KR20020058024A

KR20020058024A - 펩티드의 용도

Info

Publication number: KR20020058024A
Application number: KR1020027006387A
Authority: KR
Inventors: 기따다찌에꼬; 마쯔모또히로까즈; 히누마슈지
Original assignee: 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤
Priority date: 1999-11-18
Filing date: 2000-11-17
Publication date: 2002-07-12
Also published as: EP1230928A4; US20050209151A1; WO2001035984A1; CN1390131A; CA2391872A1; EP1230928A1; AU1415301A

Abstract

본 발명의 리간드 폴리펩티드는 CRH 분비조절작용을 갖고, 따라서 CRH 분비조절제로서, 저알도스테론증, 저코르티솔 혈증, 속발성 또는 만성 부신피질 기능저하증, 애디슨병 (권태, 오심, 색소침착, 성기능저하, 탈모, 저혈압), 부신기능부전, 비만 등의 CRH 분비에 관련되는 각종 질환의 개선, 예방 및, 치료약으로 유용할 뿐만 아니라, 진통약으로도 유용하다.

Description

펩티드의 용도 {USE OF PEPTIDE}

대부분의 호르몬이나 신경전달물질은 세포막에 존재하는 특이적인 리셉터를 통하여 생체의 기능을 조절한다. 이들 리셉터의 대부분은 공액되어 있는 구아닌 뉴클레오티드 결합성 단백질 (guanine nucleotide-binding protein, 이하 G단백질로 약칭하는 경우가 있음) 의 활성화를 통하여 세포내의 시그널전달을 행한다. 또, 이들 리셉터는 7 개의 세포막 관통영역을 갖는 공통된 구조를 갖고 있기 때문에 G단백질 공액형 리셉터 또는 7회 막관통형 리셉터 (7TMR) 라고 총칭된다.

이와 같은 G단백질 공액형 리셉터 단백질의 예로서, phGR3 (또는 GPR10 이라고 하는 경우도 있음) 유전자에 의해 코딩되는 인간형 리셉터 단백질 [Genomics, 제 29 권, 335 페이지 (1995 년)], 및 이에 대응하는 래트형 리셉터 단백질 UHR-1 [Biochem. Biophy. Res. Commun., 제 209 권, 606 페이지 (1995 년)] 이 알려져 있다.

또, 상기 phGR3 및 UHR-1 에 대한 리간드로서 기능하는 생리활성 펩티드로서 PrRP [Nature, 제 393 권, 272-276 페이지 (1998)] 가 알려져 있다.

PrRP 는 하수체 전엽에서는 특이적으로 프롤락틴 방출작용이 관찰되고 있지만 [Nature, 제 393 권, 272-276 페이지 (1998), Biochem. Biophy. Res. Commun., 259 권 321-324 페이지 (1999)], 뇌 내에서의 PrRP 의 작용은 명확하지 않다. 또, 시상하부 호르몬인 부신피질 자극호르몬 방출호르몬 (CRH) 을 조절하는 내인성 조절호르몬은 현재로서는 불명확하다.

발명의 개요

본 발명자들은 상기 문제를 해결하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 우선 인식 부위가 다른 PrRP 에 대해 특이적인 모노클로날 항체를 2 종류 제작하여, PrRP 의 고감도 측정계 (Sandwich-EIA 계) 를 제작하였다 (WO99-60112호). 이 측정계를 사용하여 래트에서의 PrRP 의 조직분포를 조사한 결과, 이미 보고된 [Biochemical and Biophysical Research Communications, 제 257 권, 264 페이지 (1999)] 바와 같이 시상하부 등에 고농도로 분포되어 있었고, 뇌 내에 널리 분포된 PrRP 의 존재를 확인하였다. 본 발명자들은 더욱 예의 연구한 결과, 뜻밖에도 PrRP 가 혈액중의 농도보다 5 ∼ 6 배로 뇌척수액 중에서 검출되어 CRH 의 방출을 조절하는 작용을 갖는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은 하기 (1) 내지 (10)에 관한 것이다:

(1) G단백질 공액형 리셉터 단백질에 대한 리간드

펩티드 또는 이의 아미드 또는 이의 에스테르 또는 이의 염을 함유하는 부신피질 자극호르몬 방출호르몬 (CRH) 분비조절제,

(2) G단백질 공액형 리셉터 단백질에 대한 리간드 펩티드 또는 이의 아미드 또는 이의 에스테르 또는 이의 염이, 서열번호: 44 또는 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산서열을 함유하는 폴리펩티드 또는 이의 아미드 또는 이의 에스테르 또는 이의 염인 상기 (1) 기재의 CRH 분비조절제,

(3) 서열번호: 44 로 표시되는 아미노산서열이 서열번호: 3, 18 또는 32 로 표시되는 아미노산서열인 상기 (2) 기재의 CRH 분비조절제,

(4) 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열이 서열번호: 6, 21 또는 35 로 표시되는 아미노산서열인 상기 (2) 기재의 CRH 분비조절제,

(5) G단백질 공액형 리셉터 단백질이 서열번호: 46 으로 표시되는 아미노산서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산서열을 함유하는 단백질인 상기 (1) 기재의 CRH 분비조절제,

(6) CRH 분비촉진제인 상기 (1) 기재의 CRH 분비조절제,

(7) 저알도스테론증, 저코르티솔 혈증, 속발성 또는 만성 부신피질 기능저하증, 애디슨병, 부신기능부전 또는 비만증의 예방 또는 치료약인 상기 (1) 기재의 CRH 분비조절제,

(8) G단백질 공액형 리셉터 단백질과 이 G단백질 공액형 리셉터 단백질에 대한 리간드 펩티드와의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 이의 염을 함유하는 CRH 분비조절제,

(9) CRH 분비조절작용을 갖는 의약을 제조하기 위한, G단백질 공액형 리셉터 단백질에 대한 리간드 펩티드 또는 이의 아미드 또는 이의 에스테르 또는 이의 염의 용도, 및

(10) G단백질 공액형 리셉터 단백질에 대한 리간드 펩티드 또는 이의 아미드 또는 이의 에스테르 또는 이의 염을 포유동물에 투여하는 것을 특징으로 하는 CRH 분비조절방법 등에 관한 것이다.

본 발명은 생리활성 펩티드의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 G단백질 공액형 리셉터 (이하, 수용체라고 하는 경우도 있음) 단백질에 대한 리간드 폴리펩티드를 함유하는 부신피질 자극호르몬 방출호르몬 (CRH) 분비조절제 등에 관한 것이다.

도 1 은 PrRP-31 (서열번호: 32 로 표시되는 아미노산서열로 이루어지는 펩티드의 아미드체를 나타낸다. 이하 동일) 을 래트의 뇌실 내에 투여했을 때의 혈중 ACTH 농도의 변동을 나타낸다. 도면 중, -○- 은 컨트롤 (인산 완충 생리식염수), -●- 은 PrRP-31 (1n㏖), -△- 은 PrRP-31 (3n㏖), -■- 은 PrRP-31 (10n㏖) 을 나타낸다. ACTH 농도는 측정값 ±표준오차로 나타냈다. 또, ** 는 유의수준 1% 로 유의차가 있는 것을 (n=6-8) 나타내고, * 는 유의수준 5% 로 유의차가 있는 것을 (n=6-8) 나타낸다.

도 2 는 PrRP-31 을 래트의 뇌실내에 투여했을 때의 혈중 β-엔도르핀농도의 변동을 나타낸다. 도면 중, -○- 은 컨트롤 (인산 완충 생리식염수), -●- 은 PrRP-31 (1n㏖), -△- 은 PrRP-31 (3n㏖), -■- 은 PrRP-31 (10n㏖) 을 나타낸다. β-엔도르핀농도는 측정값 ±표준오차로 나타냈다. 또, * 는 유의수준 5% 로 유의차가 있는 것을 (n=6-8) 나타낸다.

도 3 은 항-CRF IgG 및 정상 토끼 IgG 를 경정맥에서 투여하고, 그 30 분 후에 PrRP-31 을 래트의 뇌실내에 투여했을 때의 혈중 ACTH 농도의 변동을 나타낸다. 도면 중, -○- 은 컨트롤 (인산 완충 생리식염수) 투여 후, PrRP-31 (10n㏖) 투여, -△- 은 정상 토끼 IgG 투여 후, PrRP-31 (10n㏖) 투여, -●- 은 항-CRF IgG 투여 후, PrRP-31 (10n㏖) 투여를 나타낸다.

도 4 는 항-CRF IgG 및 정상 토끼 IgG 를 경정맥에서 투여하고, 그 30 분 후에 PrRP-31 을 래트의 뇌실내에 투여했을 때의 혈중 β-엔도르핀 농도의 변동을 나타낸다. 도면 중, -○- 은 컨트롤 (인산 완충 생리식염수) 투여 후, PrRP-31 (10n㏖) 투여, -△- 은 정상 토끼 IgG 투여 후, PrRP-31 (10n㏖) 투여, -●- 은 항-CRF IgG 투여 후, PrRP-31 (10n㏖) 투여를 나타낸다. β-엔도르핀농도는 측정값 ±표준오차로 나타냈다. 또, * 는 유의수준 5% 로 유의차가 있는 것을 (n=6-8) 나타낸다.

도 5 는 수침구속 스트레스부하시 뇌척수액 중의 PrRP-31 농도의 변동을 나타낸다.

도 6 은 수침구속 스트레스부하시 혈중 ACTH 농도의 변동을 나타낸다. ACTH 농도는 측정값 ±표준오차로 나타냈다. 또, ** 는 유의수준 1% 로 유의차가 있는 것을 (n=7-8) 나타낸다.

도 7 은 α-나선형 CRF 및 생리식염수를 경정맥에 투여하고, 그 15 분 후에 PrRP-31 을 래트의 뇌실내에 투여했을 때의 혈중 ACTH 농도의 변동을 나타낸다. 도면 중, -●- 은 생리식염수 투여 후, PrRP-31 (10n㏖) 투여, -○- 은 α-나선형 CRH 투여 후, PrRP-31 (10n㏖) 투여를 나타낸다. ACTH 농도는 측정값 ±표준오차로 나타냈다. 또, ** 는 유의수준 1% 로 유의차가 있는 것을 (n=7-8), * 는 유의수준 5% 로 유의차가 있는 것을 (n=7-8) 나타낸다.

본 명세서 및 도면에서 염기, 아미노산 등을 약호로 표시하는 경우, [IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature] 에 의한 약호 또는 당해 분야에서의 관용 약호에 기초하는 것으로, 그 예를 하기에 나타낸다. 또 아미노산에 관해 광학이성체가 존재하는 경우는, 특별히 명시하지 않으면 L 체를 나타내는 것으로 한다.

DNA: 데옥시리보핵산

cDNA: 상보적 디옥시리보핵산

A: 아데닌

T: 티민

G: 구아닌

C: 시토신

RNA: 리보핵산

mRNA: 메신저 리보핵산

ATP: 아데노신3인산

EDTA: 에틸렌디아민4아세트산

SDS: 도데실황산나트륨

EIA: 효소 면역측정법

Gly 또는 G: 글리신

Ala 또는 A: 알라닌

Val 또는 V: 발린

Leu 또는 L: 류신

Ile 또는 I: 이소류신

Ser 또는 S: 세린

Thr 또는 T: 트레오닌

Cys 또는 C: 시스테인

Met 또는 M: 메티오닌

Glu 또는 E: 글루타민산

Asp 또는 D: 아스파라긴산

Lys 또는 K: 리신

Arg 또는 R: 아르기닌

His 또는 H: 히스티딘

Phe 또는 F: 페닐알라닌

Tyr 또는 Y: 티로신

Trp 또는 W: 트립토판

Pro 또는 P: 프롤린

Asn 또는 N: 아스파라긴

Gln 또는 Q: 글루타민

pGlu: 피로글루타민산

Me: 메틸기

Et: 에틸기

Bu: 부틸기

Ph: 페닐기

또, 본 명세서에서 자주 사용되는 치환기, 보호기 및 시약을 다음과 같은 기호로 표기한다.

BHA: 벤즈히드릴아민

pMBHA: p-메틸벤즈히드릴아민

Tos: p-톨루엔술포닐

CHO: 포르밀

HONB: N-히드록시-5-노르보르넨-2,3-디카르복시이미드

OcHex: 시클로헥실 에스테르

Bzl: 벤질

Cl₂-Bzl: 디클로로벤질

Bom: 벤질옥시메틸

Z: 벤질옥시카르보닐

Br-Z: 2-브로모벤질옥시카르보닐

Boc: t-부틸옥시카르보닐

DCM: 디클로로메탄

HOBt: 1-히드록시벤즈트리아졸

DCC: N,N'-디시클로헥실카르보디이미드

TFA: 트리플루오로아세트산

DIEA: 디이소프로필에틸아민

Fmoc: N-9-플루오레닐메톡시카르보닐

DNP: 디니트로페닐

Bum: t-부톡시메틸

Trt: 트리틸

본 명세서에서 「실질적으로 동일」이란, 폴리펩티드의 활성 (예컨대, 리간드와 수용체의 결합활성 등) 또는 폴리펩티드의 CRH 분비조절작용 (예컨대, CRH 분비촉진작용, CRH 분비저해작용 등) 등이 실질적으로 동일함을 의미한다. 따라서, 「실질적으로 동일」한 아미노산서열이란, 폴리펩티드의 활성 (예컨대, 리간드와 수용체의 결합활성 등) 이나 폴리펩티드의 CRH 분비조절작용 (예컨대, CRH 분비촉진작용, CRH 분비저해작용 등) 등이 실질적으로 동일한 (현저한 변화를 발생시키고 있지 않음) 상태가 유지되는 한 변이를 가질 수 있는 아미노산서열을 의미한다.

일반적으로, 폴리펩티드를 코딩하는 아미노산서열 중에서의 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입 (부가) 등의 변이는 그 폴리펩티드의 생리적인 특성이나 화학적인 특성에 큰 (현저한) 변화를 초래하지 않는 경우가 자주 있는 것은 잘 알려진 사실이다. 이 치환의 예로서는, 어떤 아미노산이 성질 (특성) 이 유사한 다른아미노산으로 치환된 것을 들 수 있고, 일반적으로는 특성의 유사성이 강한 아미노산 상호간에 치환이 행해지는 경우일수록 그 치환이 치환전의 원래의 폴리펩티드에 미치는 특성의 변화는 작은 것으로 여겨지고 있다.

