JPH08320292A - 蛍光観察方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】本発明は、精度の高い蛍光観察を実現できる蛍
光観察方法および装置を提供する。 【構成】レーザ光によって励起された標本１３からの蛍
光をダイクロイックミラー１４を通して長波長と短波長
のものとに分離し、それぞれ吸収フィルタ１５、１７を
通して短波長および長波長検出用のディテクタ１６、１
８よりデータとして検出するもので、ディテクタ１６、
１８のそれぞれの検出光路中に吸収フィルタ１５、１７
を配して検出された長波長および短波長にかかる蛍光デ
ータと、長波長検出用のディテクタ１８側に前記短波長
検出に用いた吸収フィルタ１５を配して検出された長波
長側での短波長の漏れ蛍光データとをそれぞれ画像メモ
リに記憶し、これら記憶された蛍光データの差分結果を
長波長側の補正された画像データとして画像メモリに格
納するとともに画像モニタに表示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、多重染色標本の観察に
用いられる蛍光観察方法および装置に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】従来、走査型レーザー顕微鏡を使用して
２重染色標本を観察する場合、レーザ光によって励起さ
れた２種類の蛍光を、ダイクロイックミラーを通して長
波長のものと短波長のものとに分離し、それぞれ吸収フ
ィルタを通した後にディテクタによりデータとして検出
するようにしている。

【０００３】ところが、一般に、ダイクロイックミラー
は、その特性上、短波長の透過率を完全に０にできない
ため、２種類の蛍光をダイクロイックミラーだけで完全
に長波長のものと短波長のものとに分離するのは難し
く、長波長側に短波長の光が漏れてしまうことがある。

【０００４】そこで、従来では、長波長検出側のフィル
タを狭帯域化することで、ディテクタに入る短波長の蛍
光の漏れ光を取り除く方法や長波長側の蛍光の検出デー
タと短波長側の蛍光の検出データを比較することによ
り、短波長側で検出されていて、長波長側でも微弱なデ
ータとして検出されたものを短波長の漏れ光であるとし
て、この分を長波長側から取り除く方法などが考えられ
ている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかし、前の長波長検
出側の吸収フィルタを狭帯域化する方法では、フィルタ
の帯域を狭くすればするほど通過する光が弱くなるた
め、検出すべき長波長側の蛍光のＳ／Ｎ比が悪化し、ま
た、このような吸収フィルタの作成に費用がかさむとい
う問題点があった。

【０００６】また、後の長波長側の検出データと短波長
側の検出データを比較する方法では、長波長側での微弱
なデータは、本来の長波長側の微弱な蛍光なのか、それ
とも短波長の漏れの光なのかを厳密に判断できないた
め、結果として長波長側の検出データが不正確になって
しまうという問題点があった。本発明は、上記事情に鑑
みてなされたもので、精度の高い蛍光観察を実現できる
蛍光観察方法および装置を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】請求項１記載の発明は、
レーザ光によって励起された蛍光をダイクロイックミラ
ーを通して長波長と短波長のものとに分離するととも
に、それぞれ吸収フィルタを通してデータとして検出す
る蛍光観察方法において、短波長検出側および長波長検
出側にそれぞれ吸収フィルタを配して前記長波長および
短波長にかかる蛍光データを検出し、前記長波長検出側
に前記短波長検出に用いた吸収フィルタを配して長波長
側での短波長の漏れ蛍光データを検出し、これら検出さ
れた蛍光データの差分から長波長側の補正されたデータ
を得るようにしている。

【０００８】請求項２記載の発明は、レーザ光によって
励起された蛍光をダイクロイックミラーを通して長波長
と短波長のものとに分離するとともに、それぞれ吸収フ
ィルタを通して長波長および短波長ディテクタによりデ
ータとして検出する蛍光観察装置において、前記長波長
および短波長ディテクタのそれぞれの検出光路中に吸収
フィルタを配置して検出された前記長波長および短波長
にかかる蛍光データを記憶する第１の記憶手段と、前記
長波長ディテクタ側に前記短波長検出に用いた吸収フィ
ルタを配して検出された長波長側での短波長の漏れ蛍光
データを記憶する第２の記憶手段と、これら第１および
第２の記憶手段に記憶された蛍光データの差分から長波
長側の補正されたデータを出力する制御手段とにより構
成されている。

【０００９】請求項３記載の発明では、請求項２記載に
おいて、前記吸収フィルタは、前記長波長および短波長
ディテクタのそれぞれの検出光路中に出し入れ自在に設
けられる。

