JPH08317789A - ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ類似体及びそれを含む薬剤組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ
の新規な類似体及びその使用方法を提供する。 【解決手段】 天然ヒトマンガンスーパーオキシドジス
ムターゼポリペプチドのＮ末端のリジンもしくはリジン
とヒスチジンとが決失したヒトマンガンスーパーオキシ
ドジスムターゼポリペプチドを少なくとも１つ含むヒト
マンガンスーパーオキシドジスムターゼ類似体、並びに
該類似体を含む薬剤組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はヒトマンガンスーパ
ーキシドジスムターゼ類似体及び該類似体を含む薬剤組
成物に関する。

【０００２】本明細書では種々の刊行物を参考文献とし
て括弧内の数字で紹介し、これら参考文献の完全目録を
明細書の発明の詳細な説明の末尾に添付した。本発明の
出願された時点で当業者に公知の技術水準を完全に理解
するために、これら参考文献の開示内容全部が本明細書
に含まれるものとする。

【０００３】

【従来の技術】スーパーオキシドジスムターゼ(SOD) と
酸素遊離ラジカル（Ｏ₂ ^- ）の現象とは1968年にMcCord
及びFridovich(1)によって発見された。スーパーオキシ
ドラジカル及びその他の高度に反応性の酸素種は全ての
呼吸細胞中で種々の高分子及び細胞成分に対する酸化性
損傷の副生物として産生される（参考文献 2,3）。スー
パーオキシドジスムターゼとして公知の金属タンパク質
のグループは酸化還元反応２Ｏ₂ ^- ＋２Ｈ⁺ →Ｈ₂ Ｏ₂
＋Ｏ₂ を触媒し酸素毒性に対する防御メカニズムを与え
る。

【０００４】異なる金属及び異なるタンパク質を含む複
数の形態のSOD が公知である。SOD中に存在する金属と
しては鉄、マンガン、銅及び亜鉛がある。公知形態のSO
D は全て同じ反応を触媒する。これら酵素は幾つかの進
化的グループで検出される。鉄を含有するスーパーオキ
シドジスムターゼは主として原核細胞中で検出される。
銅及び亜鉛を含有するスーパーオキシドジスムターゼは
実質的に全ての真核生物中で検出される(4) 。マンガン
を含有するスーパーオキシドジスムターゼは微生物から
ヒトまでの生物中に検出された。

【０００５】全ての生体高分子は過剰のスーパーオキシ
ドラジカルの損傷作用の標的となり得るので、SOD の潜
在的治療能力の研究が盛んになって来ている。科学文献
はSOD の臨床用途が広いことを示唆している。これら
は、発癌及び腫瘍増殖の阻止、抗癌剤の細胞薬害及び心
臓薬害の低減(10)、虚血組織の保護(12)及び精子の保護
(13)を含む。更に、老化過程でのSOD の効果の研究も重
要である(14)。

【０００６】しかし乍らヒトSOD が少量しか入手できな
いことがヒトSOD の治療能力に関する研究の主な障害に
なっている。

【０００７】スーパーオキシドジスムターゼはまたその
抗炎症特性のために重要である(11)。ウシ由来のスーパ
ーオキシドジスムターゼ（オルゴテイン）は抗炎症特性
をもつことが認められておりヨーロッパの一部でヒト用
の薬剤として市販されている。また、米国では、特に炎
症を起こしたウマの腱を治療する獣医薬として販売され
ている。しかし乍らオルゴテインの供給量も限られてい
る。ウシ又はその他の動物細胞からの回収を含めて従来
技術には重大な制約があり、このような細胞から得られ
たオルゴテインはヒト由来でないためヒトではアレルギ
ー反応を起こす可能性もある。

【０００８】銅亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ(CuZ
n SOD)は種々の形態のスーパーオキシドジスムターゼの
うちで最も研究が進み、その特性も最も解明されてい
る。

【０００９】ヒトCuZn SODは、非共有的に結合した同一
のサブユニットから成り、各サブユニットが分子量16,0
00ダルトンで銅1 原子と亜鉛1 原子とを含む二量体金属
タンパク質である(5) 。各サブユニットは153 個のアミ
ノ酸から成りその配列は解明されている(6,7) 。

【００１０】ヒトCuZnスーパーオキシドジスムターゼを
コードするcDNAがクローニングされた(8) 。クローン化
DNA の全配列も決定された(9) 。更に、細菌中でスーパ
ーオキシドジスムターゼを産生及び回収するためのスー
パーオキシドジスムターゼをコードするDNA を含む発現
ベクターも記載されている(24,25) 。スーパーオキシド
ジスムターゼDNA の発現及びその酵母中でのSOD の産生
も開示された(26)。

【００１１】最近、ヒト染色体21上のCuZn SOD遺伝子座
が決定され(27)、CuZnスーパーオキシドジスムターゼに
関する最近の研究成果がまとめられた(28)。

【００１２】マンガンスーパージスムターゼ(MnSOD) に
ついてはまだ未知の部分が多い。大腸菌（E.coli）K-12
のMnSOD が最近クローニングされその地図が作成された
(22)。Barra 等はヒト肝臓細胞から単離されたMnSOD ポ
リペプチドの196 個のアミノ酸配列を開示している(1
9)。しかし乍ら従来技術の開示では、MnSOD 分子の構造
について、特に該構造の同一のポリペプチドサブユニッ
トが2 つであるか4 つであるかについて意見が分かれて
いる(19,23) 。しかし乍ら、MnSOD ポリペプチドとCuZn
SOD ポリペプチドとが相同でないことについては一致し
ている(19)。種々のソースからのMnSOD とFeSOD とのア
ミノ酸配列の相同性も比較されている(18)。

【００１３】Baret 等はラットモデルに於いて、ヒトMn
SOD の半減期がヒト銅SOD の半減期より実質的に長いこ
とを開示している。彼等はまた、ラットモデルに於い
て、ヒトMnSOD とラット銅SOD とは抗炎症剤として有効
でないが、ウシ銅SOD とヒト銅SOD とが完全に有効であ
ることを開示している(20)。

【００１４】McCord等は、in vitro試験では天然産生ヒ
トマンガンスーパーオキシドジスムターゼが食作用を行
なうヒト多形核(PMN) 白血球をウシ又はブタのCuZnスー
パーオキシドジスムターゼよりも十分にスーパーオキシ
ド遊離ラジカルから保護することを開示している(21)。

【００１５】

【発明が解決しようする課題】本発明はヒトマンガンス
ーパーオキシドジスムターゼポリペプチドもしくはその
類似体又はそれらの突然変異体をコードするcDNA分子の
調製に係る。本発明はまた、該cDNAを有効な細菌発現ベ
クターに挿入し、細菌中にヒトMnSOD ポリペプチド、そ
の類似体、その突然変異体及び酵素を産生し、細菌産生
ヒトMnSOD ポリペプチド、その類似体、その突然変異体
又は酵素を回収することを目的とする。

【００１６】本発明はまた、このように回収されたヒト
MnSOD ポリペプチド、その類似体又はその突然変異体と
それらの使用とに係る。

【００１７】本発明は更に、細菌中での酵素活性ヒトMn
SOD の産生方法及びこのような酵素活性ヒトMnSOD の回
収及び精製方法に係る。

【００１８】本発明はまた、ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼ遺伝子をコードするDNA 分子に係る。
本発明はまた、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ
ポリペプチド、類似体、突然変異体及び酵素を産生する
ためにDNA を哺乳類細胞に挿入することを目的とする。

【００１９】本発明はまた、スーパーオキシドラジカル
が過酸化水素及び分子酸素に還元することを触媒するた
めのヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ又はそ
の類似体もしくは突然変異体の使用に係る。本発明は特
に、虚血後の再灌流障害の抑制及び摘出単離器官の生存
期間延長のための細菌産生マンガンスーパーオキシドジ
スムターゼ又はその類似体もしくは突然変異体の使用に
係る。

【００２０】本発明は更に、炎症を治療するための細菌
産生ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ、ヒト
マンガンスーパーオキシドジスムターゼ類似体又はヒト
マンガンスーパーオキシドジスムターゼ突然変異体の使
用に係る。本発明は特に、不快な症状を生起する量の酸
素遊離ラジカルの発生に関連する疾患の治療のためのヒ
トマンガンスーパーオキシドジスムターゼ、ヒトマンガ
ンスーパーオキシドジスムターゼ類似体又はヒトマンガ
ンスーパーオキシドジスムターゼ突然変異体の使用に係
る。治療される疾患の例は、(1) 細菌性リポ多糖内毒素
(LPS) によって誘発される滑膜炎症；(2) アジュバント
誘発関節炎によって生じる炎症；又は(3) ブレオマイシ
ン誘発肺線維症である。本発明は更に、ヒトマンガンス
ーパーオキシドジスムターゼ、ヒトマンガンスーパーオ
キシドジスムターゼ類似体又はヒトマンガンスーパーオ
キシドジスムターゼ突然変異体の投与方法、及び、ヒト
マンガンスーパーオキシドジスムターゼ、ヒトマンガン
スーパーオキシドジスムターゼ類似体又はヒトマンガン
スーパーオキシドジスムターゼ突然変異体の量及び投与
量に係る。

【００２１】本発明はまた、天然ヒトマンガンスーパー
オキシドジスムターゼに比べてN 末端の１つ以上のアミ
ノ酸の欠失を異にするヒトマンガンスーパーオキシドジ
スムターゼを少なくとも１つ含む種々のヒトマンガンス
ーパーオキシドジスムターゼ類似体に係る。これらの類
似体は組成物として使用され、これらの組成物は酸素遊
離ラジカルの発生に関連する不快な症状を軽減すること
によって種々の疾患の治療に使用され得る。

【００２２】

【課題を解決するための手段】ヒトマンガンスーパーオ
キシドジスムターゼポリペプチドもしくはその類似体又
はそれらの突然変異体をコードするcDNAを含むDNA 分子
がヒトT-細胞ライブラリーから単離された。ヒトマンガ
ンスーパーオキシドジスムターゼポリペプチドもしくは
その類似体又はそれらの突然変異体をコードする二重鎖
DNA分子のヌクレオチド配列が発見された。該ポリペプ
チドもしくはその類似体をコードする１つの鎖の配列は
第１図のヌクレオチド115 から下流にヌクレオチド708
までの配列である。類似体又はそれらの突然変異体をコ
ードする別の配列は該ポリペプチドをコードする鎖と実
質的に同様であろう。24個のアミノ酸プレペプチドをコ
ードする二重鎖DNA 分子の１つの鎖のヌクレオチド配列
は同じく第１図にヌクレオチド43からヌクレオチド114
で示される。

【００２３】ヒトマンガンスーパーオキシドジスムター
ゼポリペプチドもしくはその類似体又はそれらの突然変
異体をコードする配列をもつヌクレオチド鎖を含む二重
鎖DNA 分子又はその他の任意の二重鎖DNA をプラスミド
又はウィルスの如きクローニングベヒクルに組み込んで
もよい。いずれのDNA 分子も、原核細胞例えば細菌又は
真核細胞例えば酵母もしくは哺乳動物に公知方法で導入
され得る。この公知方法はいずれかの分子を含むクロー
ニングベヒクルを使用する方法でもよいがこの方法に限
定はされない。

【００２４】好ましくはヒトマンガンスーパーオキシド
ジスムターゼポリペプチドもしくはその類似体又はそれ
らの突然変異体をコードするcDNA又はDNA をプラスミド
例えばpMSE-4又はpMS ΔRB4 に組み込んで、次にDNA が
発現できる適当な宿主細胞に導入し、ヒトマンガンスー
パーオキシドジスムターゼ(hMnSOD)ポリペプチドもしく
はその類似体又はそれらの突然変異体を産生する。好ま
しい宿主細胞は大腸菌（Escherichia coli）、特に大腸
菌A4255 株及び大腸菌A1645 株である。大腸菌A4255 株
中のプラスミドpMSE-4はAmerican Type Culture Collec
tionにATCC受託番号No.53250で寄託された。プラスミド
pMS ΔRB4 は第４図に示し図面に関する説明に記載のご
とく調製され得る。

【００２５】かかるDNA 分子が導入された細胞を、DNA
をmRNAに転写しmRNAをタンパク質として発現させ得る適
当な条件下で当業者に公知の方法で培養又は増殖させ
る。得られたマンガンスーパーオキシドジスムターゼタ
ンパク質を回収する。

【００２６】ヒトMnSOD もしくはその類似体又はそれら
の突然変異体と適当な担体とを含む獣医薬又は医薬組成
物を調製することも可能である。このヒトマンガンスー
パーオキシドジスムターゼもしくはその類似体又はそれ
らの突然変異体は以下の反応を触媒するために使用され
得る。

【００２７】

【化１】

【００２８】これによりスーパーオキシドラジカルによ
って生じる細胞傷害が低減する。

【００２９】より特定的には、これら酵素もしくはその
類似体又はそれらの突然変異体は、虚血後の再潅流によ
って生じる傷害を低減するため、摘出単離器官の生存時
間を延長するため又は炎症治療に使用され得る。

【００３０】本発明は、酵素活性ヒトマンガンスーパー
オキシドジスムターゼもしくはその類似体又はそれらの
突然変異体を細菌細胞中で産生する方法に係る。細菌細
胞は、マンガンスーパーオキシドジスムターゼもしくは
その類似体又はそれらの突然変異体をコードするDNA 配
列を含み該配列を発現し得る。本発明方法では、細菌細
胞を適当な産生培地中で適当な条件下に維持する。培地
中で細胞が利用できるMn²⁺の濃度が約２ppm を上回るよ
うに産生培地にMn²⁺を補給する。

