞をクローン選択によって選択すること
によって得ることができる。具体的には、まず、上記の
選択マーカーを指標として形質転換体を選択する。さら
に、このようにして選択マーカーを用いて得られた形質
転換体に対して、繰り返しクローン選択を行うことによ
り、ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質の高発現能を安定に
有するＣＨＯ細胞株を得ることができる。また、ＤＨＦ
Ｒ遺伝子を選択マーカーとして用いた場合、メソトレキ
セート（ＭＴＸ）の濃度を漸次上げて培養して耐性細胞
を選択することにより、導入遺伝子を細胞内で増幅する
ことにより、さらに高発現の細胞株を得ることもでき
る。なお、宿主としてＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞を用い
た場合であっても、例えばｐＡＣ０３で標示される発現
ベクターにはＤＨＦＲ遺伝子が導入されているので〔図
６〕、ｐＡＣ０３で標示される発現ベクターを含有する
ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞は、結果として、ＤＨＦＲ遺
伝子を有していることになる。本願明細書においては、
ＤＨＦＲ遺伝子を含有する発現ベクター（例えば、ｐＡ
Ｃ０３など）をＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞に含有せしめ
て得られるＣＨＯ細胞を「ＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁺）細胞」
と表記する場合がある。本発明において、ヒトＧＨＲＨ
レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを高発現できる細
胞株としては、例えば、後述する実施例５で得られるｐ
ＡＣ０３で標示される発現ベクターをＣＨＯ（ｄｈｆｒ
^-）細胞に導入せしめて得られるＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁺）細
胞などが挙げられる。具体的には、ＣＨＯ／ＨＧ７−５
で標示されるＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁺）細胞、ＣＨＯ／ＨＧ
９−３で標示されるＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁺）細胞、ＣＨＯ
／ＨＧ１３−３で標示されるＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁺）細胞
などが挙げられ、なかでもＣＨＯ／ＨＧ７−５で標示さ
れるＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁺）細胞などが好適である。

【００２５】以上のようにして得られた本発明のヒトＧ
ＨＲＨレセプター蛋白質をコードするＤＮＡを保持する
発現ベクターを含有する動物細胞（特に、ＣＨＯ細胞）
を、ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードするＤＮＡ
の発現が可能な条件下で培養することにより組換え型ヒ
トＧＨＲＨレセプター蛋白質を製造することができる。
ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードするＤＮＡを保
持する発現ベクターを含有するＣＨＯ細胞を培養する
際、培地としては約０.５〜２０％のウシ胎児血清を含
むＥＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培
地、α-ＭＥＭ培地などが挙げられる。特に、ＣＨＯ
（ｄｈｆｒ^-）細胞およびＤＨＦＲ選択マーカー遺伝子
を用いる場合、チミジンを含まない透析ウシ胎児血清を
含むＤＭＥＭ培地あるいはα-ＭＥＭ培地を用いるのが
好ましい。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養
は、通常約３０〜４０℃で、約１５〜２００時間行い、
必要に応じて培地の交換、通気、撹拌などを加える。こ
のようにして、ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコード
するＤＮＡを保持する発現ベクターを含有するＣＨＯ細
胞から組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を含有す
るＣＨＯ細胞を製造することができる。なお、上記の方
法に準じて、ＣＨＯ細胞以外の他の動物細胞の場合で
も、同様にして組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質
を含有する動物細胞を製造することができる。

【００２６】次に、本発明の組換え型ヒトＧＨＲＨレセ
プター蛋白質を含有するＣＨＯ細胞の細胞膜画分は、上
記の組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を含有する
ＣＨＯ細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られ
る細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕
方法としては、例えば、Potter−Elvehjem型ホモジナイ
ザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポ
リトロン（Kinematica社製）による破砕、超音波による
破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノ
ズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。
細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離
法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例
えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐ
ｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清を
さらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で
通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とす
る。該膜画分中には、発現したヒトＧＨＲＨレセプター
蛋白質と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が
多く含まれる。なお、ＣＨＯ細胞以外の他の動物細胞の
場合も、同様にして細胞膜画分を調製することができ
る。

【００２７】本発明の天然型のヒトＧＨＲＨレセプター
蛋白質と実質的に同質の活性を有する組換え型ヒトＧＨ
ＲＨレセプター蛋白質は、前述の本発明の組換え型ヒト
ＧＨＲＨレセプター蛋白質を含有する昆虫細胞またはＣ
ＨＯ細胞から単離され得る。すなわち、本発明の組換え
型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質は、（１）ヒトＧＨＲ
Ｈレセプター蛋白質をコードするＤＮＡを導入したバキ
ュロウイルスを昆虫細胞に感染させ、該ＤＮＡの発現が
可能な条件下で昆虫細胞を培養するか、または（２）ヒ
トＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードするＤＮＡを保持
するヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質発現ベクターを含有
するＣＨＯ細胞を、該ＤＮＡの発現が可能な条件下で培
養することにより製造され得るものである。したがっ
て、本発明の製造法以外の方法でも製造され得る。本発
明の組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質の具体例と
しては、例えば、配列番号：２で表されるアミノ酸配列
を含有する蛋白質などが挙げられるが、配列番号：２で
表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好まし
くは、１個以上４０個以下）のアミノ酸が欠失したアミ
ノ酸配列、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列に１
または２個以上（好ましくは、１個以上４０個以下）の
アミノ酸が付加したアミノ酸配列、あるいは配列番号：
２で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好
ましくは、１個以上４０個以下）のアミノ酸が他のアミ
ノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有する蛋白質などが
挙げられる。さらに、これら組換え型ヒトＧＨＲＨレセ
プター蛋白質は、分子内のアミノ酸の側鎖が適当な保護
基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ_1-6アシ
ル基など）で保護されていてもよいし、あるいは糖鎖な
どが結合していてもよい。本発明の組換え型ヒトＧＨＲ
Ｈレセプター蛋白質の塩としては、とりわけ生理学的に
許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、
例えば無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫
酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プ
ロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石
酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスル
ホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられ
る。

【００２８】組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を
細胞から抽出するのに際しては、培養後、公知の方法で
細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、ホ
モジナイザーまたは凍結融解などによって細胞を破壊し
たのち、遠心分離やろ過により組換え型ヒトＧＨＲＨレ
セプター蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いら
れる。緩衝液の中にＰＭＳＦ、ペプスタチン、ロイペプ
チンなどの蛋白分解酵素阻害剤や、ＣＨＡＰＳ、ジギト
ニン、トリトンＸ−１００（登録商標。以下、ＴＭと省
略することがある。）などの界面活性剤が含まれていて
もよい。得られた抽出液中に含まれる組換え型ヒトＧＨ
ＲＨレセプター蛋白質の精製は、自体公知の分離・精製
法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの
公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの
溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過
法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換
クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、ア
フィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を
利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの
疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等
電点の差を利用する方法などが用いられる。

【００２９】かくして得られる組換え型ヒトＧＨＲＨレ
セプター蛋白質が遊離体で得られた場合には、自体公知
の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換する
ことができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法
あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩
に変換することができる。なお、組換え体が産生する組
換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を、精製前または
精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、
任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去す
ることもできる。蛋白修飾酵素としては、トリプシン、
キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロ
テインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。以
上のごとく、ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードす
るＤＮＡを保持するバキュロウイルスを昆虫細胞に感染
させ、ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードするＤＮ
Ａの発現が可能な条件下で培養することにより製造され
得る組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質や、ヒトＧ
ＨＲＨレセプター蛋白質をコードするＤＮＡを保持する
発現ベクターを含有するＣＨＯ細胞を、ヒトＧＨＲＨレ
セプター蛋白質をコードするＤＮＡの発現が可能な条件
下で培養することにより製造され得る組換え型ヒトＧＨ
ＲＨレセプター蛋白質は、天然型のＧＨＲＨレセプター
蛋白質と実質的に同質の活性を有するものである。天然
型のＧＨＲＨレセプター蛋白質としては、例えば、ラッ
ト下垂体膜画分〔Seifert, H. et al., ネイチャー（Na
ture）、３１３巻、４８７〜４８９頁、１９８５年〕な
どが挙げられる。

【００３０】実質的に同質の活性としては、例えばリガ
ンド結合活性、シグナル情報伝達などが挙げられる。リ
ガンド結合活性としては、ヒトＧＨＲＨ、ヒト・ＰＡＣ
ＡＰなどとの結合活性が挙げられる。実質的に同質と
は、リガンド結合活性などが性質的に同質であることを
示す。したがって、リガンド結合活性の強さなどの強
弱、レセプター蛋白質の分子量などの量的要素は異なっ
ていてもよい。本発明の組換え型ヒトＧＨＲＨレセプタ
ー蛋白質の量と質の検査は、それ自体公知の方法で行う
ことができる。例えば、文献〔Nambi,P.ら、ザ・ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol.
Chem.)，267，19555−19559，(1992)〕に記載の方法に
従って行うことができる。本発明の組換え型ヒトＧＨＲ
Ｈレセプター蛋白質は、上記のごとく組換え型ヒトＧＨ
ＲＨレセプター蛋白質を含有する昆虫細胞またはＣＨＯ
細胞から、それ自体公知の方法あるいはそれに準じる方
法によって単離精製されたものであってもよいし、該昆
虫細胞またはＣＨＯ細胞の細胞膜上に存在しているもの
であってもよいし、該細胞の膜画分に存在するものであ
ってもよい。