【００１０】

【作用】この結果、請求項１記載の発明によれば、短波
長検出側および長波長検出側にそれぞれ吸収フィルタを
配して検出される前記長波長および短波長にかかる蛍光
データと、前記長波長検出側に前記短波長検出に用いた
吸収フィルタを配して検出される長波長側での短波長の
漏れ蛍光データとの差分を求めるようにしたので、長波
長側に漏れる短波長の蛍光分を取り除いた、純粋な長波
長側の蛍光データを得ることができる。

【００１１】また、請求項２記載の発明によれば、長波
長および短波長ディテクタのそれぞれの検出光路中に吸
収フィルタを配置して検出された前記長波長および短波
長にかかる蛍光データと、前記長波長ディテクタ側に前
記短波長検出に用いた吸収フィルタを配して検出された
長波長側での短波長の漏れ蛍光データをそれぞれ記憶手
段に記憶し、これら記憶された蛍光データの差分から長
波長側の補正されたデータを求めるようになるので、長
波長側に漏れる短波長の蛍光分を取り除いた、純粋な長
波長側の蛍光データを得ることができる。

【００１２】また、請求項３記載の発明によれば、吸収
フィルタは、長波長および短波長ディテクタのそれぞれ
の検出光路中に出し入れ自在に設けられるようになるの
で、蛍光観察のための操作を簡単にできる。

【００１３】

【実施例】以下、本発明の実施例を図面に従い説明す
る。 （第１実施例）図１は、本発明が適用される蛍光観察装
置の概略構成を示している。図において、１はコントロ
ーラで、このコントローラ１には、操作パネル２、蛍光
検出部３、画像メモリ４を接続し、画像メモリ４に画像
モニタ５を接続し、操作パネル２からの指令によりコン
トローラ１から蛍光検出部３に蛍光検出開始信号が出力
され、蛍光検出部３からの検出出力を画像データとして
画像メモリ４に転送するとともに、画像モニタ５に観察
像を表示するようにしている。

【００１４】図２は、蛍光検出部３の概略構成を示して
いる。この場合、レーザー発振器１０から発振されたレ
ーザ光を励起光選択フィルタ１１を通して所望の励起光
を生成し、この励起光をダイクロイックミラー１２を介
し標本１３上で走査し、また、標本１３より発光された
蛍光を、ダイクロイックミラー１２を透過させ、ダイク
ロイックミラー１４に入射する。そして、短波長側のも
のをダイクロイックミラー１４で反射させ、吸収フィル
タ１５を通して短波長検出用のディテクタ１６によりデ
ータ化し、一方、長波長側のものをダイクロイックミラ
ー１４を透過させ、吸収フィルタ１７を通して長波長検
出用のディテクタ１８によりデータ化するようにしてい
る。

【００１５】なお、図示破線１０９は、上述したように
ダイクロイックミラー１４からの短波長の漏れ光が吸収
フィルタ１７を通して長波長検出用のディテクタ１８に
入力される様子を示している。

【００１６】しかして、このような構成において、図３
に示すフローチャートに従った動作が実行される。ま
ず、観察者は、ステップ３０１で、短波長検出用ディテ
クタ１６側および長波長検出用ディテクタ１８側にそれ
ぞれ吸収フィルタ１５および１７をセットし、ステップ
３０２で、操作パネル２にて各種走査条件を設定する。
すると、コントローラ１から蛍光検出部３に蛍光検出開
始信号が出力され、レーザー発振器１０から発振された
レーザ光が励起光選択フィルタ１１を通し所望の励起光
となってダイクロイックミラー１２を介して標本１３上
で走査される。そして、標本１３からの蛍光がダイクロ
イックミラー１２を介して、ダイクロイックミラー１４
に入射されると、短波長側のものが反射され、吸収フィ
ルタ１５を通して短波長検出用のディテクタ１６でデー
タ化され、また、長波長側のものが透過され、吸収フィ
ルタ１７を通して長波長検出用のディテクタ１８でデー
タ化される。

【００１７】このようにして、長波長、短波長の各デー
タが取り込まれていき、その後、１画面分のデータが取
り込まれると、コントローラ１の指示により、ステップ
３０３で、長波長、短波長の各データＡが画像メモリ４
に格納される。

【００１８】次に、観察者は、ステップ３０４で、長波
長検出用ディテクタ１８側の吸収フィルタ１７を取り除
き、これに代わって、短波長検出用ディテクタ１６側に
あった吸収フィルタ１５をセットする。

【００１９】そして、ステップ３０５で、上述したと同
様にしてコントローラ１から蛍光検出部３に蛍光検出開
始信号が出力されると、長波長検出用のディテクタ１８
でデータ化された長波長のみの画像データが、長波長側
への短波長の漏れ蛍光の画像データとして取り込まれ
る。そして、コントローラ１の指示により、ステップ３
０６で、データＢとして画像メモリ４に格納される。こ
の場合の画像メモリ４への画像データの格納は、上述し
たステップ３０３で得られた長波長、短波長の各画像デ
ータの格納場所とは異なる領域に設定される。