【００３１】本発明の好適具体例に於いて、細菌細胞は
ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼポリペプチ
ドをコードするDNA 配列を含むプラスミド、例えばpMSE
-4又はpMS ΔRB4 を含む大腸菌細胞、例えば大腸菌A425
5 株である。産生培地中のMn²⁺の濃度範囲は約50ppm 〜
約1500ppm であり、好ましくは150ppm及び750ppmであ
る。

【００３２】本発明は更に、マンガンスーパーオキシド
ジスムターゼもしくはその類似体又はそれらの突然変異
体を含有細菌細胞から回収する方法に係る。ヒトマンガ
ンスーパーオキシドジスムターゼもしくはその類似体又
はそれらの突然変異体を含む細胞中に存在するタンパク
質を含むタンパク質分画を回収すべく細胞を先ず処理
し、次にタンパク質分画を処理してヒトマンガンスーパ
ーオキシドジスムターゼもしくはその類似体又はそれら
の突然変異体を回収する。本発明の好適具体例に於いて
は、細胞を先ず処理して不溶タンパク質と細胞壁破片と
から可溶タンパク質を分離し、次に可溶タンパク質を回
収する。次に可溶タンパク質を処理して、hMnSODもしく
はその類似体又はそれらの突然変異体を含む可溶タンパ
ク質の分画を分離例えば沈澱させ、hMnSODもしくはその
類似体又はそれらの突然変異体を含む分画を回収する。
回収した可溶タンパク質分画を次に処理してヒトマンガ
ンスーパーオキシドジスムターゼもしくはその類似体を
分離回収する。

【００３３】より好ましい方法によれば、ヒトマンガン
スーパーオキシドジスムターゼもしくはその類似体又は
それらの突然変異体を含有する細菌細胞からヒトマンガ
ンスーパーオキシドジスムターゼもしくはその類似体又
はそれらの突然変異体を回収する。該方法では先ず産生
培地から細菌細胞を単離し、pH約 7.0〜8.0 の適当な溶
液に懸濁させる。次に細胞を破壊し遠心して得られた上
清を55〜65℃で約30〜120 分間、好ましくは58〜62℃で
45〜75分間、より好ましくは60℃で１時間加熱し、10℃
未満好ましくは約４℃まで冷却する。形成された沈澱物
を例えば遠心によって完全に除去し、冷却された上清を
適当なバッファ、例えばpH約7.8 の2mM燐酸カリウムバ
ッファに透析する。好ましくは30K より小さい濾過膜を
使用し限外濾過によって透析する。透析と同時又は透析
後に、冷却した上清を適当な容量、例えば初期容量の0.
03まで任意に濃縮してもよい。保持物(retentate) を適
当なバッファ溶液例えばpH約7.8 の20mM以上の燐酸カリ
ウムバッファ溶液でアニオン交換クロマトグラフィーカ
ラムから溶出する。スーパーオキシドジスムターゼを含
む溶出物の分画を収集し、プールし、pH5.5 の約40mMの
酢酸カリウムに透析する。透析したプール分画をpH5.5
の約40〜約200mM の酢酸カリウムの直線濃度勾配をもつ
カチオン交換クロマトグラフィーカラムで溶出する。ス
ーパーオキシドジスムターゼを含むピーク分画を収集
し、プールする。プールしたピーク分画を任意に適当な
溶液、例えば水又はpH約7.8 の約10mM燐酸カリウムバッ
ファのバッファ溶液に透析する。

【００３４】本発明はまた、本発明の方法で産生され精
製された酵素活性ヒトマンガンスーパーオキシドジスム
ターゼもしくはその類似体例えばmet-hMnSOD又はそれら
の突然変異体に係る。

【００３５】本発明はまた、ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼ遺伝子をコードするDNA 分子に係る。
マンガンスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子の１つの
鎖のエキソンコード領域のヌクレオチド配列を第６図に
示す。マンガンスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子を
コードするDNA はプラスミド又はウイルスのごときクロ
ーニングベヒクルに組み込まれ得る。DNA 又はクローニ
ングベヒクルは公知方法で真核細胞に導入され得る。ヒ
トマンガンスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子をコー
ドするDNA は、プラスミドpMSG11-1、pMSG4 及びpMSG-1
b 中にコードされる。形質転換される真核細胞は好まし
くはヒトHeLa細胞系又はマウスL 細胞系のごとき哺乳類
細胞系である。本発明の別の目的は、本発明の細胞を適
当な培地中で適当な条件下に増殖することによってヒト
マンガンスーパーオキシドジスムターゼポリペプチド、
類似体、突然変異体又は酵素を産生することである。

【００３６】本発明はまた、ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼ、ヒトマンガンスーパーオキシドジス
ムターゼ類似体をコードしそのコード鎖が第６図のヌク
レオチド配列をもつ二重鎖DNA 分子に係る。本発明は更
に、ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ突然変
異体をコードしそのコード鎖が第６図のヌクレオチド配
列に比べて１つ以上のヌクレオチドを異にするヌクレオ
チド配列をもつ二重鎖DNA 分子に係る。

【００３７】本発明はまた、ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼ、ヒトマンガンスーパーオキシドジス
ムターゼ類似体又はヒトマンガンスーパーオキシドジス
ムターゼ突然変異体をコードするDNA 配列が発現された
真核細胞に係る。本発明はまた、ヒトマンガンスーパー
オキシドジスムターゼ、ヒトマンガンスーパーオキシド
ジスムターゼ類似体又はヒトマンガンスーパーオキシド
ジスムターゼ突然変異体をコードするDNA 配列を含むプ
ラスミドによって形質転換された真核細胞に係る。この
DNA 配列は単一コピーで存在してもよく又は多数コピー
で存在してもよい。ヒトマンガンスーパーオキシドジス
ムターゼ、ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ
類似体又はヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ
突然変異体をコードするDNA 配列は、ヒトマンガンスー
パーオキシドジスムターゼ遺伝子を含むヒトゲノムDNA
のフラグメントに由来する。更に、ヒトマンガンスーパ
ーオキシドジスムターゼをコードするDNA 配列は、ヒト
ゲノムマンガンスーパーオキシドジスムターゼ、ヒトマ
ンガンスーパーオキシドジスムターゼ類似体又はヒトマ
ンガンスーパーオキシドジスムターゼ突然変異体の天然
調節要素によって調節される。ヒトマンガンスーパーオ
キシドジスムターゼ、類似体又は突然変異体をコードし
且つこれらの遺伝子を調節する天然調節要素をコードす
るDNA 配列の一例が第６図のDNA 配列に示される。

【００３８】ヒトマンガンスーパーオキシドジスムター
ゼ、ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ類似体
又はヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ突然変
異体のゲノムDNA 配列を発現する真核細胞は、哺乳類細
胞である。ゲノムDNA 配列を発現し得る哺乳類細胞の例
はヒトHeLa細胞及びマウスL 細胞である。

【００３９】本発明はまた、ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼ、その類似体もしくは突然変変異体を
産生させ得る適当な条件下に適当な培地中で前記真核細
胞を増殖させ、得られたヒトマンガンスーパーオキシド
ジスムターゼ、その類似体もしくは突然変異体を回収す
るヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ、ヒトマ
ンガンスーパーオキシドジスムターゼ類似体又はヒトマ
ンガンスーパーオキシドジスムターゼ突然変異体の産生
方法を提供する。本発明はまた、本発明方法によって産
生されたヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼポ
リペプチド、ヒトマンガンスーパーオキシドジスムター
ゼ類似体及びヒトマンガンスーパーオキシドジスムター
ゼ突然変異体を提供する。

【００４０】本発明はまた、炎症の治療、特にリポ多糖
内毒素(LPS) によって誘発された滑膜炎症、アジュバン
ト誘発関節炎に起因する炎症及びブレオマイシン誘発肺
線維症の治療に使用されるヒトマンガンスーパーオキシ
ドジスムターゼ、ヒトマンガンスーパーオキシドジスム
ターゼ類似体又はヒトマンガンスーパーオキシドジスム
ターゼ突然変異体に係る。これらの種々の疾患を治療す
るためのマンガンスーパーオキシドジスムターゼ、マン
ガンスーパーオキシドジスムターゼ類似体及びマンガン
スーパーオキシドジスムターゼ突然変異体の使用に関し
ては後出の実施例で詳細に説明する。本発明はまた、症
状を軽減し疾患を治療するために使用されるヒトマンガ
ンスーパーオキシドジスムターゼ、その類似体もしくは
突然変異体の量及び投与量と投与方法とに係る。

【００４１】本発明は更に、天然ヒトマンガンスーパー
オキシドジスムターゼに比べてN 末端のアミノ酸が１つ
以上欠失したヒトマンガンスーパーオキシドジスムター
ゼポリペプチドを１つ以上含むヒトマンガンスーパーオ
キシドジスムターゼ類似体に係る。

【００４２】本発明はまた、ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼ、ヒトマンガンスーパーオキシドジス
ムターゼ類似体又はヒトマンガンスーパーオキシドジス
ムターゼ突然変異体と適当な担体とを含む組成物に係
る。これらの組成物は、天然スーパーオキシドジスムタ
ーゼを使用できる任意の疾患の治療のため及び酸素遊離
ラジカルの発生に関連する不快な症状の軽減のために使
用され得る。これらの疾患及び症状の非限定例は、虚血
又は臓器移植後の再灌流障害、炎症、気管支肺異形成、
放射線治療に起因する線維症、クローン病に起因する炎
症又は大腸炎(collitis)に起因する炎症である。

【００４３】図面の説明 第１図。ヒトMnSODcDNA の配列 第１図はヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼを
コードする二重鎖DNA分子の１つの鎖のヌクレオチド配
列と該DNA 配列に対応するヒトMnSOD の198 個のアミノ
酸配列とを示す。第１図はまた、24個のアミノ酸から成
る、成熟ヒトMnSOD に対するプレペプチドをコードする
二重鎖DNA 分子の１つの鎖のヌクレオチド配列と該DNA
配列に対応するアミノ酸配列とを示す。また5'及び3'の
未翻訳配列を示す。

【００４４】第２図。pMSE-4: ヒトMnSOD 発現プラスミ
ドの構築 Eco RＩ(R₁ ) インサートにMnSOD を含むプラスミドpM
S8-4をNde ＩとNar Ｉ制限酵素で完全消化した。大きい
断片を単離し第２図に示すように合成オリゴマーと結合
した。得られたプラスミドpMS8-NN はATG 開始コドンの
直後に成熟MnSOD のコード領域を含む。このプラスミド
をEco R Ｉで消化し、Polymerase ＩのKlenow断片で末端
を充填し、更にNde Ｉで開裂した。MnSOD 遺伝子を担持
する小さい断片をNde ＩとStu Ｉとによって処理したpS
ODα13に挿入した。pSODα13は、1984年８月27日出願の
米国特許出願第644245号に開示された方法で得られる。
該特許出願は本明細書に含まれるものとする。この結果
得られたプラスミドpMSE-4はλＰ_L プロモータのコント
ロール下でcII リボソーム結合部位の直後にMnSODコー
ド領域を含む。プラスミドpMSE-4はAmerican Type Cult
ure CollectionにATCC受託番号No.53250で寄託されてい
る。

【００４５】第３図。大腸菌中で産生されたSOD の活性
に対するMn²⁺の濃度の影響 第３図のチャート図は、非誘発条件（32℃）及び誘発条
件（42℃）下でプラスミドpMSE-4を含む大腸菌A4255 株
によって産生された組換体可溶性MnSOD の比活性（単位
／ｌ) と増殖培地中のMn²⁺濃度(ppm) との相関関係を示
す。

【００４６】第４図。pMS ΔRB4:ヒトMnSOD 発現プラス
ミドの構築 pSODβ₁ T-11をEco RＩで完全消化しBam HＩ制限酵素
で部分開裂することによって Tet^R 発現ベクターp ΔRB
を調製した。pSODβ₁ T-11はAmerican Type Culture Co
llection(ATCC)に受託番号No.53468で寄託されている。
消化されたプラスミドを合成オリゴマー

【００４７】

【化２】

【００４８】と結合しλＰ_L プロモータを含むp ΔRBを
調製した。

【００４９】cII リボソーム結合部位と成熟酵素の完全
コード配列とを含むMnSOD 発現プラスミドpMSE-4のEco
RＩ断片をp ΔRBの単一Eco RＩ部位に挿入した。得ら
れたプラスミドpMS ΔRB4 はλＰ_L のコントロール下の
MnSOD 遺伝子とcII RBS とを含みテトラサイクリン耐性
であった。

【００５０】第５図。ヒトマンガンスーパーオキシドジ
スムターゼ遺伝子の制限地図及び編制 太い実線はゲノムDNA を種々の制限エンドヌクレアーゼ
の位置と共に示す。黒塗りの矩形Ｉ〜VIはエキソンを示
す。上方の３つの白抜き横線はマンガンスーパーオキシ
ドジスムターゼ遺伝子を含むゲノムクローンを示す。

【００５１】第６図。ヒトマンガンスーパーオキシドジ
スムターゼ遺伝子のヌクレオチド配列 コード領域及び隣接ヌクレオチドを示す。エキソン（斜
線部分）はcDNAクローンとの比較によって同定された。
下線を付けた部分は、開始コドン(ATG) 、終止コドン(T
AA) 及びポリアデニレーションシグナル(AATAAA)を示
す。配列に上線を引いた部分はSpl ヘキサヌクレオチド
(GGGCGG)結合部位を示す。点線矢印は可能なステム−ル
ープ構造を示す。実線矢印はダイレクトリピートを示
す。図の左から始まる番号は、本文中で言及した領域が
同定できるように任意に選択した数であることを理解さ
れたい。非コード領域又はコード領域の全体を示しては
いない。