【００３１】本発明の組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター
蛋白質の部分ペプチドとしては、例えば、本発明の組換
え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質分子のうち、細胞膜
の外に露出している部位などが用いられる。具体的に
は、疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性
（Hydrophilic）部位）であると分析された部分ペプチ
ドである。また、疎水性（Hydrophobic）部位を一部に
含むペプチドも同様に用いることができる。さらに、個
々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数
のドメインを同時に含む部分ペプチドでもよい。本発明
の組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質の部分ペプチ
ドの塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加
塩が好ましい。この様な塩としては、例えば無機酸（例
えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、ある
いは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマ
ル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リン
ゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンス
ルホン酸）との塩などが用いられる。

【００３２】本発明の組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター
蛋白質の部分ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプ
チドの合成法に従って、あるいは本発明の組換え型ヒト
ＧＨＲＨレセプター蛋白質を適当なペプチダーゼで切断
することによって製造することができる。ペプチドの合
成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれ
によっても良い。すなわち、本発明の蛋白質を構成し得
る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合さ
せ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離するこ
とにより目的のペプチドを製造することができる。公知
の縮合方法や保護基の脱離としてはたとえば、以下の
〜に記載された方法が挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide),
Academic Press, New York (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成
広川書店 また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸
留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィ
ー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを
精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペ
プチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当
な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合
は、公知の方法によって遊離体に変換することができ
る。

【００３３】本発明の組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター
蛋白質を含有する昆虫細胞もしくはその細胞膜画分、組
換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を含有するＣＨＯ
細胞またはその細胞膜画分、またはこれら細胞から単離
した組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質、その部分
ペプチドもしくはそれらの塩は、ＧＨＲＨレセプターア
ゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用試薬
として有用である。すなわち、本発明は、（１）本発明
の組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を含有する昆
虫細胞（以下、本発明の昆虫細胞と略称する）またはそ
の細胞膜画分を用いることを特徴とするＧＨＲＨレセプ
ターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング
方法、（２）本発明の組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター
蛋白質を含有する昆虫細胞から単離される組換え型ヒト
ＧＨＲＨレセプター蛋白質（以下、本発明の組換え型ヒ
トＧＨＲＨレセプター蛋白質１と略称する）、その部分
ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とするＧＨＲ
Ｈレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリ
ーニング方法、（３）本発明の組換え型ヒトＧＨＲＨレ
セプター蛋白質を含有するＣＨＯ細胞（以下、本発明の
ＣＨＯ細胞と略称する）またはその細胞膜画分を用いる
ことを特徴とするＧＨＲＨレセプターアゴニストまたは
アンタゴニストのスクリーニング方法、および（４）本
発明の組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を含有す
るＣＨＯ細胞から単離される組換え型ヒトＧＨＲＨレセ
プター蛋白質（以下、本発明の組換え型ヒトＧＨＲＨレ
セプター蛋白質２と略称する）、その部分ペプチドまた
はそれらの塩を用いることを特徴とするＧＨＲＨレセプ
ターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング
方法を提供する。

【００３４】より具体的には、 （１ａ）（ｉ）ＧＨＲＨを本発明の昆虫細胞またはその
細胞膜画分に接触させた場合と、（ii）ＧＨＲＨおよび
試験化合物を本発明の昆虫細胞またはその細胞膜画分に
接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするＧＨ
ＲＨレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスク
リーニング方法 （２ａ）（ｉ）ＧＨＲＨを本発明の組換え型ヒトＧＨＲ
Ｈレセプター蛋白質１、その部分ペプチドまたはその塩
に接触させた場合と、（ii）ＧＨＲＨおよび試験化合物
を本発明の組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質１、
その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合との比
較を行なうことを特徴とするＧＨＲＨレセプターアゴニ
ストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、 （３ａ）（ｉ）ＧＨＲＨを本発明のＣＨＯ細胞またはそ
の細胞膜画分に接触させた場合と、（ii）ＧＨＲＨおよ
び試験化合物を本発明のＣＨＯ細胞またはその細胞膜画
分に接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする
ＧＨＲＨレセプターアゴニストまたはアンタゴニストの
スクリーニング方法、および （４ａ）（ｉ）ＧＨＲＨを本発明の組換え型ヒトＧＨＲ
Ｈレセプター蛋白質２、その部分ペプチドまたはその塩
に接触させた場合と、（ii）ＧＨＲＨおよび試験化合物
を本発明の組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質２、
その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合との比
較を行なうことを特徴とするＧＨＲＨレセプターアゴニ
ストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法を提供
する。具体的には、上記の（１ａ）〜（４ａ）のスクリ
ーニング方法において、（ｉ）と（ii）の場合におけ
る、例えば、該組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質
１、その部分ペプチドもしくはその塩、該組換え型ヒト
ＧＨＲＨレセプター蛋白質２、その部分ペプチドもしく
はその塩、組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を含
有する昆虫細胞もしくはその細胞膜画分、組換え型ヒト
ＧＨＲＨレセプター蛋白質を含有するＣＨＯ細胞もしく
はその細胞膜画分に対するＧＨＲＨの結合量、細胞刺激
活性などを測定して、比較することを特徴とするもので
ある。

【００３５】より具体的には、 （１ｂ）（ｉ）標識したＧＨＲＨを、本発明の昆虫細胞
もしくはその細胞膜画分に接触させた場合と、（ii）標
識したＧＨＲＨおよび試験化合物を、本発明の昆虫細胞
もしくはその細胞膜画分に接触させた場合における、該
昆虫細胞もしくはその細胞膜画分に対する標識したＧＨ
ＲＨの結合量を測定し、比較することを特徴とするＧＨ
ＲＨレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスク
リーニング方法、 （１ｃ）（ｉ）ＧＨＲＨを、本発明の昆虫細胞もしくは
その細胞膜画分に接触させた場合と、（ii）ＧＨＲＨお
よび試験化合物を、本発明の昆虫細胞もしくはその細胞
膜画分に接触させた場合における、組換え型ヒトＧＨＲ
Ｈレセプターを介した細胞刺激活性（例えば、アラキド
ン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺濃度の変
動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシ
トールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリ
ン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、細胞遊走活
性、ホルモンの分泌、Ｇ蛋白質の活性化、細胞増殖など
を促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比
較することを特徴とするＧＨＲＨレセプターアゴニスト
またはアンタゴニストのスクリーニング方法、 （２ｂ）（ｉ）標識したＧＨＲＨを、本発明の組換え型
ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質１、その部分ペプチドも
しくはその塩に接触させた場合と、（ii）標識したＧＨ
ＲＨおよび試験化合物を、本発明の組換え型ヒトＧＨＲ
Ｈレセプター蛋白質１、その部分ペプチドもしくはその
塩に接触させた場合における、該組換え型ヒトＧＨＲＨ
レセプター蛋白質、その部分ペプチドもしくはその塩に
対する標識したＧＨＲＨの結合量を測定し、比較するこ
とを特徴とするＧＨＲＨレセプターアゴニストまたはア
ンタゴニストのスクリーニング方法、

【００３６】（３ｂ）（ｉ）標識したＧＨＲＨを、本発
明のＣＨＯ細胞もしくはその細胞膜画分に接触させた場
合と、（ii）標識したＧＨＲＨおよび試験化合物を、本
発明のＣＨＯ細胞もしくはその細胞膜画分に接触させた
場合における、該ＣＨＯ細胞もしくはその細胞膜画分に
対する標識したＧＨＲＨの結合量を測定し、比較するこ
とを特徴とするＧＨＲＨレセプターアゴニストまたはア
ンタゴニストのスクリーニング方法、 （３ｃ）（ｉ）ＧＨＲＨを、本発明のＣＨＯ細胞または
その細胞膜画分に接触させた場合と、（ii）ＧＨＲＨお
よび試験化合物を、本発明のＣＨＯ細胞またはその細胞
膜画分に接触させた場合における、組換え型ヒトＧＨＲ
Ｈレセプターを介した細胞刺激活性（例えば、アラキド
ン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺濃度の変
動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシ
トールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリ
ン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、細胞遊走活
性、ホルモンの分泌、Ｇ蛋白質の活性化、細胞増殖など
を促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比
較することを特徴とするＧＨＲＨレセプターアゴニスト
またはアンタゴニストのスクリーニング方法、 （４ｂ）（ｉ）標識したＧＨＲＨを、本発明の組換え型
ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質２、その部分ペプチドも
しくはその塩に接触させた場合と、（ii）標識したＧＨ
ＲＨおよび試験化合物を、本発明の組換え型ヒトＧＨＲ
Ｈレセプター蛋白質２、その部分ペプチドもしくはその
塩に接触させた場合における、該組換え型ヒトＧＨＲＨ
レセプター蛋白質、その部分ペプチドもしくはその塩に
対する標識したＧＨＲＨの結合量を測定し、比較するこ
とを特徴とするＧＨＲＨレセプターアゴニストまたはア
ンタゴニストのスクリーニング方法、