아미노산은 그 특성의 유사성을 하나의 기준으로 하여 예컨대 다음과 같은 클래스로 분류된다. (ⅰ) 비극성 (소수성) 아미노산으로는, 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌 등을 들 수 있다. (ⅱ) 극성 (중성) 아미노산으로는, 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민 등을 들 수 있다. (ⅲ) 양전하를 갖는 (염기성) 아미노산으로는, 아르기닌, 리신, 히스티딘 등을 들 수 있다. (ⅳ) 음전하를 갖는 (산성) 아미노산으로는, 아스파라긴산, 글루타민산 등을 들 수 있다.

본 명세서중에서 대상으로 하는 아미노산서열 중의 「실질적으로 동일」한 치환물로는, 예컨대 그 아미노산이 속하는 클래스 중 특성이 유사한 다른 아미노산류로부터 선택되는 경우가 많다.

본 발명에서는 원래의 (무변이의) 폴리펩티드의 생리적인 특성이나 화학적인 특성에 중대한 (현저한) 변화를 초래하지 않는 치환, 결실 또는 삽입 등의 아미노산서열에서의 변이의 결과로 얻어지는 폴리펩티드 (변이형 폴리펩티드) 는, 그와 같은 변이를 갖고 있지 않는 원래의 (무변이의) 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 것으로 간주되고, 또 그 변이형 폴리펩티드의 아미노산서열은 원래의 (무변이의) 폴리펩티드의 아미노산서열과 실질적으로 동일한 것으로 간주된다.

또한, 본 발명에서의 폴리펩티드중의 구성아미노산은 D 체 또는 L 체 중 어느 것이어도 되지만, 특별히 언급하지 않는 한 통상은 L 체가 바람직하다.

본 발명에서의 폴리펩티드는 G단백질 공액형 리셉터 단백질에 대한 리간드 펩티드, 또는 이의 아미드 또는 이의 에스테르 또는 이의 염, 즉 G단백질 공액형 리셉터 단백질에 결합될 수 있는 리간드 폴리펩티드, 또는 이의 아미드 또는 이의 에스테르 또는 이의 염이고, 구체적으로는 예컨대 서열번호: 44 또는 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산서열을 함유하는 폴리펩티드 또는 이의 아미드 또는 이의 에스테르 또는 이의 염 (이하, 간략하게 본 발명의 리간드 폴리펩티드 또는 본 발명의 폴리펩티드라고 약칭하는 경우가 있음) 을 들 수 있다.

여기에서, G단백질 공액형 리셉터 단백질이란, 7 개의 세포막 관통영역을 갖는 공통된 구조를 갖고 있는 리셉터 단백질로 그 대부분은 공액되어 있는 구아닌 뉴클레오티드 결합성 단백질의 활성화를 통하여 세포내의 시그널전달을 행하는 것이다.

서열번호: 44 로 표시되는 이 아미노산서열로서 바람직하게는 서열번호: 3, 18 또는 32 로 표시되는 아미노산서열을 들 수 있고, 특히 서열번호: 32 로 표시되는 아미노산서열로 표시되는 아미노산서열을 들 수 있다.

서열번호: 45 로 표시되는 이 아미노산서열로서 바람직하게는 서열번호: 6, 21 또는 35 로 표시되는 아미노산서열을 들 수 있고, 특히 서열번호: 35 로 표시되는 아미노산서열로 표시되는 아미노산서열을 들 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드로는, 온혈동물 (예컨대, 인간, 모르모트, 래트, 마우스, 돼지, 양, 소, 원숭이 등) 의 모든 조직 (예컨대, 하수체, 췌장, 뇌, 신장, 간, 생식선, 갑상선, 담낭, 골수, 부신, 피부, 근육, 폐, 소화관, 혈관, 심장 등) 또는 세포 등에서 유래되는 폴리펩티드를 들 수 있고, 구체적으로는 예컨대 서열번호: 44 또는 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산서열, 바람직하게는 서열번호: 3, 18 또는 32 또는 서열번호: 6, 21 또는 35 로 표시되는 아미노산서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산서열을 함유하는 것이면 된다.

예컨대, 본 발명의 폴리펩티드로는, 서열번호: 44 또는 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열, 바람직하게는 서열번호: 3, 18 또는 32 또는 서열번호: 6, 21 또는 35 로 표시되는 아미노산서열을 함유하는 폴리펩티드 등에 더하여, 서열번호: 44 또는 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열, 바람직하게는 3, 18 또는 32 또는 서열번호: 6, 21 또는 35 로 표시되는 아미노산서열과 약 50 ∼ 99.9% (바람직하게는 70 ∼ 99.9%, 보다 바람직하게는 80 ∼ 99.9%, 보다 더 바람직하게는 90 ∼ 99.9%) 의 상동성을 갖는 아미노산서열을 함유하거나, 서열번호: 44 또는 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열, 바람직하게는 서열번호: 3, 18 또는 32 또는 서열번호: 6, 21 또는 35 로 표시되는 아미노산서열을 함유하는 폴리펩티드와 실질적으로 동질의 활성을 갖는 폴리펩티드 등을 들 수 있다. 이 활성으로는, 예컨대 리셉터 결합활성, 시그널전달활성 등과 같은, 이 리간드 폴리펩티드가 갖는 활성, 폴리펩티드의 CRH 분비조절작용 (예컨대, CRH 분비촉진작용, CRH 분비저해작용 등) 등을 들 수 있다. 활성이 「실직적으로 동질」이란, 이 리셉터 결합활성,폴리펩티드의 CRH 분비조절작용 (예컨대, CRH 분비촉진작용, CRH 분비저해작용 등) 등의 특성이 동질임을 나타낸다. 따라서, 이 리셉터 결합활성에는 현저하지 않을 정도의 강약이 관찰되어도 되고, 또 이 리간드 폴리펩티드의 분자량은 상이할 수 있다. 인간이나 온혈동물의 동일 속 유래의 실질적으로 동일한 펩티드가 유래되는 종의 차이에 의해 그 펩티드의 본질적이지 않은 아미노산서열상의 차이가 관찰되는 경우가 있는데, 본 발명에서의 폴리펩티드로는 본질적이지 않은 아미노산서열상의 차이에 의한 이들 펩티드도 포함된다.

본 발명의 리간드 폴리펩티드, 그 제조법 및 용도를 이하에 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명의 리간드 폴리펩티드로서 구체적으로는, 예컨대 서열번호: 44 또는 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열을 함유하는 래트, 소, 인간 또는 마우스 유래의 폴리펩티드 등을 들 수 있다 (또한, 서열번호: 44 에서 제 3 번째의 Xaa 는 Thr 또는 Ala, 제 5 번째의 Xaa 는 Arg 또는 Gln, 제 10 번째의 Xaa 는 Ile 또는 Thr, 제 21 번째의 Xaa 는 Thr 또는 Ala, 제 22 번째의 Xaa 는 Gly 또는 Ser 을 나타내고, 서열번호: 45 에서 제 10 번째의 Xaa 는 Thr 또는 Ala, 제 11 번째의 Xaa 는 Gly 또는 Ser 을 나타냄).

또, 본 발명의 리간드 폴리펩티드에는,

(ⅰ) 서열번호: 44 로 표시되는 아미노산서열중의 1 개 이상 15 개 이하, 바람직하게는 1 개 이상 10 개 이하, 보다 바람직하게는 1 개 이상 5 개 이하의 아미노산이 다른 아미노산서열으로 치환된 아미노산서열,

(ⅱ) 서열번호: 44 로 표시되는 아미노산서열중의 1 개 이상 15 개 이하, 바람직하게는 1 개 이상 10 개 이하, 보다 바람직하게는 1 개 이상 5 개 이하의 아미노산이 결실된 아미노산서열,

(ⅲ) 서열번호: 44 로 표시되는 아미노산서열에 1 개 이상 15 개 이하, 바람직하게는 1 개 이상 10 개 이하, 보다 바람직하게는 1 개 이상 5 개 이하의 아미노산이 부가된 (삽입된) 아미노산서열, 및

(ⅳ) 상기 (ⅰ), (ⅱ) 또는 (ⅲ) 의 폴리펩티드중의 구성아미노산 (특히 그 측쇄)이 개질된 아미노산서열

을 함유하는 폴리펩티드 또는 이의 아미드 또는 이의 에스테르 또는 이의 염도 포함된다.

또한, 본 발명의 리간드 폴리펩티드에는,

(ⅴ) 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열중의 1 개 이상 10 개 이하, 바람직하게는 1 개 이상 5 개 이하의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산서열,

(ⅵ) 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열중의 1 개 이상 10 개 이하, 바람직하게는 1 개 이상 5 개 이하의 아미노산이 결실된 아미노산서열,

(ⅶ) 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열에 1 개 이상 10 개 이하, 바람직하게는 1 개 이상 5 개 이하의 아미노산이 부가된 (삽입된) 아미노산서열, 및

(ⅷ) 상기 (ⅴ), (ⅵ) 또는 (ⅶ) 의 폴리펩티드중의 구성아미노산 (특히 그 측쇄)이 개질된 아미노산서열

본 발명의 리간드 폴리펩티드는 그 아미노산서열중에 상기 (ⅰ) 내지 (ⅷ) 의 치환, 결실, 부가, 개질 등을 의도적 또는 우발적으로 실시함으로써, 열이나 프로테아제에 대한 안정형 리간드 폴리펩티드나 이 리간드 폴리펩티드가 갖는 생리활성이 높아진 고활성형 리간드 폴리펩티드로 변이 (변환)될 수 있다. 본 발명에서의 이 리간드 폴리펩티드 또는 이의 아미드, 에스테르 또는 이의 염에는 이들 변이형 리간드 폴리펩티드도 포함된다.

본 명세서에서, 펩티드의 표기는 그 관례에 따라 좌단이 N 말단 (아미노말단), 우단이 C 말단 (카르복실말단) 으로 기재한다.

본 발명의 폴리펩티드중의 구성아미노산에서의 개질의 예로는, 예컨대 Gln 의 N 단측이 생체내에서 절단되어 이 Gln 이 피로글루타민산으로 전환된 것 등을 들 수 있다.

본 발명에서의 폴리펩티드, 예컨대 서열번호: 44 또는 서열번호: 45 로 표시되는 폴리펩티드에서, C 말단 아미노산잔기의 α-카르복실기는 통상은 카르복실기 (-COOH) 또는 카르복실레이트 (-COO^-) 이지만, C 말단 아미노산잔기의 이 카르복실기가 아미드 (-CONH₂) 또는 에스테르 (-COOR) 여도 된다. -COOR 로 표시되는 이 에스테르의 R 로서는, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필 또는 n-부틸 등의 C_1-6알킬기, 시클로펜틸, 시클로헥실 등의 C_3-8시클로알킬기, 페닐, α-나프틸 등의C_6-12아릴기, 벤질, 페네틸 등의 페닐 C_1-2알킬기, 벤즈히드릴 등의 디페닐-C_1-2알킬, 및 α-나프틸메틸 등의 α-나프틸-C_1-2알킬 등의 C_7-14아르알킬기뿐만 아니라, 경구용 에스테르로서 범용되는 피발로일옥시메틸기 등을 들 수 있다.

또, 본 발명에서의 폴리펩티드, 예컨대 서열번호: 44 또는 서열번호: 45 로 표시되는 폴리펩티드가, C 말단 이외에 카르복실기 또는 카르복실레이트를 갖고 있는 경우, 이들 기가 아미드화 또는 에스테르화되어 있는 폴리펩티드도 본 발명의 폴리펩티드에 포함된다. 이 경우의 에스테르로는, 예컨대 전술한 C 말단 아미노산잔기의 에스테르 등과 동일하다.

본 발명의 리간드 폴리펩티드로는 특히 C 말단 아미노산잔기의 카르복실기가 아미드화된 펩티드가 바람직하다. 서열번호: 44 또는 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열을 갖는 폴리펩티드, 그 중에서도 서열번호: 3, 6, 18, 21, 32 또는 35 로 표시되는 아미노산서열을 갖는 폴리펩티드 (특히 서열번호: 32 또는 35 로 표시되는 아미노산서열을 갖는 폴리펩티드) 의 C 말단 아미노산잔기의 카르복실기가 아미드화된 폴리펩티드가 바람직하다.

본 발명의 폴리펩티드의 염으로는, 생리학적으로 허용되는 염기 (예컨대 알칼리금속 등) 나 산 (유기산, 무기산) 과의 염이 사용되는데, 특히 생리학적으로 허용되는 산부가염이 바람직하다. 이와 같은 염으로는 예컨대 무기산 (예컨대, 염산, 인산, 브롬화수소산, 황산) 과의 염, 또는 유기산 (예컨대, 아세트산, 포름산, 프로피온산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 말산, 옥살산,벤조산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산) 과의 염 등을 들 수 있다.

본 발명의 리간드 폴리펩티드는 (ⅰ) 인간이나 온혈동물의 조직 또는 세포로부터 폴리펩티드를 정제하는 방법으로 제조할 수 있거나 (ⅱ) 공지된 폴리펩티드합성법에 준하여 제조할 수도 있다. 또한, (ⅲ) 이 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 를 함유하는 형질전환체를 배양하는 방법 (후술) 으로 제조할 수도 있다.

(ⅰ) 이 리간드 폴리펩티드를 인간이나 온혈동물의 조직 또는 세포로부터 제조하는 경우, 인간이나 온혈동물의 조직 또는 세포를 균질화시킨 후 산 등으로 추출하고, 이 추출액을 역상 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등의 크로마토그래피를 조합함으로써 정제 단리할 수 있다.

(ⅱ) 이 리간드 폴리펩티드는 자체 공지된 폴리펩티드의 합성법에 따라 제조할 수도 있다. 펩티드의 합성법으로는, 예컨대 고상 합성법, 액상 합성법 중 어느 방법이어도 된다. 즉, 리간드 폴리펩티드를 구성할 수 있는 부분 펩티드 또는 아미노산과 잔여부분을 축합시키고, 생성물이 보호기를 갖는 경우는 보호기를 탈리시킴으로써 목적으로 하는 펩티드를 제조할 수 있다. 이 경우의 공지된 축합방법이나 보호기의 탈리방법으로는 예컨대, 이하의 ① ∼ ⑤ 에 기재된 방법을 들 수 있다.

