JPS5816685A - 固定化酵素，その製造法および製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、マンガン型スーパーオキシドディスムターゼ
の固定化酵素、その製造法および製剤に関する。

本発明者らは、セフチア属菌の培養によシ抗炎１ｆ：、
作用を有する新規マンガン型スーパーオキシドディスム
ターゼを得ることができることを見い出し友。そこで、
該新規酵素を抗炎症剤として用いる際の有利な方法を検
索したところ、該酵素に水溶性担体を結合させた固定化
酵素とすると、該酵素の抗原性が減少し、抗炎症作用プ
・；増強される等すぐれ丸薬理効果が発現されるζ−と
を見い出し、これに基づいてさらに研究した結果、本発
明を完成し友。

本発明は、（１）セフチア属−が産生ずるマンガン型ス
ーパーオキシドディスムターゼに水溶性担体を結合させ
た固定化酵素、（２）セフチア属菌が産生ずるマンガン
型スーパーオキシドディスムターゼに水溶性担体を結合
させることを特徴とする固定化酵素の製造法および（３
）セラチア属菌が産生ずるマンガン型スーパーオキシド
ディスムターゼを含有する抗炎症剤である。

本願においては、セラチア属菌が産生ずるマンガン型ス
ーパーオキシドディスムターゼヲ単に「セフチア５ＯＤ
Ｊと、これに水溶性担体を結合させた固定化酵素を単に
「セラチア８０Ｄ固定化酵素」とそれぞれ略称するとと
亀ある。

セフチア８０Ｄを製造する際に用いられる微生物は、セ
フチア属に属しかつセフチア８０Ｄを生産する能力を有
する微生物また拡その変異株であれば何れで亀よい。こ
のような微生物としては、側光ば、セラチア・リクエフ
ァシエンス（５ｅｒｒａｔｉａ　　１ｉｑｕｅｆａｏｉ
ｅｎａ）　Ｉｌｉ’０　１２９７９゜セラチアーマ〜セ
ツセンス（１３ｅｒｒａｔｉａｎ＋ａｒｏａｓｏｅｎｓ
　）　ＩＪ’０　８０４６．セフチア・マルセツセンス
ＩＦＯａ７５９（ＡＴＣＣ４００２）、　　セフチアΦ
マμセツセンスＩＦＯａ７ａ６　　セラチア・マルセッ
センス　ＡＴＣＣ２１０７４，セラチア・マリノμプラ
（８ｅｒｒａｔｉａ　　ｍａｒｉｎｏｒｕｂｒａ）工Ｆ
０１２９７ａ（ＡＴＣＣＳ！７６１４）等が挙げらレル
。

上記工Ｆ０　１２９７９株は昭和４４年４月２９日Ｋ、
Ｉ）’Ｏ８０４６株は昭和２２年に、ｌＰＯ３７６９株
は昭和８８年９月２８日に、１７０８７８６株は昭和８
８年６月２１日に、工ｙ。

１２９７ａ株は昭和４４年４月２９日にそれぞれ財団法
人発酵研究所に寄託され、財団法人発酵研究所のリスト
・オプ・力〜チャーズ１９７８年第６版（Ｉｎ５ｔｉｔ
ｕｔｅ　ｆｏｒ　　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　。

０ｓａｋａ　　Ｌｉ５ｔ　　ｏｆ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ
　　１９７８　ＢｌＸｔｂｌ＜Ｌｉｔｌｏｎ）に掲載さ
れている。

上記ＡＴＣＣ２１０７４株は、昭和４２年５月１５日に
ジ・アメリカン・タイプ・力／Ｌ／プ１ヤ′−・コレク
ション（Ｔｈｅ　　Ａ＋ｎｅｒｉｏａｎ　　’［’７ｐ
θ（：ｕｌｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｏｔｉｏｎ）　Ｋ寄
託されている。また、上記ＡＴＣＣ４００２株、ＡＴＣ
Ｃ２１０７４株、ＡＴＣＣ２７６１４株は、ジ・アメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログ・
オプ・ストレインズ　エ　第１４版１９８０年（Ｔｈｅ
　　Ａｍｅｒｉｏａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ
　ＣｏｌＣｏ１１ｅｏｔｉｏｎＣａｔａｌＱ　　ｏｒ　
　９ｔｒ＆ｉｎｓ　　Ｉ　　Ｆｏｕｒｔｅｅｎｔｈｇｄ
ｉｔｉｏｎ　　１９８０　）に掲載されている。

一般にセラチア属菌は、その性状が変化しやすく、九と
えばＸ！１１１１！射、紫外線照射、放射線照射。

人工変異剤（例、ニトロソグアニジン、エチレンイミン
など）を用いる人工変異手段などで春易に変異しうる。

このようにして得られる変異株であっても、セフチアＳ
ＯＤを生産する能力を有するものはすべてセフチア８０
Ｄの製造Ｋｌ）ｅ！用し得る。

セラチア８０Ｄの製造は、上記微生物に培地に培養し、
培地中に生産された目的物を採取、精製することＫよっ
て行なわれる。上記の培養に用いられる培地は、上記微
生物が利用し得る栄養源を含むものであれば、液状でも
固状で４よい。大量に行なう場合には、液状の培地が好
ましい。

培地には、上記徽、生物が利用し得る栄養源九とえば羨
素源、窒素源、無機物質、微量栄養素等が適宜配合され
る。炭素源としては澱粉、デキストリン、ブドウ糖、シ
ョ糖等が、窒素源としては、コーン・スチープ・リカー
、大豆粉、脱脂大豆粉。