【００５２】第７図。ヒトマンガンスーパーオキシドジ
スムターゼ遺伝子のエキソン−イントロン接合 全部で５つのイントロンの縁端のヌクレオチド配列をコ
ンセンサス配列と比較する。イントロン#1の１つのヌク
レオチドのシフトがドナー配列又はアクセプター配列を
変更させ得ることに注目されたい。

【００５３】第８図。ラットに皮下注射後のマンガンス
ーパーオキシドジスムターゼの薬物動態 50mg／KgのCuZn SOD（下のグラフ）又はマンガンスーパ
ーオキシドジスムターゼ（上のグラフ）の皮下投与後の
ラットの血清レベルのSOD 酵素活性の経時変化。比活性
3000ユニット／mgをもつと想定しμg ／mlで算出した酵
素活性の平均と標準偏差（各点３ラット）とを示す。

【００５４】第９図。マンガンスーパーオキシドジスム
ターゼとCuZn SODとの比較 カラゲナンで誘発されたラットの前足腫脹に対するCuZn
SOD及びマンガンスーパーオキシドジスムターゼの投与
の効果。マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（50mg
／Kg）はカラゲナン注射の24時間前に皮下投与（−24h
Mn）し、 CuZnSOD （50mg／Kg）はカラゲナン注射の２
時間前（−2h Cu ）又は24時間前（−24h Cu）に皮下投
与した。コントロールラットにはカラゲナンだけを投与
した。棒グラフ及び縦の鉤括弧はカラゲナン投与の１、
２、３及び４時間後の前足腫脹の増加の平均±標準偏差
（各グループ８ラット）を示す。* 印はコントロールグ
ループと処置グループとの間の統計的有意差を示す。
(*)p 0.05;(**)p 0.01;(***)p 0.001 。

【００５５】第10図。ラットにおける組換マンガンスー
パーオキシドジスムターゼの薬物動態 ３つの経路でラットに投与した組換マンガンスーパーオ
キシドジスムターゼの薬物動態。曲線(1) は体重(b.w.)
当たり25mg／Kgで静注投与(i.v.)、曲線(2) は25mg／Kg
b.w. で腹膜組織内投与(i.p.)、曲線(3) は25mg／Kg
b.w. で皮下投与(s.c.)した場合を示す。

【００５６】ラット（各グループ７匹）に時間０で注射
し、注射の0.03、0.5 、２、４、24、30及び48時間後に
血液サンプルを採取し、酵素学的及びRIA の双方を用い
て各ラットの血清中のマンガンスーパーオキシドジスム
ターゼの存在量を分析した。各サンプル毎に平均値（±
標準偏差）を注射後の時間の関数としてプロットする。

【００５７】第11図。炎症治療における組換マンガンス
ーパーオキシドジスムターゼとCuZnスーパーオキシドジ
スムターゼ類似体との治療効果 棒グラフは細菌リポ多糖(LPS) によって誘発された膝関
節炎症に対するマンガンスーパーオキシドジスムターゼ
及びCuZn SODの治療効果を示す。膝関節炎症を滑液重量
（ｇ）として示す。５つのグループのラットを使用して
試験した。グループ１（ポジティブコントロール；LPS
）にはLPS だけを与えてマンガンスーパーオキシドジ
スムターゼで治療しない。グループ２（ネガティブコン
トロール）には偽注射として生理食塩水だけを与えた。
グループ３には膝関節当たり５mgのCuZnをLPS と共に使
用した。グループ４には膝関節当たり１mgのCuZn SODを
ＬＰＳと共に使用した。グループ５には膝関節当たり
０．６ｍｇ のマンガンスーパーオキシドジスムターゼ
をLPS と共に使用した。マンガンスーパーオキシドジス
ムターゼとCuZn SODとのLPS 誘発炎症阻害効果の有意性
を決定するために統計的試験（スチューデント式テス
ト）を行なった。

【００５８】第12図。アジュバント誘発関節炎の治療に
おける組換マンガンスーパーオキシドジスムターゼ及び
CuZn SODの効果 棒グラフはアジュバント（フロインドアジュバント）で
誘発された関節炎の阻害に対するマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼ及びCuZn SODの効果を示す。関節炎の
程度をアジュバント注射後の前足腫脹の増加によって示
す。免疫的に誘発された慢性関節炎の期間に相当するア
ジュバント注射14日後の前足体積に対する前足体積増加
を測定する。アジュバント注射14日後からアジュバント
処置ラットに対してマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼ及びCuZn SODの体重(b.w.)に応じた量の投与を開始
する。（各グループ６匹から成る）７グループのラット
を使用して試験した。第１日目にヒト結核菌の死菌を10
mg／ml含むフロインドアジュバント50mlを動物全部に注
射した。14日〜20日目に以下の処置を与えた。グループ
１（コントロール）のラットは全く処置しない。グルー
プ２のラットには体重に対して12.5mg／Kgのマンガンス
ーパーオキシドジスムターゼを毎日１回ずつ７日間投与
した。グループ３のラットには体重に対して25mg／Kgの
マンガンスーパーオキシドジスムターゼを毎日１回ずつ
７日間投与した。グループ４のラットには体重に対して
12.5mg／KgのCuZn SODを毎日１回ずつ７日間投与した。
グループ５のラットには体重に対して25mg／Kg のCuZn
SODを毎日１回ずつ７日間投与した。グループ６のラッ
トには体重に対して50mg／Kg のマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼを隔日毎、即ち１、３及び５日目に投
与した。グループ７のラットには50mg／KgのCuZn SODを
隔日毎、即ち１、３及び５日目に投与した。

【００５９】14日目に対する21日目の動物の前足腫脹の
程度を測定した。スチューデント式テストで統計的分析
を行なった。

【００６０】第13図。ブレオマイシン誘発肺線維症の治
療における組換マンガンスーパーオキシドジスムターゼ
の治療効果 棒グラフはブレオマイシン誘発肺線維症に対するマンガ
ンスーパーオキシドジスムターゼの治療効果を示す。

【００６１】ブレオマイシンに誘発された肺線維症の程
度は２つの方法で表現できる。(1)体重に対する肺重量
の比、又は(2) 肺当たりのヒドロキシプロリンの量（μ
g ／ｇ湿潤重量) 。

【００６２】３グループのラット（１グループ15匹）を
試験した。グループ１のラット（ネガティブコントロー
ル) には偽処置によって生理食塩水だけを与えた。グル
ープ２のラットには１日目に１匹当たり1.5 ユニット
（＝1.5mg ）のブレオマイシンを気管内投与した。グル
ープ３のラット（ポジティブコントロール）には１日目
にブレオマイシン（ラット１匹当たり1.5 ユニットを気
管内投与）を与え、以後７日目までマンガンスーパーオ
キシドジスムターゼ（体重に対して50mg／Kg）を毎日１
回皮下注射した。

【００６３】試験開始３週後に生存動物を殺し肺を摘出
した。各肺の湿潤重量を測定し、各肺のヒドロキシプロ
リン含量を（実施例14に記載の標準方法で）検定した。
白い棒グラフは体重に対する肺重量の比を示し、斜線棒
グラフは湿潤組織重量当たりのヒドロキシプロリンの含
量を示す。鉤括弧は平均の標準偏差(S.E.M.)を示す。

【００６４】第14図。ブレオマイシン誘発肺線維症に対
する組換ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼの
毎日皮下注射の効果 ３つのグループのラット（体重 100〜120 ｇ）（15匹／
グループ）を使用して試験した。第１グループには１日
目にブレオマイシン(1.5ユニット／ラット) を気管内投
与した。第２グループには第１グループ同様のブレオマ
イシンを投与し同時に７日目まで組換ヒトマンガンスー
パーオキシドジスムターゼ（50mg／μｇ）を毎日１回ず
つ皮下投与した。（組換ヒトマンガンスーパーオキシド
ジスムターゼはブレオマイシン投与の２時間前に投与し
た）。第３グループ（ネガティブコントロール）には１
日目に生理食塩水を気管内注射した。

【００６５】３週後、全部の生存動物を殺し肺を摘出し
て肺のコラーゲン含量（ヒドロキシプロリンとして示さ
れる）を測定した。結果を第１４図に示す。

【００６６】第15図。ブレオマイシン誘発肺線維症に対
するマンガンスーパーオキシドジスムターゼ投与頻度の
効果 実験の細部は第14図の記載と本質的に同じであるが、マ
ンガンスーパーオキシドジスムターゼの投与頻度を変更
した。組換ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ
を１日目に１回皮下注射するか又は隔日毎に３回（１、
３、５日）皮下注射した。また、組換CuZn SOD類似体の
肺線維症阻害効果も分析した。結果を第15図に示す。

【００６７】第16図。ブレオマイシン誘発肺線維症に対
する腹膜組織内に投与したマンガンスーパーオキシドジ
スムターゼの効果 実験の細部は第14図の記載と本質的に同じであるが、マ
ンガンスーパーオキシドジスムターゼ又はCuZn SOD類似
体を皮下でなく腹膜組織内に投与した。第15図の記載と
同様に単一投与量のマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼ又はCuZn SODを隔日毎に１回ずつに分割投与した。
結果を第16図に示す。

【００６８】

【発明の実施の形態】ヒトマンガンスーパーオキシドジ
スムターゼポリペプチドもしくはその類似体又はそれら
の突然変異体をコードするcDNAを含む二重鎖DNA 分子が
ヒトT-細胞DNA ライブラリーから単離された。ヒトマン
ガンスーパーオキシドジスムターゼポリペプチドもしく
はその類似体又はそれらの突然変異体をコードする二重
鎖DNA分子のヌクレオチド配列が発見された。ヒトマン
ガンスーパーオキシドジスムターゼポリペプチドもしく
はその類似体をコードするDNA 分子の１つの鎖の配列は
第１図に示されておりヌクレオチド115 から708 までを
含む。hMnSOD類似体又はそれらの突然変異体をコードす
る１つの鎖の配列はhMnSODポリペプチドをコードする鎖
に実質的に等しい。ヒトマンガンスーパーオキシドジス
ムターゼのプレペプチドのヌクレオチド配列も第１図に
示されている。ヌクレオチド43から114 までがこのプレ
ペプチドをコードする。

【００６９】ヒトマンガンスーパーオキシドジスムター
ゼポリペプチドもしくはその類似体又はそれらの突然変
異体をコードするcDNAを調製しDNA の配列を決定する方
法は当業者に公知であり詳細に後述する。更に、ヒトマ
ンガンスーパーオキシドジスムターゼをコードするDNA
配列が発見されたので、この配列部分を含むDNA 分子を
調製するために公知の合成方法を使用し得る。

【００７０】従来のクローニングベヒクル例えばpBR322
の如きプラスミド、ウィルス又は例えばλの如きバクテ
リオファージはヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼポリペプチドもしくはその類似体又はそれらの突然
変異体をコードするcDNAを含む新規なクローニングベヒ
クルを産生するように公知方法によって修飾及び操作さ
れ得る。同様にかかるクローニングベヒクルは、１つの
鎖が第１図に示すヒトマンガンスーパーオキシドジスム
ターゼポリペプチドの配列をもつ断片又はこれと実質的
に等しい断片を含むDNA 分子を含むように修飾又は操作
され得る。挿入されるDNA 分子は酵素合成又は化学合成
の如き種々の方法によって調製され得る。

【００７１】得られたクローニングベヒクルは、天然に
は産生しない化学物質であり、一般にDNA 組換技術と指
称される最新の技術でしか調製できない。好ましくはク
ローニングベヒクルはプラスミド、例えばpMSE-4又はpM
S ΔRB4 である。これらクローニングベヒクルは形質転
換、トランスフェクション等の当業者に公知の技術を使
用し原核細胞例えば細菌（大腸菌、枯草菌）に導入され
てもよく、又は真核細胞例えば酵母もしくは哺乳動物に
導入されてもよい。従って、クローニングベヒクルが導
入される細胞はクローニングベヒクル中にcDNAが存在す
るときはヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼポ
リペプチドもしくはその類似体又はそれらの突然変異体
をコードするcDNAを含み、クローニングベヒクル中にDN
A が存在するときはそのDNA の１つの鎖の全部又は一部
が第１図のヒトMnSOD ポリペプチドの配列又はこれと実
質的に等しい配列を含む該DNA を含む。

【００７２】大腸菌は本発明のクローニングベヒクルの
好ましい宿主細胞である。現状で大腸菌の好ましい栄養
要求菌はプラスミドpApoE-Ex2 を含む大腸菌A1645 であ
る。該大腸菌はAmerican Type Culture Collection、Ro
ckville 、Maryland、USA にATCC受託番号No.39787で寄
託されている。本出願に記載のAmerican Type Culture
Collectionへの寄託はいずれも微生物の寄託の国際的承
認に関するブダペスト条約に従ってなされたものであ
る。

【００７３】A1645 は Gal⁺ （ガラクトース発酵能）と
テトラサイクリン耐性の喪失とに基づく選択によってA1
637 から得られた。A1645 はλファージのエレメントを
維持している。その表現型は、C600ｒ^- ｍ⁺ gal⁺ thr
^- leu^- lacZ^- bl（λcI857ΔH1 ΔBamH1N⁺ ）であ
る。

【００７４】A1637 はテトラサイクリン耐性遺伝子を含
むトランスポゾンをガラクトースオペロンとcIリプレッ
サー合成を生起させるエレメントを含むλファージのエ
レメントとに導入することによってc600から得られた。
C600はAmerican Type Culture CollectionからATCC受託
番号No.23724として得られる。

【００７５】最小培地中で増殖するときでも高いレベル
のポリペプチドを発現し得る大腸菌の原栄養株はマンガ
ンスーパーオキシドジスムターゼをコードする遺伝子の
発現用宿主として更に好ましい。現在の好ましい原栄養
株はA4255 である。プラスミドpMSE-4を含むA4255 株は
American Type Culture CollectionにATCC受託番号No.5
3250で寄託されている。