① [M. Bodanszky 및 M.A. Ondetti: Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966 년)]

② [Schroeder 및 Luebke: The Peptide, Academic Press, New York (1965 년)]

③ [Nobuo Izumiya 등: Fundamentals and Experiments in Peptide Synthesis,Maruzen, (1975 년)]

④ [Haru'aki Yajima 및 Shunpei Sakakibara: Biochemical Experiment Series 1:

Protein Chemistry Ⅳ, 205, (1977 년)]

⑤ [Haru'aki Yajima 감수, Development of Drugs-Continued, 제 14 권, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten]

상기 (ⅱ) 의 이 리간드 폴리펩티드의 합성법으로 구체적으로는, 예컨대 다음 방법 등을 들 수 있다.

이 리간드 폴리펩티드의 아미드체를 합성하기 위해서는 아미드형성에 적합한 펩티드합성용 수지를 사용하면 된다. 그와 같은 수지로는 예컨대 클로로메틸수지, 히드록시메틸수지, 벤즈히드릴아민수지, 아미노메틸수지, 4-벤질옥시벤질알코올수지, 4-메틸벤즈히드릴아민수지, PAM 수지, 4-히드록시메틸메틸페닐아세트아미드메틸수지, 폴리아크릴아미드수지, 4-(2',4'-디메톡시페닐-히드록시메틸)페녹시수지, 4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc 아미노에틸)페녹시수지 등을 들 수 있다. 이와 같은 수지를 사용하여, α-아미노기와 측쇄 관능기가 공지된 적당한 보호기로 보호된 아미노산을, 자체 공지된 각종 축합방법에 따라 목적으로 하는 펩티드의 서열과 같이 이 수지상에서 축합시킨다. 반응 마지막에 수지로부터 펩티드를 절단함과 동시에 각종 보호기를 제거하여 목적으로 하는 폴리펩티드를 취득할 수 있다.

전술한 보호된 아미노산을 축합시키기 위해서 펩티드합성에 사용할 수 있는 각종 활성화 시약을 사용할 수 있지만, 특히 카르보디이미드류가 바람직하다.카르보디이미드류로는, DCC, N,N'-디이소프로필카르보디이미드, N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프롤릴)카르보디이미드 등을 들 수 있다.

이들에 의한 활성화에는 라세미화 억제첨가제 (예컨대, HOBt) 와 함께 보호된 아미노산을 직접 수지에 첨가하거나, 또는 대칭 산무수물 또는 HOBt 에스테르 또는 HOOBt 에스테르로서 미리 보호된 아미노산의 활성화를 행한 후에 수지에 첨가할 수 있다. 보호된 아미노산의 활성화나 수지와의 축합에 사용되는 용매로는, 펩티드축합반응에 사용이 가능한 공지된 용매에서 적절하게 선택하면 된다. 이 용매로는, 예컨대 N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 산아미드류, 염화메틸렌, 클로로포름 등의 할로겐화 탄화수소류, 트리플루오로에탄올 등의 알코올류, 디메틸술폭시드 등의 술폭시드류, 피리딘 등의 3 급 아민류, 디옥산, 테트라히드로푸란 등의 에테르류, 아세토니트릴, 프로피오니트릴 등의 니트릴류, 아세트산메틸, 아세트산에틸 등의 에스테르류 또는 이들의 적절한 혼합물 등을 들 수 있다. 이 축합반응에서의 반응온도는 공지된 펩티드 결합형성반응에 사용이 가능한 온도범위에서 적절하게 선택하면 되고, 통상 약 -20℃ ∼ 50℃ 의 범위를 들 수 있다. 이 활성화된 아미노산 유도체는 통상 1.5 ∼ 4 배 과잉으로 사용된다. 축합도는 공지된 닌히드린반응을 사용하여 확인할 수 있고, 그 결과 축합이 불충한 경우에는 보호기의 탈리를 행하지 않고 축합반응을 반복함으로써 충분한 축합을 행할 수 있다. 반응을 반복해도 충분한 축합을 얻을 수 없을 때에는 무수아세트산 또는 아세틸이미다졸을 사용하여 미반응아미노산을 아세틸화시킴으로써, 이후의 반응에 영향을 미치지 않도록 할 수도 있다.

이 펩티드합성시에 원료가 되는 아미노산의 아미노기의 보호기로는, 예컨대 Z, Boc, tert-아밀옥시카르보닐, 이소보르닐옥시카르보닐, 4-메톡시벤질옥시카르보닐, Cl-Z, Br-Z, 아다만틸옥시카르보닐, 트리플루오로아세틸, 프탈릴, 포르밀, 2-니트로페닐술페닐, 디페닐포스피노티오일, Fmoc 등을 들 수 있다. 카르복실기의 보호기로는, 예컨대 전술한 C_1-6알킬기, C_3-8시클로알킬기, C_7-14아르알킬기뿐만 아니라, 2-아다만틸, 4-니트로벤질, 4-메톡시벤질, 4-클로로벤질, 페나실기 및 벤질옥시카르보닐 히드라지드, tert-부톡시카르보닐 히드라지드, 트리틸 히드라지드 등을 들 수 있다.

세린 및 트레오닌의 수산기는, 예컨대 에스테르화 또는 에테르화에 의해 보호할 수 있다. 이 에스테르화에 적합한 기로는 예컨대 아세틸기 등의 저급 (C_1-6) 알카노일기, 벤조일기 등의 아로일기, 벤질옥시카르보닐기, 에톡시카르보닐기 등의 탄산에서 유도되는 기 등을 들 수 있다. 또, 에테르화에 적합한 기로는, 예컨대 벤질기, 테트라히드로피라닐기, tert-부틸기 등이다.

티로신의 페놀성 수산기의 보호기로는, 예컨대 Bzl, Cl₂-Bzl, 2-니트로벤질, Br-Z, tert-부틸 등을 들 수 있다.

히스티딘의 이미다졸의 보호기로는, Tos, 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐, DNP, 벤질옥시메틸, Bum, Boc, Trt, Fmoc 등을 들 수 있다.

본 발명의 리간드 폴리펩티드 또는 이의 아미드 또는 이의 에스테르로는, 예컨대 상기한 서열번호: 44 또는 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산서열을 함유하는 폴리펩티드와 동일한 CRH 분비조절작용을 갖고 있는 한, 그 아미노산서열에 변이를 갖는 어떠한 펩티드여도 된다. 이와 같은 펩티드로는, 예컨대 서열번호: 44 로 표시되는 아미노산서열을 갖는 펩티드에서 1 개 이상 20 개 이하의 아미노산이 결실된 아미노산서열을 갖는 펩티드를 들 수 있다. 구체적으로는, 예컨대 (a) 서열번호: 44 로 표시되는 아미노산서열의 제 2 번째 내지 제 31 번째의 아미노산서열을 갖는 펩티드, (b) 서열번호: 44 로 표시되는 아미노산서열의 제 3 번째 내지 제 31 번째의 아미노산서열을 갖는 펩티드, (c) 서열번호: 44 로 표시되는 아미노산서열의 제 4 번째 내지 제 31 번째의 아미노산서열을 갖는 펩티드, (d) 서열번호: 44 로 표시되는 아미노산서열의 제 5 번째 내지 제 31 번째의 아미노산서열을 갖는 펩티드, (e) 서열번호: 44 로 표시되는 아미노산서열의 제 6 번째 내지 제 31 번째의 아미노산서열을 갖는 펩티드, (f) 서열번호: 44 로 표시되는 아미노산서열의 제 7 번째 내지 제 31 번째의 아미노산서열을 갖는 펩티드, (g) 서열번호: 44 로 표시되는 아미노산서열의 제 8 번째 내지 제 31 번째의 아미노산서열을 갖는 펩티드, (h) 서열번호: 44 로 표시되는 아미노산서열의 제 9 번째 내지 제 31 번째의 아미노산서열을 갖는 펩티드, (i) 서열번호: 44 로 표시되는 아미노산서열의 제 10 번째 내지 제 31 번째의 아미노산서열을 갖는 펩티드, (j) 서열번호: 44 로 표시되는 아미노산서열의 제 11 번째 내지 제 31 번째의 아미노산서열을 갖는 펩티드, (k) 서열번호: 44 로 표시되는 아미노산서열의 제 12 번째 내지 제 31 번째의 아미노산서열을 갖는 펩티드, (l) 서열번호: 44 로 표시되는 아미노산서열의 제 13 번째 내지 제 31 번째의 아미노산서열을갖는 펩티드, (m) 서열번호: 44 로 표시되는 아미노산서열의 제 14 번째 내지 제 31 번째의 아미노산서열을 갖는 펩티드, (n) 서열번호: 44 로 표시되는 아미노산서열의 제 15 번째 내지 제 31 번째의 아미노산서열을 갖는 펩티드, (o) 서열번호: 44 로 표시되는 아미노산서열의 제 16 번째 내지 제 31 번째의 아미노산서열을 갖는 펩티드, (p) 서열번호: 44 로 표시되는 아미노산서열의 제 17 번째 내지 제 31 번째의 아미노산서열을 갖는 펩티드, (q) 서열번호: 44 로 표시되는 아미노산서열의 제 18 번째 내지 제 31 번째의 아미노산서열을 갖는 펩티드, (r) 서열번호: 44 로 표시되는 아미노산서열의 제 19 번째 내지 제 31 번째의 아미노산서열을 갖는 펩티드, (s) 서열번호: 44 로 표시되는 아미노산서열의 제 20 번째 내지 제 31 번째의 아미노산서열을 갖는 펩티드, (t) 서열번호: 44 로 표시되는 아미노산서열의 제 21 번째 내지 제 31 번째의 아미노산서열을 갖는 펩티드 등이 바람직하다.

서열번호: 44 로 표시되는 아미노산서열로서 보다 바람직한, 서열번호: 3, 18, 또는 32 에 대해서도 서열번호: 44 로 표시되는 아미노산서열에 대해 예시한 바와 같이 그 아미노산서열에 변이를 갖고 있어도 된다.

또, 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열을 갖는 펩티드에서 1 개 이상 10 개 이하의 아미노산이 결실된 아미노산서열을 갖는 펩티드를 들 수 있다. 구체적으로는, 예컨대 (a) 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열의 제 2 번째 내지 제 20 번째의 아미노산서열을 갖는 펩티드, (b) 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열의 제 3 번째 내지 제 20 번째의 아미노산서열을 갖는 펩티드, (c) 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열의 제 4 번째 내지 제 20 번째의 아미노산서열을갖는 펩티드, (d) 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열의 제 5 번째 내지 제 20 번째의 아미노산서열을 갖는 펩티드, (e) 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열의 제 6 번째 내지 제 20 번째의 아미노산서열을 갖는 펩티드, (f) 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열의 제 7 번째 내지 제 20 번째의 아미노산서열을 갖는 펩티드, (g) 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열의 제 8 번째 내지 제 20 번째의 아미노산서열을 갖는 펩티드, (h) 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열의 제 9 번째 내지 제 20 번째의 아미노산서열을 갖는 펩티드, (i) 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열의 제 10 번째 내지 제 20 번째의 아미노산서열을 갖는 펩티드, (j) 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열의 제 11 번째 내지 제 20 번째의 아미노산서열을 갖는 펩티드 등이 바람직하다.

또, 본 발명의 리간드 폴리펩티드로는, 서열번호: 1 또는 서열번호: 15 의 아미노산서열을 함유하는 래트 전체 뇌 또는 소 시상하부 유래의 폴리펩티드 등도 들 수 있고, 이들 폴리펩티드에 대해서도 서열번호: 44 또는 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열에 대해 예시한 바와 같이 그 아미노산서열에 변이를 갖고 있어도 된다. 또, 이들 폴리펩티드는 서열번호: 44 또는 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열을 갖는 폴리펩티드의 전구체로서 들 수도 있다.

또한, 본 발명의 리간드 폴리펩티드로는, 상기에 더하여 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 19, 서열번호: 20, 서열번호: 22, 서열번호: 23, 서열번호: 33, 서열번호: 34, 서열번호: 36 또는 서열번호: 37 로 표시되는 아미노산서열을 갖는 폴리펩티드 등도 들 수 있고, 이들 폴리펩티드에 대해서도 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열에 대해 예시한 바와 같이 그 아미노산서열에 변이를 갖고 있어도 된다.

서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열로서 보다 바람직한, 서열번호: 6, 21 또는 35 에 대해서도 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열에 대해 예시한 바와 같이 그 아미노산서열에 변이를 갖고 있어도 된다.

본 발명의 리간드 폴리펩티드는 또한 다른 단백질 (예, 기능 또는 성질이 잘 알려져 있는 공지된 단백질) 과의 융합단백질이어도 된다.

본 발명의 리간드 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 로는, 본 발명에서의 서열번호: 44 또는 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산서열을 함유하는 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열을 함유하는 것이면 어떠한 것이어도 된다. 또, 게놈 DNA, 게놈 DNA 라이브러리, 조직ㆍ세포 유래의 cDNA, 조직ㆍ세포 유래의 cDNA 라이브러리, 합성 DNA 중 어느 것이어도 된다. 라이브러리에 사용하는 벡터는 박테리오파아지, 플라스미드, 코스미드, 파아지미드 등 어느 것이어도 된다. 또, 조직ㆍ세포로부터 RNA 분획을 제조한 것을 사용하여 직접 RT-PCR (reverse transcription PCR) 법으로 증폭시킬 수도 있다.

보다 구체적으로는, 서열번호: 1 또는 서열번호: 15 의 아미노산서열을 함유하는 래트 전체 뇌 또는 소 시상하부 유래의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 로는, 서열번호: 2 로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA 등이 사용된다.

여기에서, 서열번호: 2 에서 제 129 번째의 R 은 G 또는 A 를, 제 179 번째 및 240 번째의 Y 는 C 또는 T 를 나타낸다. 제 179 번째의 Y 가 C 일 때, 서열번호: 1 로 표시되는 아미노산서열을 코딩하고, 제 179 번째의 Y 가 T 일 때, 서열번호: 15 로 표시되는 아미노산서열을 코딩한다.