【００３７】上記の（１ｂ）、（２ｂ）、（３ｂ）およ
び（４ｂ）のスクリーニング方法において、該組換え型
ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質１、その部分ペプチドも
しくはその塩、該組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白
質２、その部分ペプチドもしくはその塩、組換え型ヒト
ＧＨＲＨレセプター蛋白質を含有する昆虫細胞もしくは
その細胞膜画分、組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白
質を含有するＣＨＯ細胞もしくはその細胞膜画分に結合
して、ＧＨＲＨと組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白
質との結合を阻害する化合物がＧＨＲＨレセプターアゴ
ニストまたはアンタゴニストの候補化合物として選択で
きる。さらに、上記（１ｃ）および（３ｃ）のスクリー
ニング方法において、ヒトＧＨＲＨレセプターに結合
し、該レセプターを介して細胞刺激活性（例えば、アラ
キドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺濃度
の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イ
ノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質
のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、細胞の
遊走活性、ホルモン分泌、Ｇ蛋白質の活性化、細胞増殖
などを促進する活性または抑制する活性など）を有する
化合物をＧＨＲＨレセプターアゴニストの候補化合物と
して選択することができる。一方、上記の（１ｂ）、
（２ｂ）、（３ｂ）および（４ｂ）のスクリーニング方
法において、ＧＨＲＨと組換え型ヒトＧＨＲＨレセプタ
ー蛋白質との結合を阻害する活性が認められた試験化合
物の中で、該細胞刺激活性を有しない化合物をＧＨＲＨ
レセプターアンタゴニストとして選択することができ
る。本発明の組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を
含有する昆虫細胞またはＣＨＯ細胞が得られ、簡便で効
率的なスクリーニング方法が発明される以前は、ＧＨＲ
Ｈレセプターアゴニストまたはアンタゴニストを効率良
くスクリーニングすることができなかった。

【００３８】以下に、本発明のスクリーニング方法を具
体的に説明する。本発明のスクリーニング方法におい
て、ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を含有する昆虫細胞
またはＣＨＯ細胞を用いる場合、それらの生細胞を用い
たり、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで
固定化することができる。固定化方法は、それ自体公知
の方法に従って行うことができる。リガンドとして使用
するＧＨＲＨとしては、市販のものなどを用いることが
できる。また、ＧＨＲＨの代わりに、公知のＧＨＲＨレ
セプターアゴニストやアンタゴニストなどを使用するこ
ともできる。標識したＧＨＲＨとしては、例えば、〔³
Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識した
ＧＨＲＨなどを用いることができ、さらには、
〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識し
た公知のＧＨＲＨアゴニストやアンタゴニストなどを用
いることもできる。例えば、〔¹²⁵Ｉ〕で標識されたヒ
トＧＨＲＨ（Amersham社, IM180）などが好適である。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク、非ペ
プチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出
液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これ
ら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合
物であってもよい。

【００３９】具体的には、上記の（１ｂ）、（２ｂ）、
（３ｂ）および（４ｂ）のスクリーニング方法を実施す
るには、まず、本発明の昆虫細胞もしくはその細胞膜画
分、本発明のＣＨＯ細胞もしくはその細胞膜画分、本発
明の組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質１、その部
分ペプチドもしくはその塩、または本発明の組換え型ヒ
トＧＨＲＨレセプター蛋白質２、その部分ペプチドもし
くはその塩を、スクリーニングに適した反応バッファー
に懸濁することによりレセプター標品を調製する。反応
バッファーには、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約
６〜８）で約１ｍＭ〜２００ｍＭ（好ましくは、約１０
ｍＭ〜５０ｍＭ）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バ
ッファーなどの、ＧＨＲＨとレセプターとの結合を阻害
しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特
異的結合を低減させる目的で、約０.０１〜０.５％（好
ましくは、約０.０５〜０.２％）のＣＨＡＰＳなどの界
面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、
プロテアーゼによるレセプターやリガンドの分解を抑え
る目的で、ＰＭＳＦ、ロイペプチン、バシトラシン、ア
プロチニン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタ
チンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもでき
る。さらに、蛋白質成分として、約０.０１〜５％（好
ましくは、０．１〜１％）のＢＳＡ、約０.０１〜５％
（好ましくは、０.０５〜１％）のゼラチンなどを加え
ることもできる。従来、ＧＨＲＨは４４個のアミノ酸か
らなる比較的分子量の大きいペプチドであるため、リガ
ンド結合実験の際の反応容器やピペットなどに吸着しや
すく、正確で感度の高い測定は不可能であった。そこ
で、本発明の上記（１ｂ）、（２ｂ）、（３ｂ）および
（４ｂ）のスクリーニング方法において、ＧＨＲＨの特
異的結合量を測定するための反応条件としては、本発明
の組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質またはその
塩、あるいは本発明の組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター
蛋白質を含有する昆虫細胞またはＣＨＯ細胞またはそれ
らの細胞膜画分にＧＨＲＨを接触させる際の反応バッフ
ァーの組成、吸引濾過の方法などをそれぞれ適切に設定
することが望ましい。

【００４０】後述の実施例４に記載したとおり、反応バ
ッファーの組成中に非特異的結合を低減させる目的で、
界面活性剤や蛋白質を添加することが効果的で、特に界
面活性剤としては、例えば約０.１％のＣＨＡＰＳを添
加することが望ましい。また、蛋白質成分としては、約
０.５％のゼラチンを添加することが望ましい。一方、
上記スクリーニング方法に組換え型ヒトＧＨＲＨレセプ
ター蛋白質を含有する昆虫細胞またはＣＨＯ細胞を用い
る場合、培養器に付着させたまま、つまり昆虫細胞やＣ
ＨＯ細胞を生育させた状態で、あるいはグルタルアルデ
ヒドやパラホルムアルデヒドで固定化した細胞を用い
て、ＧＨＲＨとＧＨＲＨレセプター蛋白質を結合させる
ことができる。この場合、該反応バッファーとしては、
例えば培地やハンクス液などが用いられる。そして、
０.０１ｍｌ〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量
（例えば、２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌの場合、約１０００
０ｃｐｍ〜１００００００ｃｐｍ）の標識したＧＨＲＨ
（例えば、〔¹²⁵Ｉ〕−ＧＨＲＨ）を添加し、同時に１
０^-4Ｍ〜１０^-10Ｍの試験化合物を共存させる。非特異
的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識のＧＨ
ＲＨを加えた反応チューブも用意する。反応は０℃から
５０℃、望ましくは４℃から３７℃で２０分から２４時
間、望ましくは３０分から３時間行なう。反応後、０．
０１〜０．２％ポリエチレンイミンで前処理したガラス
繊維濾紙等で濾過し、適量の洗浄用バッファーで洗浄し
た後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性（例えば、〔
¹²⁵Ｉ〕の量）をγ−カウンターで測定する。濾過に
は、マニホールドやセルハーベスターを用いることがで
きるが、セルハーベスターを用いることが大量の試験化
合物を処理するためには望ましい。拮抗する物質がない
場合の最大結合量(Ｂ₀）から非特異的結合量（ＮＳＢ）
を引いたカウント（Ｂ₀−ＮＳＢ）を１００％とした
時、試験化合物を入れた時の特異的結合量（Ｂ−ＮＳ
Ｂ）が、例えばカウント（Ｂ₀−ＮＳＢ）の５０％以下
になる試験化合物をアゴニストまたはアンタゴニスト候
補化合物として選択することができる。

【００４１】また、上記（１ｃ）および（３ｃ）のスク
リーニング方法を実施するためには、ヒトＧＨＲＨレセ
プター蛋白質を介する細胞刺激活性（例えば、アラキド
ン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺濃度の変
動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシ
トールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリ
ン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、ｐＨの低下、細胞の遊走活
性、ホルモンの分泌、Ｇ蛋白質の活性化、細胞増殖など
を促進する活性または抑制する活性など）を公知の方法
または市販の測定用キットを用いて測定することができ
る。具体的には、まず、組換え型ヒトＧＨＲＨレセプタ
ー蛋白質を含有する昆虫細胞またはＣＨＯ細胞をマルチ
ウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行なう
にあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を
示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを
添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あ
るいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方
法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質
（例えば、ｃＡＭＰやアラキドン酸など）の生成が、細
胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分
解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なっても
よい。