【００７６】得られた細胞はヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼポリペプチドもしくはその類似体又は
それらの突然変異体をコードするDNA を取り込んでお
り、この細胞を当業者に公知の適当な条件下で増殖又は
培養によって適宜処理するとDNA は、そのDNA によって
コードされた遺伝情報の発現を指令する。例えばDNA が
hMnSODポリペプチドもしくはその類似体又はそれらの突
然変異体の発現を指令し、細胞はhMnSODポリペプチドも
しくはその類似体又はそれらの突然変異体を発現させ、
次にこれを回収する。

【００７７】本明細書中の「スーパーオキシドジスムタ
ーゼ(SOD) 」なる用語は、受容体としてスーパーオキシ
ド又は酸素遊離ラジカルに作用するか又は不均化反応

【００７８】

【化３】

【００７９】を触媒する酵素又はポリペプチドを意味す
る。

【００８０】本明細書中の「マンガンスーパーオキシド
ジスムターゼ(MnSOD) 」なる用語は、マンガン元素を任
意の化学的形態で含有するスーパーオキシドジスムター
ゼ分子を意味する。

【００８１】本明細書中の「ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼポリペプチド」なる用語は、198 個の
アミノ酸から成りその一部分が第１図のアミノ酸配列で
あるポリペプチドを意味する。配列のN 末端は第１図の
ヌクレオチド 115〜117 によってコードされるリジンで
あり、配列のCOOH末端は第１図のヌクレオチド 706〜70
8 によってコードされるリジンである。

【００８２】本明細書中の「ポリペプチドマンガン複合
体」なる用語は、ヒトマンガンスーパーオキシドジスム
ターゼポリペプチドを任意の化学的形態のマンガンとの
複合体として含み、天然産生ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼの酵素活性をもつ分子を意味する。

【００８３】本明細書中の「ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼ」なる用語は、少なくとも２つのヒト
マンガンスーパーオキシドジスムターゼポリペプチドを
任意の化学的形態のマンガンとの複合体として含み、天
然産生ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼの酵
素活性をもつ分子を意味する。

【００８４】本明細書中の「ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼポリペプチド類似体」なる用語は、一
端又は両端に１つ以上の付加アミノ酸が結合したヒトマ
ンガンスーパーオキシドジスムターゼポリペプチドを含
むポリペプチドを意味する。

【００８５】本明細書中の「ポリペプチドマンガン複合
体類似体」なる用語は、一端又は両端に結合した１つ以
上の付加アミノ酸を含むポリペプチド部分をもつポリペ
プチドマンガン複合体を含む分子を意味する。

【００８６】本明細書中の「ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼ類似体」なる用語は、２つ以上のポリ
ペプチドを任意の化学的形態のマンガンとの複合体とし
て含み、ポリペプチドの少なくとも１つがヒトマンガン
スーパーオキシドジスムターゼポリペプチド類似体であ
り、天然産生ヒトマンガンスーパーオキシドジスムター
ゼの酵素活性をもつ分子を意味する。

【００８７】本明細書中の「ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼポリペプチド突然変異体」なる用語
は、ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼポリペ
プチドに実質的に等しいが１つ以上の異なるアミノ酸を
含むアミノ酸配列をもつポリペプチドを意味する。

【００８８】本明細書中の「ポリペプチドマンガン複合
体突然変異体」なる用語は、ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼポリペプチド突然変異体を任意の化学
的形態のマンガンとの複合体として含みマンガンスーパ
ーオキシドジスムターゼの酵素活性をもつ分子を意味す
る。

【００８９】本明細書中の「ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼ突然変異体」なる用語は、２つ以上の
ポリペプチドを任意の化学的形態のマンガンとの複合体
として含み、ポリペプチドの少なくとも１つがヒトマン
ガンスーパーオキシドジスムターゼポリペプチド突然変
異体であり、天然産生ヒトマンガンスーパーオキシドジ
スムターゼの酵素活性をもつ分子を意味する。

【００９０】本発明の一部を構成するhMnSODポリペプチ
ド及びhMnSODの突然変異体は第１図のDNA 配列の突然変
異によって調製され得る。該配列のN 末端はヌクレオチ
ド115 〜117 によってコードされるリジンであり、該配
列のCOOH末端はヌクレオチド706〜708 によってコード
される。

【００９１】DNA は当業者に公知の方法、例えばBauer
等、Gene 、37:73-81(1985)の方法で突然変異させ得る。
突然変異した配列を本文に記載の適当な発現ベクターに
挿入し、これを細胞に導入し処理して突然変異DNA がhM
nSODポリペプチド突然変異体とhMnSOD突然変異体との発
現を指令する。

【００９２】ヒトマンガンスーパーオキシドジスムター
ゼの酵素活性形態は、少なくとも２つ、場合によっては
４つの等しいサブユニットをもつタンパク質であり、サ
ブユニットの各々が第１図のヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼの配列中のほぼ198 個のアミノ酸をも
ち、配列のN 末端が第１図のヌクレオチド115 〜117で
コードされるリジンであり、配列のCOOH末端が第１図の
ヌクレオチド706 〜708 でコードされるリジンであると
推定される。

【００９３】ヒトMnSOD もしくはその類似体又はそれら
の突然変異体はヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼもしくはその類似体又はそれらの突然変異体をコー
ドするDNA 又はcDNAを導入した細胞から調製される。こ
のヒトMnSOD もしくはその類似体又はそれらの突然変異
体は陽子の存在下でスーパーオキシドアニオンの不均化
反応又は一価還元によって式

【００９４】

【化４】

【００９５】で示される過酸化水素を形成する反応を触
媒する。

【００９６】有効量のhMnSOD又は1 種類以上のhMnSOD類
似体又はそれらの突然変異体と適当な担体とを含有する
獣医薬及び医薬組成物の調製も可能である。かかる担体
は当業者に公知である。hMnSODもしくはその類似体又は
それらの突然変異体は、炎症にかかった患者を治療する
ため又は虚血もしくは臓器移植後の再潅流のときの酸素
遊離ラジカルによる患者に対する傷害を低減するために
直接に又は動物又はヒト患者に適した組成物の形態で投
与することができる。hMnSODもしくはその類似体又はそ
れらの突然変異体はまた、摘出後の潅流のときの酸素遊
離ラジカルによる単離器官の傷害を低減しこの器官の生
存期間を延長するために、単離器官の潅流媒体に直接添
加されてもよく又は組成物の形態で添加されてもよい。
更に、hMnSODもしくはその類似体又はそれらの突然変異
体は虚血後の再潅流のときの神経傷害を低減するために
使用されてもよく又は気管支肺形成異常の治療に使用さ
れてもよい。

【００９７】本発明はまた、細菌細胞中で酵素活性ヒト
マンガンスーパーオキシドジスムターゼもしくはその類
似体又はそれらの突然変異体を産生する方法を提供す
る。細菌細胞はヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼもしくはその類似体又はそれらの突然変異体をコー
ドするDNA 配列を含み該配列を発現し得る。本発明方法
では、細菌細胞を適当な条件下で適当な産生培地中に維
持する。培地中のMn²⁺濃度が約2ppmを上回るような量の
Mn²⁺を産生培地に補給する。

【００９８】細菌細胞はDNA 組換技術によってヒトマン
ガンスーパーオキシドジスムターゼをコードするDNA 配
列が導入できるいかなる細菌でもよい。細菌はDNA 配列
を発現しタンパク物質を産生し得る必要がある。細菌の
種及び株に従って適正条件及び産生培地を任意に調整し
得る。

【００９９】細菌細胞はプラスミドの如きベクターDNA
分子本体にスーパーオキシドジスムターゼ又は類似体を
コードするDNA 配列を含む必要がある。ベクター即ちプ
ラスミドは分子の適当な位置に取り込まれたSOD をコー
ドする配列をもつようにDNA組換技術によって構築され
得る。

【０１００】本発明の好適具体例では細菌細胞が大腸菌
細胞である。大腸菌の好ましい栄養要求株はA1645 であ
る。大腸菌の好ましい原栄養株はA4255 である。本発明
の大腸菌細胞はヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼもしくはその類似体又はそれらの突然変異体をコー
ドするプラスミドを含む。

【０１０１】本発明の好適具体例で細菌細胞はプラスミ
ドpMSE-4を含む。このプラスミドの構築方法は図面の説
明に記載されておりプラスミド自体は実施例２に記載さ
れている。このプラスミドはATCC受託番号NO.53250で寄
託されている。

【０１０２】本発明の別の好適具体例によれば、細菌細
胞がプラスミドpMS ΔRB4 を含む。このプラスミドの構
築方法は図面の説明に記載されておりプラスミド自体は
実施例5 に記載されている。このプラスミドはATCC受託
番号No.53468で寄託されたプラスミドpSODβ₁ T-11から
構築される。

【０１０３】本発明の特定具体例に於いて、酵素活性ヒ
トマンガンスーパーオキシドジスムターゼ類似体は、プ
ラスミドpMSE-4を含む大腸菌A4255 株細胞及びプラスミ
ドpMS ΔRB4 を含む大腸菌A4255 株によって産生され
る。

【０１０４】細菌細胞の適当な産生培地はカゼイン水解
物又はLB(Luria Broth) 培地の如き許容されるいかなる
タイプの増殖培地でもよい。後者の方が好ましい。大腸
菌の株及び大腸菌が含むプラスミドに従って増殖条件を
適宜調整し得る。例えばプラスミドpMSE-4を含む大腸菌
A4255 は42℃で誘発され、この温度で約１〜５時間維持
される。産生段階以前に接種物を増殖させ培養物を所望
濃度まで増殖させ且つ産生期間中に培養物を維持するた
めの適当な温度、時間、撹拌及び通気条件は適宜変化し
得、当業者に公知である。

【０１０５】酵素活性MnSOD を産生するに必要な培地中
のMn²⁺濃度は使用培地の種類によって調整される。

【０１０６】LB- タイプ増殖培地では150ppm〜750ppmの
Mn²⁺濃度が有効である。全ての複合タイプの増殖培地で
は、培地中のMn²⁺濃度は約50〜約1500ppm であるのが好
ましい。

【０１０７】適当な保存、培養、接種及び産生用培地の
個々の成分を種々に調整し得ることも当業者に公知であ
る。

【０１０８】本発明はまた、ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼもしくはその類似体又はそれらの突然
変異体を含有する細菌細胞からこれらを回収する方法を
提供する。細胞を先ず処理してヒトマンガンスーパーオ
キシドジスムターゼもしくはその類似体又はそれらの突
然変異体を含む細胞中に存在するタンパク質を含むタン
パク質分画を回収し、このタンパク質分画を処理してヒ
トマンガンスーパーオキシドジスムターゼもしくはその
類似体又はそれらの突然変異体を回収する。

【０１０９】本発明の好適具体例によれば、細胞を先ず
処理して可溶タンパク質を不溶タンパク質及び細胞壁破
片から分離し次に可溶タンパク質を回収する。このよう
に回収された可溶タンパク質を処理しヒトマンガンスー
パーオキシドジスムターゼもしくはその類似体又はそれ
らの突然変異体を含む可溶タンパク質の分画を分離例え
ば沈澱させ、この分画を回収する。次にこの分画を処理
してヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼもしく
はその類似体又はそれらの突然変異体を分離回収する。

【０１１０】本発明の好適具体例を以下により詳細に説
明する。先ず、細菌細胞を産生培地から単離しpH約7.0
又は8.0 の適当な溶液に懸濁させる。次に細胞を破壊し
遠心する。得られた上清を約55〜65℃の範囲の温度で約
30〜120 分間、好ましくは58〜62℃で45〜75分間、より
好ましくは60℃で１時間加熱し、10℃未満好ましくは約
４℃に冷却する。冷却中に形成された沈澱物を例えば遠
心によって完全に除去し、次に冷却上清を適当なバッフ
ァに透析する。好ましくは30K 、より好ましくは10K よ
り小さい濾過膜を用いる限外濾過によって冷却上清を透
析する。適当なバッファとしてはpH約7.8 の2mM 燐酸カ
リウムバッファがある。この透析と同時又は透析後に、
冷却上清を適当な容量に任意に濃縮し得る。例えば上清
の初期容量の0.03容に濃縮するのが有利である。次に保
持物を適当なバッファ溶液例えばpH約7.8 の少なくとも
20mMの燐酸カリウムバッファ溶液を用い、アニオン交換
クロマトグラフィーカラムから溶出する。スーパーオキ
シドジスムターゼを含む溶出物の分画を収集しプール
し、pH5.5 の約40mM酢酸カリウムに透析する。透析した
プール分画をpH5.5 の約40〜約200mM 酢酸カリウム(KOA
C)直線勾配をもつカチオン交換クロマトグラフィーカラ
ムから溶出する。スーパーオキシドジスムターゼを含む
ピーク分画を収集しプールする。プールしたピーク分画
を適当な溶液例えば水又はpH約7.8 の約10mMの燐酸カリ
ウムのバッファ溶液で任意に透析してもよい。

【０１１１】本発明はまた、本発明方法によって産生さ
れる精製された即ち実質的にヒト由来の別の物質を含ま
ないヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼもしく
はその類似体又はそれらの突然変異体に係る。特に本発
明は、２つ以上のポリペプチドを含み、このポリペプチ
ドの少なくとも１つが第１図のアミノ酸配列をもち、該
配列のN 末端が第１図のヌクレオチド115 〜117 でコー
ドされるリジンであり、該配列のCOOH末端が第１図のヌ
クレオチド706 〜708 でコードされるリジンであり、該
配列のN 末端に付加メチオニン残基が結合している(Met
-hMnSOD)ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ類
似体に係る。本発明の好適具体例は比活性3500単位／ｌ
をもつ精製Met-hMnSODである。