또, 서열번호: 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 로 표시되는 아미노산서열을 함유하는 소 유래 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 로는, 각각 서열번호: 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA 등이 사용된다. 여기에서, 서열번호: 9, 10, 11 의 제 63 번째의 R 및 서열번호: 12, 13, 14 의 제 30 번째의 R 은 G 또는 A 를 나타낸다.

또, 서열번호: 16, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23 으로 표시되는 래트 유래 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 로는, 각각 서열번호: 17, 24, 25, 26, 27, 28 또는 29 로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA 등이 사용된다.

또한, 서열번호: 30, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37 으로 표시되는 인간 유래 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 로는, 각각 서열번호: 31, 38, 39, 40, 41, 42 또는 43 으로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA 등이 사용된다.

또, 본 발명에서의 서열번호: 1, 서열번호: 15 로 표시되는 아미노산서열을 함유하는 소형 폴리펩티드, 서열번호: 16 으로 표시되는 아미노산서열을 함유하는 래트형 폴리펩티드, 또는 서열번호: 30 으로 표시되는 아미노산서열을 함유하는 인간형 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 중에서 예컨대 6 개 이상 90 개 이하 (바람직하게는 6 개 이상 60 개 이하, 보다 바람직하게는 9 개 이상 30 개 이하, 보다 더 바람직하게는 12 개 이상 30 개 이하) 의 부분염기서열을 함유하는 DNA 단편은 DNA 검출프로브로서도 바람직하게 사용된다.

(ⅲ) 본 발명에서의 폴리펩티드는 이하에 기재하는 바와 같이, 이 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 를 함유하는 형질전환체를 배양하는 방법으로 제조할 수도 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 완전하게 코딩하는 DNA 의 클로닝 (클론화) 은, 이하의 방법에 따라 행할 수 있다. 즉, (1) 이 폴리펩티드의 부분염기서열을 갖는 DNA 를 합성하고, 이것을 프라이머로서 사용하여 PCR 법으로 이 폴리펩티드를 완전하게 코딩하는 DNA 를 증폭하거나, 또는 (2) cDNA 또는 게놈 DNA, 또는 그 DNA 단편을 적당한 벡터에 삽입하여 얻어지는 DNA 라이브러리를, 예컨대 이 리간드 폴리펩티드의 일부 또는 전체 영역을 갖는 표지된 DNA 단편 또는 합성 DNA 를 사용하여 혼성화시킴으로써 선별하면 된다. 이 혼성화 방법은, 예컨대 [Molecular Cloning (2nd ed.; J.Sambrook 등, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)] 등에 기재된 방법에 따라 실시하면 된다. 또, DNA 라이브러리로서 시판되는 것을 사용할 경우는, 첨부된 사용설명서에 기재된 방법에 따라 실시하면 된다.

DNA 의 염기서열의 변환은, PCR 이나 공지된 키트, 예컨대 Mutan^TM-super Express Km (다까라슈조 (주)), Mutan^TM-K (다까라슈조 (주)) 등을 사용하여, ODA-LA PCR 법이나 갭 듀플렉스 (Gapped duplex) 법이나 쿤켈 (Kunkel) 법 등의 자체 공지된 방법 또는 이들에 준하는 방법에 따라 행할 수 있다.

클론화된 이 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 는 그대로 사용해도, 또는 원하는 바에 따라 제한효소로 절단한 후 또는 링커 DNA 를 부가시킨 후에 사용해도 된다.이 DNA 는 그 5' 말단측에 번역 개시 코돈으로서의 ATG 를 갖고, 또 3' 말단측에 번역 종결 코돈으로서의 TAA, TGA 또는 TAG 를 갖고 있어도 된다. 이들 번역 개시 코돈이나 번역 종지 코돈은 적당한 합성 DNA 어댑터를 사용하여 부가할 수 있다.

이 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열을 갖는 DNA 를 함유하는 발현 벡터는, 예컨대 (a) 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 를 함유하는 DNA 로부터 목적으로 하는 DNA 단편을 절단하고, (b) 이 DNA 단편을 공지된 적당한 발현 벡터중의 프로모터서열의 하류에 결찰시킴으로써 제조할 수 있다.

이 벡터로는, 대장균 유래의 플라스미드 (예, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 유래의 플라스미드 (예, pUB110, pTP5, pC194), 효모 유래 플라스미드 (예, pSH19, pSH15), λ파아지 등의 박테리오파아지, 레트로 바이러스, 백시니아 바이러스, 배큘로바이러스 등의 동물 바이러스 등이 사용된다. 이 프로모터로는, 목적으로 하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현에 사용되는 숙주에서 적절하게 기능하는 프로모터이면 어느 것이어도 된다.

형질전환할 때의 숙주가 에쉐리키아속 균인 경우는, trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, λPL 프로모터, lpp 프로모터 등이 바람직하고, 숙주가 바실러스속 균인 경우는, SPOl 프로모터, SPO2 프로모터, penP 프로모터 등이 바람직하며, 숙주가 효모인 경우는, PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터 등이 바람직하다. 숙주가 동물세포인 경우에는, SV40 유래의 프로모터,레트로바이러스 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 열충격 (heat shock) 프로모터, 사이토메갈로 바이러스 프로모터, SPα프로모터 등을 각각 바람직하게 들 수 있다. 또한, 목적으로 하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 효율적으로 발현시키기 위해서는 인핸서 (enhancer)를 사용하는 것이 바람직하다.

또, 필요에 따라 숙주에 맞는 시그널서열을 폴리펩티드의 N 단말측에 부가시킨다. 숙주가 에쉐리키아속 균인 경우는 알칼리 포스파타아제ㆍ시그널서열, OmpAㆍ시그널서열 등을, 숙주가 바실러스속 균인 경우는 α-아밀라아제ㆍ시그널서열, 서브틸리신ㆍ시그널서열을, 숙주가 효모인 경우는 MFαㆍ시그널서열, 인버타아제ㆍ시그널서열을, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린ㆍ시그널서열, α-인터페론ㆍ시그널서열, 항체 분자ㆍ시그널서열 등을 각각 이용할 수 있다. 이렇게 해서 구축된 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 함유한 벡터를 이용하여 형질전환체를 제조한다.

형질전환할 때의 숙주로서는 예컨대 공지된 에쉐리키아속 균, 바실러스속 균, 효모, 곤충, 동물세포 등을 들 수 있다.

에쉐리키아속 균의 구체예로서는, 예컨대 에쉐리키아 콜리 (Escherichia coli) K12ㆍDH1 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 제 60 권, 160 페이지 (1968 년)], JM103 [Nucleic Acids Research, 제 9 권, 309 페이지 (1981 년)], JA221 [Journal of Molecular Biology, 제 120 권, 517 페이지 (1978 년)], HB101 [Journal of Molecular Biology, 제 41 권, 459 페이지 (1969 년)], C600 [Genetics, 제 39 권, 440 페이지 (1954 년)] 등을 들 수 있다.

바실러스속 균의 구체예로서는, 예컨대 바실루스 서브틸리스 MI114 [Gene, 제 24 권, 255 페이지 (1983 년)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 제 95 권, 87 페이지 (1984 년)] 등을 들 수 있다.

효모로서는, 예컨대 사카로미세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22R^-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12 등을 들 수 있다.

곤충으로서는, 예컨대 누에의 유충 등을 들 수 있다 [마에다 등, Nature, 제 315 권, 592 페이지 (1985 년)].

동물세포로서는, 예컨대 원숭이 세포 COS-7, Vero, 차이니스 햄스터 세포 CHO, DHFR 유전자 결실 차이니스 햄스터 세포 CHO (dhfr^-CHO 세포), 마우스 L 세포, 마우스 골수종 세포, 인간 FL 세포 등을 들 수 있다.

에쉐리키아속 균을 형질전환시키기 위해서는, 예컨대 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 제 69 권, 2110 페이지 (1972 년)] 이나 [Gene, 제 17 권, 107 페이지 (1982 년)] 등에 기재된 방법에 따라 실시하면 된다.

바실러스속 균을 형질전환시키기 위해서는, 예컨대, [Molecular & General Genetics, 제 168 권, 111 페이지 (1979 년)] 등에 기재된 방법에 따라 실시하면 된다.

효모를 형질전환시키기 위해서는, 예컨대 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 제 75 권, 1929 페이지 (1978 년)] 등에 기재된 방법에 따라 실시하면 된다.

곤충세포를 형질전환시키기 위해서는, 예컨대 [Bio/Technology, 제 6 권, 47페이지 (1988 년)] 등에 기재된 방법에 따라 실시하면 된다.

동물세포를 형질전환시키기 위해서는, 예컨대 [Virology, 제 52 권, 456 페이지 (1973 년)] 등에 기재된 방법에 따라 실시하면 된다.

이렇게 해서 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 함유한 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 얻을 수 있다.

숙주가 에쉐리키아속 균, 바실러스속 균인 형질전환체를 배양할 때의 배지로서는 액체 배지가 바람직하고, 그 중에는 이 형질전환체의 성장에 필요한 탄소원, 질소원, 미네랄 기타를 함유하도록 제조된다. 탄소원으로서는 예컨대 글루코스, 덱스트린, 가용성 전분, 수크로오스 등이, 질소원으로서는 예컨대 암모늄염류, 질산염류, 옥수수 침지수 (corn steep liquor), 펩톤, 카제인, 고기 추출액, 대두박, 감자 추출액 등과 같은 무기 또는 유기물질이, 미네랄로서는 예컨대 염화칼슘, 인산2수소나트륨, 염화마그네슘 등을 들 수 있다. 또, 이 배지중에는 효모 추출액, 비타민류, 생장촉진인자 등을 필요에 따라 첨가해도 된다. 이 배지의 pH 는 형질전환체가 성장하는 pH 이면 어느 정도라도 되지만, pH 는 통상 약 5 ∼ 8 이 바람직하다.

에쉐리키아속 균을 배양할 때의 배지로서는 예컨대 글루코스, 카자미노산을 함유한 M9 배지 [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431 페이지, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972 년] 가 바람직하다. 필요에 따라 프로모터를 효율적으로 작동시키기 위해서, 예컨대 3β-인돌릴 아크릴산과 같은 약제를 첨가하여 배양해도 된다. 숙주가 에쉐리키아속 균인 경우, 배양은 통상 약 15℃ ∼ 43℃ 에서 약 3 ∼ 24 시간 행하고, 필요에 따라 통기나 교반할 수도 있다.

숙주가 바실러스속 균인 경우, 배양은 통상 약 30℃ ∼ 40℃ 에서 약 6 ∼ 24 시간 행하고, 필요에 따라 통기나 교반할 수도 있다.

숙주가 효모인 형질전환체를 배양할 때에 배지로서는, 예컨대 부르크홀더 (Burkholder) 최소 배지 [Bostian, K.L.외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 제 77 권, 4505 페이지 (1980 년)] 나 0.5% 카자미노산을 함유한 SD 배지 [Bitter, G.A. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 제 81 권, 5330 페이지 (1984 년)] 를 들 수 있다.

배지의 pH 는 약 5 ∼ 8 로 조정하는 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 20℃ ∼ 35℃ 에서 약 24 ∼ 72 시간 동안 행하고, 필요에 따라 통기나 교반할 수도 있다.

숙주가 곤충인 형질전환체를 배양할 때에, 배지로서는 그레이스의 곤충 배지 (Grace's Insect Medium) (Grace, T.C.C., Nature, 제 195 권, 788 페이지 (1962 년)) 에 비활성화된 10% 소 혈청 등의 첨가물을 적절하게 첨가한 것 등이 사용된다. 배지의 pH는 약 6.2 ∼ 6.4 로 조정하는 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 27℃ 에서 약 3 ∼ 5 일간 행하고, 필요에 따라 통기나 교반할 수도 있다.

숙주가 동물세포인 형질전환체를 배양할 때에, 배지로서는 예컨대 약 5 ∼ 20% 의 소 태아 혈청을 함유한 MEM 배지 [Science, 제 122 권, 501 페이지 (1952 년)], DMEM 배지 [Virology, 제 8 권, 396 페이지 (1959 년)], RPMI 1640 배지[The Journal of the American Medical Association 제 199 권, 519 페이지 (1967 년)], 199 배지 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 제 73 권, 1 페이지 (1950 년)] 등을 들 수 있다. pH 는 약 6 ∼ 8 인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 30℃ ∼ 40℃ 에서 약 15 ∼ 60 시간 행하고, 필요에 따라 통기나 교반할 수도 있다.

상기 배양물 (배양액 및 배양균체 또는 배양세포) 로부터 폴리펩티드를 분리 정제하기 위해서는, 예컨대 다음과 같은 방법으로 실시하면 된다.

이 폴리펩티드가 배양균체중 또는 배양세포중에 축적되는 경우는, 배양 후 공지 방법으로 균체 또는 세포를 모아 이것을 적당한 완충액에 현탁시킨 후, 공지된 초음파처리, 리소자임처리 및/또는 동결융해처리 등으로 균체 또는 세포를 파괴하고, 이어서 공지된 원심분리나 여과 등의 조작에 의해 목적으로 하는 폴리펩티드는 추출액으로서 얻을 수 있다. 이 완충액 중에는 요소나 염산구아니딘 등과 같은 단백질 변성제나 트리톤 X-100 (와꼬쥰야꾸 (주) 등, 등록상표: 이하, TM 이라고 생략하는 경우가 있음) 등과 같은 계면활성제를 필요에 따라 첨가하여 사용해도 된다.

한편, 배양액중에 폴리펩티드가 분비되는 경우에는, 배양 후, 우선 배양균체 또는 배양세포와 배양상층액을 공지된 방법으로 분리하여 배양상층액으로 얻을 수 있다.

얻어지는 배양상층액 또는 추출액중에 함유되는 폴리펩티드의 정제는 자체 공지된 분리ㆍ정제법을 적절하게 조합하여 실시할 수 있다. 이들의 공지된 분리, 정제법으로는, (1) 염석이나 용매 침전법 등과 같은 용해도를 이용하는 방법, (2) 투석법, 한외여과법, 겔여과법 및 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동법 등과 같은 주로 분자량의 차이를 이용하는 방법, (3) 이온 교환 크로마토그래피 등의 하전의 차이를 이용하는 방법, (4) 친화 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법, (5) 역상 고속 액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차이를 이용하는 방법, (6) 등전점 전기영동법이나 크로마토포커싱 등의 등전점의 차이를 이용하는 방법 등을 들 수 있다.