酵母エキス、脱核酵母、カゼイン、綿実粉、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム等の窒素含有化合物が、無機
物質としては、無機塩たとえばナトリウム＃１（例、塩
化ナトリウム）、リン酸塩（例、リン酸ナトリウム）、
力μシウム塩（例、次酸力ｆｉ／Ｖウム）、カリウム＃
Ｌ（例、塩化カリウム、リン酸カリウム）、マグネシウ
ム塩（例、硫酸マグネシウム）、マンガン樵（例、塩化
マンガン、炭酸マンガン）、鉄１４Ｋ（例、塩化鉄）、
亜鉛塩（例、炭酸亜鉛）などがそれぞれ挙げられる。微
量栄養素としては、ビタミン類（例、ビタミンＢ１　＋
Ｂ２　）を脂質〔例、オレイン酸、ツウリン酸、カプロ
ン酸などのエステｙｖｃ例、メチルエステル、エチルエ
ヌテＡ／））、核酸（例、リボ核酸、デオキシリボ核酸
）、核酸の関連化合物（例、イノシン酸、グアニル酸、
アデニＡ４）などが挙げられる。さらに油脂類（例、大
豆油、コーン油、落花生油）２合成消泡剤〔例、トウィ
ーン２０　、６０　、８０　（花王・アトラス社製）、
アクトコール（武田薬品′工柴株式会社製）〕等を消泡
の目的で添加して屯よい。

培養の手段は、静置培養、振盪培養または通気攪拌培養
等の手段が挙げられる。特に工業的規模で行なう場合に
社、深部通気攪拌培養がよシ有利である。培養の条件は
、培地の状態２組成、菌株の種類、培養の手段等によっ
て異なるが、培養温没は約２０〜４０℃で、培養時間は
約１０〜１００時間、さらに好ましくは約２０〜７２時
間で、ｐＨは約４〜９、さらに好ましくは約６〜８で行
なわれる。

目的の酵素は主として菌体内に蓄積される。該酵素は、
通常用いられる精製手段により分離精製される。すなわ
ち培養終了後、培養物から遠心分離法あるいは濾過法な
ど通常用いられる方法で集菌し、見られた菌体を例えば
超音波処理法、ガラス・ビーズによるグラインディング
破砕法、あるいは種々の界面活性剤や溶媒など通常用い
られる方法で破砕し、その破砕物から酵素を抽出するの
が有利である。酵素の採取に当っては、いずれの場合も
当分野における公知の分離精製手段を適宜利用し、任意
純度の標品に導きうる。即ち、この酵素含有破砕物を遠
心分離法あるいは濾過法で破砕菌体残音物を除去した後
、上清あるいはｐ液を得る。これを酵素抽出液とする。

この酵素抽出液Ｋ［Ｉアンモニウムあるいはアセトンな
どを加え、生じた沈澱物を遠心分離法で集めた後、これ
を少量の水に溶解し、透析などで脱塩し凍結乾燥すると
とＫより粗酵素粉末を得ることができる。精製はとの粗
酵素粉末を通常の酵素の精製に用いられる手段を利用す
る仁とによシ達成できる。例えば、セファデックス（フ
ァルマシア社（スエーデン）製）によるゲＡ／濾過、更
にジエチルアミノエチルセルロース（七ｐパ社（西ドイ
ツ）製）Ｋ！るカラム・クロマトグツフィー等の手段を
適宜実施することによシ七フチア８０Ｄが単離される。

このようにして任意純度のセラチアＳＯＤが分離精製さ
れる。

後述の参考例２によって見られたスーパーオキシドディ
スムターゼの酵素化学的特性は下記の通シである。

（ａ）作用：　スーパーオキシトイオンを過酸化水素水
分子と酸素分子とに不均化する。

０）基質特異性：　スーパーオキジトイオンに作用する
。

（ｏ）作用至適ＰＨ： 本酵素の活性は、第１図に示すように、その作用至適ｐ
ａは約７〜８にある。

Ｃ＾）ｐＨ安定性： 本酵素のｐＨ安定曲線は、第２図に示すように、ｐｉｌ
ｌ約６〜１１の範囲で安定である。。

（ｅ）作用適温の範囲：　約２０〜４５℃（ｒ）熱安定
性（失活の条件）； 本酵素はｐＨ７，８で一定時間、各温度で処理し、その
残存活性をしらべたところ、第８図に示すように、８７
℃、６０分間処理では安定であり、５０〜６０℃、ＳＯ
分間処理では約５０％が失活し、８０℃、５分間処理で
はほぼ１００％が失活する。

（ｇ）分子量： 本酵素の分子量はセファデックスＧ−１００（ファμマ
Ｖア社製）のカラムによるゲ／Ｌ／濾過法〔ザ・バイオ
ケミカル・ジャーナ／Ｌ’　（ＴｈｅＢｉｏａｈｅｍｉ
ｃａｌ　　Ｊｏｕｒｎａｌ）　９１巻、２２２−２ａａ
頁、１９６４年参照。〕で約４，８４０′をえた。また
１％フウリ１ｖｉｉｉｌ′酸ナトリウム（以下８ＤＳと
略称する。）で処理した後、そのＳ法〔ザ・ジャーナμ
・オプ・パイオロジカμ・ケミストリー（Ｔｈ＠Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｌｇｉ　−ｏａｌ　　Ｃｈ
＠ｍ１ｓｔｒｙ　）　２４４巻、５０７４〜５０８０頁
、１９６９年参照）では分子量約２．４Ｘ１０’をえる
。この結果、本酵素は分子量約２．４Ｘ１０のサブユニ
ットの２量体から成り立っていることがわかる。