【００２０】次いで、ステップ３０７に進み、コントロ
ーラ１は、ステップ３０６で得られた長波長側への短波
長の漏れ蛍光のデータＢをステップ３０３で得られたデ
ータＡから差し引き、その結果を長波長側の補正された
画像データとして画像メモリ４に格納するとともに、ス
テップ３０８で、長波長、短波長の各画像データを画像
モニタ５に表示するようになる。

【００２１】従って、このようにすれば、レーザ光によ
って励起された標本１３からの蛍光をダイクロイックミ
ラー１４を通して長波長と短波長のものとに分離し、そ
れぞれ吸収フィルタ１５、１７を通して短波長および長
波長検出用のディテクタ１６、１８によりデータとして
検出するようになっていて、前記短波長および長波長検
出用のディテクタ１６、１８のそれぞれの検出光路中に
吸収フィルタ１５、１７を配置して検出された長波長お
よび短波長にかかる蛍光データを画像メモリ４に記憶
し、また、前記長波長検出用のディテクタ１８側に前記
短波長検出に用いた吸収フィルタ１５を配して検出され
た長波長側での短波長の漏れ蛍光データを画像メモリ４
に記憶し、先に画像メモリ４に記憶された蛍光データと
このデータとの差分を求め、その結果を長波長側の補正
された画像データとして画像メモリ４に格納するととも
に、長波長、短波長の各画像データを画像モニタ５に表
示するようにしたので、長波長側に漏れる短波長の蛍光
分を取り除いた、純粋な長波長側の蛍光データを得るこ
とができ、これにより精度の高い蛍光観察を実現できる
ことになる。 （第２実施例）図４は、吸収フィルタ１５、１７の切り
換え構成の具体例を示したもので、この場合、ダイクロ
イックミラー１４と短波長検出用のディテクタ１６との
間にフィルタ用スライダ１９を配置するとともに、ダイ
クロイックミラー１４と長波長検出用のディテクタ１８
との間にもフィルタ用スライダ２０を配置している。

【００２２】これらフィルタ用スライダ１９、２０は、
吸収フィルタ１５、１７をそれぞれ収容できる構成にな
っていて、これら吸収フィルタ１５、１７を選択的に検
出光路から出し入れできるようにしている。

【００２３】しかして、このような構成では、まず、図
示するようにフィルタ用スライダ１９に吸収フィルタ１
５、フィルタ用スライダ２０に吸収フィルタ１７をそれ
ぞれセットし、この状態で、長波長、短波長の各データ
を取り込みを行い、次に、フィルタ用スライダ２０の吸
収フィルタ１７を取り外し、フィルタ用スライダ１９の
吸収フィルタ１５をフィルタ用スライダ２０側に入れ替
えて、長波長側への短波長の漏れ蛍光の画像データを取
り込むことにより、上述したと同様に長波長側の補正さ
れた画像データが得られることになる。

【００２４】なお、図４では、短波長検出用の吸収フィ
ルタ１５を、フィルタ用スライダ１９から引き出し、そ
れをフィルタ用スライダ２０に入れるようにしたが、吸
収フィルタ１５をもう１枚用意しておき、それを使用す
ることで短波長の漏れ蛍光を検出することもできる。

【００２５】従って、このようにすれば、フィルタ用ス
ライダ１９、２０を採用することで、吸収フィルタ１
５、１７の出し入れを簡単に行うことができるので、蛍
光観察のための操作を簡単にできる。 （第３実施例）図５（ａ）（ｂ）は、吸収フィルタ１
５、１７の切り換え構成の他の具体例を示したもので、
この場合、ダイクロイックミラー１４の反射光路にミラ
ー２１を配置して、短波長検出用ディテクタ１６の検出
光路を直角に折り曲げて、長波長検出用ディテクタ１８
の検出光路に対して並行する検出光路を形成している。

【００２６】そして、これら短波長検出用ディテクタ１
６および長波長検出用ディテクタ１８のそれぞれの検出
光路中に吸収フィルタ付きターレット２２、２３を配置
している。

【００２７】これら吸収フィルタ付きターレット２２、
２３は、それぞれ同図（ｂ）に示すように吸収フィルタ
１５、１７を各別に設けており、ターレット２２、２３
を回転させることで、それぞれの吸収フィルタ１５、１
７を各検出光路から出し入れできるようにしている。