폴리펩티드가 유리체로 얻어지는 경우에는, 자체 공지 방법 또는 이에 준하는 방법으로 염으로 변환시킬 수 있고, 반대로 염으로 얻어진 경우에는 자체 공지 방법 또는 이에 준하는 방법으로 유리체 또는 다른 염으로 변환시킬 수 있다.

또한, 폴리펩티드의 정제 전 또는 정제 후, 이것에 공지된 방법에 따라 적당한 단백질 개질 효소를 작용시킴으로써 이 폴리펩티드를 임의로 개질시키거나 이 폴리펩티드중의 서열을 부분적으로 제거할 수도 있다. 이 단백질 개질 효소로는 예컨대, 트립신, 키모트립신, 아르기닐 엔도펩티다아제, 단백질 키나아제, 글리코시다아제 등을 들 수 있다. 이렇게 해서 얻어지는 변이 폴리펩티드의 활성은 리셉터와의 결합실험이나 특이 항체를 사용한 효소면역측정법 등에 의해 측정할 수 있다.

본 발명의 리간드 폴리펩티드는 CRH 분비의 조절작용, 즉 CRH 분비의 촉진 및 억제작용을 갖는다. 즉, 본 발명의 리간드 폴리펩티드는 후술하는 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, CRH 분비의 촉진작용을 갖기 때문에, CRH 분비부전에 관련되는 각종 질환의 예방 및 치료약 (의약ㆍ동물약) 에 사용할 수 있다. 한편, 본 발명의 리간드 폴리펩티드는, 리셉터 단백질과의 친화성이 강하기 때문에, 투여량이 증가하면 CRH 분비에 대해 탈감작 (desensitization) 이 발생되어, CRH 분비를 억제하는 작용도 갖는다. 이 경우, CRH 과잉분비에 관련되는 각종 질환의 예방 및 치료약에 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명의 리간드 폴리펩티드는 CRH 분비촉진제로서, 저알도스테론증, 저코르티솔 혈증, 속발성 및 만성 부신피질 기능저하증, 애디슨병 (권태, 오심, 색소침착, 성기능저하, 탈모, 저혈압), 부신기능부전 및 비만증 등의 CRH 분비에 관련되는 각종 질환의 개선, 예방 및, 치료약으로 유용할 뿐만 아니라 진통약으로도 유용하다.

또, 본 발명의 리간드 폴리펩티드는 CRH 분비억제제로서, 쿠싱병, 쿠싱증후군 (중심성 비만, 만월상안모, 고혈압, 홍자색 피부 선조, 다모), 부신피질 자극호르몬 (ACTH) 생산 하수체 종양, CRH 생산 종양, 알도스테론 생산 종양, 알도스테론증 (원발성, 속발성), 원발성 코르티솔 저항증, 선천성 부신효소 결핍증, 항스트레스, 울병, 신경성 식욕부진증, 불면, 위ㆍ십이지장 궤양 및 과민성 장증후군 등의 CRH 분비에 관련되는 각종 질환의 개선, 예방 및 치료약으로 유용하다.

본 발명의 리간드 폴리펩티드는 CRH 분비기능을 조사하기 위한 검사약으로도 유용하다.

본 발명의 폴리펩티드를 전술한 의약 또는 동물약으로 사용하는 경우는, 통상적인 방법에 따라 제제화하면 된다. 예컨대 필요에 따라 당으로 코팅된 정제, 캡슐제, 엘릭시르제, 마이크로캡슐제 등으로서 경구적으로, 또는 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 액과의 무균성 용액 또는 현탁액제 등의 주사제 형태로 비경구적으로, 또는 점비제로서 사용할 수 있다. 예컨대, 이 폴리펩티드 또는 이의 염을 생리학적으로 인정되는 담체, 향미제, 부형제, 비히클, 방부제, 안정제, 결합제 등과 함께 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위용량 형태로 혼화시킴으로써 제조할 수 있다. 이들 제제에서의 유효 성분량은 지시된 범위의 적당한 용량을 얻을 수 있도록 하는 것이다.

정제, 캡슐제 등에 혼화될 수 있는 첨가제로서는, 예컨대 젤라틴, 옥수수전분, 트라간트검, 아라비아고무와 같은 결합제, 결정성 셀룰로오스와 같은 부형제, 옥수수전분, 젤라틴, 알긴산 등과 같은 팽화제, 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제, 수크로오스, 락토오스 또는 사카린과 같은 감미제, 페파민트, 아까모노오일 또는 체리와 같은 향미제 등이 사용된다. 제조단위 형태가 캡슐인 경우에는 상기 타입의 재료에 추가로 유지와 같은 액상 담체를 함유시킬 수 있다. 주사용 무균조성물은 주사용수와 같은 비히클중에 활성물질, 참기름, 야자유 등과 같은 천연산출 식물유 등을 용해 또는 현탁시키는 등 통상적인 제제 실시에 따라 처방할 수 있다.

주사용 수성액으로서는 예컨대 생리식염수, 글루코스나 그 외의 보조약을 함유한 등장액 (예컨대, D-소르비톨, D-만니톨, 염화나트륨 등) 등을 들 수 있고, 적당한 용해보제조, 예컨대 알코올 (예컨대, 에탄올 등), 폴리알코올 (예컨대, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온성 계면활성제 (예컨대, 폴리소르베이트80(^TM), HCO-50) 등과 병용해도 된다. 유성액으로서는 참기름, 대두유 등을 들 수 있고, 용해보제조로서 벤조산벤질, 벤질알코올 등과 병용해도 된다. 또, 완충제 (예컨대, 인산염 완충액, 아세트산나트륨 완충액), 무통화제 (예컨대, 염화벤잘코늄, 염산프로카인 등), 안정제 (예컨대, 인간 혈청 알부민, 폴리에틸렌글리콜 등), 보존제 (예컨대, 벤질알코올, 페놀 등), 산화방지제 등과 배합해도 된다. 제조된 주사액은 통상 적당한 앰플에 무균적으로 충전된다.

이와 같이 하여 얻어지는 제제는 안전하고 저독성이기 때문에, 예컨대 포유동물 (예컨대, 인간, 마우스, 래트, 모르모트, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이, 침팬지 등) 에 대하여 투여할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 함유하는 CRH 분비조절제의 투여량은 증상 등에 따라 차이는 있지만, 경구 투여하는 경우, 일반적으로 저알도스테론증 환자 (체중 60㎏ 에 대해) 에게는 1 회 당 본 발명에서의 폴리펩티드를 통상 약 0.1㎎ ∼ 100㎎, 바람직하게는 약 1.0㎎ ∼ 50㎎, 보다 바람직하게는 약 1.0㎎ ∼ 20㎎ 투여한다. 비경구적으로 투여하는 경우에는, 이 1 회 투여량은 투여대상, 증상, 투여방법 등에 따라서도 다르지만, 예컨대 주사제 형태로 저알도스테론증 환자 (체중 60㎏ 에 대해) 에게는 1 회 당 본 발명에서의 폴리펩티드를 통상 약 0.01㎎ ∼ 30㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1㎎ ∼ 20㎎ 정도, 보다 바람직하게는 약 0.1㎎ ∼ 10㎎ 정도를 정맥주사에 의해 투여하면 된다. 다른 동물의 경우에도 체중 60㎏ 당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 G단백질 공액형 리셉터 단백질 (이하, 간략하게 본 발명의 리셉터 단백질이라고 하는 경우가 있음) 또는 리간드 폴리펩티드는 예컨대 WO96/05302 호 또는 WO97/24436 호의 기재에 기초하여 제조할 수 있다.

이 리셉터 단백질로서 구체적으로는 예컨대 서열번호: 46 으로 표시되는 아미노산서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산서열을 함유하는 단백질 또는 이의 염을 들 수 있다. 「실질적으로 동일」한 아미노산서열이란, 단백질의 활성 예컨대 수용체와 리간드 (본 발명의 리간드 폴리펩티드) 와의 결합활성 등이 실질적으로 동일한 (현저한 변화를 발생시키고 있지 않음) 상태가 유지되는 한 변이를 가질 수 있는 아미노산서열을 의미하고, WO96/05302 호 또는 WO97/24436 호에 정의되어 있는 리셉터 단백질과 동일한 의미이다.

서열번호: 46 으로 표시되는 아미노산서열과 실질적으로 동일한 아미노산서열로서 보다 구체적으로는, 예컨대 서열번호: 48 로 표시되는 아미노산서열 등을 들 수 있다.

또, 서열번호: 46 으로 표시되는 아미노산서열을 코딩하는 DNA 의 염기서열로는, 예컨대 서열번호: 47 로 표시되는 염기서열 등을 들 수 있고, 서열번호: 48 로 표시되는 아미노산서열을 코딩하는 DNA 의 염기서열로는, 예컨대 서열번호: 49 로 표시되는 염기서열 등을 들 수 있다.

본 발명의 리셉터 단백질에 대한 본 발명의 리간드 폴리펩티드와 이 리셉터 단백질의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 이의 염을 함유하는 CRH 분비조절제의 취득방법 및 그 용도에 관해 이하에 기재한다.

본 발명의 리셉터 단백질에 대한 본 발명의 리간드 폴리펩티드와 이 리셉터 단백질의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 이의 염에는 본 발명의 리간드 폴리펩티드의 기능 (예, CRH 분비작용 등) 을 촉진시키는 화합물 또는 이의 염 및 본 발명의 리간드 폴리펩티드의 기능 (예, CRH 분비작용 등) 을 저해하는 화합물 또는 이의 염이 포함된다.

본 발명의 리간드 폴리펩티드는 CRH 분비조절작용 (CRH 분비촉진작용, CRH 분비저해작용 등) 등을 갖기 때문에, 본 발명의 리간드 폴리펩티드의 기능 (예, CRH 분비작용 등) 을 촉진시키는 화합물 또는 이의 염은 CRH 분비촉진제로서, 저알도스테론증, 저코르티솔 혈증, 속발성 및 만성 부신피질 기능저하증, 애디슨병 (권태, 오심, 색소침착, 성기능저하, 탈모, 저혈압), 부신기능부전 및 비만증 등의 CRH 분비에 관련되는 각종 질환의 개선, 예방 및, 치료약으로 유용할 뿐만 아니라 진통약으로 사용할 수 있다.

한편, 본 발명의 리간드 폴리펩티드의 CRH 분비작용을 저해하는 화합물 또는 이의 염은 쿠싱병, 쿠싱증후군 (중심성 비만, 만월상안모, 고혈압, 홍자색 피부 선조, 다모), 부신피질 자극호르몬 (ACTH) 생산 하수체 종양, CRH 생산 종양, 알도스테론생산 종양, 알도스테론증 (원발성, 속발성), 원발성 코르티솔 저항증, 선천성 부신효소 결핍증, 항스트레스, 울병, 신경성 식욕부진증, 불면, 위ㆍ십이지장 궤양 및 과민성 장증후군 등의 CRH 분비에 관련되는 각종 질환의 개선, 예방 및 치료약으로 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명의 리간드 폴리펩티드는 본 발명의 리간드 폴리펩티드의 기능 (예, CRH 분비작용 등) 을 촉진 또는 저해하는 화합물 또는 이의 염의 스크리닝을 위한 시약으로 유용하다.

본 발명의 리간드 폴리펩티드의 기능을 촉진 또는 저해하는 화합물 또는 이의 염은, 예컨대 G단백질 공액형 리셉터 단백질 (예컨대, phGR3, UHR-1 등 (WO96/05302 호, WO97/24436 호)) 과 본 발명의 리간드 폴리펩티드와의 결합성을 변화시키는 화합물을 스크리닝함으로써 얻을 수 있다.

이하에 이 스크리닝 방법에 대해 기재한다.

G단백질 공액형 리셉터 단백질 (예컨대, phGR3, UHR-1 등 (WO96/05302 호, WO97/24436 호)) 발현계를 구축하고, 이 발현계를 사용한 리셉터 결합 분석계를 사용함으로써 본 발명의 리간드 폴리펩티드와 G단백질 공액형 리셉터 단백질 (예컨대, phGR3, UHR-1 등 (WO96/05302 호, WO97/24436 호)) 과의 결합성을 변화시키는 화합물 (예컨대, 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성화합물, 발효산물 등) 또는 이의 염을 효율적으로 스크리닝할 수 있다.

이와 같은 화합물에는, (a) G단백질 공액형 리셉터를 통하여 세포자극활성 (예컨대, 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca²⁺유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 의 저하 등을 촉진시키는 활성 또는 억제시키는 활성 등) 을 갖는 화합물, (b) 이 세포자극활성을 갖지 않는 화합물 (소위, 리셉터 단백질에 대한 길항제), (c) 본 발명의 리간드 폴리펩티드와 G단백질 공액형 리셉터 단백질과의 결합력을 감소시키는 화합물 등이 포함된다.

즉, 본 발명의 리셉터 단백질에 대한 본 발명의 리간드 펩티드와 이 리셉터 단백질과의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 이의 염은, (ⅰ) 리셉터 단백질과, 본 발명의 리간드 폴리펩티드를 접촉시킨 경우와 (ⅱ) 리셉터 단백질과, 본 발명의 리간드 폴리펩티드 및 시험화합물을 접촉시킨 경우와의 비교를 행하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 리간드 폴리펩티드와 리셉터 단백질과의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 이의 염의 스크리닝 방법에 의해 얻을 수 있다.

이 스크리닝 방법에서는, (ⅰ) 과 (ⅱ) 의 경우에서의, 예컨대 이 리셉터 단백질에 대한 리간드의 결합량, 세포자극활성 등을 측정하여 비교하는 것을 특징으로 한다.