（ｈ）元素分析： ０４８．９０±２．０％、　Ｈ７，０５±２．０％。

Ｎ　１４．８０±２．０襲 （１）紫外部および可視部領域の吸収ヌベクトμ：第４
図および第６図に示すように、本酵素の紫外部領械では
２８０　ｎｍ付近に極大吸収を、２６　ａ　ｎｌａ付近
に極小吸収があシ、２９０１１１ｍ付近に肩をもってい
る。２８Ｏｎｌ！ｌ　　の吸光度に対する２　６０　ｍ
Ｗ　（Ｄ＠光度比は１．８である。また可視部領域では
４７０〜４７５１１ｍ付近に極４大吸収を、８７６−ａ
８０ｎｍＶＣ極小吸収が、また＠　１０　ｎｍ付近に肩
をもっている。

（ｊ）赤外線吸収スペクトＡ／： ＫＢｒ法によるスペクトμを第６図に示す。特徴的ピー
クは、３．０２（強）、３．２１８（中）。

６．００（強）、６．６０（強）、６．９５（中）。

７、２６　（中）、８．ＩＱ（中）、８．６０（弱）。

９、１０　（弱）である。

（ｋ）分子吸光係数： 本酵素の２８ＯｎｌｌｌＫおける分子吸光係数は約１．
０８　Ｘ　１０５Ｍ−１−ｃｉ１テある。

（１）アミノ酸組成： 本酵素を６Ｎ−ＨＣＩ、１１０℃で一定時間（２４〜７
２時間）加水分解した後、アミノ酸分析機により構成ア
ミノ酸を定量する。表の値は酵素ｌモ〃（分子量−４，
８Ｘ１０’）当シの残基数で示す。

（以下会・白） （ｍ）金属分析： 本酵素は原子吸光分析法によ）、酵素１モル当夛約１．
６ｆ原子のマンガンを含んでいる。従って本酵素はマン
ガン型スーパーオキシドディスムターゼであることが判
る。

（ｎ）醇電点は１１Ｈ５付近である。

＆シ酵素力価の測定は次のようにして行われる。

頓　ザψジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｏａｌＣｈｅｒｎｉｓｔｒｙ　）　２４４巻、６０
４９〜６０６５頁。

１９６９年に記載の方法に従う。即ち、光路１ａＩセル
に１００　ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７，８）　１．Ｓ
ｓ（。

６０μ輩チトクロームＣ０，５謬ｔ　ｔ　Ｏ，６ｍＭエ
チレンジアミン四酢酸ナトリウム０．５ｇ？、０．６ｍ
Ｍキサンチン０．２６ｍ、測定可能な濃度にｐＨ７，８
のリン酸緩衝液で希釈した酵素液０．２１　ｗｌを入れ
、これにキサンチンオキシダーゼ溶液０．０４ｍｔｉｌ
！加し全量を３０Ｍ１とし１１分光光度針にセットして
、２５℃で反応を開始し、６５０　ｎｌｌにおけるチト
クロームＣ還元の初速！！ｔ（マ）を測定する。ま九酵
素液の代シに蒸留水を加えた時のチトクロームＣ還元籾
速度（Ｖ）をも測定する。酵素力価は上記反応条件下、
チトクロームＣの還元籾速度を５０％阻害する酵素量を
ｌ単位とし、次式よシ算出する。

（ロ）アナリテイカμ・バイオケミストリー（Ａｎａｌ
ｙｔｉｏａｌ　　Ｂｉｏｏｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　４４
巻、２７６〜２８７頁、１９７１年に記載の活性染色法
を本適宜利用される。即ちポリアクリμアミドゲル電気
泳動を行った後、ゲルを１４５ｍＭ　　ニドロブルーテ
トラゾリウム溶液に２０分間浸す。次いで２８ｍＭテト
フエチ〜エチレンジアミン、０．０２８ｍ１（リボフラ
ビン、　３６　ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７，８）の混
合液に１５分間浸した後、ゲルを試験管に入れ、１５１
螢光灯下で３０分間照射すると、リボフラビンの光還元
によシ発生したスーパーオキシトイオン、０２がニドロ
ブｙ−テトフゾリウムをｔ元して、スーパーオキシドデ
ィスムターゼ活性のある部位以外はブルー・フォμマザ
ンを形成し青紫色に染色される。

蛋白質はローリ−法〔ザ・ジャーナル・オプ・バイオロ
ジカμΦケミストリー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　
　Ｂｉｏｌｏｇｉａａｌ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　
１９８巻。

２６５〜２７６頁、１９５１年〕により定量される。

セフチアＳＯＤは、会知のスーパーオキＳ７　Ｆ　テイ
スムターゼとは物性が異なる。すなわち、公知の４のと
してはエシェリヒア・コリＢ（Ｅ日ｏｈｅｒｉ−ａｈｉ
ａ　　ｏｏｌｉ　　Ｂ）　　から得られるもの〔ザージ
ャーナ〜−オプ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈ
ｅ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｌｏｇｉｏａ
ｌ　　Ｃｈｅｍｉ　−θｔｒｙ　）マｏＬ　２４５，４
２２．　　ｐｐ、６１７６−６１８１．１９７０参照〕
、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｏｉｌｌｕ
ｓ　　ａｔｏａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ　−１ｕ８）か
ら得られるもの〔ジャーナル・オプ・モレキュフー〇バ
イオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆｌ［ｏｌｅｏｕｌ
ａｒ　　Ｂｉｏｌｏｇｙ　）マ０１．１０５．ｐｐ、ａ
ａａ−ａａ５，１９７６参照〕が挙げられるが、エシェ
リヒア・コリから得られるものの分子量は８９．５００
であシ、バチルス・ステアロサーモフィルスから得られ
るものの分子量は４０，０００である。ところがセラチ
アＳＯＤの分子量は約４．８×１０′　　であシ、した
がって分子量が大きく異なる。それ由、セラチアＳＯＤ
は新規酵素と考えられる。