【００４２】本発明のスクリーニング用キットは、本発
明の組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を含有する
昆虫細胞またはＣＨＯ細胞もしくはそれらの細胞膜画
分、あるいは本発明の組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター
蛋白質またはその塩を含有するものである。本発明のス
クリーニング用キットの例としては、次のものが挙げら
れる。 〔スクリーニング用試薬〕 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。 組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質標品 組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を含有するＣＨ
Ｏ細胞を、１２穴プレートに５×１０⁵個／穴で継代
し、３７℃、５％ＣＯ₂、９５％ａｉｒで２日間培養し
たもの。 標識ＧＨＲＨ 市販の〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで
標識したＧＨＲＨ溶液の状態のものを４℃あるいは−２
０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて５ｎＭに希釈
する。 ＧＨＲＨ標準液 ＧＨＲＨを０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）
を含むＰＢＳで０.１ｍＭとなるように溶解し、−２０
℃で保存する。

【００４３】〔測定法〕 １２穴組織培養用プレートにて培養した組換え型ヒト
ＧＨＲＨレセプター蛋白質を含有するＣＨＯ細胞を、測
定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定
用緩衝液を各穴に加える。 １０^-3〜１０^-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた
後、５ｎＭ標識ＧＨＲＨを５μｌ加え、室温にて１時間
反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物
のかわりに１０^-4ＭのＧＨＲＨを５μｌ加えておく。 反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄す
る。細胞に結合した標識ＧＨＲＨを０．５ｍｌの０.２
Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シン
チレーターＡ（和光純薬製）と混合する。 液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）
を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding
（ＰＭＢ）を次の式〔数１〕で求める。なお、
〔¹²⁵Ｉ〕で標識されている場合は、液体シンチレータ
ーと混合することなしに直接ガンマーカウンターで測定
できる。

【数１】 ＰＭＢ：Percent Maximum Binding Ｂ ：検体を加えた時の値 ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量） Ｂ₀ ：最大結合量

【００４４】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られるＧＨＲＨレセプター
アゴニストまたはアンタゴニストは、本発明のスクリー
ニング方法またはスクリーニング用キットを用いて、試
験化合物（例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性
化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽
出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これらの試験化
合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物で
あってもよい）の中から選択される化合物であり、ＧＨ
ＲＨと本発明の組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質
との結合を阻害する化合物である。そして、ＧＨＲＨレ
セプターアゴニストは、ヒトＧＨＲＨレセプターを介し
て細胞刺激活性を有する化合物であり、ＧＨＲＨレセプ
ターアンタゴニストは該細胞刺激活性を有しない化合物
である。さらに、本発明のスクリーニング方法またはス
クリーニング用キットを用いて得られるＧＨＲＨレセプ
ターアゴニストまたはアンタゴニストの構造式を化学修
飾あるいは置換したもの、また該アゴニスト／アンタゴ
ニストの構造式を基にデザイン化したものなども、本発
明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キット
を用いて得られるＧＨＲＨレセプターアゴニストまたは
アンタゴニストに含まれる。

【００４５】該ＧＨＲＨレセプターアゴニストまたはア
ンタゴニストの塩としては、とりわけ生理学的に許容さ
れる酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば
無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）と
の塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオ
ン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエ
ン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、
ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。本発明
のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを
用いて得られるＧＨＲＨレセプターアゴニストは、ＧＨ
ＲＨが有する生理活性の全部または一部を有しているの
で、該生理活性に応じて安全で低毒性な医薬組成物とし
て有用である。例えば、小人症、骨粗鬆症、腎不全、慢
性炎症性疾患、貧血などに対する予防・治療剤、下垂体
の機能検査薬、または老化防止薬などとして有用であ
る。一方、本発明のスクリーニング方法またはスクリー
ニング用キットを用いて得られるＧＨＲＨレセプターア
ンタゴニストは、ＧＨＲＨが有する生理活性の全部また
は一部を抑制することができるので、該抑制作用に応じ
て安全で低毒性な医薬組成物として有用である。例え
ば、巨人症または末端肥大症などに対する予防・治療剤
などとして有用である。

【００４６】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られるアゴニストまたはア
ンタゴニストを上述の医薬組成物として使用する場合、
常套手段に従って実施することができる。例えば、必要
に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル
剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは
水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性
溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使
用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に
認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、
安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製薬実施
に要求される単位用量形態で混和することによって製造
することができる。これら製剤における有効成分量は指
示された範囲の適当な容量が得られるようにするもので
ある。錠剤、カプセル剤などに混和することができる添
加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラ
ガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロー
スのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギ
ン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムの
ような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような
甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのよ
うな香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセル
である場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のよう
な液状担体を含有することができる。注射のための無菌
組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻
油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解また
は懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方す
ることができる。

【００４７】注射用の水溶液としては、例えば生理食塩
水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、
Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム
など）などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえばア
ルコール（たとえばエタノール）、ポリアルコール（た
とえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ル）、非イオン性界面活性剤（たとえばポリソルベート
８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補
助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなど
と併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩
衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩
化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤
（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコー
ルなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェ
ノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調整
された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。こ
のようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、
例えば温血哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツ
ジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、ヒトなど、特にヒ
ト）に対して投与することができる。該化合物またはそ
の塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投
与の場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）において
は、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約
１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ
である。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は
投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異
なるが、たとえば注射剤の形では通常成人（６０ｋｇと
して）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程
度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましく
は約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するの
が好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに
換算した量を投与することができる。

【００４８】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commision on Biochemical Nomenclature による略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があ
り得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとす
る。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＥＩＡ ：エンザイムイムノアッセイ

【００４９】Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ＢＳＡ ：ウシ血清アルブミン

【００５０】本願明細書において用いられている配列番
号は次のものを示す。 〔配列番号：１〕ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコー
ドするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：２〕ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質のアミ
ノ酸配列を示す。 〔配列番号：３〕ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコー
ドするｃＤＮＡのクローニングに用いたＤＮＡオリゴマ
ーの塩基配列を示す。 〔配列番号：４〕ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコー
ドするｃＤＮＡのクローニングに用いたＤＮＡオリゴマ
ーの塩基配列を示す。

【００５１】後述の実施例１で得られたプラスミドｐＢ
ａｃ１５を保持する形質転換体 エシェリヒア コリ
（Escherichia coli）ＪＭ１０９／ｐＢａｃ１５は、
平成７年１月３０日から通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ
−４９８７として寄託されており、また平成７年２月１
日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ １５７
９５として寄託されている。後述の実施例５で得られた
プラスミドｐＡｃ０３を保持する形質転換体 エシェリ
ヒア コリ （Escherichia coli）ＪＭ１０９／ｐＡ
Ｃ０３は、平成７年５月１１日から通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−５０９７として寄託されており、また平成
７年４月２８日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にＩ
ＦＯ １５８１４として寄託されている。後述の実施例
６で得られた形質転換体 ＣＨＯ／ＨＧ７−５は、平成
７年４月５日から通商産業省工業技術院生命工学工業技
術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５０
６２として寄託されており、また平成７年４月１１日か
ら財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ ５０４５５
として寄託されている。

【００５２】

【実施例】以下に参考例および実施例を挙げて本発明を
さらに具体的に説明するが、本発明がそれに限定される
ものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法
は、成書（Maniatisら、モレキュラー・クローニング
〔Molecular Cloning〕、ColdSpring Harbor Laborator
y、1989年）に記載されている方法に従った。

【００５３】

【参考例１】ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質ｃＤＮＡの
クローニング 公知のヒトＧＨＲＨｃＤＮＡの塩基配列〔Mayo, K. E.,
モレキュラー・エンドクリノロジー（Mol. Endocrino
l.） 6巻、1734-1744頁、1992年〕および〔Gaylinn, B.
D. et al., モレキュラー・エンドクリノロジー（Mol.
Endocrinol.）7巻、77-84頁、1993年〕に基づき、ＤＮ
ＡオリゴマーＰＴ-３およびＰＴ-４を合成した。ＰＴ-
３は、５'−ＣＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＣ
ＧＣＣＧＧＡＴＧＴ−３'（配列表の配列番号：３）で
あり、５'末端に制限酵素ＸｈｏＩの認識配列と−５〜
＋１６（翻訳開始部位を＋１とする）のセンス配列を含
むオリゴマーである。ＰＴ-４は、５'−ＣＣＴＣＧＡＧ
ＧＣＡＧＣＣＴＡＧＣＡＣＡＴＡＧＡＴＧ−３'（配列
表の配列番号：４）であり、５'末端に制限酵素Ｘｈｏ
Ｉの認識配列と＋１２５９〜＋１２８０のアンチセンス
配列を含むオリゴマーである。ヒト下垂体ｃＤＮＡ（ク
ロンテック社、カタログ番号7173-1）を鋳型として用い
た。該ｃＤＮＡ１ｎｇに上記ＤＮＡオリゴマーをそれぞ
れ２５pmolずつ加え、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒
造（株））２.５単位を用いてポリメラーゼ連鎖反応を
行なった。反応液組成は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼに
添付された指示書に従った。