이 스크리닝 방법으로서 보다 구체적으로는, 하기 ①, ②, ③ 등을 들 수 있다:

① 표지된 본 발명의 리간드 폴리펩티드를, 본 발명의 리셉터 단백질에 접촉시킨 경우와, 표지된 본 발명의 리간드 폴리펩티드 및 시험화합물을 본 발명의 리셉터 단백질에 접촉시킨 경우에서의, 표지된 본 발명의 리간드 폴리펩티드의 이 리셉터 단백질에 대한 결합량을 측정하고 비교하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 리간드 폴리펩티드와 본 발명의 리셉터 단백질과의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 이의 염의 스크리닝 방법,

② 표지된 본 발명의 리간드 폴리펩티드를, 본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 세포 또는 이 세포의 막분획에 접촉시킨 경우와, 표지된 본 발명의 리간드 폴리펩티드 및 시험화합물을 본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 세포 또는 이 세포의 막분획에 접촉시킨 경우에서의, 표지된 본 발명의 리간드 폴리펩티드의 이 세포 또는 이 막분획에 대한 결합량을 측정하고 비교하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 리간드 폴리펩티드와 본 발명의 리셉터 단백질과의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 이의 염의 스크리닝 방법,

③ 표지된 본 발명의 리간드 폴리펩티드를, 본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 를 함유하는 형질전환체를 배양함으로써 세포막상에 발현된 리셉터 단백질에 접축시킨 경우와, 표지된 본 발명의 리간드 폴리펩티드 및 시험화합물을 본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 를 함유하는 형질전환체를 배양함으로써 세포막상에 발현된 리셉터 단백질에 접촉시킨 경우에서의, 표지된 본 발명의 리간드 폴리펩티드의 이 리셉터 단백질에 대한 결합량을 측정하고 비교하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 리간드 폴리펩티드와 본 발명의 리셉터 단백질과의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 이의 염의 스크리닝 방법.

이하에, 상기의 스크리닝 방법을 보다 구체적으로 설명한다.

우선, 상기 스크리닝 방법에 사용하는 본 발명의 리셉터 단백질로는, 상기한 본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 것이면 어느 것이어도 되지만, 리셉터 단백질을 함유하는 포유동물의 장기의 세포 막분획이 바람직하다. 그러나, 특히 인간 유래의 장기는 입수가 매우 곤란하기 때문에, 스크리닝에 사용되는 것으로는 재조합체를 사용하여 대량 발현시킨 인간 유래의 리셉터 단백질 등이 적합하다.

본 발명의 리셉터 단백질을 제조하기 위해서는, 리셉터 단백질을 코딩하는DNA 를 포유세포나 곤충세포에서 발현시킴으로써 행하는 것이 바람직하다. 목적으로 하는 단백질 부분을 코딩하는 DNA 단편에는 통상 cDNA 가 사용되지만, 반드시 이것에 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 유전자 단편이나 합성 DNA 를 사용해도 된다. 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 단편을 숙주 동물세포에 도입하여 이들을 효율적으로 발현시키기 위해서는, 이 DNA 단편을 곤충을 숙주로 하는 배큘로 바이러스에 속하는 핵 다각체병 바이러스 (nuclear polyhedrosis virus; NPV) 의 폴리헤드린 프로모터, SV40 유래의 프로모터, 레트로 바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 인간 열충격 프로모터, 사이토메갈로 바이러스 프로모터, SRα프로모터 등의 하류에 삽입하는 것이 바람직하다. 발현된 리셉터의 양과 질의 검사는 그 자체 공지된 방법으로 행할 수 있다. 예컨대, 문헌 [Nambi, P. 등, J. Biol. Chem., 267 권, 19555 ∼ 19559 페이지, 1992 년] 에 기재된 방법에 따라 행할 수 있다.

따라서, 상기한 스크리닝 방법에서 본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 것으로는, 그 자체 공지된 방법에 따라 정제된 리셉터 단백질이어도 되고, 이 리셉터 단백질을 함유하는 세포를 사용해도 되고, 또 이 리셉터 단백질을 함유하는 세포의 막분획을 사용해도 된다.

상기 스크리닝 방법에서 본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 세포를 사용하는 경우, 이 세포를 글루타르알데히드, 포르말린 등으로 고정화해도 된다. 고정화방법은 그 자체 공지된 방법에 따라 행할 수도 있다.

본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 세포는 이 리셉터 단백질을 발현시킨숙주세포를 말하는데, 이 숙주세포로는 대장균, 바실루스 서브틸리스, 효모, 곤충세포, 동물세포 등이 바람직하다.

세포 막분획으로는, 세포를 파쇄시킨 후, 그 자체 공지된 방법으로 얻어지는 세포막이 많이 함유되는 분획인 것을 말한다. 세포의 파쇄방법으로는, 포터-엘베헴 (Potter-Elvehjem) 형 균질화기로 세포를 분쇄시키는 방법, 워링 (Waring) 블렌더나 폴리트론 (Polytron) (Kinematica 사 제조) 에 의한 파쇄, 초음파에 의한 파쇄, 프렌치 프레스 등으로 가압하면서 세포를 가는 노즐로부터 분출시키는 파쇄 등을 들 수 있다. 세포막의 분획화에는 분획화 원심분리법이나 밀도구배 원심분리법 등의 원심력에 의한 분획화법이 주로 사용된다. 예컨대, 세포 파쇄액을 저속 (500rpm ∼ 3000rpm) 으로 단시간 (통상, 약 1 분 ∼ 10 분) 원심시키고, 상층액을 다시 고속 (15000rpm ∼ 30000rpm) 으로 통상 30 분 ∼ 2 시간 원심시켜 얻어지는 침전물을 막분획으로 한다. 이 막분획중에는 발현된 본 발명의 리셉터 단백질과 세포 유래의 인지질이나 막단백질 등의 막성분이 많이 함유된다.

이 리셉터 단백질을 함유하는 세포나 막분획중의 리셉터 단백질의 양은 1 세포 당 10³∼ 10⁸분자인 것이 바람직하고, 10⁵∼ 10⁷분자인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 발현량이 많을수록 막분획 당 리간드 결합활성 (비활성) 이 높아져 고감도인 스크리닝계의 구축이 가능해질 뿐만 아니라 동일 로트에서 대량의 시료를 측정할 수 있게 된다.

본 발명의 리간드 폴리펩티드와 본 발명의 리셉터 단백질과의 결합성을 변화시키는 화합물을 스크리닝하기 위해서는, 예컨대 적당한 리셉터 단백질 분획과, 표지된 본 발명의 리간드 폴리펩티드가 사용된다.

리셉터 단백질 분획으로는, 천연형 리셉터 단백질 분획이거나 또는 이와 동등한 활성을 갖는 재조합형 리셉터 단백질 분획 등이 바람직하다. 여기에서, 동등한 활성이란, 동등한 리간드 결합활성, 시그널정보 전달작용 등을 나타낸다.

표지된 리간드로는, 표지된 리간드, 표지된 리간드 아날로그 화합물 등이 사용된다. 예컨대, [³H], [¹²⁵I], [¹⁴C], [³⁵S] 등으로 표지된 리간드 등이 사용된다.

구체적으로는 본 발명의 리간드 폴리펩티드와 본 발명의 리셉터 단백질과의 결합성을 변화시키는 화합물의 스크리닝을 행하기 위해서는, 우선 본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 세포 또는 세포의 막분획을, 스크리닝에 적합한 완충액에 현탁시킴으로써 리셉터 단백질 표준품을 제조한다. 완충액에는 pH 4 ∼ 10 (바람직하게는 pH 6 ∼ 8) 의 인산 완충액, 트리스-염산 완충액 등의 리간드와 리셉터 단백질과의 결합을 저해하지 않는 완충액이면 어떤 것이어도 된다. 또, 비특이적 결합을 저감시키는 목적으로 CHAPS, Tween-80^TM(가오-아틀라스사), 디기토닌, 데옥시콜레이트 등의 계면활성제를 완충액에 첨가할 수도 있다. 또한, 프로테아제에 의한 리셉터나 리간드의 분해를 억제하는 목적으로 PMSF, 류펩틴, E-64 (펩티드겐뀨쇼 제조), 펩스타틴 등의 프로테아제 저해제를 첨가할 수 있다. 0.01㎖ ∼ 10㎖ 의 이 리셉터 용액에 일정량 (5000cpm ∼ 500000cpm) 의 표지된 리간드를 첨가하고, 동시에 10^-4M ∼ 10^-10M 의 시험화합물을 공존시킨다. 비특이적 결합량 (NSB) 을 알기 위해 과잉의 미표지 리간드를 첨가한 반응튜브도 준비한다. 반응은 약 0℃ 내지 50℃, 바람직하게는 약 4℃ 내지 37 ℃ 에서 약 20 분 내지 24 시간, 바람직하게는 약 30 분 내지 3 시간 행한다. 반응 후, 유리섬유 여과지 등으로 여과하여 적당한 양의 동일 완충액으로 세정한 후, 유리섬유 여과지에 잔존하는 방사활성을 액체 신틸레이션 카운터 또는 γ-카운터로 계측한다. 길항하는 물질이 없는 경우의 카운트 (B₀) 에서 비특이적 결합량 (NSB) 을 뺀 카운트 (B₀-NSB) 를 100% 로 했을 때, 특이적 결합량 (B-NSB) 이, 예컨대 50% 이하가 되는 시험화합물을 길항 저해능력이 있는 후보물질, 즉 본 발명의 리간드 폴리펩티드의 기능 (예컨대, CRH 분비작용) 을 저해하는 화합물 또는 이의 염으로 선택할 수 있다.

또, 본 발명의 리간드 폴리펩티드와 본 발명의 리셉터 단백질과의 결합성을 변화시키는 화합물을 스크리닝하는 방법을 실시하기 위해서는, 예컨대 리셉터 단백질을 통하는 세포자극활성 (예컨대, 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca²⁺유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생성, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 의 저하 등을 촉진시키는 활성 또는 억제시키는 활성 등) 을 공지된 방법 또는 시판되고 있는 측정용 키트를 사용하여 측정할 수 있다.

구체적으로는, 우선 본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 세포를 멀티 웰 플레이트 등에서 배양한다. 스크리닝을 행함에 있어서는 미리 신선한 배지 또는세포에 독성을 나타내지 않는 적당한 완충액으로 교환하고, 시험화합물 등을 첨가하여 일정 시간 인큐베이트한 후, 세포를 추출하거나 또는 상층액을 회수하여, 생성된 산물을 각각의 방법에 따라 정량한다. 세포자극활성의 지표로 하는 물질 (예컨대, 아라키돈산 등) 의 생성이 세포가 함유하는 분해효소에 의해 검정이 곤란한 경우는, 이 분해효소에 대한 저해제를 첨가하여 측정을 행해도 된다. 또, cAMP 생산억제 등의 활성에 대해서는 포르스콜린 등으로 세포의 기초 생산량을 증대시킨 세포에 대한 생산억제작용으로 검출할 수 있다.

세포자극활성을 측정하여 스크리닝을 행하기 위해서는 적당한 리셉터 단백질을 발현시키는 세포가 사용된다. 본 발명의 리셉터 단백질을 발현시키는 세포로는 천연형의 본 발명의 리셉터 단백질을 갖는 세포주, 전술한 재조합형 리셉터 단백질 등을 발현시키는 세포주 등이 바람직하다.

시험화합물로서는, 예컨대 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성화합물, 발효생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물조직 추출액 등이 사용되고, 이들 화합물은 신규 화합물이어도 되고, 공지 화합물이어도 된다.

본 발명의 리간드 폴리펩티드와 본 발명의 리셉터 단백질과의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 이의 염의 스크리닝용 키트는 본 발명의 리셉터 단백질, 본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 세포, 또는 본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 세포의 막분획을 함유하는 것 등이다.

상기 스크리닝용 키트의 예로는 다음의 것을 들 수 있다.

1. 스크리닝용 시약

① 측정용 완충액 및 세정용 완충액

Hank's Balanced Salt Solution (기브코사 제조) 에 0.05% 의 소 혈청 알부민 (시그마사 제조) 을 첨가한 것.

세공 직경 0.45㎛ 의 필터로 여과 멸균하여 4℃ 에서 보존하거나, 또는 사용시 제조해도 된다.

② G단백질 공액형 리셉터 표준품

본 발명의 리셉터 단백질을 발현시키는 CHO 세포를 12 웰 플레이트에 5 ×10⁵개/웰로 계대하고, 37℃, 5% CO₂, 95% 공기에서 2 일간 배양한 것.

③ 표지 리간드

시판되고 있는 [³H], [¹²⁵I], [¹⁴C], [³⁵S] 등으로 표지된 본 발명의 리간드 폴리펩티드.

수용액 상태인 것을 4℃ 또는 -20℃ 에서 보존하여, 사용시에 측정용 완충액으로 1μM로 희석한다.

④ 리간드 표준액

본 발명의 리간드 폴리펩티드를 0.1% 소 혈청 알부민 (시그마사 제조) 을 함유하는 PBS에 1mM 가 되도록 용해시켜 -20℃ 에서 보존한다.

2. 측정법

① 12 웰 조직배양용 플레이트에서 배양한 본 발명의 리셉터 단백질 발현 CHO 세포를, 측정용 완충액 1㎖ 로 2 회 세정한 후, 490㎕ 의 측정용 완충액을 각웰에 첨가한다.

② 10^-3∼ 10^-10M 의 시험화합물 용액을 5㎕ 첨가한 후, 표지리간드를 5㎕ 첨가하여 실온에서 1 시간 반응시킨다. 비특이적 결합량을 알기 위해서는 시험화합물 대신에 10^-3M 의 리간드 폴리펩티드를 5㎕ 첨가해 둔다.

③ 반응액을 제거하여 1㎖ 의 세정용 완충액으로 3 회 세정한다. 세포에 결합된 표지리간드를 0.2N NaOH-1% SDS에 용해시켜 4㎖ 의 액체 신틸레이터 A (와꼬쥰야꾸 제조) 와 혼합한다.

④ 액체 신틸레이션 카운터 (베크만사 제조) 를 사용하여 방사활성을 측정하고, 최대 결합 백분율 (PMB: Percent Maximum Binding) 을 다음 식으로 구한다.

PMB=[(B-NSB)/(B₀-NSB)] ×100

PMB: 최대 결합 백분율

B: 검체를 첨가한 때의 값

NSB: 비특이적 결합량

B₀: 최대 결합량

본 발명의 리셉터 단백질에 대한 본 발명의 리간드 폴리펩티드와 이 리셉터 단백질과의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 이의 염을 전술한 CRH 분비조절제로 사용하는 경우는, 통상적인 방법에 따라 실시하면 된다. 예컨대 필요에 따라 당으로 코팅된 정제, 캡슐제, 엘릭시르제, 마이크로캡슐제 등으로서 경구적으로,또는 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 액과의 무균성 용액 또는 현탁액제 등의 주사제 형태로 비경구적으로, 또는 점비제로서 사용할 수 있다. 예컨대, 이 화합물 또는 이의 염을 생리학적으로 인정되는 담체, 향미제, 부형제, 비히클, 방부제, 안정제, 결합제 등과 함께 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위용량 형태로 혼화시킴으로써 제조할 수 있다. 이들 제제에서의 유효 성분량은 지시된 범위의 적당한 용량을 얻을 수 있도록 하는 것이다.