本発明方法において用いられる水溶性担体としては、た
とえば水溶性多糖類〔例、デキストリン。

デキストフン、フィコ−１ｖ７０　（Ｆｉｏｏｌｌ　　
Ｔｙｐｅ７０、Ｖグマ（ｓｉｇｍａ）社（米国）製）〕
、蛋白質あるいは酵素〔例、血清アμプミン、ヘモグロ
ビン、カゼイン、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、ト
リプＶン、キモトリプシン〕、水溶性合成高分子化合物
Ｃ例、ポリエチレングリコ−μ、ポリビニルアμコーμ
〕などが挙げられる。

セラチアＳＯＤを担体に固定化するＫは、その結合方法
として物理的吸着、イオン結合、共有結合方法などがあ
る。具体的には生化学突稜講座第５巻６４１〜６６６頁
（１９７５）（東京化学同人発行）Ｋ記載されている既
知の方法に従っておこなえばよい。すなわち、セフチア
ＳＯＤを例えデヒドあるいはジシクロヘキシμカμポジ
イミドを用い、ポリエチレングリコールと結合せしめ石
にはトリクロロ−トリアジンを用いる方法などがある。

反応はすべて酵素Ｏ失活を防ぐ丸めたとえば中性溶液中
で室温（２６℃）以下の温度でおこなうのが望ましい。

得られた固定化酵素と残存している試薬との分離はたと
えば透析法あるいはゲｆｉ／濾過法にて行われる。

セラチア８０Ｄは、抗炎症作用を有する。たとえば、セ
ラチア５ｏｎ（８０００Ｕ／岬の標品）を通常行われる
ラット後肢のカラゲニン浮腫法〔ジャーナル・オプ・フ
ァーマコロジー・アンド・エクスペリメンタル・セラビ
ューティクス（Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　、Ｐｈａｒ
ｍａｏｏｌｏ６ｙ　　　ａｎｄＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ
ｌ　　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｏｓ　）１５０．３２Ｂ（
１９６５））で、１．０！／＆ｆ以上を静脈内に投与す
ることＫよシ明らかに浮腫抑制効果を示す。

以下に、セラチア８０Ｄの生物突稜データを記す。

ナイスタチン浮腫（Ｎｙｓｔａｔｉｎ　　ｅｄｅｍａ　
）Ｋ対する効果； −ＴＣＬ−ＩＣ１’ｔｖウスの足１１（ｐａｗ）　Ｋ生
理食塩水に溶解した１％（Ｗ／Ｖ　）ナイスタチン溶液
０．０２６ｇ／を皮下注射した。同時にセフチア８０Ｄ
（１２，０ＯＯＵ／ダ＠　ｐｒｏｔｅｉｎ　　）を皮下
注射により該部位に投与した。本突稜は、ファーマコロ
ジ−（Ｐｈａｒｍａｏｏｌｏｇｙ　）第５巻第２１５−
２２４頁（１９７１年）に記載の方法に従って行なった
。

ナイスタチンを投与して６時間後に発生した浮腫の量を
測定した。結果を次表に示す。

表１ 対１１−　１０　１２０．４５±８．８７　−セフチア ８ｏＤ５０　　１０　　　９２．８５＋４．８８　　２
ａ、ａセラチア ８ｏＤ５００　　１０　　　８３．７１±８．２８　　
８０．５（注）　：　８．Ｅ、一種牛誤差 上記の結果から明らかなように、セフチアＳＯＤは、ナ
イスタチン浮腫を阻止する。

前記の方法で得られたセフチア８０ＤＫ水溶性担体を結
合させた固定化酵素は、その酵素化学的性質にあっては
、その熱安定性が増大し、また、その１１１１′ＮＡ的
性質にあっては、抗原性が減少し、過酸化脂質生成に対
する抑制作用が増大し、抗炎症作用が増強されるので、
静脈投与も可能となる。

したがって、該固定化酵素は、哺乳動物とシわけ人への
投与の際に、極めて有用な性質を有する。

上記の性質について、以下に具体的に説明する。

（１）熱安定性 セラチアＳＯＤ、セフチア８０Ｄ固定化酵素（フィコ−
μｍセフチア８０Ｄ　、デキストフン−セフチア８０Ｄ
）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，８）中で８７℃、
６０℃および７６℃で一定時間放置した後、残存活性を
測定した。結果を第７図に示す。第７図においては、０
時間における各酵素の活性（１，００００／Ｗ）を１０
０％として表示した。

該結果から明らかなように、フィコ−ｐ−セフチアＳＯ
ＤおよびダキストランーセラチアＳＯＤは、セラチアＳ
ＯＤよシ耐熱性が増大している。

（２）抗原性 臨床検査技術全書第４巻８６頁（１９７８年）Ｃ合志編
、医学書院）に記載のラフタロニー（０ｕｏｈｉｅｒｌ
ｏｎｙ　）の二重拡散テスト法に従って、抗原性を調べ
た。すなわち、１囁寒天板（１１１１層。

５０　ｍＭ　　！ｊ　ン酸Ｗｋ衝１１　、ｐＨ７，０）
　Ｏ直径ａｍｏ穴へ下記表２に記載の濃度の酵素液５μ
ｌを入れ、また抗血清５μＥを別の穴に入れて、４℃で
６日間放置した後、免疫沈降線の有無を判定した。なお
、抗血清は、セフチア８０Ｄ（５ｗｆ）を家兎（メス、
ａ＃）Ｋ対し背部の皮肉に２週間間隔でａ回くシ返し注
射するととによシ得た。