【００５４】反応条件は、９４℃で３０秒間、５２℃で
２０秒間、７２℃で６０秒間を１サイクルとして、３０
サイクル繰り返した。反応液を１％アガロースゲルで電
気泳動したところ、目的とするサイズ（約１.３ｋｂ）
のＤＮＡ断片が特異的に増幅されていた。該ＤＮＡ断片
をアガロースゲルから常法にしたがって回収し、Ｈｉｎ
ｃIIサイトで開裂したｐＵＣ１１８に接続し、宿主細胞
であるエシェリヒアコリ（Escherichia coli）ＪＭ１０
９に形質転換した。該ＤＮＡ断片を含むプラスミドを有
する形質転換体を２株（Ｎｏ.６１およびＮｏ.６２）選
抜し、蛍光色素を用いた自動塩基配列解析装置３７３Ａ
（アプライドバイオシステムズ社）で挿入ＤＮＡ断片の
塩基配列を確認したところ、各クローンにそれぞれ、３
カ所の点変異が存在したので、２クローンでそれぞれ変
異がなかった制限酵素断片をつなぎ合わせて完全なヒト
ＧＨＲＨレセプターｃＤＮＡを作製した。該ｃＤＮＡ断
片の塩基配列を確認したところ、前記Gaylinnらの報告
に記載されたヒトＧＨＲＨレセプターｃＤＮＡの塩基配
列と、完全に一致するＤＮＡ断片を有するクローン（Ｎ
ｏ.６１６２）が得られた。Ｎｏ.６１６２の塩基配列お
よびそれから推定されるアミノ酸配列を〔図１〕に示し
た。

【００５５】

【実施例１】ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質発現用組換
え体ウイルスの作製 参考例１に記載のヒトＧＨＲＨレセプターｃＤＮＡ断片
を有するプラスミドＮｏ．６１６２ １０μｇを制限酵
素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIで消化した後、１％アガロ
ースゲル電気泳動を行い、ヒトＧＨＲＨレセプターをコ
ードする１.３ｋｂ ＤＮＡ断片を回収した。一方、ト
ランスファーベクターｐＢｌｕｅＢａｃIII（Invitroge
n社）２μｇをＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIで消化した。該
トランスファーベクター０.１μｇと１.３ｋｂ ＤＮＡ
断片をＴ₄ＤＮＡリガーゼを用いて結合し、ヒトＧＨＲ
ＨレセプターｃＤＮＡ断片が、ポリヘドリンプロモータ
ーに対して順方向に挿入されたトランスファープラスミ
ドｐＢａｃ１５を得た。このプラスミドｐＢａｃ１５を
大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、形質転換体エシェリヒ
ア コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９／ｐＢａｃ１５
を得た。ｐＢａｃ１５ ３μｇと線状ＡｃＮＰＶ ＤＮ
Ａ１μｇを同時にリポソームを用いてＳｆ９細胞に導入
し、２７℃で３日間培養した後、培養上清を回収した。
該培養上清から組換え体ウイルスを選び出すために、５
-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-β-Ｄ-ガラクトシド
（Ｘ−ｇａｌ）を含む軟寒天培地中でプラークを作ら
せ、青色を呈する組換え体ウイルス（ｖＢａｃ１５）を
得た。これを用いて再度単一プラークを作らせた後、２
回増幅操作を行って発現のためのウイルスストックを作
製した。

【００５６】

【実施例２】昆虫細胞を用いたヒトＧＨＲＨレセプター
蛋白質の発現 Ｓｆ９細胞およびＳｆ２１細胞を５００ml用のスピナー
フラスコを用いて２００mlの昆虫細胞用培地で浮遊培養
し、細胞濃度が１．５×１０⁶の時、実施例１で調製し
たウイルスストック液を３ml加え、２７℃、８０rpmで
４日間培養した。培養後、遠心（３,０００rpm、１０
分）で細胞を回収し、小分けした後、使用時まで−２５
℃で冷凍保存した。細胞を融解した後、３０mlの抽出バ
ッファー（１０ｍＭ ＮａＨＣＯ₃，１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ，０.５ｍＭ ＰＭＳＦ，２０μg/ml leupeptin，４
μg/ml Ｅ−６４，１μg/ml pepstatin）に懸濁し、
ポリトロンを用いて細胞を破砕した（２０,０００rpm，
２０秒×３回）。サンプルを低速で遠心（３,０００rp
m，１０分）した後、その上清を高速で遠心分離し（３
０,０００rpm，６０分）、沈殿を膜画分として回収し
た。これを１５mlのストックバッファー〔２０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４），０.２５Ｍ sucrose，
２ｍＭ ＥＤＴＡ，０.５ｍＭＰＭＳＦ，２０μg/ml l
eupeptin，１μg/ml pepstatin〕に懸濁し、小分けし
て使用時まで−８０℃で保存した。この時の蛋白量はＳ
ｆ９細胞からのものが２.０mg/ml、Ｓｆ２１細胞からの
ものが２.６mg/mlであった。

【００５７】該細胞膜画分のＧＨＲＨレセプター活性
は、以下の方法で測定した。測定用バッファー〔２５ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＧＴＡ，５ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ₂，０.５％ ゼラチン，０.１％ ＣＨＡＰＳ，
０.０３％ ＮａＮ₃，２０μg/ml leupeptin，１μg/m
l pepstatin，４μg/ml Ｅ−６４，０.１ｍＭ ＰＭ
ＳＦ（ｐＨ７.０）〕で膜画分を懸濁し、同バッファー
で希釈して蛋白量が２００μｌ当たり１μｇ、２μｇ、
４μｇ、８μｇ、１５μｇ、３０μｇおよび５０μｇに
なるように調製した。各２００μｌをチューブに分注
し、５ｎＭ〔¹²⁵Ｉ〕−ＧＨＲＨ ２μｌを添加し、２
５℃、６０分間反応させた。非特異的結合量（ＮＳＢ）
を測定するために、１０^-4Ｍ ＧＨＲＨ２μｌを加えた
チューブも同時に用意した。洗浄用バッファー〔５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，５ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ₂（ｐＨ７.５）〕を１.５ml加え、あらかじめ０.
１％のポリエチレンイミンに１時間以上ひたしたＧＦ／
Ｆガラスフィルター（Whatman社）で濾過し、さらに同
バッファー（１.５ml）で洗浄した後、ガラスフィルタ
ーに残った〔¹²⁵Ｉ〕−ＧＨＲＨをγ−カウンターで測
定した。その結果を〔図２〕と〔図３〕に示す。〔図
２〕と〔図３〕において−○−は全結合量を、−△−は
非特異的結合量を、−●−は特異的結合量を示す。この
結果、昆虫細胞で十分量のＧＨＲＨレセプターが発現し
ていることが確認された。

【００５８】

【実施例３】ヒトＧＨＲＨレセプターを含有する昆虫細
胞膜画分を用いた結合阻害実験 実施例２で得られたＳｆ２１細胞由来のヒトＧＨＲＨレ
セプター含有膜画分を用いて、〔¹²⁵Ｉ〕−ＧＨＲＨに
対するＣＲＦ、ＰＡＣＡＰ３８、ソマトスタチン１４、
ＶＩＰおよびＧＨＲＨの結合阻害実験を行った。１０μ
gの膜画分を含む２００μlの測定用バッファーをチュー
ブに分注し、５ｎＭ〔¹²⁵Ｉ〕−ＧＨＲＨを２μl添加
し、同時に可変量の上記競合物を２μl加え、２５℃で
１時間反応を行った。次に、実施例２に記載の方法で膜
画分に結合した〔¹²⁵Ｉ〕活性をγ−カウンターで測定
し、下記の〔数２〕の計算式に従って、Percent Maximu
m Binding（ＰＭＢ）を求めた。

【数２】 ＰＭＢ：Percent Maximum Binding Ｂ ：結合量 ＮＳＢ：非特異的結合量 Ｂ₀ ：最大結合量 その結果を〔図４〕に示す。この結果から、昆虫細胞で
発現させたヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質は、天然のＧ
ＨＲＨレセプター蛋白質と同等のリガンド特異性を有す
ることが明らかになった。