【０１１２】本発明は更に、哺乳類細胞に導入されてMn
SOD を産生できる完全ヒトマンガンスーパーオキシドジ
スムターゼ遺伝子フラグメントを得るために種々のプラ
スミドから採取されたヒトマンガンスーパーオキシドジ
スムターゼ遺伝子フラグメントの結合に係る。プラスミ
ドから単離された種々のヒトマンガンスーパーオキシド
ジスムターゼフラグメントは、コードヌクレオチドと隣
接ヌクレオチドとを含むゲノムヒトマンガンスーパーオ
キシドジスムターゼ遺伝子のヌクレオチド配列と遺伝子
の制限地図と編制(organization)とを詳細に示す。

【０１１３】ゲノム遺伝子は、第６図の下線部分で示す
ATG 開始コドンの第一ヌクレオチドであるヌクレオチド
479 から始まる。ゲノム遺伝子のTAA 終止コドンはヌク
レオチド2022〜2024にある。これらの番号はヌクレオチ
ド領域が同定され易いように採用した任意の番号であ
る。

【０１１４】ゲノムヒトマンガンスーパーオキシドジス
ムターゼ遺伝子の制限地図及び編制を第５図に示す。

【０１１５】ゲノムマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼDNA の部分は、同じく第５図に示す異なる３つのク
ローンpMSG11-1、pMSG4 及びpMSG-1b の各々において検
出され、これらのクローンから得られたDNA を使用して
第６図のヌクレオチド配列の地図を作成した。第６図及
び第７図はまた、ヒトマンガンスーパーオキシドジスム
ターゼ遺伝子のエキソン領域及びイントロン領域を示
す。

【０１１６】本発明はまた、ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼをコードするDNA配列が発現された真
核細胞、及び、ヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼをコードするDNA 配列を含むプラスミドによって形
質転換された真核細胞に係る。このDNA 配列は細胞中に
単一コピー又は多数コピーとして存在し得る。ヒトマン
ガンスーパーオキシドジスムターゼをコードするDNA 配
列は、ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ遺伝
子を含むヒトゲノムDNA のフラグメントに由来する。

【０１１７】更に、ヒトマンガンスーパーオキシドジス
ムターゼをコードするDNA 配列は、ヒトゲノムマンガン
スーパーオキシドジスムターゼの天然調節要素によって
調節される。遺伝子発現を調節する天然調節要素をコー
ドする遺伝子配列を含むゲノムヒトマンガンスーパーオ
キシドジスムターゼポリペプチド又はその類似体の複合
DNA 配列は第６図の非コード領域のプレポリペプチドコ
ード領域の後に示される。

【０１１８】ヒトマンガンスーパーオキシドジスムター
ゼのゲノム配列を発現する真核細胞は哺乳類細胞であ
る。ゲノムDNA 配列を発現するために使用され得る哺乳
類細胞の例は、ヒトHeLa細胞系及びマウスL 細胞である
が任意の哺乳類細胞株を使用し得ることが理解されよ
う。

【０１１９】本発明はまた、ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼ、ヒトマンガンスーパーオキシドジス
ムターゼ類似体、又はヒトマンガンスーパーオキシドジ
スムターゼ突然変異体を産生し得る適当な条件下に適当
な培地中で前記真核細胞を増殖させ、得られたヒトマン
ガンスーパーオキシドジスムターゼ、ヒトマンガンスー
パーオキシドジスムターゼ類似体、ヒトマンガンスーパ
ーオキシドジスムターゼ突然変異体を回収するヒトマン
ガンスーパーオキシドジスムターゼの産生方法に係る。

【０１２０】本発明はまた、本発明のヒトマンガンスー
パーオキシドジスムターゼ、ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼ類似体、ヒトマンガンスーパーオキシ
ドジスムターゼ突然変異体の種々の用途に係る。

【０１２１】ヒトマンガンスーパーオキシドジスムター
ゼ、ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ類似体
又はヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ突然変
異体は例えば、不快な症状を生起するに十分な量の酸素
遊離ラジカルの発生に関連する疾患に罹患した患者を治
療するために、不快な症状を軽減する量のヒトマンガン
スーパーオキシドジスムターゼ、類似体又は突然変異体
を患者に投与することによって使用される。化合物はま
た、炎症を生じた患者、特に滑膜炎症を生じた患者の治
療に使用され得る。炎症は、リポ多糖内毒素(LPS) 又は
その他の炎症原因物質に起因する。ヒトマンガンスーパ
ーオキシドジスムターゼは好ましくは、関節当たり約１
〜約200mg の一日投与量で直接関節内投与される。別の
投与方法の使用も可能である。

【０１２２】ヒトマンガンスーパーオキシドジスムター
ゼ、ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ類似体
又はヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ突然変
異体は更に、関節炎の治療及び関節炎に起因する炎症の
治療に使用され得る。関節炎は例えば、アジュバントに
よって誘発される。ヒトマンガンスーパーオキシドジス
ムターゼ、類似体もしくは突然変異体は好ましくは、患
者の体重に対し約１〜約100mg ／Kg、より好ましくは約
３〜約50mg／Kgの一日投与量で皮下投与される。化合物
はまた、静注によって投与されてもよく当業者に公知の
別の方法によって投与されてもよい。

【０１２３】ヒトマンガンスーパーオキシドジスムター
ゼ、ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ類似
体、ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ突然変
異体は更に、ブレオマイシンの副作用としてしばしば発
症する肺線維症の治療に使用され得る。ヒトマンガンス
ーパーオキシドジスムターゼ、類似体もしくは突然変異
体は好ましくは、患者の体重に対して約１〜約100mg ／
Kg、より好ましくは約３〜約50mg／Kgの一日投与量で皮
下投与される。化合物はまた、静注によって投与されて
もよく気管内投与されてもよい。

【０１２４】本発明は更に、ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼポリペプチドの１つが天然ヒトマンガ
ンスーパーオキシドジスムターゼと比べて１つ以上のN
末端アミノ酸の欠失の点で異なるような特定のヒトマン
ガンスーパーオキシドジスムターゼ類似体に係る。

【０１２５】本発明はまた、適当な薬剤担体中にヒトマ
ンガンスーパーオキシドジスムターゼ、ヒトマンガンス
ーパーオキシドジスムターゼ類似体又はヒトマンガンス
ーパーオキシドジスムターゼ突然変異体を含む薬剤組成
物に係る。

【０１２６】本発明組成物は、種々の疾患の治療に使用
され得る。本発明組成物が使用され得る疾患の非限定例
は、虚血又は臓器移植後の再灌流障害の治療、炎症の治
療、関節炎の治療、気管支肺異形成の治療、クローン病
に起因する炎症の治療、大腸炎(collitis)に起因する炎
症の治療である。組成物は酸素遊離ラジカルの発生に関
連する不快な症状を軽減する。

【０１２７】実施例 以下の実施例は本発明の理解を助けるための記載であ
り、本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならな
い。実施例はベクター構築、ポリペプチドをコードする
遺伝子の該ベクター内挿入、又は、得られたプラスミド
の宿主内導入の従来方法に関する詳細な記載を含まな
い。実施例はまたかかる宿主ベクター系によって産生さ
れるポリペプチドの検定に使用される従来方法又は等電
点フォーカシング(IEF) ゲルの活性染色によるかかるポ
リペプチドの同定に使用される従来方法についても詳細
に説明しない。かかる方法は当業者に公知であり多くの
文献に記載されている。これら文献の例を以下に挙げ
る。

【０１２８】T.Maniatis、E.F.Fritsch 及びJ.Somobroo
k 、Molecular Cloning:A LaboratoryManual、Cold Spri
ng Harbor Laboratory 、New York(1982):J.M.McCord及
びI.Fridovich 、J.Biol.Chem. 244:6049-55(1969):C.
Beauchamp 及びI.Fridovich 、Anal.Biochem.44:276-87
(1971)。

【０１２９】

【実施例】実施例1 MnSOD cDNAクローンを同定するために、公表されている
アミノ酸配列(18,19)に従って混合オリゴマープローブ
を合成した。

【０１３０】

【化５】

【０１３１】30個のヌクレオチドから成る5'- プローブ
は成熟MnSOD のアミノ酸15〜24に対応する。32個のヌク
レオチドから成る3'- プローブは成熟MnSOD のアミノ酸
179〜189 に対応する。5'- プローブは上記のごとく異
なる36個の配列から成る混合プローブである。3'- プロ
ーブは上記のごとく異なる16個の配列から成る混合プロ
ーブである。（所与の位置に１つ以上のヌクレオチドが
図示されるとき、DNA鎖は図示のヌクレオチドの各々を
等モル量ずつ用いて合成される混合プローブである）。

【０１３２】λgt-10 ベクターにクローニングされたT-
細胞cDNAライブラリーの300,000 のプラークを5'- プロ
ーブを使用してスクリーニングした。ニトロセルロース
フィルターに固定したファージプラークレプリカに対す
るハイブリダイゼーションを標準方法（上掲のManiatis
等）を準用し50℃の８×SSC 中で16時間行なった。次に
フィルターを50℃の５×SSC 及び0.1 ％SDS で洗浄し
た。３つの陽性プラークを単離しPhi MS8 、Phi MS1 及
びPhi MS1Jと命名した。

【０１３３】Phi MS8 及びPhi MS1 から得たDNA のEcoR
Ｉ消化物は、双方ともが長さ約800bp のcDNAインサート
をもち5'- 及び3'- 末端のオリゴヌクレオチドプローブ
にハイブリダイズすることが判明した。Phi MS1Jは5'-
末端プローブのみにハイブリダイズする僅か450bp のcD
NAインサートを担持していた。

【０１３４】３つのファージクローンのEco RＩインサ
ートをpBR322のEco RＩ部位にサブクローニングすると
夫々pMS8-4、pMS1-4及びpMS1J が得られた。制限解析及
び5'- 及び3'- オリゴヌクレオチドプローブへのハイブ
リダイゼーションによって、pMS8-4及びpMS1-4の双方で
同様のパターンが判明した。双方のプラスミドについて
5'- →3'- 方向の以下の制限地図が推定された。

【０１３５】

【化６】

【０１３６】pMS8-4のcDNAインサートの配列を第１図に
示す。予想されるアミノ酸配列は公表されているアミノ
酸配列(19)に比較して３つの位置(AA42 、88、108)でGl
n がGlu で置換されAA₁₂₃ −₁₂₄ 間に２つの付加アミノ
酸Gly 及びTrp がある。pMS1-4及びpMS1J の配列解析よ
り、３つのMnSOD クローンが別々に誘導されることが判
明し、公表アミノ酸配列に比較して上記の違いをもつこ
とが確認された。

【０１３７】成熟MnSOD のN 末端リジンの上流の配列は
24個のアミノ酸のプレペプチド配列を予想させる。

【０１３８】実施例2 pMSE-4:Amp^R ヒトMnSOD 発現プラスミドの構築 pMSE-4の構築の出発点は実施例1 に記載のごとく得られ
たプラスミドpMS8-4である。Eco R Ｉインサートにヒト
MnSOD cDNAを含むプラスミドpMS8-4をNde Ｉ及びNar Ｉ
制限酵素で完全消化した。大きい断片を単離し第２図に
示すごとく合成オリゴマーと結合した。得られたプラス
ミドpMS8-NN はATG 開始コドンの直後の成熟MnSOD のコ
ード領域を含んでいた。前記プラスミドをEco RＩで消
化し末端をPolymeraseＩのKlenow断片で充填し更にNde
Ｉで開裂した。MnSOD 遺伝子を含む小さい断片をNde Ｉ
及びStu Ｉで処理したpSOD13に挿入した。pSOD13は1984
年8 月27日出願の米国特許出願第644245号に記載の方法
で得られる。該特許出願は本明細書に含まれるものとす
る。得られたプラスミドpMSE-4はcII リボソーム結合部
位の直後のMnSOD コード領域を含みλＰ_L プロモータの
コントロール下にある。プラスミドpMSE-4はATCC受託番
号No.53250で寄託されている。上記手順で使用される全
ての方法は上掲のManiatisの方法と実質的に同じであ
る。

【０１３９】実施例3 組換体ヒトMnSOD の発現 公知方法を用いプラスミドpMSE-4を大腸菌A4255 株に導
入した。pMSE-4を含む大腸菌A4255 株を100 g／mlのア
ンピシリンを含むLuria Broth(LB) 培地で32℃で600nm
の光学密度(OD)が0.7 になるまで増殖させた。誘発は42
℃で行なった。種々の時点でサンプルを採取しドデシル
硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS
−PAGE) で分離した。該ゲルによるとヒトMnSOD レベル
は誘発後の120 分間まで増加し、Coomasie-blue 染色ゲ
ルの走査によって定量するとこの時期に組換体MnSOD タ
ンパク質は全細胞タンパク質の27％を構成していた。W-
375 超音波処理装置でサンプルを90秒間超音波処理し1
0,000ｇで5 分間遠心してタンパク質を可溶(s) 分画と
不溶(p) 分画とに分別すると、産生された殆んどの組換
体MnSOD が不溶であることが判明した。標準方法で検定
すると、誘発された可溶タンパク質分画は誘発されない
同様の分画よりもSOD 活性をすこしだけ多く含むことが
判明した。上掲のMcCord等参照。可溶分画中に検出され
るMnSOD の一部分は明らかに不活性である。これはこの
実施例に記載の条件下で産生されたヒトMnSOD の殆どが
事実上不活性であることを示唆する。