表　２　　　免疫反応性 セ？＋７８０Ｄ　　　　　　　　ａｏｏ　　　　　　ｆ
フイ】−μｍセフチア８０Ｄ　　　　　　　５００　　
　　　　　　＋デキストランーセラチア８０Ｄ　　　　
　１５００　　　　　　　　±判定ニー　なし１士　わ
ずか向す、＋　あシ上記表２から明らかなように、セフ
チアＳＯＤに比べ、抗セラチア８０Ｄ血清に対する反応
性は、フィコ−μｍセフチア！３０ＤＫあっては　３１
５−に、デキストラン−セフチア８０Ｄにあっては１１
５に減少している。

（３）過酸化脂質生成に対する抑制作用５Ｑｍ１［リン
酸緩衝液（ｐＥ［７，０）中に、１０１１Ｍリルイン酸
ソーダおよび０．８％トウィーン　８０（Ｔｗｅｅｎ　
８０．　　、Ｌ’、Ｘ”−了゛１５ス−３！ｉ！　　＞
からなる混液に、表３に示す各酵素を５００／ｇ／にな
るように加え、８７℃で２日間放置する。反応混液中の
過酸化脂質量をメソッド・イン・エンリアモロジー（Ｍ
ｅｔｈｏｄ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　）第５
２巻８０６頁（１９７８年）アカデミツク・プレス（Ａ
ｏａ（ｌｅｍｉａ　　Ｐｒｅｓｓ）　（米国）に記載の
チオパルピッ−〜法に従って定量し、過酸化脂質生成に
対する抑制作用を酵素無添加での生成量に対する阻害率
で第８表に示し友。

表８　゛　リルイン酸の自動過酸化に対する抑制効果 ００ −に？チアＳＯＤ　　　　　　　　５０　　　　　　ａ
６フイコールーセラチア８０Ｉ）　　　　６０　　　　
　　９１上紀表８から明らかなごとく、フィコ−〃−セ
ラチアＳＯＤおよびデキストラン−セラチアＳＯＤは、
セラチアＳＯＤに比し、脂質の自動過酸化に対しよシ強
い抑制能を有する。

（４）抗炎症作用 ＡｒｏｈｉＶ４ａ工ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｓ　ｄｅ
　Ｐｈａｒｍａｏｏｄｙ　−ｎａｍｉｏｓ　ｅｔ　ａｅ
　Ｔｈｅｒａｐｘｅ　ｖｏｌ、　１４４．ｐ、　１８５
（１９６ａ）Ｋ記載の方法に従って、ラットの背部の皮
下に２％（Ｗ／Ｖ　）のカフゲナン溶液０．５ｗｌを注
入し、その８０分後に、下記の表４に記載の酵素を静脈
投与して、２４時間後の膿瘍を切シ出しその重量を測定
し、対照（生理食樵水投与）と比較した。

上記の表４から明らかなごとく、フィコ−〜−セフチア
ＳＯＤおよびデキストラン−８ＯＤは、ラットのカフゲ
ナン膿瘍に対し、セフチア８０Ｄよりも強力な抗炎症作
用を有する。

セフチア８０Ｄの毒性は低く、ラット腹腔内に６０ダ／
＃量を注射で投与しても死亡例を認めない。マウス腹腔
内にセフチアＳＯＤを６２６ＷｆＡＱ量を注射で投与し
ても死亡例を認めなかった。また、Ｙウスに−ｈラチ７
８０Ｄを２，０００１１Ｆ／＃量を静脈注射で投与して
も死亡例を認めなかった。ま九、セフチア８０Ｄ固定化
酵素については、固定化酵素中の担体に毒性は認められ
ないので、セフチア８０Ｄの毒性と同程度である。

このように、セフチア８０Ｄおよびセフチア８０Ｄ固定
化酵素は、抗炎症作用を有するので、抗炎症剤として用
いることができる。

セフチア８０Ｄまたはセフチア８０Ｄ固定化酵素は、通
常の方法に従グ・て、錠剤、カプセル剤。

注射剤、軟膏剤などの製剤として、１日投与量約１〜６
ダ（酵素量として）／ｋｇを哺乳動物（例、マウス、ラ
ット、ウサギ、ネコ、犬、すμ２人）治療を目的として
、経口的ま九は非経ロ的ド投与し得る。

上記の製剤の製造の際に用いられる担体としては、たと
えばアルブミン、グロブリン、デキストラン、フイ）−
／ｌ／７０（ＦｉＯＯｌｌ　　’ｒｙｐｅ　　７０゜シ
グマ社（Ｓｉｇｍａ　　Ｃｏ、、　Ｔ７．８．Ａ、）　
）　、ラクトース、デキストリン、スターチなどが挙げ
られる。