정제, 캡슐제 등에 혼화될 수 있는 첨가제로서는, 예컨대 젤라틴, 옥수수전분, 트라간트검, 아라비아고무와 같은 결합제, 결정성 셀룰로오스와 같은 부형제, 옥수수전분, 젤라틴, 알긴산 등과 같은 팽화제, 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제, 수크로오스, 락토오스 또는 사카린과 같은 감미제, 페파민트, 아까모노오일 또는 체리와 같은 향미제 등이 사용된다. 제조단위 형태가 캡슐인 경우에는 상기 타입의 재료에 추가로 유지와 같은 액상 담체를 함유시킬 수 있다. 주사용 무균조성물은 주사용수와 같은 비히클 중에 활성물질, 참기름, 야자유 등과 같은 천연산출 식물유 등을 용해 또는 현탁시키는 등 통상적인 제제 실시에 따라 처방할 수 있다.

주사용 수성액으로서는 예컨대 생리식염수, 글루코스나 그 외의 보조약을 함유한 등장액 (예컨대, D-소르비톨, D-만니톨, 염화나트륨 등) 등을 들 수 있고, 적당한 용해보제조, 예컨대 알코올 (예컨대, 에탄올 등), 폴리알코올 (예컨대, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온성 계면활성제 (예컨대, 폴리소르베이트80(^TM), HCO-50) 등과 병용해도 된다. 유성액으로서는 참기름, 대두유 등을 들 수 있고, 용해보제조로서 벤조산벤질, 벤질알코올 등과 병용해도 된다. 또, 완충제 (예컨대, 인산염 완충액, 아세트산나트륨 완충액), 무통화제 (예컨대, 염화벤잘코늄, 염산프로카인 등), 안정제 (예컨대, 인간 혈청 알부민, 폴리에틸렌글리콜 등), 보존제 (예컨대, 벤질알코올, 페놀 등), 산화방지제 등과 배합해도 된다. 제조된 주사액은 통상 적당한 앰플에 충전된다.

본 발명의 리셉터 단백질에 대한 본 발명의 리간드 폴리펩티드와 이 리셉터 단백질과의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 이의 염을 함유하는 CRH 분비조절제의 투여량은 증상 등에 따라 차이는 있지만, 경구 투여하는 경우, 일반적으로 저알도스테론증 환자 (체중 60㎏ 에 대해) 에게는 1 회 당 이 화합물 또는 이의 염을 통상 약 0.1㎎ ∼ 100㎎, 바람직하게는 약 1.0㎎ ∼ 50㎎, 보다 바람직하게는 약 1.0㎎ ∼ 20㎎ 투여한다. 비경구적으로 투여하는 경우에는, 이 1 회 투여량은 투여대상, 증상, 투여방법 등에 따라서도 다르지만, 예컨대 주사제 형태로 저알도스테론증 환자 (체중 60㎏ 에 대해) 에게는 1 회 당 이 화합물 또는 이의 염을 통상 약 0.01㎎ ∼ 30㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1㎎ ∼ 20㎎ 정도, 보다 바람직하게는 약 0.1㎎ ∼ 10㎎ 정도를 정맥주사에 의해 투여하면 된다. 다른 동물의경우에도 체중 60㎏ 당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.

본원 명세서의 서열목록의 서열번호는 이하의 서열을 나타낸다.

[서열번호: 1]

소 시상하부 유래 리간드 폴리펩티드의 전체 길이 아미노산서열을 나타낸다.

[서열번호: 2]

소 시상하부 유래 리간드 폴리펩티드 cDNA 의 전체 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 3]

소 시상하부 유래 리간드 폴리펩티드의 아미노산서열을 나타낸다. 서열번호: 1 의 제 23 ∼ 53 번째의 아미노산서열에 대응하고 있다.

[서열번호: 4]

소 시상하부 유래 리간드 폴리펩티드의 아미노산서열을 나타낸다. 서열번호: 1 의 제 23 ∼ 54 번째의 아미노산서열에 대응하고 있다.

[서열번호: 5]

소 시상하부 유래 리간드 폴리펩티드의 아미노산서열을 나타낸다. 서열번호: 1 의 제 23 ∼ 55 번째의 아미노산서열에 대응하고 있다.

[서열번호: 6]

소 시상하부 유래 리간드 폴리펩티드의 아미노산서열을 나타낸다. 서열번호: 1 의 제 34 ∼ 53 번째의 아미노산서열에 대응하고 있다.

[서열번호: 7]

소 시상하부 유래 리간드 폴리펩티드의 아미노산서열을 나타낸다. 서열번호: 1 의 제 34 ∼ 54 번째의 아미노산서열에 대응하고 있다.

[서열번호: 8]

소 시상하부 유래 리간드 폴리펩티드의 아미노산서열을 나타낸다. 서열번호: 1 의 제 34 ∼ 55 번째의 아미노산서열에 대응하고 있다.

[서열번호: 9]

소 시상하부 유래 리간드 폴리펩티드 (서열번호: 3) 를 코딩하는 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 10]

소 시상하부 유래 리간드 폴리펩티드 (서열번호: 4) 를 코딩하는 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 11]

소 시상하부 유래 리간드 폴리펩티드 (서열번호: 5) 를 코딩하는 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 12]

소 시상하부 유래 리간드 폴리펩티드 (서열번호: 6) 를 코딩하는 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 13]

소 시상하부 유래 리간드 폴리펩티드 (서열번호: 7) 를 코딩하는 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 14]

소 시상하부 유래 리간드 폴리펩티드 (서열번호: 8) 를 코딩하는 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 15]

소 게놈 DNA 로부터 발견된 리간드 폴리펩티드의 전체 길이 아미노산서열을 나타낸다.

[서열번호: 16]

래트형 리간드 폴리펩티드의 전체 길이 아미노산서열을 나타낸다.

[서열번호: 17]

래트형 리간드 폴리펩티드 cDNA 의 전체 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 18]

래트형 리간드 폴리펩티드의 아미노산서열을 나타낸다. 서열번호: 16 의 제 22 ∼ 52 번째의 아미노산서열에 대응하고 있다.

[서열번호: 19]

래트형 리간드 폴리펩티드의 아미노산서열을 나타낸다. 서열번호: 16 의 제 22 ∼ 53 번째의 아미노산서열에 대응하고 있다.

[서열번호: 20]

래트형 리간드 폴리펩티드의 아미노산서열을 나타낸다. 서열번호: 16 의 제 22 ∼ 54 번째의 아미노산서열에 대응하고 있다.

[서열번호: 21]

래트형 리간드 폴리펩티드의 아미노산서열을 나타낸다. 서열번호: 16 의제 33 ∼ 52 번째의 아미노산서열에 대응하고 있다.

[서열번호: 22]

래트형 리간드 폴리펩티드의 아미노산서열을 나타낸다. 서열번호: 16 의 제 33 ∼ 53 번째의 아미노산서열에 대응하고 있다.

[서열번호: 23]

래트형 리간드 폴리펩티드의 아미노산서열을 나타낸다. 서열번호: 16 의 제33 ∼ 54 번째의 아미노산서열에 대응하고 있다.

[서열번호: 24]

래트형 리간드 폴리펩티드 (서열번호: 18) 를 코딩하는 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 25]

래트형 리간드 폴리펩티드 (서열번호: 19) 를 코딩하는 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 26]

래트형 리간드 폴리펩티드 (서열번호: 20) 를 코딩하는 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 27]

래트형 리간드 폴리펩티드 (서열번호: 21) 를 코딩하는 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 28]

래트형 리간드 폴리펩티드 (서열번호: 22) 를 코딩하는 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 29]

래트형 리간드 폴리펩티드 (서열번호: 23) 를 코딩하는 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 30]

인간형 리간드 폴리펩티드의 전체 길이 아미노산서열을 나타낸다.

[서열번호: 31]

인간형 리간드 폴리펩티드 cDNA 의 전체 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 32]

인간형 리간드 폴리펩티드의 아미노산서열을 나타낸다. 서열번호: 30 의 제 23 ∼ 53 번째의 아미노산서열에 대응하고 있다.

[서열번호: 33]

인간형 리간드 폴리펩티드의 아미노산서열을 나타낸다. 서열번호: 30 의 제 23 ∼ 54 번째의 아미노산서열에 대응하고 있다.

[서열번호: 34]

인간형 리간드 폴리펩티드의 아미노산서열을 나타낸다. 서열번호: 30 의 제 23 ∼ 55 번째의 아미노산서열에 대응하고 있다.

[서열번호: 35]

인간형 리간드 폴리펩티드의 아미노산서열을 나타낸다. 서열번호: 30 의제 34 ∼ 53 번째의 아미노산서열에 대응하고 있다.

[서열번호: 36]

인간형 리간드 폴리펩티드의 아미노산서열을 나타낸다. 서열번호: 30 의 제 34 ∼ 54 번째의 아미노산서열에 대응하고 있다.

[서열번호: 37]

인간형 리간드 폴리펩티드의 아미노산서열을 나타낸다. 서열번호: 30 의 제 34 ∼ 55 번째의 아미노산서열에 대응하고 있다.

[서열번호: 38]

인간형 리간드 폴리펩티드 (서열번호: 32) 를 코딩하는 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 39]

인간형 리간드 폴리펩티드 (서열번호: 33) 를 코딩하는 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 40]

인간형 리간드 폴리펩티드 (서열번호: 34) 를 코딩하는 DNA 의 염기서열을 나타낸다

[서열번호: 41]

인간형 리간드 폴리펩티드 (서열번호: 35) 를 코딩하는 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 42]

인간형 리간드 폴리펩티드 (서열번호: 36) 를 코딩하는 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 43]

인간형 리간드 폴리펩티드 (서열번호: 37) 를 코딩하는 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 44]

본 발명의 리간드 폴리펩티드의 아미노산서열을 나타낸다. 서열 중, 제 3 번째의 Xaa 는 Thr 또는 Ala, 제 5 번째의 Xaa 는 Arg 또는 Gln, 제 10 번째의 Xaa 는 Ile 또는 Thr, 제 21 번째의 Xaa 는 Thr 또는 Ala, 제 22 번째의 Xaa 는 Gly 또는 Ser 을 나타낸다.

[서열번호: 45]

본 발명의 리간드 폴리펩티드의 아미노산서열을 나타낸다. 서열 중, 제 10 번째의 Xaa 는 Thr 또는 Ala, 제 11 번째의 Xaa 는 Gly 또는 Ser 을 나타낸다.

[서열번호: 46]

본 발명의 리간드 폴리펩티드의 수용체인 phGR3 의 아미노산서열을 나타낸다.

[서열번호: 47]

본 발명의 리간드 폴리펩티드의 수용체인 phGR3 의 아미노산서열을 코딩하는 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 48]

본 발명의 리간드 폴리펩티드의 수용체인 UHR-1 의 아미노산서열을 나타낸다.

[서열번호: 49]

본 발명의 리간드 폴리펩티드의 수용체인 UHR-1 의 아미노산서열을 코딩하는 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

서열번호: 47 로 표시되는 phGR3 의 아미노산서열을 코딩하는 염기서열을 갖는 형질전환체 대장균 JM109/phGR3 는 1994 년 9 월 27 일에 일본 이바라기껭 쓰꾸바시 히가시 1-1-3, 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 (NIBH) 에 기탁번호 FERM BP-4807 로서 기탁되었고, 일본 오사까후 오사까시 주산본마찌 2-17-85, 재단법인 발효연구소 (IFO) 에 1994 년 9 월 22 일에 기탁번호 IFO 15748 로서 기탁되었다.

이하에, 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1PrRP-31 (서열번호: 32 로 표시되는 아미노산서열로 이루어지는 펩티드의 C 말단 아미노산잔기의 카르복실기가 아미드화된 펩티드) 의 제 3 뇌실내 투여가 혈장중의 부신피질 자극호르몬 (ACTH) 및 β-엔도르핀 농도에 미치는 영향

성체 위스타르계 (Wistar) 수컷 래트 (수술시 체중 350 ∼ 380g) 를 펜토바르비탈 50㎎/㎏ 의 복강내 투여로 마취시키고, 래트뇌 정위 고정장치에 고정시켰다. 절치용 바는 인터오럴 라인 (interaural line)에서 3.3㎜ 낮게 하였다.두개골을 노출시키고 제 3 뇌실에 가이드 캐뉼러 AG-12 (내경 0.4㎜, 외경 0.5㎜, 에이콤) 를 심기 위해 치과용 드릴을 사용하여 골에 구멍을 뚫었다. 또, 그 주위 4 곳에 앵커 나사를 심었다. 스테인리스제 가이드 캐뉼러 AG-12 를 그 끝부분이 제 3 뇌실의 상부에 위치하도록 삽입하였다. 정위 좌표는 Paxinos 와 Watson (1986) 의 아틀라스에 따라 인터오럴 라인에서 AP: +7.1㎜, L: 0.0㎜, H: +2.0㎜ 로 하였다. 가이드 캐뉼러는 순간 접착제, 치과용 시멘트 및 앵커 나사로 두개골에 고정시켰다. 가이드 캐뉼러에는 스테인리스제 더미 (dummy) 캐뉼러, AD-12 (외경 0.35㎜, 에이콤사) 를 삽입하여 캡 너트 (에이콤사) 로 고정시켰다. 수술 후, 래트를 개별적인 우리에서 사육하였다.

가이드 캐뉼러를 심고 나서 약 1 주간 사육하여 수술 후의 회복되도록 하고, 자유행동하에 채혈용 수술을 행하였다. 상기 수술을 실시한 래트를 펜토바르비탈 50㎎/㎏ 의 복강내 투여로 마취시켰다. 해부용 패드 위에 엎드린 자세로 고정시켜 좌측의 경정맥을 노출시켰다. 폴리에틸렌 튜브 SP35 (내경 0.5㎜, 외경 0.9㎜, 나쯔메세이사꾸쇼) 를 약 30㎝ 의 길이로 잘라, 200 단위/㎖ 의 헤파린을 함유하는 생리식염수로 채운 후, 경정맥에 약 4.5㎝ 삽입하여 고정시켰다. 튜브의 또다른 끝은 배측(背側) 피하를 통하여 경부 (배측)에서 노출시켰다.