【０１４０】実施例4 MnSOD の溶解度及び活性に対する増殖培地中のMn²⁺濃度
の影響 42℃での誘発の２時間前にpMSE-4を含む大腸菌A4255 の
増殖培地に450ppmまで濃度を増加させ乍らMn²⁺を添加す
るとヒトMnSOD の総収率に不利な影響を与えないことが
判明した。超音波処理した可溶タンパク質(s) 分画と不
溶タンパク質(p) 分画とをドデシル硫酸ナトリウム−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE) で分析する
と、Mn²⁺の濃度増加に伴って組換体タンパク質の溶解度
が増加することが判明した（表１）。SOD 活性の定量ア
ッセイ（上掲のMcCord等参照）は、増殖培地中のMn²⁺濃
度の増加とMnSOD の溶解度の増加との相関関係があり培
地中のMn²⁺濃度150ppmで見掛け上最適の溶解度が得られ
ることを示唆する（第３図）。更にMn²⁺濃度を増加する
とそれまで不活性の可溶酵素が活性化された。これらの
Mn²⁺レベルで増殖させた誘発培養物の可溶タンパク質分
画は、これらのMn²⁺レベルで増殖させた非誘発培養物の
可溶タンパク質分画に比較して60倍までのSOD 活性を示
した。等電点フォーカシング(IEF) ゲル（上掲のBeau-c
hamp等参照）の活性染色では多数の形態の組換体MnSOD
が天然のヒト肝臓MnSOD の形態に等しいことが判明し
た。

【０１４１】pMSE-4を含む大腸菌A1645 によるヒトMnSO
D 産生の結果は上記と同様であった。

【０１４２】

【表１】

【０１４３】実施例5 pMS ΔRB4: Tet^R ヒトMnSOD 発現プラスミドの構築 Ec oRＩで完全消化しBam H Ｉ制限酵素で部分開裂してpS
ODβ T-11 からTet 発現ベクターp ΔRBを生成した。pS
ODβ T-11 はACTT受託番号No.53468で寄託されている。
消化されたプラスミドを合成オリゴマー

【０１４４】

【化７】

【０１４５】と結合しλP プロモータを含むp ΔRBを調
製した。

【０１４６】cII リボソーム結合部位と成熟酵素の完全
コード配列とを含むMnSOD 発現プラスミドpMSE-4のEco
R Ｉ断片をp ΔRBの唯１つのEco R Ｉ部位に挿入した。
得られたプラスミドpMS ΔRB4 はλP のコントロール下
のMnSOD 遺伝子及びcII RBSを含みテトラサイクリン耐
性（第４図）である。

【０１４７】実施例6 pMS ΔRB4 からのヒトMnSOD の発現 公知方法を用い大腸菌A4255 株にプラスミドpMS ΔRB4
を導入した。種々の濃度のMn²⁺を含むLuria Broth(LB)
培地中で32℃で600nm の光学密度(OD)が6.7 になるまで
培養物を増殖させた。42℃で誘発した。種々の時点でサ
ンプルを採取しSDS−PAGEの電気泳動にかけた。hMnSOD
レベルは120 分間までは誘発時間に伴って増加し、この
時期にCoomasie Blue 染色ゲルの走査によって定量する
と総細胞タンパク質の約15％を含んでいた。

【０１４８】増殖培地中のMn²⁺濃度にかかわりなく誘発
MnSOD は可溶であった。これは Amp^R プラスミドpMSE-4
での観察と対照的である（実施例４参照）。しかし乍ら
最大SOD 活性及び発現レベルはMn²⁺の補給量に依存した
（表２）。

【０１４９】

【表２】

【０１５０】実施例7 酵素活性組換体ヒトMnSOD の精製 プラスミドpMS ΔRB4 を含む大腸菌A4255 株を750ppmの
Mn²⁺を補給したLB中で32℃でA600が17.0になるまで発酵
させた。温度を42℃にし２時間維持してヒトMnSOD の発
現を誘発した。この時期に培養物のA600は43.0に達して
いた。細胞を遠心によって回収し、250mM のNaClを含む
pH7.8 の50mMの燐酸カリウムバッファの出発容量の0.2
容で再懸濁させた。Dynomillに２回通して細菌を破壊
し、遠心し、細胞破片を廃棄した。上清を60℃で1 時間
加熱し、４℃に冷却し、透明な上清を初期容量の0.03容
に濃縮し、10K 膜を備えたPelicon 限外濾過装置でpH7.
8 の2mM の燐酸バッファに透析した。粗酵素調製物をDE
52カラムに充填しpH7.8 の2mM 燐酸カリウムバッファで
完全に洗い、pH7.8 の20mMの燐酸カリウムバッファで溶
出した。酵素を含有するプール分画をpH5.5 の40mMの酢
酸カリウムに透析し、CM52カラムに充填しpH5.5 の40〜
200mM 酢酸カリウムの直線勾配で溶出した。ヒトMnSOD
を含むピーク分画をプールし、pH7.8 の10mM燐酸カリウ
ムバッファに調整したＨ₂ Ｏに透析し−20℃で凍結し
た。

【０１５１】得られた組換体ヒトMnSOD は純度99％以上
であり比活性約3500単位／ｌであった。精製手順の総収
率は約30％であった（表３）。

【０１５２】精製酵素の配列決定によって公知のヒトMn
SOD (19)に比較してN 末端アミノ酸に付加メチオニンが
存在することが判明した。

【０１５３】原子吸収によって金属含量を分析すると、
酵素サブユニット当たり約0.77原子Mnが存在していた。
これは公表データと一致する(23)。

【０１５４】

【表３】

【０１５５】実施例８ ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子の単
離及び構造 HindIII 及びBamHI で消化したヒト胎盤DNA を大きさに
応じて分別し、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ
cDNAプローブでハイブリダイズして、陽性高濃度分画を
pBR322中でクローンした。３つの異なるクローンを制限
及びハイブリダイゼーションパターンによって同定し
た。これら３つのクローンのうちpMSG11-1はpMSG4 と一
部重複していて双方共マンガンスーパーオキシドジスム
ターゼ遺伝子の5'末端を含み、それに続くクローンpMSG
-1b は前記遺伝子の3'末端を含む。プラスミドMSG11-1
は受託番号No.67363でATCCに寄託され、プラスミドpMSG
4 は受託番号No.67364でATCCに寄託され、プラスミドpM
SG-1b は受託番号No.67365でATCCに寄託されている。第
５図はマンガンスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子の
制限地図及び機構（編制）を示す。この遺伝子のヌクレ
オチド配列は第６図に示した。このマンガンスーパーオ
キシドジスタムーゼ遺伝子は約15kbの範囲にわたり、エ
キソンを６個含んでいる。最初のイントロンはリーダー
ペプチドをコードする領域を切断し、最後のイントロン
はTAA 終止コドンの下流の3'未翻訳領域に現われてい
る。

【０１５６】エキソン−イントロン境界の供与及び受容
スプライス部位の配列を第７図に要約して示し、コンセ
ンサス配列と比較した。ここで留意すべきこととして、
最初のイントロンは通常と異なる供与配列を含む、即ち
（第６図に示すような）極めて一般的なGTではなくGCを
含むか、又は通常と異なる受容配列を含む、即ち（エキ
ソンをヌクレオチド１個動かしたとして）AGではなくGC
を含む。残りの４つのイントロンは総て通常のGT...AG
ヌクレオチドによって結合されている。

【０１５７】プロモーター領域にはTATA及び／又はCAT
ボックが欠失している。しかしながらこの領域にはGCが
多く含まれ、転写因子SP1 を結合するためのコンセンサ
スヘキサヌクレオチド核（GGGCGG）が８回反復してい
る。この領域は更に、一連の直接反復も含み、場合によ
ってはステムループ構造も含む。ホリアデニル化信号AA
TAAAは（既知のcDNA配列に基づいて説明すると）最終エ
キソンからヌクレオチド85個分下流に現れる。このプロ
モーター領域の配列並びにコード領域及び隣接ヌクレオ
チドの配列を調べた。

【０１５８】プラスミドpMSG11-1、pMSG4 及びpMSG-1b
からのマンガンスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子領
域はこれらのプラスミドから単離して、完全マンガンス
ーパーオキシドジスムターゼ遺伝子を構成すべく互いに
連結することができる。例えば、pMSG11-1からの約６KB
のHindIII-部分的完全BamHI フラグメントをプラスミド
pMSG4 中の完全BamHI 挿入部位に連結し、次いでpMSG-1
b からの完全BamHI 挿入部位に連結するようにし得る。
この連結の結果得られるのは、ヒトマンガンスーパーオ
キシドジスムターゼ遺伝子をコードするDNA フラグメン
トである。このDNA フラグメントは次いで公知の方法に
より直接的に、又はプラスミドもしくはウイルスのごと
きクローニングベヒクルへの連結の後で、哺乳類細胞中
に導入し得る。形質転換した細胞系は次いで、適当な培
地中適当な条件下での培養によりマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼポリペプチド、その類似体又は突然変
異体を産生するのに用いることができる。このようにし
て産生したポリペプチドは次いで、実施例７と同様の方
法で回収し得る。回収したポリペプチドは製剤化して、
例えば虚血もしくは炎症の治療に使用し得る。

【０１５９】実施例９ ヒト細胞中でのマンガンスーパーオキシドジスムターゼ
の転写 プラスミドpMS-S4（第２図）からのヒトマンガンスーパ
ーオキシドジスムターゼcDNAをヒト細胞系、ヒト胎盤、
マウスWEHI-3細胞及びウシ肝臓からのポリ A⁺RNA とハ
イブリダイズした。マンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼに関するヒトmRNAの種を２つ同定した。即ち、ヌク
レオチド約1000個分（nt）の長さのマンガンスーパーオ
キシドジスムターゼをコードするヒトmRNA主転写体、及
び長さ約4000ntの副転写体である。マンガンスーパーオ
キシドジスムターゼに関するマウスmRNAはヒト主転写体
と同様の大きさを有するが、ウシマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼに関するmRNAはそれより約300nt 長
い。長い方のヒト転写体（4000個のヌクレオチド）はヒ
トマンガンスーパーオキシドジスムターゼのカルボキシ
末端をコードするエキソンの下流で、該酵素遺伝子の５
番目のイントロンにハイブリダイズする。この部分的に
スプラスした転写体は組織特異性をもたない。

【０１６０】種々の細胞系におけるCuZn及びマンガンス
ーパーオキシドジスムターゼmRNAの割合は、連続的に希
釈したポリ A⁺ RNA のドットブロットに対するSOD cDNA
プローブのハイブリダイゼーションによって測定したと
ころ、10^-3％のオーダーであった（表４）。マンガンス
ーパーオキシドジスムターゼメッセージは肝癌細胞に最
も多く存在し(2.5×10^-3%)、CuZn SOD転写体はＴリンパ
球系に最も多く存在していた(4×10^-3%)。

【０１６１】

【表４】

【０１６２】実施例10 ヒト組換えマンガンスーパーオキシドジスムターゼの薬
物動態学特性及び抗炎症特性 序論 CuZn SODの抗炎症活性は種々の生物学的モデルについて
実証されている。種々の経路で投与した後のCuZn SODの
薬物動態学的特性も研究され、その結果比較的短い半減
期（静脈注射した場合で約７分）を有することが判明し
た。これに対し、MnSOD の薬物動態学的特性及び生物学
的活性は殆ど知られていない。CuZnおよびMn含有酵素の
薬物動態学的特性及び抗炎症特性の比較に関する報告が
１つ存在するだけである（Baret 他、1984）。Baret 等
は、静脈注射したマンガンスーパーオキシドジスムター
ゼの半減期が極めて長い（6.45時間）と主張している。
また、マンガンスーパーオキシドジスムターゼはカラゲ
ナンによって誘発したラットの足(paw) の炎症に対して
効果がなく、CuZn SODはこの炎症の軽減に効果があった
とも述べている。本明細書に記載の研究では、ヒト組換
えマンガンスーパーオキシドジスムターゼの薬物動態学
的特性を、皮下注射したヒト組換えCuZn SOD類似体のそ
れと比較した。それと同時に、カラゲナンで足に水腫を
誘発したモデルを用いて、これら２つの酵素の抗炎症活
性も比較した。その結果意外なことに、マンガンスーパ
ーオキシドジスムターゼはこのラットモデル系で炎症を
軽減させる効果を示した。

【０１６３】薬物動態学的研究 ラットにヒト組換えCuZn SOD類似体又はヒト組換えMnSO
D のいずれかを体重kg当り50mgで皮下注射した。注射後
0.5、２、４、８、24、30及び48時間の時点で血液サン
プルを採取し、これらサンプルにおけるマンガンスーパ
ーオキシドジスムターゼ活性を酵素アッセイ（Fridovic
h 法）によって測定した。

【０１６４】その結果を第８図に示す。この図から明ら
かなように、CuZn SOD類似体の値は２時間後に約10μｇ
／mlの最高値に達し、このレベルに更に約６時間維持さ
れ、24時間後に注射前のレベルに戻った。これに対し、
マンガンスーパーオキシドジスムターゼのレベルは徐々
に上昇して約８時間後までに約70μｇ／mlの最高レベル
に達し、ほぼこのレベルに少なくとも30時間維持され
た。48時間後までに血清中の酵素活性は約20μｇ／mlに
落下したが、それでもこの値は注射前のレベルより十分
に高かった。