【００５９】

【実施例４】ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質に対するリ
ガンド結合実験の条件検討 これまで、ＧＨＲＨレセプターを含有する膜画分に対す
るＧＨＲＨの結合実験では、繁雑で手間のかかる遠心法
によりレセプターに結合したＧＨＲＨと未結合のＧＨＲ
Ｈを分離していた。しかしこの方法では大量のサンプル
を評価しなければならないスクリーニングには不向きな
ため、ガラスフィルターを使った吸引濾過法による高感
度な結合実験を可能にするための条件検討を行った。結
合反応の条件として、ガラスフィルターの前処理、測定
用バッファーのｐＨ、組成を検討した。ガラスフィルタ
ーの前処理の条件検討は次のように行った。まず、ガラ
スフィルターＧＦ／Ｆ（Whatman社）を２０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５），１％ ＢＳＡに１時間以
上ひたしたもの、ガラスフィルターを２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５），１０％ Block Ace（大日本
製薬）に１時間以上ひたしたもの、ガラスフィルターを
シリコナイズしたもの、およびガラスフィルターを２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５），０.０３％ ポ
リエチレンイミンに１時間以上ひたしたものを用意し
た。次に、実施例２に記載のＳｆ９細胞由来のヒトＧＨ
ＲＨレセプターを含有する膜画分を用いて、実施例２に
記載の方法で〔¹²⁵Ｉ〕−ＧＨＲＨの結合反応を行っ
た。なお、この時、反応液２００μｌ中１５μｇの膜画
分を用いた。反応後、上記の前処理済のガラスフィルタ
ーを用いて吸引濾過し、その後ガラスフィルターの〔
¹²⁵Ｉ〕活性をγ−カウンターで測定した。その結果を
〔表１〕に示す。

【００６０】

【表１】

【００６１】この結果から、〔¹²⁵Ｉ〕−ＧＨＲＨの特
異的結合（〔表１〕の）を検出するためには、ガラス
フィルターのポリエチレンイミン処理が必須であること
が判明した。測定用バッファーのｐＨの検討は、次のよ
うに行った。実施例２に記載の測定用バッファーでＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌのｐＨを５.５から８.４まで変えたバッフ
ァーで膜画分を懸濁し、蛋白質が２００μｌあたり１５
μｇになるように調製した。２００μｌずつチューブに
分注し、実施例２に記載の方法で、〔¹²⁵Ｉ〕−ＧＨＲ
Ｈと反応させた後ガラスフィルターによる吸引濾過を行
い、ガラスフィルターに残った〔¹²⁵Ｉ〕を測定した。
その結果を〔図５〕に示す。この図から、中性から弱酸
性にかけてが、測定用バッファーの至適ｐＨであること
が判明した。測定用バッファーの組成の検討は次のよう
に行った。まず、反応チューブに吸着する〔¹²⁵Ｉ〕−
ＧＨＲＨの量を低く抑えるため、測定用バッファーに加
えるＢＳＡ、ゼラチンおよびＣＨＡＰＳの影響を調べ
た。基本バッファー〔２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７），５ｍＭ ＭｇＣｌ₂，１ｍＭ ＥＧＴＡ，０.０３
％ ＮａＮ₃，０.１ｍＭ ＰＭＳＦ，１μg/ml pepsta
tin，２０μg/ml leupeptin，４μg/ml Ｅ−６４〕に
上記の添加物を加え、２００μｌの測定用バッファーに
〔¹²⁵Ｉ〕−ＧＨＲＨを５０ｐＭ加えた後、２５℃で１
時間放置した後のチューブ内壁に吸着した〔¹²⁵Ｉ〕活
性をγ−カウンターで測定した。その結果を〔表２〕に
示す。

【００６２】

【表２】

【００６３】〔表２〕から、測定用バッファーの中にゼ
ラチンなどの蛋白質や、ＣＨＡＰＳなどの界面活性剤を
添加することが、〔¹²⁵Ｉ〕−ＧＨＲＨが反応チューブ
に吸着してしまうことを防ぐのに有効であることが判明
した。次に、〔¹²⁵Ｉ〕−ＧＨＲＨの特異的結合量を感
度よく検出するための測定用バッファーを検討した。上
記の基本バッファーにＣＨＡＰＳ、ゼラチン、BlockAce
（大日本製薬）を加え、実施例２に記載の方法でヒトＧ
ＨＲＨレセプター蛋白質を含有する膜画分に対する〔
¹²⁵Ｉ〕−ＧＨＲＨの結合量を測定した。〔表３〕にそ
の結果を示した。

【００６４】

【表３】 この結果から、０.１％ ＣＨＡＰＳと０.５％ゼラチン
を測定用バッファーに加えることが感度よく〔¹²⁵Ｉ〕
−ＧＨＲＨの結合活性を評価するのに有効であることが
判明した。

【００６５】

【実施例５】ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質ｃＤＮＡの
発現プラスミドの構築 ＣＨＯ細胞での発現ベクターとしては、ｐＡＫＫＯ−１
１１を用いた。ｐＡＫＫＯ−１１１は次のようにして構
築した。特開平５−０７６３８５公報に記載のｐＴＢ１
４１７からＨｉｎｄIIIおよびＣｌａＩ処理によってＳ
ＲαプロモーターおよびｐｏｌｙＡ付加シグナルを含む
１．４ｋｂのＤＮＡ断片を得た。また、ｐＴＢ３４８
〔Naruo, K. et al. バイオケミカル・アンド・バイオ
フィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Bioche
m. Biophys. Res. Commun.）128巻,256-264頁(1985)〕
からＣｌａＩおよびＳａｌＩ処理によりジヒドロ葉酸還
元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を含む４．５ｋｂのＤＮＡ断
片を得た。これらのＤＮＡ断片をＴ４ポリメラーゼ処理
により末端を平滑末端にした後、Ｔ４リガーゼにより連
結し、ｐＡＫＫＯ−１１１プラスミドを構築した。次
に、参考例１で得られたヒトＧＨＲＨレセプターｃＤＮ
Ａ断片を有するプラスミド（Ｎｏ．６１６２）５μｇを
制限酵素ＸｈｏＩで消化した後、１％アガロースゲル電
気泳動を行い、ヒトＧＨＲＨレセプターをコードする
１．３ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。そして、上記の発
現ベクターｐＡＫＫＯ−１１１（５．５ｋｂ）１μｇを
ＳａｌＩで消化し、ヒトＧＨＲＨレセプターｃＤＮＡ断
片を挿入するためのクローニング部位を作製した。該発
現ベクター断片と１．３ｋｂのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて結合し、反応液を塩化カルシウム法に
て大腸菌ＪＭ１０９に導入し、形質転換体の中からヒト
ＧＨＲＨレセプターｃＤＮＡ断片がプロモーターに対し
て順方向に挿入された発現プラスミドｐＡＣ０３を得た
〔図６〕。この形質転換体をエシェリヒア コリ（Esch
erichia coli）ＪＭ１０９／ｐＡＣ０３と標示する。

【００６６】

【実施例６】ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質ｃＤＮＡの
ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞への導入と発現 ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞１×１０⁶細胞を、直径８cmの
シャーレを用いて、１０％ウシ胎児血清を含むハムＦ１
２培地で２４時間培養し、この細胞に実施例５で得たヒ
トＧＨＲＨレセプターｃＤＮＡ発現プラスミドｐＡＣ０
３ １０μｇをリン酸カルシウム法（Cell Phect Transf
ection Kit；Pharmacia）で導入した。導入２４時間
後、培地を１０％透析ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地
に換えて、本培地でコロニーを形成する細胞（すなわ
ち、ＤＨＦＲ⁺細胞）を選択した。さらに、選択された
細胞を限界希釈法によって単一細胞からクローニング
し、ヒトＧＨＲＨレセプターを発現する細胞株を複数得
た。上記の細胞株のうち、ＣＨＯ／ＨＧ７−５、ＣＨＯ
／ＨＧ９−３、ＣＨＯ／ＨＧ１３−３株のＧＨＲＨレセ
プター蛋白質活性を以下の方法で測定した。ＣＨＯ／Ｈ
Ｇ７−５、ＣＨＯ／ＨＧ９−３およびＣＨＯ／ＨＧ１３
−３を１２−well−plateに２×１０⁵細胞ずつ播種し、
１０％透析ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中で３日間
培養した後、ＰＢＳで軽くwellを洗浄し、２％ウシ胎児
血清を含むＤＭＥＭ培地０.５ml/wellを加えた。次に〔
¹²⁵Ｉ〕−ＧＨＲＨ（Amersham社 IM180）を２５ｐＭに
なるように加え、２５℃で１時間反応させた。非特異的
結合を測定するためにＧＨＲＨ（ペプチド研究所）を、
１μＭになるように加えたwellも用意した。反応終了
後、１ｍｌのＰＢＳでwellを３回洗浄した後、０.５ml
の０.５Ｎ ＮａＯＨ、０.１％ＳＤＳを加え、wellに残
った〔¹²⁵Ｉ〕−ＧＨＲＨをバイアルに回収した。１ml
の蒸留水を加え、wellを洗浄した後、それもバイアルに
回収した。バイアル中の〔¹²⁵Ｉ〕をγ−カウンターで
測定した結果を〔表４〕に示す。