また、製剤の製造は、自体公知の方法に従って行なうこ
とができる。

以下に参考例および実施例を示すが、本発明は以下の実
施例の範囲に限定されるものではない。

パーセント（％）は特にことわシのないかぎシ、重量／
容量パーセント（Ｗ／Ｖ％）を表わす。

参考例１ 脱脂大豆粉１．０％、カゼイン１．６％、リン酸ニアン
モニウム０．６％、塩化ナトリウム０．１％、塩化カリ
ウム０．０５％、塩化力μシウム０．０２％。

硫酸マグネＶウム０，０２％、炭酸カルシウム１．０％
１脚酸亜鉛０．００２１％、大豆油０，６％、アクトコ
−／Ｌ’０．１％から成る液体培地（ｐＨ７，ＯＫ調節
）４０耐を２００　ｗｅ容三角フラスコに分注し、１２
０℃で２０分間蒸気滅菌した。これに下記の各種セフチ
ア属菌株の一白金耳量をρ種し、２８℃で毎分２ａＯ回
転のロータリ一式振盪培養機で４８時間培養した。培養
終了後、培養物から遠心分離法によシ集菌し、−２０℃
で凍結保存した。凍結菌体１０ｇをとシ、８０℃で融解
後、これＫ　２０　ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，８）を
４０ｓｌ加え、超音波処理（２Ａ、５分間）で菌体を破
砕した。この破砕菌体から遠心分離法により上清をえた
。この上清液についてスーパーオキシドディスムターゼ
の力（曲を先にのべたキサンチン中キサンチンオキシダ
ーゼ・チトクロームＣ法およびポリアクリルアミドゲル
電気泳動法で測定した。結果は次表に示す通りで、セフ
チア属に属するいずれの菌株とも、その菌体内にセラチ
アＳＯＤを蓄積していることを認めた。

セラチア・リクエフアシエンス　エＦＯ１２９７９７４
セラチア・マμセツセンス　　エＦＯ３０４６６７セフ
チア・マμセツセンス　　ｌ：Ｆｏ　　ａ７５９　　　
　　１１５セラチア・マμセツセンス　　エｒｏ　　ａ
７ａ６　　　　　９１セラチア・マリノルグラ　　　エ
ＦＯ１２９７ａ　　　　　　２００参考例２ ば〕集菌 参考例１で使用した液体培地と同一組成の培地５００　
ａｔを２１の坂ロフラスコに分注、滅菌し、これにセフ
チア・マルセツセンスＩｒＯａ７ａ６　を接種して、２
８℃で毎分２ａＯ回転のロータリ一式振盪培養機で２４
時間培養し種培養を調製した。

同じ組成の培地１００１を２００１のタンクに注−人し
、これに前記の種培養物を接種し、培養温度２８℃で毎
分１００１の空気を送シながら、通気攪拌培養を２０時
間行った。この培豐物から遠心分離法によシ菌体を採取
し、−２０℃で凍結保存した。

（ロ）粗酵素標品の調製 凍結保存菌体１．５＃を８０℃で融解し、これにａ　Ｕ
ｌ）　２０　ｍＭ　９　ン酸Ｊｌｆｒ液（ｐＨ７，８）
　を加Ｌ、ダイノミＡ’（ウィリー・工・パツコーフエ
ン社製。

スイス）装置で菌体を破砕し、シャープレス遠心分離機
にかけて澄明な上清液をえ九。この上清液から硫酸アン
モニウム８０〜７０％（Ｗ／Ｖ　”）で生じてくる沈澱
物を遠心分離法で集めた。この沈澱物を少量の０、ｌ　
Ｍ　ＫＣＩ　を含んだ２０＋！ＩＭ　！Ｊン酸緩衝液（
ｐＨ７，０）Ｋ溶解し、セロファン・チューブに入れ、
同一緩衝液に対して３日間透析した。

透析内液１５０ｄをダイアフローＵＭ−５（アミコン社
製（アメリカ）、限外濾過膜）の膜で限外濾過法によシ
ａＯｗｔにまで濃縮した。この濃Ｉｍ液を予め同一緩衝
液で平衡化したセファデックスＧ−１５０（ファ〜マシ
ア社＄１１）のカラム（４，０Ｘ６６．０ｃ１１）に負
荷し、同一＊＊液で溶出し、酵素活性を有する一分２１
０−を集めた。この画分に硫酸アンモニウムを７０％ｃ
　Ｗ／Ｖ　＞まで加え、生じた沈澱物を遠心分離法で集
め、これを少量の水に溶解し、セロファンチューブに入
れ、水に対して８日間透析後、透析内液を凍結乾燥に付
し、粗酵素標品６２０ダをえた。この標品の比活性は、
ａ、６００　Ｕ　／　Ｗ　・ｐｒｏｔｅｉｎ　テ１）ツ
ｆｔ−０（ハ）精製標品の調製 （１）　　ジエチルアミノエチ〜セμロースのカフムク
ロマトグフフイー （ロ）でえた粗酵素標品６２０＃を少量の２０　ｍＭト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ９，０）で溶解し、セロファン
チューブに入れ、同一の緩衝液に対してａ日間透析した
。この透析内液８０ｓ／を予め同一緩衝液で平衡化した
ジエチ〃アミノエチμセルロースのカラム（２，５’ｘ
４５．０３）に負荷させた後、同一緩衝液中で塩化す）
ＩＪウム濃度を直線的に０〜２５０ｍＭに上げることに
よシ酵素を溶出し、酵素活性を有する一分４６耐を集め
た。

（６）セファデックスＧ−１００によるゲμ濾過（１）
でえた酵素液４６ｗｔをセロファンチューブに入れ、０
．１　Ｍ　ＫＣＩを含んだ２０ｍＭ　　リン酸緩衝液に
対して透析した。透析内液＠Ｏａ、ｆダイアフローＵＭ
−５の膜で限外濾過法により６．０　ｗｌまで濃縮した
。この濃縮液を予め同一緩衝液で平衡化したセファデッ
クスＧ−１００（ファルマシア社１ｔｌ）のカラム（２
，６ｘ　７４．Ｏａｇ　）に負荷し、同一緩衝液で溶出
し、酵素活性を有した赤紫色の溶出画分を集めた。この
ようにして見られたいずれの画分屯その比活性に変動が
なく、ま九ポリアクリルアミトゲ〃電気泳動法でも単一
であるセフチアＳ。