【０１６５】抗炎症活性 カラゲナンで足に水腫を誘発したラットのモデルを用い
て、CuZn SOD類似体及びMn SODの抗炎症活性を分析し
た。このモデルでは、Wistar系雄ラット（体重 130〜15
0 ｇ）の左後足の底の皮下に 0.1％w/v のカラゲナン0.
1ml を注射した。注射前の他、注射後１時間毎に足の大
きさをHg移動容積計（イタリー、Comerio社のUgo-Basil
e^R を改変したもの）で測定した。ラットを４つのグル
ープに分けた（８ラット／グループ）。１つのグループ
にはカラゲナン投与の24時間前に50mg／kgのマンガンス
ーパーオキシドジスムターゼを皮下注射した（-24 時間
Mn；第９図参照）。第２のグループにはカラゲナンでチ
ャレンジ処理する24時間前にCu／Zn SOD類似体（50mg／
kg）を注射し（-24h Cu ）、第３のグループにはカラゲ
ナンチャレンジの僅か２時間前にCuZn SOD類似体を60mg
/kg 注射した（-2h Cu）。第４のグループは予処理せず
に対象として使用した。

【０１６６】結果を第９図に示す。この図から明らかな
ように、炎症誘発の２時間前にCuZnSOD類似体を投与す
ると腫張反応が50％低下した。これに対し、チャレンジ
の24時間前にCuZn酵素で予処理した場合には効果がなか
った。しかしながら、24時間前にマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼで予処理すると、２時間前に CuZnSOD
類似体で予処理した場合と同程度の抗炎症反応が得ら
れた。

【０１６７】結論 本発明の研究では、ラットにおけるヒト組換えマンガン
スーパーオキシドジスムターゼの消失速度が組換えCuZn
SOD類似体のそれより遥かに遅いことが判明した。この
結果は、天然ヒトマンガンスーパーオキシドジスムター
ゼに関するBaret 等の前記報告（1984）と合致する。し
かしながら、このマンガン含有酵素は本発明の研究では
in vivo で抗炎症剤として有効であることが立証され
た。この活性はそのスーパーオキシドジスムターゼ能力
に帰する。マンガンスーパーオキシドジスムターゼが同
様の系において不活性であるというBaret 等の報告を考
えると、前記発見は驚嘆に値する。マンガンスーパーオ
キシドジスムターゼが投与後24時間の時点でも抗炎症剤
として有効であり続けるという発見は、この酵素を長期
間作用する治療剤として使用できることを示唆するもの
である。

【０１６８】実施例１１ 組換えマンガンスーパーオキシドジスムターの生物学的
モデル及び該酵素の抗炎症剤としての役割：静脈注射し
たＭｎＳＯＤ の薬物動態学的特性 雄ラット（体重 100〜110 ｇ、各グループ毎に７匹）に
生理食塩溶液（生理食塩＝0.15M NaCl）中で調製したヒ
ト組換えマンガンスーパーオキシドジスムターゼを静脈
注射した。マンガンスーパーオキシドジスムターゼの投
与量はラットの体重に応じて決定され、本発明の研究で
は体重Kg当たり25mgにした。

【０１６９】生理食塩中の組換えマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼの用量（25mg／Kg体重）及びグループ
当たりのラット数（ｎ＝７）を同じにして、静脈注射し
たグループを、腹腔内注射したグループ及び皮下注射し
たグループと比較した。

【０１７０】前記３つのグループにマンガンスーパーオ
キシドジスムターゼを投与し、投与後0.03、0.5 、２、
４、24、30及び48時間後の時点で血液サンプルを採取し
て、酵素分析又はRIA 分析にかけた。酵素アッセイは実
施例10と全く同じ方法で実施した(Fridovich法を使
用）。RIA は標準的方法に従い抗マンガンスーパーオキ
シドジスムターゼ抗体（本発明者等が調製したもの）及
びタンパク質Ａ（Staphylococcus aureausに由来）を用
いて実施した。

【０１７１】結果を第10図に示す。これは下記のように
要約し得る。

【０１７２】（１）静脈注射した（曲線（１））マンガ
ンスーパーオキシドジスムターゼは予想通り 430μg ／
mlという極めて高い初期血清レベルを示す。このレベル
は注射後最初の２時間で激減する（240 μmg／Kgま
で）。この急激な減少は、マンガンスーパーオキシドジ
スムターゼが（取込みメカニズムにより）体の種々の組
織にわたって再分配されるために生じる。最初の２時間
が経過すると、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ
のクリアランス速度が一次速度を示す。半減期は 6.2時
間である。

【０１７３】（２）腹腔内投与した（曲線（２））マン
ガンスーパーオキシドジスムターゼは初期に（最初の２
時間）急激な血清マンガンスーパーオキシドジスムター
ゼレベルの上昇を示した。これは、腹腔膜を介する急速
な取込み（０μg ／mlから 115μg ／mlまで）に呼応す
る。その後２時間のレベル上昇は緩慢であり、４時間後
に最高血清レベル 120μg ／mlに到達する。この時点で
血清マンガンスーパーオキシドジスムターゼレベルは一
次クリアランス速度で降下し始める。半減期は 5.5時間
である。

【０１７４】（３）皮下注射したマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼは血清中への侵入速度が緩慢であり、
４時間後に27μg ／mlのレベルに到達するにすぎない。
この時点で血清マンガンスーパーオキシドジスムターゼ
レベルは一次クリアランス速度で下降する。半減期は
7.3時間である。

【０１７５】ここでは、特に静脈注射した組換えマンガ
ンスーパーオキシドジスムターゼの場合には、注射後48
時間の時点でもまだかなり高い血清レベル（10μg ／m
l）が存在することにも留意されたい。

【０１７６】以上の理由から我々は、マンガンスーパー
オキシドジスムターゼの最も効果的な投与法は静脈注射
であると結論する。この方法で投与すると、極めて高い
初期血清レベルが得られ、これが注射後最初の４時間で
極めて高いレベル（ 160μg／ml）に維持される。この
方法は、同じ用量のマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼを腹腔内注射又は皮下注射した場合より遥かに効果
的である。

【０１７７】前記のいずれの場合でも、血清マンガンス
ーパーオキシドジスムターゼの半減期はCuZn SODの半減
期（約７〜30分）より遥かに長い。従ってマンガンスー
パーオキシドジスムターゼはCuZn SODより有効な治療剤
となる可能性がある。

【０１７８】ヒトマンガンスーパーオキシドジスムター
ゼは、ラットに静脈注射した後の半減期（6.45時間）
が、系統的に関係のない酵素CuZn SODの半減期（６分）
より遥かに長いと報告されている(Baret, Jadot 及びMi
chelson, Biochem. Pharmacol.33: 2755(1984))。またC
uZn SODと異なり、マンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼはin vivo で炎症モデルについてテストした場合に
薬理学的に不活性であるとされていた。前述のごとく、
我々はヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼをク
ローンし且つ大腸菌中に発現させた。この精製組換えタ
ンパク質は更にアミノ末端にメチオニンを有するという
点で天然酵素と異なる。しかしながら、このタンパク質
はヒト肝臓から精製した天然ミトコンドリアマンガンス
ーパーオキシドジスムターゼのそれと区別のつかない特
異的酵素活性を示す。

【０１７９】ラットに静脈注射したヒト組換えマンガン
スーパーオキシドジスムターゼ（r-hMnSOD) の薬物動態
学的分析の結果、半減期は 6.2時間であった。これは、
天然酵素の公表値と合致する。r-hMnSODの潜在的抗炎症
活性を、カラゲナンで足に水腫を誘発したラットのモデ
ルを用いてテストした。比較用としてヒト組換えCuZn(r
-hCuZnSOD)を使用した。これら２つの酵素を下記の２つ
の実験条件に従って投与した: (1) 酵素をカラゲンナン
チャレンジの２時間又は24時間前に皮下注射する（体重
Kg当たり50mg); (2)酵素をカラゲンナンチャレンジの10
分前に体重Kg当たり８〜20mgで静脈注射する。結果を表
５に示す。

【０１８０】

【表５】

【０１８１】これらの結果は、r-hMnSODが効果的な抗炎
症剤であることを立証している。更に、r-hMnSODは血液
中での半減期がCuZn SODより長いため、慢性炎症性疾
患、例えば関節炎、大腸菌及び放射性障害の治療により
適していると言える。

【０１８２】実施例12 組換マンガンスーパーオキシドジスムターゼとその抗炎
症剤としての役割の生物学的モデル：マンガンスーパー
オキシドジスムターゼの関節内投与のリポ多糖菌体内毒
素(LPS) 誘発滑膜炎症に対する効果 滑膜炎症と、このような炎症を抑制するマンガンスーパ
ーオキシドジスムターゼの効能とのモデルとして、ラッ
トにおける膝関節（滑膜）炎症モデルを用いた（本明細
書に参考として含まれる細部については、Ginsburg et
al.,“Bayer-Symposium VI: Experimental Models of C
hronic Inflammatory Diseases, ”256−299(1977), Sp
ringer Verlagに述べられている）。

【０１８３】このモデルにおいて、炎症をリポ多糖菌体
内毒素(LPS) の関節内注射(0.1MG／ラット）によって誘
発する。炎症の程度は滑膜組織の腫脹に反映され、投与
後８〜16時間の重量増加として測定することができる。
第11図に、LPS と共に投与したヒトCuZn SOD及びマンガ
ンスーパーオキシドジスムターゼ間の比較を示す。マン
ガンスーパーオキシドジスムターゼ及びCuZn SODの上記
モデルにおける抗炎症作用を試験するには、LPS 毒素と
マンガンスーパーオキシドジスムターゼあるいはCuZn S
ODとを共投与することが最良である。用いた投与量は、
マンガンスーパーオキシドジスムターゼが膝一つにつき
0.6mg 、CuZn SODが膝一つにつき１mgg及び５mgであっ
た。図示のように、マンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼはLPS 誘発滑膜炎症の抑制にCuZn SODと同様に有効
であった。CuZn SODの両投与量（１mg／膝、5mg/膝) も
マンガンスーパーオキシドジスムターゼの投与量(0.6mg
／膝）も、LPS で誘発される膝関節の炎症の量を著しく
減少するのに有効であった。実際、SOD(CuZn SODあるい
はMnSOD)とLPS との共注射によってもたらされる炎症レ
ベルは、生理的食塩水のみで行なう擬注射（陰性対照）
の場合のレベルを越えない。従ってこのことから、SOD
(MnSOD 及びCuZn SOD) の抗炎症作用が明らかである。
炎症の抑制は、３レベル、即ち５％、１％及び 0.1％レ
ベル（それぞれp ＜0.05、p ＜0.01及びp ＜0.001)の確
率的精度(probabilistic stringency)でのスチューデン
ト式テストによる統計分析に基づいて有効であると判定
した。即ち、多い方の投与量（５mg／膝) のCuZn SODが
その作用において最も有効であり、マンガンスーパーオ
キシドジスムターゼ( 投与量0.6mg/膝) 並びに少ない方
の投与量（１mg／膝) のCuZn SODも炎症の抑制にきわめ
て有効であった。

【０１８４】実施例13 組換マンガンスーパーオキシドジスムターゼとその抗炎
症剤としての役割の生物学的モデル：マンガンスーパー
オキシドジスムターゼのアジュバント誘発関節炎に対す
る効果 フロイントアジュバントの投与によりラットにおいて関
節の炎症を誘発することが、実験的慢性関節リウマチの
特に好ましいモデルと看做される（本明細書に参考とし
て含まれる細部については、Newbould, Brit. J. Pharm
acol.,21（1963）,127−に述べられている）。アジュバ
ント(10mg/mlの死菌Mycobacterium Tuberculosisを伴っ
たフロイントアジュバント50μl ）を肉趾に注射する
と、まず足が腫脹して３日後にプラトーに達し、14日後
再び足が腫脹し、更には関節が腫脹して、これが７〜10
日継続する。第二の期間は、免疫誘発される慢性関節炎
の段階と看做される。SOD の抗関節炎薬としての有効性
を調べるため、CuZn SOD及びマンガンスーパーオキシド
ジスムターゼをアジュバント処理したラットにアジュバ
ント投与後14〜21日間皮下投与した（投与量は、体重１
Kg当たりの割合において単位mgで表す）。両酵素は毎日
（いずれも投与量12.5mg／Kg及び25mg／Kg）か、あるい
は１日おき（投与量50mg／Kg）に投与した。第12図に示
した結果は、マンガンスーパーオキシドジスムターゼが
毎日投与する治療薬としてより有効であり、一方１日お
きに投与したCuZn SODは無効と考えられることを示唆し
ている。処理の有効性のレベルは、（実施例12に述べ
た）三つの精度レベルでのスチューデント式テストを用
いた統計分析によって決定した。得られた結果から、マ
ンガンスーパーオキシドジスムターゼの抗関節炎薬とし
ての有効性が明らかである。