【００６７】

【表４】 〔表４〕より、ＣＨＯ／ＨＧ７−５株が最も高い発現量
を示すことが判明した。

【００６８】

【発明の効果】本発明のヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質
をコードするＤＮＡを導入したバキュロウイルスを感染
させた昆虫細胞は、ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を高
発現することができる。本発明のヒトＧＨＲＨレセプタ
ー蛋白質をコードするＤＮＡを保持する発現ベクターｐ
ＡＣ０３は、ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を高発現す
るように構築された発現ベクターである。該発現ベクタ
ーｐＡＣ０３を含有するＣＨＯ細胞は、ヒトＧＨＲＨレ
セプター蛋白質を高発現することができる。また、本発
明の組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を含有する
昆虫細胞もしくはその細胞膜画分、本発明の組換え型ヒ
トＧＨＲＨレセプター蛋白質を含有するＣＨＯ細胞もし
くはその細胞膜分画、またはそれら細胞から製造される
組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質もしくはその塩
を用いて、ＧＨＲＨレセプターアゴニストまたはアンタ
ゴニストを効率良く、正確にスクリーニングすることが
できる。本発明のスクリーニング方法によれば、ＧＨＲ
Ｈレセプターアゴニストまたはアンタゴニストを有利
に、かつ早期に選択することができる。該アゴニスト
は、例えば、小人症、骨粗鬆症、腎不全、慢性炎症性疾
患、貧血に対する予防・治療剤、下垂体の機能検査薬、
もしくは老化防止薬などとして有用である。一方、該ア
ンタゴニストは、例えば巨人症および末端肥大症に対す
る予防・治療剤などとして有用である。本発明のヒトＧ
ＨＲＨレセプターと、スクリーニング方法を使えば、こ
れらを目的とした医薬品を早期に開発することができ
る。

【００６９】

【配列表】

【配列番号：１】 配列の長さ：１２６９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATGGACCGCC GGATGTGGGG GGCCCACGTC TTCTGCGTGT TGAGCCCGTT ACCGACCGTA 60 TTGGGCCACA TGCACCCAGA ATGTGACTTC ATCACCCAGC TGAGAGAGGA TGAGAGTGCC 120 TGTCTACAAG CAGCAGAGGA GATGCCCAAC ACCACCCTGG GCTGCCCTGC GACCTGGGAT 180 GGGCTGCTGT GCTGGCCAAC GGCAGGCTCT GGCGAGTGGG TCACCCTCCC CTGCCCGGAT 240 TTCTTCTCTC ACTTCAGCTC AGAGTCAGGG GCTGTGAAAC GGGATTGTAC TATCACTGGC 300 TGGTCTGAGC CCTTTCCACC TTACCCTGTG GCCTGCCCTG TGCCTCTGGA GCTGCTGGCT 360 GAGGAGGAAT CTTACTTCTC CACAGTGAAG ATTATCTACA CCGTGGGCCA TAGCATCTCT 420 ATTGTAGCCC TCTTCGTGGC CATCACCATC CTGGTTGCTC TCAGGAGGCT CCACTGCCCC 480 CGGAACTACG TCCACACCCA GCTGTTCACC ACTTTTATCC TCAAGGCGGG AGCTGTGTTC 540 CTGAAGGATG CTGCCCTTTT CCACAGCGAC GACACTGACC ACTGCAGCTT CTCCACTGTT 600 CTATGCAAGG TCTCTGTGGC CGCCTCCCAT TTCGCCACCA TGACCAACTT CAGCTGGCTG 660 TTGGCAGAAG CCGTCTACCT GAACTGCCTC CTGGCCTCCA CCTCCCCCAG CTCAAGGAGA 720 GCCTTCTGGT GGCTGGTTCT CGCTGGCTGG GGGCTGCCCG TGCTCTTCAC TGGCACGTGG 780 GTGAGCTGCA AACTGGCCTT CGAGGACATC GCGTGCTGGG ACCTGGACGA CACCTCCCCC 840 TACTGGTGGA TCATCAAAGG GCCCATTGTC CTCTCGGTCG GGGTGAACTT TGGGCTTTTT 900 CTCAATATTA TCCGCATCCT GGTGAGGAAA CTGGAGCCAG CTCAGGGCAG CCTCCATACC 960 CAGTCTCAGT ATTGGCGTCT CTCCAAGTCG ACACTTTTCC TGATCCCACT CTTTGGAATT 1020 CACTACATCA TCTTCAACTT CCTGCCAGAC AATGCTGGCC TGGGCATCCT CCTCCCCCTG 1080 GAGCTGGGAC TGGGTTCCTT CCAGGGCTTC ATTGTTGCCA TCCTCTACTG CTTCCTCAAC 1140 CAAGAGGTGA GGACTGAGAT CTCACGGAAG TGGCATGGCC ATGACCCTGA GCTTCTGCCA 1200 GCCTGGAGGA CCCGTGCTAA GTGGACCACG CCTTCCCGCT CGGCGGCAAA GGTGCTGACA 1260 TCTATGTGC 1269

【００７０】

【配列番号：２】 配列の長さ：４２３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク 配列 Met Asp Arg Arg Met Trp Gly Ala His Val Phe Cys Val Leu Ser Pro 1 5 10 15 Leu Pro Thr Val Leu Gly His Met His Pro Glu Cys Asp Phe Ile Thr 20 25 30 Gln Leu Arg Glu Asp Glu Ser Ala Cys Leu Gln Ala Ala Glu Glu Met 35 40 45 Pro Asn Thr Thr Leu Gly Cys Pro Ala Thr Trp Asp Gly Leu Leu Cys 50 55 60 Trp Pro Thr Ala Gly Ser Gly Glu Trp Val Thr Leu Pro Cys Pro Asp 65 70 75 80 Phe Phe Ser His Phe Ser Ser Glu Ser Gly Ala Val Lys Arg Asp Cys 85 90 95 Thr Ile Thr Gly Trp Ser Glu Pro Phe Pro Pro Tyr Pro Val Ala Cys 100 105 110 Pro Val Pro Leu Glu Leu Leu Ala Glu Glu Glu Ser Tyr Phe Ser Thr 115 120 125 Val Lys Ile Ile Tyr Thr Val Gly His Ser Ile Ser Ile Val Ala Leu 130 135 140 Phe Val Ala Ile Thr Ile Leu Val Ala Leu Arg Arg Leu His Cys Pro 145 150 155 160 Arg Asn Tyr Val His Thr Gln Leu Phe Thr Thr Phe Ile Leu Lys Ala 165 170 175 Gly Ala Val Phe Leu Lys Asp Ala Ala Leu Phe His Ser Asp Asp Thr 180 185 190 Asp His Cys Ser Phe Ser Thr Val Leu Cys Lys Val Ser Val Ala Ala 195 200 205 Ser His Phe Ala Thr Met Thr Asn Phe Ser Trp Leu Leu Ala Glu Ala 210 215 220 Val Tyr Leu Asn Cys Leu Leu Ala Ser Thr Ser Pro Ser Ser Arg Arg 225 230 235 240 Ala Phe Trp Trp Leu Val Leu Ala Gly Trp Gly Leu Pro Val Leu Phe 245 250 255 Thr Gly Thr Trp Val Ser Cys Lys Leu Ala Phe Glu Asp Ile Ala Cys 260 265 270 Trp Asp Leu Asp Asp Thr Ser Pro Tyr Trp Trp Ile Ile Lys Gly Pro 275 280 285 Ile Val Leu Ser Val Gly Val Asn Phe Gly Leu Phe Leu Asn Ile Ile 290 295 300 Arg Ile Leu Val Arg Lys Leu Glu Pro Ala Gln Gly Ser Leu His Thr 305 310 315 320 Gln Ser Gln Tyr Trp Arg Leu Ser Lys Ser Thr Leu Phe Leu Ile Pro 325 330 335 Leu Phe Gly Ile His Tyr Ile Ile Phe Asn Phe Leu Pro Asp Asn Ala 340 345 350 Gly Leu Gly Ile Leu Leu Pro Leu Glu Leu Gly Leu Gly Ser Phe Gln 355 360 365 Gly Phe Ile Val Ala Ile Leu Tyr Cys Phe Leu Asn Gln Glu Val Arg 370 375 380 Thr Glu Ile Ser Arg Lys Trp His Gly His Asp Pro Glu Leu Leu Pro 385 390 395 400 Ala Trp Arg Thr Arg Ala Lys Trp Thr Thr Pro Ser Arg Ser Ala Ala 405 410 415 Lys Val Leu Thr Ser Met Cys 420

【００７１】

【配列番号：３】 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CCTCGAGTCA CCATGGACCG CCGGATGT 28

【００７２】

【配列番号：４】 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CCTCGAGGCA GCCTAGCACA TAGATG 26

【００７３】

【図面の簡単な説明】

【図１】参考例１で調製したヒトＧＨＲＨレセプターｃ
ＤＮＡの塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配
列を示す。