Ｄ１１品２４岬をえ九。この精製標品の比活性は１２、
　ＯＯＯＵ　／ｑ／　ｅｐｒｏｔｅｌｎであった。

参考例８ セフチア・マルセッセンスエＦＯａ７５９を参考例２と
同様の方法で処理し、凍結菌体１．５峠から、粗酵素標
品４１０岬をえ九。この標品の比活性はａ、６　ａ　Ｏ
Ｕ　／　ＩＰ　−ｐｒｏｔｅｉ　ｎであった。またこの
粗酵素より参考例２と同じ方法で、精製したセラチアＳ
ＯＤ標品をえた。この精製標品の比活性は１２．０００
　Ｕ　／　Ｉｌｆ／　ｅｐｒｏｔｅｌｎであった。

参考例４ セラチア・マリノルプフエＦＯ１２９７ａを参考例２と
同様の方法で処理し、凍結菌体１．５　ｋＱから、粗セ
フチア８０Ｄ標品８８０岬をえた。この標品の比活性は
８，８００　Ｕ　／Ｍｆ　−ｐｒｏｉｅｔｎ　ン汐ゝ参
考例５ ば）集菌 脱脂大豆粉１．０％、カゼイン１．５％、リン酸ニアン
モニウム０．６％、塩化ナトリウム０．１％、塩化カリ
ウム０．０５％、塩化力ｐシウム０．０２％。

硫酸マグネシウム０．０２％、炭酸力ｐシウム１．θ％
２脚酸亜鉛０．００２１％、大豆油０．６％、アクトコ
−、ｕｏ、１％から成る液体培地（ｐＨ７゜０に調節）
５００　ｍｌを２１の坂ロフラスコに分注、滅菌し、こ
れにセフチア・マμセツセンスＡＴＣＣ２１０７４を、
接種して、２８℃で毎分２８０回転のロータリ一式振盪
培養機で２４時間培養し種培養を調製した。同じ組成の
培地１００１を２００１のタンクに注入し、これに前記
の種培養物を接種し、培養温度２８℃で毎分１００ｇの
空気を送シながら、通気攪拌培養を２０時間行った。こ
の培養物から遠心分離法によシ一体を採取し、−２０℃
で凍結保存した。

（ロ）粗酵素標品の調製 凍結保存菌体６幻を８０℃で融解し、これにｔａｌｌの
２０１１１Ｍ　　リン酸緩衝液（ｐＨ７，８）を加え、
ダイノミ〜装置で菌体を破砕し、シャープレス遠心分離
機にかけて澄明な上清液をえた。この上清液から硫酸ア
ンモニウムａＯ〜７０％（Ｗ／Ｖ　）で生じてくる沈澱
物を遠心分離法で集めた。との沈澱物を少量の０．１　
Ｍ　ＫＣＩを含んだ２０１１１Ｍ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ
７，０）に溶解し、セロファン・チューブに入れ、同一
緩衝液に対して２日間透析した声透析内液５８０１をダ
イアフローＵＭ−５の膜で限外−過性によ）４ＧｍＫま
で濃縮した。この濃縮液を予め同一緩衝液で平衡化した
セファデックスＧ−１５０のカラム（４，０Ｘ６６．０
３）に負荷し、同一緩衝液で溶出し、酵素活性を有する
両分５５０ｍ？を集め友。この画分に硫酸アンモニウム
を７０％（Ｗ／Ｖ　）まで加え、生じた沈澱物を遠心分
離法で集め、これを少量の水に溶解し、セロファンチュ
ーブに入れ、水に対してａ日間透析後、透析内液を凍結
乾燥に付し、粗酵素標品２０７０９を得た。この標品の
比活性は、８．６００Ｔ７ＡＩｇ・ｐｒｏｔｅｉｎであ
った。

（ハ）精製標品の調製 （Ｉ）　　ジヱチルアミノヱチルセルロ＾スのカラムク
ロマトグラフィー （ロ）でえ九粗酵素標品２，０７０１Ｆを少量の２０１
１１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９，０）で溶解し、セ
ロファンチューブに入れ、同一の緩衝液に対して８日間
透析した。このｉ析内液１ａ４ｗ！を予め同一緩衝液で
平衡化したジエチルアミノヱチルセμロースのカラム（
３，８ｘ５５．Ｏａｍ）に負荷させた後、同一緩衝液中
で塩化ナトリウム濃度を直線的に０〜２５０息Ｍに上げ
ることによシ酵素を溶出し、酵素活性を有する画分５４
ｇ／を集めた。

（Ｉ）　　セファデックスＧ−１００によるゲ／Ｌ／′
濾過（１〕でえた酵素液５４−をセロファンチューブに
入れ、０．１　Ｍ　ＭＣＩを含んだ２０ｍＭリン酸緩衝
液に対して透析した。透析内液７ａａｆｆをダイアフロ
ーＵＭ−５の膜で限外濾過法により２．０ｄまで濃縮し
九。この濃縮液を予め同一緩衝液で平衡化したセファデ
ックスＧ−１００のカラム（２，６Ｘ７ｔＯｔＭ）に負
荷し、同−ｌｌ衝液で溶出し、酵素活性を有し曳き紫色
の溶出画分を集めた。このようにして見られたいずれの
画分もその比活性に変動がなく、またポリアクリルアミ
トゲμ電気泳動法でも単一であるセフチア８０Ｄ標品２
．０７岬をえた。この精製標品の比活性は１２，０００
０／Ｍｌ・ｐｒｏｔｅｉｎ　であった。