【０１８５】実施例１４ 組換マンガンスーパーオキシドジスムターゼとその抗炎
症剤としての役割の生物学的モデル：マンガンスーパー
オキシドジスムターゼのブレオマイシン誘発肺繊維症に
対する効果 ブレオマイシン（ＢＬＭ） は、様々な種類の癌及びリ
ンパ腫に対して広く用いられている抗腫瘍薬である（本
明細書に参考として含まれる細部についてはCounts et
al., J. Pharmacol. Exp. Ther.,219 : 675 −678 (198
1)に述べられている)。ブレオマイシンを用いることに
伴う主な問題点は、この薬剤を大量投与すると肺繊維症
が誘発されることで、このことが該薬剤の治療上の有用
性を制限している（例えばCrooks & Bradner, J. Med.,
7:333 (1976) 参照) 。ブレオマイシンの上記副作用
は、肺組織中での酸素遊離基の発生によって媒介される
と考えられる（例えばFrank, Trends Pharmacol. Sci.,
4： 124 (1983) 参照）。ブレオマイシンによって誘発
される繊維症から肺を保護するのにマンガンスーパーオ
キシドジスムターゼを用いることが可能かどうか調べる
ため、ラットを生物学的モデルとして用いた（例えばKe
lley et al.,J. Lab. Clin. Med., 96: 254 (1980)参
照）。このモデルにおいて、ラット（体重100 〜120g)1
5 匹を、ブレオマイシン1.5mg(＝1.5 単位）の気管内投
与によって処理した。陰性対照としての第二のグループ
のラット（15匹）には生理的食塩水のみを投与する一
方、第三のグループ(15 匹) のラットを、第一のグルー
プでのようにブレオマイシンを投与し、その後７日間毎
日マンガンスーパーオキシドジスムターゼを（体重１Kg
当たり50mgの投与量で）皮下注射することによって処理
した。表６に、ブレオマイシン投与後３週間の死亡率デ
ータを示す。この表から知見されるように、マンガンス
ーパーオキシドジスムターゼで毎日処理することによっ
て著しい保護が達成される（生存率40％に対して87％；
統計的有意性p ＞0.05でスチューデント式テストによ
る）。生存ラットの肺を切除して、（ヒドロキシプロリ
ン含量で表される) コラーゲン含量を測定した(Woessne
r,“The Methodology of Connentive Tissue Researc
h,”Hall, Ed., Ox-ford (1976) Joynson-Bruvvers Lt
d., pp. 227−233 及びWoessner, Arch. Biochem. Biop
hys.,93: 440−447 (1961)による標準的な方法を用い
た）。第13図に、処理動物の肺重量（体重100gについて
正規化）及びヒドロキシプロリン含量を示す。第13図に
示したように、MnSOD 処理によって全肺重量の増加が幾
分抑制され、肺は（ヒドロキシプロリンレベルに反映さ
れる）コラーゲンの増加から有効に保護された。

【０１８６】第13図及び第14図から知見されるように、
r −ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ処理し
たグループのOH−プロリンレベルはBLM グループの25％
までしか上昇しておらず、このことは上記酵素が繊維症
を有効に抑制したことを示している。

【０１８７】二つの付加的な実験において、異なる投与
頻度及び投与方法の影響を、r −ヒトマンガンスーパー
オキシドジスムターゼ及びr −CuZn SODを用いて比較し
た。第一の実験では酵素を、１日１回１日おき（第１
日、第３日、第５日) にか、あるいは第１日におけるた
だ１回の注射によって皮下投与した（50mg／Kg）。第15
図から知見されるように、r −ヒトマンガンスーパーオ
キシドジスムターゼはただ1 回投与した場合幾分保護能
力を示し(BLM結果の約34％減）、１週間の間１日おきに
かあるいは毎日投与した場合（第14図及び第15図）は更
に有効であった(BLM結果のほぼ75％減）。r −ヒトCuZn
SODは、ただ１回の投与では保護能力を示さなかった
が、１日おきに投与した場合にはr −ヒトマンガンスー
パーオキシドジスムターゼをただ１回投与した場合と同
程度の保護能力を示した。

【０１８８】同じ実験を、皮下投与法ではなく腹膜組織
内投与法を用いて繰り返した。第16図に示したこの実験
の結果も、r −ヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼを１週間に３回投与する組み合わせが好ましいこと
を示している。

【０１８９】全体として、得られた結果から、肺繊維症
におけるBLM が酸素遊離基により媒介され、上記繊維症
はr −ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼある
いはr −ヒトCuZn SODによって抑制され得るという仮定
が確認される。この過程でr−hMnSODの方がr −CuZn SO
Dより有効であるのは、恐らく静脈内注射後の循環にお
ける半減期がより長いことに起因する（ラットにおい
て、r −hMnSOD及びCuZnSODに関するt 1/2 i.v.はそれ
ぞれ約6 時間及び6 分である) 。第10図に、3 種の投与
法を用いた、ラットにおけるr −ヒトマンガンスーパー
オキシドジスムターゼの薬物動態試験(25mg/kg) の結果
を示す。

【０１９０】ピークレベルからの動的一次減衰が、静脈
内投与法、腹膜組織内投与法及び皮下投与法における半
減期がそれぞれ6.2 、5.5 及び7.3 時間であることを示
している。r −ヒトCuZn SODの半減期ははるかに短い
（第８図）ので、r −ヒトマンガンスーパーオキシドジ
スムターゼの場合と等価の薬理学的レベルを達成して同
様の保護効果を生じさせるには投与回数を増し、場合に
よっては投与量も増さなければならない。用量応答を評
価する実験が更に進行中である。

【０１９１】組換SOD 酵素、特にr −ヒトマンガンスー
パーオキシドジスムターゼは、ブレオマイシン（及び場
合によってはタリソマイシンのようなブレオマイシン誘
導体）での治療に有用な佐剤であり得よう。

【０１９２】結論 本明細書において、組換マンガンスーパーオキシドジス
ムターゼが有効な抗炎症剤であることを、炎症の３種の
生物学的モデルにおける上記酵素の治療効果によって示
した。３種のモデルの総てにおいて、組換マンガンスー
パーオキシドジスムターゼは炎症の抑制にきわめて優れ
た効果を有し、少なくとも比較のために用いたCuZn SOD
と同程度に有効（多くの場合CuZn SODより有効）であっ
た。そのうえ、薬物動態試験によって示したようにマン
ガンスーパーオキシドジスムターゼは血清中に長期間残
存するので、この酵素を持続性治療薬として用いること
が可能である。

【０１９３】

【表６】

【０１９４】実施例15 ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ類似体の製
造 ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼを、実質的
に実施例７で述べたようにして製造した。マンガンスー
パーオキシドジスムターゼは次のアミノ末端配列を有す
る。

【０１９５】Met −Lys −His −Ser −Leu −Pro −…
… 後述するように、マンガンスーパーオキシドジスムター
ゼ(MnSOD) をAeromonas アミノペプチダーゼで処理し
た。Aeromonas アミノペプチダーゼは、実質的にJ. M.
Prescott & S. H. Wilkes, Methods Enzymol.,46： 530
−543 (1976)によりアメリカタイプカルチュアコレクシ
ョン(ATCC 受託番号第15338 号) から得られるAeromona
s proteo lytica の細胞外濾液から製造した。精製操作
は、細菌の沈降及び濾過、濾液の硫酸アンモニウム沈澱
(1l 当たり367g) 、アセトン分別（アセトン43.7〜70
％) 、70℃での(8時間の) 熱処理によるエンドペプチダ
ーゼ活性破壊、セファデックスG −75（登録商標）での
ゲル濾過、及びDEAEセファデックスA −50（登録商標）
でのイオン交換クロマトグラフィーを含んでいた。全実
験において、Prescott & Wilkes の用いたpH8.0 の10mM
トリシンバッファに替えてpH8.0 の10mMトリスHCl バッ
ファを用いた。予平衡化並びにセファデックスG−75カ
ラムからの溶離を、元来の操作(Prescott & Wilkes, su
pra ) でのように50μMではなく5μMのZnCl₂ を含有す
る溶液を用いて実施した。DEAEセファデックスA −50カ
ラムでの精製を、5μMのZnCl₂ を含有するpH8.0 の10mM
トリスHCl中で0.1M NaCl で上記カラムを予平衡化し、
カラムに試料を付与し、かつ(5μMのZnCl₂ を含有す
る）上記と同じバッファ中で0.6MNaClで傾斜溶離を行な
うことによって実施した。塩濃度が約0.5Mに達したとこ
ろで、同一バッファ中で0.7M NaCl でカラムからの溶離
を行なった。カラムから溶出した主要ピークを集めて、
５μM ZnCl₂ を含有するpH8.0 の10mMトリスHCl 、0.1M
NaClに対して透析し、その後−20℃で凍結状態にした。

【０１９６】ヒトマンガンスーパーオキシドジスムター
ゼ(hMnSOD)、(hMnSOD の) 類似体あるいは突然変異体と
の反応の前にアミノペプチダーゼ酵素溶液を、製造中保
持され、かつ長期の貯蔵後に再活性化される恐れのある
エンドペプチダーゼのあらゆる可能な痕跡を不活化する
べく70℃に2 時間保温した。

【０１９７】FMOC(9−フルオロエニルメチルオキシカル
ボニルクロリド) を用いるプレカラム誘導法(Josefs-so
n & Einarsson による方法であり、例えばEinarsson et
al., J. Chromatography, 282: 609−618 (1983)及び
Einarsson, J. Chromatography,348: 213−220 (1985)
参照) によってアミノ酸分析を実施した。アミノ酸誘導
体をHPLC( 高圧液体クロマトグラフィー) 系( 製造者の
仕様説明に従って操作されるHewlett Packard(登録商
標) 1090HPLC系) において、逆相Lichrocart Supersphe
re（登録商標）(C18) カラム(Merck（登録商標))で分離
した。

【０１９８】処理中の溶液のpH並びに処理時間に従っ
て、MnSOD のN 末端から1 種以上のアミノ酸を除去し
た。pHは4.5 〜10であり、また処理時間は最長24時間で
あった。次の実験によって、MnSOD のN 末端からアミノ
酸を除去するうえで目下のところ好ましい条件を説明す
る。

【０１９９】実施例3 に述べたようにして製造した30mg
/ml のMet −MnSOD を、pH4.5 の5mM 酢酸カリウム中で
一晩透析した。

【０２００】pH4.5 のMet −MnSOD 溶液（最終濃度6mg/
ml)250μl と、pH4.5 の5mM KOAcバッファ700 μl と、
アミノペプチダーゼ溶液(1mg/ml)50μl とを混合し、37
℃に保温した。０時間、５時間及び24時間後に、108μl
のアリコート二つを取得した。

【０２０１】第一のアリコートに15％スルホサリチル酸
水溶液12μl を添加して混合し、得られた混合物を37℃
に15分間保温した後、Eppendorf(登録商標) ベンチ遠心
分離機で遠心分離した。100 μl 試料を、（酸加水分解
を行なわない）直接アミノ酸分析のために除去した。第
二のアリコートはN 末端配列分析用とした。

【０２０２】上述の操作で用いたようなアミノペプチダ
ーゼの不在下にMet −MnSOD を保温することによって行
なう対照実験を並行実施した。上記各時点に108 μl ア
リコート二つを取得し、これらのアリコートを実際の試
料と同様に処理及び分析した。

【０２０３】37℃に24時間保温後、次の表７に示すよう
な分子が得られた。

【０２０４】

【表７】

【０２０５】実施例10〜14に述べたような治療目的に、
異なる類似体を用いることが可能である。

【０２０６】所望であれば、当業者に公知である標準的
な技術を用いて、異なる類似体を互いから精製すること
ができる。

【０２０７】参考文献

【０２０８】

【表８】

【０２０９】

【表９】

【０２１０】

【表１０】

【０２１１】

【表１１】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】ヒトMnSOD cDNAの配列を示す。

【図１Ｂ】ヒトMnSOD cDNAの配列を示す。

【図２】ヒトMnSOD 発現プラスミドpMSE-4の構築を示
す。

【図３】大腸菌中で生産されるSODSの活性に及ぼすMn²⁺
の濃度の影響を示す。

【図４】ヒトMnSOD 発現プラスミドpMS ΔRB4 の構築を
示す。

【図５】ヒトMnSOD 遺伝子の制限地図を示す。

【図６Ａ】ヒトMnSOD 遺伝子のヌクレオチド配列を示
す。

【図６Ｂ】ヒトMnSOD 遺伝子のヌクレオチド配列を示
す。

【図６Ｃ】ヒトMnSOD 遺伝子のヌクレオチド配列を示
す。

【図７】ヒトMnSOD 遺伝子のエキソン−イントロン結合
を示す。

【図８】SOD の薬物動態を示す。

【図９】SOD の治療効果を示す。

【図１０】SOD の薬物動態を示す。

【図１１】SOD の治療効果を示す。

【図１２】SOD の治療効果を示す。

【図１３】SOD の治療効果を示す。

【図１４】SOD の治療効果を示す。

【図１５】SOD の治療効果を示す。

【図１６】SOD の治療効果を示す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成８年６月５日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 アブラハム・ニムロツド イスラエル国、レホボツト、アイゼンバー グ・ストリート・８

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 天然ヒトマンガンスーパーオキシドジス
   ムターゼポリペプチドのＮ末端のリジンが欠失したヒト
   マンガンスーパーオキシドジスムターゼポリペプチドを
   少なくとも１つ含むことを特徴とするヒトマンガンスー
   パーオキシドジスムターゼ類似体。
2. 【請求項２】 天然ヒトマンガンスーパーオキシドジス
   ムターゼポリペプチドのＮ末端のリジンとヒスチジンと
   が欠失したヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ
   ポリペプチドを少なくとも１つ含むことを特徴とするヒ
   トマンガンスーパーオキシドジスムターゼ類似体。
3. 【請求項３】 酸素遊離ラジカルの発生に関連した不快
   な症状を軽減するのに有効な量のヒトマンガンスーパー
   オキシドジスムターゼ類似体を薬剤として許容される担
   体と共に含む薬剤組成物であって、前記ヒトマンガンス
   ーパーオキシドジスムターゼ類似体が天然ヒトマンガン
   スーパーオキシドジスムターゼポリペプチドのＮ末端の
   リジンが欠失したヒトマンガンスーパーオキシドジスム
   ターゼポリペプチドを少なくとも１つ含むことを特徴と
   する薬剤組成物。
4. 【請求項４】 酸素遊離ラジカルの発生に関連した不快
   な症状を軽減するのに有効な量のヒトマンガンスーパー
   オキシドジスムターゼ類似体を薬剤として許容される担
   体と共に含む薬剤組成物であって、前記ヒトマンガンス
   ーパーオキシドジスムターゼ類似体が天然ヒトマンガン
   スーパーオキシドジスムターゼポリペプチドのＮ末端の
   リジンとヒスチジンとが欠失したヒトマンガンスーパー
   オキシドジスムターゼポリペプチドを少なくとも１つ含
   むことを特徴とする薬剤組成物。