수술 하룻밤 후, PrRP-31 의 투여 30 분전에 용량 1㎖ 의 주사기와 25 게이지 주사바늘 (모두 테루모사) 을 사용하여 400㎕ 의 혈액을 채취하였다. 혈액응고를 방지하기 위해, 주사통에는 미리 200 단위/㎖ 의 헤파린을 함유하는 생리식염수를 20㎕ 넣어 두었다. 래트의 두개골에 장착된 캡 너트와 더미 캐뉼러를제거하고, 대신에 테플론 튜브 (길이 50㎝, 내경 0.1㎜, 외경 0.35㎜, 에이콤사) 에 연결된 스테인리스제 마이크로인젝션 캐뉼러 (내경 0.17㎜, 외경 0.35㎜, 에이콤사) 를 삽입하였다. 마이크로인젝션 캐뉼러의 길이는 그 끝부분 1㎜ 가 가이드 캐뉼러로부터 노출되도록 조절해 두었다. 테플론 튜브의 한쪽을 마이크로시린지 펌프에 연결하고, 0.5% 소 혈청 알부민 (BSA) 을 함유하는 인산 완충 생리식염수 또는 PrRP-31 (각 1, 3, 10n㏖)가 용해된 0.5% BSA 를 함유하는 인산 완충 생리식염수를 5㎕/분의 유속으로 계(計) 10㎕를 측뇌실에 주입하였다. 주입 종료 15 분 후 마이크로인젝션 캐뉼러를 제거하고, 다시 더미 캐뉼러를 캡 너트로 고정시켰다. 뇌실내 투여를 개시하기 15 분 전, 및 뇌실내 투여의 개시시점으로부터 각각 0, 5, 15, 30, 45, 60 분 후에 경정맥에서 700㎕ 씩 채혈하였다. 채혈된 혈액을 미량 고속냉각 원심기 (MR-150, 토미세이꼬) 를 사용하여 원심 (5,000rmp, 10 분간) 시켜 상층액 (혈장) 을 회수하였다. 혈장중에 함유되는 ACTH 및 β-엔도르핀을 방사선 면역측정법 (ACTH; Mitsubishi Kagaku, β-엔도르핀; Peninsula 사) 를 사용하여 측정하였다. 도 1 및 도 2 에 나타난 바와 같이, PrRP-31 투여군에서는 대조군에 비해 투여 15 분 후를 피크로 하여 농도의존적으로 혈중 ACTH 및 β-엔도르핀농도의 상승이 관찰되었다.

실시예 2CRH 항체에 의한 PrRP-31 의 혈중 ACTH 및 β-엔도르핀 농도의 상승 억제활성

실시예 1 과 동일하게 처치된 성체 위스타르계 수컷 래트에게 항-CRH IgG (PHOENIX PHARMACEUTICAL 사) 및 정상 토끼 IgG (Pepro Tech EC 사) 를 400㎍ 씩0.5% 소 혈청 알부민 (BSA) 을 함유하는 인산 완충 생리식염수에 용해시켜 경정맥에 투여하고, 30 분 후에 PrRP-31 10n㏖ 을 뇌실내 투여하였다. 뇌실내 투여의 개시시점으로부터 0, 5, 15, 30, 45, 60 분 후에 경정맥에서 700㎕ 씩 채혈하고, 혈액을 미량 고속냉각 원심기 (MR-150, 토미세이꼬) 를 사용하여 원심 (5,000rmp, 10 분간) 시켜 상층액 (혈장) 을 회수하였다. 혈장중에 함유되는 ACTH 및 β-엔도르핀을 방사선 면역측정법 (ACTH; Mitsubishi Kagaku, β-엔도르핀; Peninsula 사) 를 사용하여 측정하였다. 도 3 및 도 4 에 나타난 바와 같이 항-CRH IgG 투여군은 정상 토끼 IgG 투여군에 비해 PrRP-31 투여에 의한 혈중 ACTH 및 β-엔도르핀농도의 상승 억제가 관찰되었다.

실시예 3생체내 PrRP-31 에 대한 스트레스의 영향

본 발명자들은 스트레스부하에 의해 PrRP-31 생산세포나 PrRP-31 함유 신경종말로부터 PrRP-31 가 분비되어 생체내 PrRP-31 함량이 증가되는 것으로 여기고, 수침구속 스트레스부하시 뇌척수액중의 PrRP-31 농도를 측정하였다. 위스타르계 수컷 래트 (체중 200 ∼ 220g) 를 스트레스 우리 (W265 ×L95 ×H200㎜, 나쯔메세이사꾸쇼) 에 넣은 후, 목까지 물 (25℃)에 잠기게 하여 수침구속 스트레스를 부하하였다. 개시 0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8 시간 후에 물에서 래트를 꺼내어 펜토바르비탈 50㎎/㎏ 을 복강내 투여하여 마취시켰다. 뇌척수액의 채취는 Chou,R.B. 등의 대조천자법 (J. Pharmaclo. Exp. Ther., 219; 42-48, 1981) 에 따라 행하였다. 즉, 래트를 엎드려 눕게 하여 두피를 절개하고, 다시 근육층을 한장 절개하였다. 두개골의 경계선에서 약 2㎜ 배중측(背中側)에 1㎖ 의 주사기 (테루모)에 부착된 날개형상 바늘 (25G, 테루모) 을 천자하여, 바늘끝이 약 5㎜ 정도 들어간 시점에서 주사기를 뺐다. 바늘이 삽입되어 있으면 투명한 뇌척수액이 유입되게 된다. 뇌척수액의 유입을 확인한 후, 순간접착제로 침을 고정시켜 약 10 분 정도에 걸쳐 뇌척수액을 채취하였다. 튜브내에 혈액이 혼입된 시점에서 채취를 중지하고, 지혈겸자로 튜브를 죄어 뇌척수액을 2mM EDTA, 300KIU/㎖ 아프로티닌 (베링거 맨하임 야마노우찌) 및 최종 농도 0.05% 의 CHAPS (와꼬쥰야꾸)를 함유한 에펜도르프 튜브에 넣었다. 회수된 뇌척수액은 빙냉하에서 보존하고, 13,000rpm ×5분으로 4회 원심시켜 상층액을 회수, 동결시켰다. 뇌척수액중의 PrRP 농도는 본 발명자들이 제작한 인식 부위가 다른 PrRP-31 에 대한 2 종류의 특이적 모노클로날 항체를 사용하여 제작한 고감도 측정계 (WO99-60112 호) 로 측정하였다. 뇌척수액중 PrRP-31 농도 (평균값 ±표준오차) 는 컨트롤값 0.92 ±0.10f㏖/㎖ 에 대해, 수침구속 부하 0.5 및 1 시간 후 각각 2.90 ±0.25f㏖/㎖ 및 2.60 ±0.25f㏖/㎖ 로 현저히 높은 값 (p＜0.01, n=7) 을 나타내고, 도 5 에 나타난 바와 같이 그 후 시간이 경과함에 따라 감소하였다. 또, 수침구속 스트레스부하시 혈중 ACTH 농도를 방사선 면역측정법 (미쯔비시카가꾸) 에 의해 측정한 결과는, 도 6 에 나타난 바와 같이 0.5 시간 후를 피크로 시간이 경과함에 따라 감소하고, 뇌척수액중 PrRP-31 농도와 동일한 변동을 나타냈다.

실시예 4CRH 길항제에 의한 PrRP-31 의 혈중 ACTH 농도의 상승 억제활성

실시예 1 과 마찬가지로 처치한 성체 위스타르계 수컷 래트에게 CRH 수용체 길항제인 α-나선형 CRF (Peninsula Laboratories Europe 사) 2㎎ 을 생리식염수0.5㎖ 에 용해시켜 경정맥에 투여하였다. 대조군에는 생리식염수 0.5㎖ 를 경정맥에 투여하였다. 양쪽 군 모두, 15 분 후에 PrRP-31 10n㏖ 을 뇌실내 투여하였다. 뇌실내 투여의 개시시점으로부터 0, 10, 20, 30, 45, 60 분 후에 경정맥에서 400㎕ 씩 채혈하고, 혈액을 미량 고속냉각 원심기 (MR-150, 토미세이꼬) 를 사용하여 원심 (5,000rmp, 10 분간) 시켜 상층액 (혈장) 을 회수하였다. 혈장중에 함유된 ACTH 를 방사선 면역측정법 (ACTH; Mitsubishi Kagaku) 에 의해 측정하였다. 도 7 에 나타난 바와 같이 α-나선형 CRF 투여군은 생리식염수 투여군에 비해 PrRP-31 뇌실내 투여에 의한 혈중 ACTH 농도의 상승의 현저한 억제가 관찰되었다.

제제예 1

일본 약전 주사용 증류수 50㎖ 에 본 발명의 리간드 폴리펩티드 50㎎ 을 용해시킨 후, 일본 약전 주사용 증류수를 첨가하여 100㎖ 로 한다. 이 용액을 멸균조건하에서 여과하고, 이어서 이 용액 1㎖ 씩을 취하여 멸균조건하에 주사용 바이알에 충전하고 동결건조시켜 밀폐하였다.

제제예 2

일본 약전 주사용 증류수 50㎖ 에 본 발명의 리간드 폴리펩티드 100㎎ 을 용해시킨 후, 일본 약전 주사용 증류수를 첨가하여 100㎖ 로 한다. 이 용액을 멸균조건하에서 여과하고, 이어서 이 용액 1㎖ 씩을 취하여 멸균조건하에 주사용 바이알에 충전하고 동결건조시켜 밀폐하였다.

본 발명의 리간드 폴리펩티드는 CRH 분비의 조절작용, 즉 CRH 분비의 촉진 및 억제작용을 갖는다. 즉, 본 발명의 리간드 폴리펩티드는 CRH 분비의 촉진작용을 갖기 때문에, CRH 분비부전에 관련되는 각종 질환의 예방 및 치료약에 사용할 수 있다. 한편, 본 발명의 리간드 폴리펩티드는 그 리셉터 단백질과의 친화성이 강하기 때문에 투여량이 증가되면 CRH 분비에 대하여 탈감작이 발생되어 CRH 분비를 억제하는 작용도 갖는다. 이 경우, CRH 과잉분비에 관련되는 각종 질환의 예방 및 치료약에 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명의 리간드 폴리펩티드는 CRH 분비촉진제로서, 저알도스테론증, 저코르티솔 혈증, 속발성 및 만성 부신피질 기능저하증, 애디슨병 (권태, 오심, 색소침착, 성기능저하, 탈모, 저혈압), 부신기능부전 및 비만증 등의 CRH 분비에 관련되는 각종 질환의 개선, 예방 및, 치료약으로 유용할 뿐만 아니라 진통약으로 유용하다.

또, 본 발명의 리간드 폴리펩티드는 CRH 분비억제제로서, 쿠싱병, 쿠싱증후군 (중심성 비만, 만월상안모, 고혈압, 홍자색 피부 선조, 다모), 부신피질 자극호르몬 (ACTH) 생산 하수체 종양, CRH 생산 종양, 알도스테론생산 종양, 알도스테론증 (원발성, 속발성), 원발성 코르티솔 저항증, 선천성 부신효소 결핍증, 항스트레스, 울병, 신경성 식욕부진증, 불면, 위ㆍ십이지장 궤양 및 과민성 장증후군 등의 CRH 분비에 관련되는 각종 질환의 개선, 예방 및 치료약으로 유용하다.

그 외, 본 발명의 리간드 폴리펩티드는 CRH 분비기능을 조사하기 위한 검사약으로 유용하다.

Claims

G단백질 공액형 리셉터 단백질에 대한 리간드 펩티드 또는 이의 아미드 또는 이의 에스테르 또는 이의 염을 함유하는 부신피질 자극호르몬 방출호르몬 분비조절제.
제 1 항에 있어서, G단백질 공액형 리셉터 단백질에 대한 리간드 펩티드 또는 이의 아미드 또는 이의 에스테르 또는 이의 염이, 서열번호: 44 또는 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산서열을 함유하는 폴리펩티드 또는 이의 아미드 또는 이의 에스테르 또는 이의 염인 부신피질 자극호르몬 방출호르몬 분비조절제.
제 2 항에 있어서, 서열번호: 44 로 표시되는 아미노산서열이 서열번호: 3, 18 또는 32 로 표시되는 아미노산서열인 부신피질 자극호르몬 방출호르몬 분비조절제.
제 2 항에 있어서, 서열번호: 45 로 표시되는 아미노산서열이 서열번호: 6, 21 또는 35 로 표시되는 아미노산서열인 부신피질 자극호르몬 방출호르몬 분비조절제.
제 1 항에 있어서, G단백질 공액형 리셉터가 서열번호: 46 으로 표시되는 아미노산서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산서열을 함유하는 단백질인 부신피질 자극호르몬 방출호르몬 분비조절제.
제 1 항에 있어서, 부신피질 자극호르몬 방출호르몬 분비촉진제인 부신피질 자극호르몬 방출호르몬 분비조절제.
제 1 항에 있어서, 저알도스테론증, 저코르티솔 혈증, 속발성 또는 만성 부신피질 기능저하증, 애디슨병, 부신기능부전 또는 비만증의 예방 또는 치료약인 부신피질 자극호르몬 방출호르몬 분비조절제.
G단백질 공액형 리셉터 단백질과 이 G단백질 공액형 리셉터 단백질에 대한 리간드 펩티드와의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 이의 염을 함유하는 부신피질 자극호르몬 방출호르몬 분비조절제.
부신피질 자극호르몬 방출호르몬 분비조절작용을 갖는 의약을 제조하기 위한, G단백질 공액형 리셉터 단백질에 대한 리간드 펩티드 또는 이의 아미드 또는 이의 에스테르 또는 이의 염의 용도.
G단백질 공액형 리셉터 단백질에 대한 리간드 펩티드 또는 이의 아미드 또는이의 에스테르 또는 이의 염을 포유동물에 투여하는 것을 특징으로 하는 부신피질 자극호르몬 방출호르몬 분비조절방법.