寮施例１ フィコ−／％／（Ｖグマ社製２分子量７０，０００）１
．６１・をアクタ會ケミカ・スカンディナビア（Ａｏｔ
ａ　　Ｃｈｅｍｉｏａ　　９ｏａｎｄｉｎａｂｉａ）第
２６巻１８５５頁（１９７１年）に記載の方法に従って
ブロムｙアンで活性化せしめ、これに参考例６で得られ
たセフチア８０Ｄ　　ＯＪｆを加え２８℃で１日反応せ
しめたのち、反応液をセロファンチューブに入れ、蒸留
水に対し８日間透析したのち内液を凍結乾燥し、１．７
Ｆのフイコールーセフチア５ＯＤｔ−得た（１，０ＯＯ
Ｕ／Ｉｆ）。このフィコール−セラチア８０Ｄは水溶性
で５ｏキ／ｓＺ（生理食塩水中）でも充分可溶である。

実施例２ デキストラン（和光純薬工業株式会社製１分子ｆｉ６０
．０００〜９０，０００）１．５ｆと参考例５で得られ
たセフチア８０Ｄ　　Ｏ，ａＦとを実施例１と同様の方
法で処理してデキストラン−セフチアＳＯＤ　　１．７
Ｆを得ｑ（１，０ＯＯＵ／Ｗ）。

このデキストラン−セラチアＳＯＤは水溶性でｌｓＯ’
ｌ／ｍｌｃ生理食塩水中）でも充分可溶であ艷。

実施例８ 以下の成分を用い、通常用いられる方法により腸溶性カ
ブ七ル剤を製造する。

参考例６で得られた πう今Ｙ　５０　ｔ）（ｉ、　６ｂＯ％１）　　　　　
　　　　１０　”Ｆ乳糖　　　　　　　　　　　　　　
　　　４６１％１コーンスターチ　　　　　　　　　　
　　１６岬結晶性セルロース　　　　　　　　　　　　
１２ダグリコール酸セルロース　　　　　　　　　　５
１！１’ツルピトーｖ　　　　　　　　　　　　　　　
１０１１ｊｆＩ９１１ｆ （ｌカブ七〜あたり） 上記カプセル剤は、通常大人に１回２カデセμを食後Ｋ
１８８回投与する。

実施例４ 以下の成分を用い、通常用いられる方法により腸溶錠を
製造する。

参考例５で得られた ｔう今了、Ｓ’　Ｏｆ）　（３、ｔｏｏ％７）　　　　
　　　　　　ｔｏｗ乳糖　　　　　　　　　　　　　　
　　　７９　岬コーンスターチ　　　　　　　　　　　
　４５．５Ｗステアリン酸マグネシウム　　　　　　　
　０５１１Ｆ１８６　呼 （１錠あたシ） 上記錠剤は、通常大人Ｋ１回２錠を食後に１日８回投与
する。

実施例６ 以下の成分を用い、通常用いられる方法にょ夛腸溶性カ
プセ〃剤を製造する。

実施例１で得られた ７Ａニア−ルーｔ５＋了ΣθＤ　　（１，０００Ｕ／Ｉ
Ｆ）　　４０　　　ｑ乳糖　　　　　　　　　　　　　
　　　　４６　１％１コーンスターチ　　　　　　　　
　　　、１６　ｑ結晶性セルロース　　　　　　　　　
　　１２　ダグリコール酸セルロース　　　　　　　　
　５Ｍｇツルピトー／Ｌ／１０ｓｙ １２９　岬 （ｌカブ１〜あたり） 上記カブ七μ剤は１１通常大人に１回２カブ七〃を食後
に１日ａ回投与する。

実施例６ 以下の成分を用い、通常用いられる方法によシ腸溶錠を
製造する。

実施例２で得られた テ”Ｉｃｌトｉ％ｊ’ｐ７３０ｔ）　　　　（１，０Ｏ
ＯＵ／＃）４０　　　”ＩＦ乳糖　　　　　　　　　　
　　　　　　　７９　　ｗｖコーンスターチ　　　　　
　　　　　　４５゜５ｓｊＦ（１錠あたシ） 上記錠剤は、通常大人に１回２錠を食後に１日８回投与
する。

【図面の簡単な説明】

第１図は参考例２で得られたマンガンＷＩノーバーオキ
ＶドデイスムターゼのｐＨ作用曲線を、第２図はそのｐ
Ｈ安定曲線を、第８図はその熱安定性を、第４図はその
紫外部領域における吸収スペクトμを、第６図はその可
視部領域における吸収スペクトルを、第６図はその赤外
線吸収スペクトμをそれぞれ表わす。、第７図は、実施
例１および２で得られたマンガン型スーパーオキシドデ
ィスムターゼの固定化酵素の熱安定性を示す。 竿′７　閃 ゼラチア　ｓｏｏ　　　　　　　７．ゴー少し−セーラ
チア５ＯＤ０＋０２０３０　　　　　６０　　　０１０
２０３０　　　　　６Ｏ−Ｏ−：１７＠ｃ −・−６０’″Ｃ −ム−ゴＣ デーストラン−とラチ７ＳＯＤ

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　セフチア属菌が産生ずるマンガン型スーパー
   オキシドディスムターゼに水溶性担体を結合させた固定
   化酵素
2. （２）　　セフチア属菌が産生するマンガン型スーパー
   オキシドディスムターゼに水溶性担体を結合させること
   を特徴とする固定化酵素の製造法Ｏ）　セラチア属菌が
   産生ずるマンガン型スーパーオキシドディスムターゼを
   含有する抗炎症剤（４）　　マンガン型スーパーオキシ
   ドディスムターゼが水溶性担体を結合させた固定化酵素
   である特許請求の範囲第３項記載の抗炎症剤