【図２】ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を含有するＳｆ
９細胞の細胞膜画分に対する〔¹²⁵Ｉ〕−ＧＨＲＨの結
合実験の結果を示す。縦軸は〔¹²⁵Ｉ〕−ＧＨＲＨの結
合量（ｃｐｍ）を示し、横軸は細胞膜画分の蛋白量（μ
g/tube）を示す。●は特異的結合量（ＳＢ）を示し、○
は全結合量（ＴＢ）、△は非特異的結合量（ＮＳＢ）を
示す。

【図３】ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を含有するＳｆ
２１細胞の細胞膜画分に対する〔¹²⁵Ｉ〕−ＧＨＲＨの
結合実験の結果を示す。縦軸は〔¹²⁵Ｉ〕−ＧＨＲＨの
結合量（ｃｐｍ）を示し、横軸は細胞膜画分の蛋白量
（μg/tube）を示す。●は特異的結合量（ＳＢ）を示
し、○は全結合量（ＴＢ）、△は非特異的結合量（ＮＳ
Ｂ）を示す。

【図４】ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を含有するＳｆ
２１細胞の細胞膜画分と〔¹²⁵Ｉ〕−ＧＨＲＨの結合に
対する各種ペプチドの結合阻害実験を調べた結果をリガ
ンド結果阻害曲線で示したものである。縦軸は
〔¹²⁵Ｉ〕−ＧＨＲＨ単独の場合の結合量を１００％と
した時の相対的結合量（％）を示す。横軸は加えたペプ
チドの濃度（ｎＭ）を示す。●はＧＨＲＨ、○はＣＲ
Ｆ、□はＰＡＣＡＰ３８、△はＶＩＰ、黒塗り□はソマ
トスタチン１４を示す。

【図５】ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を含有するＳｆ
９細胞の細胞膜画分に対する〔¹²⁵Ｉ〕−ＧＨＲＨの結
合実験を行う際の測定用バッファーの最適ｐＨを調べた
結果を示す。縦軸は〔¹²⁵Ｉ〕−ＧＨＲＨの特異的結合
量（ｃｐｍ）を示し、横軸は測定用バッファーのｐＨを
示す。●は特異的結合量を示し、□は反応チューブに吸
着した〔¹²⁵Ｉ〕−ＧＨＲＨの量（ｃｐｍ）を示す。

【図６】ヒトＧＨＲＨレセプターｃＤＮＡを保持する発
現ベクターｐＡＣ０３を示す。黒塗りの部分はヒトＧＨ
ＲＨレセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡを示す。Po
lyＡ signalはポリＡ付加シグナルを示す。ＤＨＦＲは
ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を示す。Ａｐ^rはアンピシ
リン耐性遺伝子を示す。ＳＲαpromoterはＳＲαプロモ
ーターを示す。

【図７】ヒトＧＨＲＨレセプターｃＤＮＡを保持する発
現ベクターｐＡＣ０３−ＣＭＶを示す。黒塗りの部分は
ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡを
示す。PolyＡ signalはポリＡ付加シグナルを示す。Ｎ
ｅｏはネオマイシン耐性遺伝子を示す。Ａｐ^rはアンピ
シリン耐性遺伝子を示す。ＣＭＶpromoterはＣＭＶプロ
モーターを示す。

【図８】ヒトＧＨＲＨレセプターｃＤＮＡを保持する発
現ベクターｐＡＣ０３−ＲＳＶを示す。黒塗りの部分は
ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡを
示す。PolyＡ signalはポリＡ付加シグナルを示す。Ｎ
ｅｏはネオマイシン耐性遺伝子を示す。Ａｐ^rはアンピ
シリン耐性遺伝子を示す。ＲＳＶpromoterはＲＳＶプロ
モーターを示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/02 8931−4Ｂ Ｃ１２Ｓ 13/00 Ｃ１２Ｓ 13/00 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/04 Ａ６１Ｋ 37/43 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードす
   るＤＮＡを導入したバキュロウイルスを感染させた昆虫
   細胞。
2. 【請求項２】ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードす
   るＤＮＡを導入したバキュロウイルスを感染させた昆虫
   細胞を、ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードするＤ
   ＮＡの発現が可能な条件下で、培養することにより製造
   されることを特徴とする組換え型ヒトＧＨＲＨレセプタ
   ー蛋白質を含有する昆虫細胞またはその細胞膜画分。
3. 【請求項３】請求項２記載の昆虫細胞から単離される天
   然型のヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質と実質的に同質の
   活性を有する組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質、
   その部分ペプチドまたはそれらの塩。
4. 【請求項４】ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードす
   るＤＮＡを導入したバキュロウイルスを昆虫細胞に感染
   させ、該ＤＮＡの発現が可能な条件下で昆虫細胞を培養
   することを特徴とする請求項３記載のヒトＧＨＲＨレセ
   プター蛋白質またはその塩の製造法。
5. 【請求項５】請求項２記載の組換え型ヒトＧＨＲＨレセ
   プター蛋白質を含有する昆虫細胞またはその細胞膜画分
   を用いることを特徴とするＧＨＲＨレセプターアゴニス
   トまたはアンタゴニストのスクリーニング方法。
6. 【請求項６】請求項３記載の組換え型ヒトＧＨＲＨレセ
   プター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩を用いる
   ことを特徴とするＧＨＲＨレセプターアゴニストまたは
   アンタゴニストのスクリーニング方法。
7. 【請求項７】請求項２記載の組換え型ヒトＧＨＲＨレセ
   プター蛋白質を含有する昆虫細胞またはその細胞膜画分
   を含有することを特徴とするＧＨＲＨレセプター蛋白質
   アゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用キ
   ット。
8. 【請求項８】請求項３記載の組換え型ヒトＧＨＲＨレセ
   プター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩を含有す
   ることを特徴とするＧＨＲＨレセプターアゴニストまた
   はアンタゴニストのスクリーニング用キット。
9. 【請求項９】ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコードす
   るＤＮＡを保持することを特徴とするｐＡＣ０３で標示
   されるヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質発現ベクター。
10. 【請求項１０】ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質をコード
    するＤＮＡを保持するｐＡＣ０３で標示されるヒトＧＨ
    ＲＨレセプター蛋白質発現ベクターを含有することを特
    徴とするＣＨＯ細胞。
11. 【請求項１１】ＣＨＯ細胞がジヒドロ葉酸還元酵素遺伝
    子を欠損しているＣＨＯ細胞である請求項１０記載のＣ
    ＨＯ細胞。
12. 【請求項１２】請求項１０記載のＣＨＯ細胞を、ヒトＧ
    ＨＲＨレセプター蛋白質をコードするＤＮＡの発現が可
    能な条件下で培養することを特徴とする組換え型ヒトＧ
    ＨＲＨレセプター蛋白質の製造法。
13. 【請求項１３】請求項１０記載のＣＨＯ細胞を、ヒトＧ
    ＨＲＨレセプター蛋白質をコードするＤＮＡの発現が可
    能な条件下で培養することによって製造されることを特
    徴とする組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質を含有
    するＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分。
14. 【請求項１４】請求項１３記載のＣＨＯ細胞から単離さ
    れ得る天然型のヒトＧＨＲＨレセプター蛋白質と実質的
    に同質の活性を有する組換え型ヒトＧＨＲＨレセプター
    蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩。
15. 【請求項１５】請求項１３記載のＣＨＯ細胞またはその
    細胞膜画分を用いることを特徴とするＧＨＲＨレセプタ
    ーアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方
    法。
16. 【請求項１６】請求項１４記載の組換え型ヒトＧＨＲＨ
    レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩
    を用いることを特徴とするＧＨＲＨレセプターアゴニス
    トまたはアンタゴニストのスクリーニング方法。
17. 【請求項１７】請求項１３記載のＣＨＯ細胞またはその
    細胞膜画分を含有することを特徴とするＧＨＲＨレセプ
    ターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング
    用キット。
18. 【請求項１８】請求項１４記載の組換え型ヒトＧＨＲＨ
    レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはそらの塩を
    含有することを特徴とするＧＨＲＨレセプターアゴニス
    トまたはアンタゴニストのスクリーニング用キット。
19. 【請求項１９】請求項５、請求項６、請求項１５もしく
    は請求項１６記載のスクリーニング方法または請求項
    ７、請求項８、請求項１７もしくは請求項１８記載のス
    クリーニング用キットを用いて得られるＧＨＲＨレセプ
    ターアゴニストまたはその塩。
20. 【請求項２０】請求項５、請求項６、請求項１５もしく
    は請求項１６記載のスクリーニング方法または請求項
    ７、請求項８、請求項１７もしくは請求項１８記載のス
    クリーニング用キットを用いて得られるヒトＧＨＲＨレ
    セプターアンタゴニストまたはその塩。
21. 【請求項２１】請求項１９記載のＧＨＲＨレセプターア
    ゴニストまたはその塩を含有することを特徴とする医薬
    組成物。
22. 【請求項２２】請求項２０記載のＧＨＲＨレセプターア
    ンタゴニストまたはその塩を含有することを特徴とする
    医薬組成物。