【００２８】しかして、このような構成では、まず、タ
ーレット２２、２３を回転操作して短波長検出用ディテ
クタ１６および長波長検出用ディテクタ１８のそれぞれ
の検出光路中に吸収フィルタ１５、１７を各別にセット
して、長波長、短波長の各データの取り込みを行い、次
に、ターレット２２、２３を再び回転操作して長波長検
出用ディテクタ１８の検出光路中の吸収フィルタ１７を
除去するとともに、吸収フィルタ１５を長波長検出用デ
ィテクタ１８の検出光路中にセットして、長波長側への
短波長の漏れ蛍光の画像データを取り込むことにより、
上述したと同様に長波長側の補正された画像データが得
られることになる。

【００２９】従って、このようにすれば、吸収フィルタ
付きターレット２２、２３を採用することで、吸収フィ
ルタ１５、１７の出し入れを簡単に行うことができるの
で、この場合も、蛍光観察のための操作を簡単にでき
る。

【００３０】なお、上述した各実施例での吸収フィルタ
１５、１７の出し入れ操作は、原則として観察者が手動
操作により行うようにしたが、例えば、第３実施例の吸
収フィルタ付きターレット２２、２３を採用したもので
は、コントローラ１の指示に基づいて、これらターレッ
ト２２、２３の上述した回転操作をコントロールするよ
うにすれば、長波長側の補正された画像データを全自動
により得られるようになる。

【００３１】また、上述した各実施例では、まず、短波
長検出用ディテクタ１６および長波長検出用ディテクタ
１８のそれぞれの検出光路中に吸収フィルタ１５、１７
をセットして長波長、短波長の各データを取り込み、次
いで長波長検出用ディテクタ１８の検出光路中の吸収フ
ィルタ１７を除去し吸収フィルタ１５を同長波長検出用
ディテクタ１８の検出光路中にセットして、長波長側へ
の短波長の漏れ蛍光の画像データを取り込むような動作
を交互に実行するようにしているが、例えば、ステージ
を移動させ、連続して長波長側の補正を行いながら画像
データの取り込みを繰り返すような場合は、まず、上述
した順序で、１枚目の画像データを取り込み、次いで、
ステージの移動を行って、２枚目のデータの取り込みで
は、吸収フィルタの設定状態をそのままにして、まず長
波長側への短波長の漏れ蛍光の画像データを取り込み、
次に、吸収フィルタ１５、１７を通常の短波長検出用デ
ィテクタ１６および長波長検出用ディテクタ１８のそれ
ぞれの検出光路中に戻して、長波長、短波長の各画像デ
ータを取り込むことにより、長波長側の補正された画像
データを得るようにし、このような動作を繰り返すこと
で、設定された枚数分の画像取り込みを行うことができ
る。

【００３２】このようにすれば、連続して複数枚の画像
データを取り込みを行うような場合、効率のよい蛍光観
察を実現することができる。以上、実施例に基づいて説
明したが、本発明中には以下の発明が含まれる。

【００３３】（１）レーザ光によって励起された蛍光を
ダイクロイックミラーを通して長波長と短波長のものと
に分離するとともに、それぞれ吸収フィルタを通してデ
ータとして検出する蛍光観察方法において、短波長検出
側および長波長検出側にそれぞれ吸収フィルタを配して
前記長波長および短波長にかかる蛍光データを検出し、
前記長波長検出側に前記短波長検出に用いた吸収フィル
タを配して長波長側での短波長の漏れ蛍光データを検出
し、これら検出された蛍光データの差分から長波長側の
補正されたデータを得ることを特徴とする蛍光観察方
法。

【００３４】このようにすれば、短波長検出側および長
波長検出側にそれぞれ吸収フィルタを配して検出される
前記長波長および短波長にかかる蛍光データと、前記長
波長検出側に前記短波長検出に用いた吸収フィルタを配
して検出される長波長側での短波長の漏れ蛍光データと
の差分を求めるようになるので、長波長側に漏れる短波
長の蛍光分を取り除いた、純粋な長波長側の蛍光データ
を得ることができ、精度の高い蛍光観察を実現できる。

【００３５】（２）レーザ光によって励起された蛍光を
ダイクロイックミラーを通して長波長と短波長のものと
に分離するとともに、それぞれ吸収フィルタを通して長
波長および短波長ディテクタによりデータとして検出す
る蛍光観察装置において、前記長波長および短波長ディ
テクタのそれぞれの検出光路中に吸収フィルタを配置し
て検出された前記長波長および短波長にかかる蛍光デー
タを記憶する第１の記憶手段と、前記長波長ディテクタ
側に前記短波長検出に用いた吸収フィルタを配して検出
された長波長側での短波長の漏れ蛍光データを記憶する
第２の記憶手段と、これら第１および第２の記憶手段に
記憶された蛍光データの差分から長波長側の補正された
データを出力する制御手段とを具備したことを特徴とす
る蛍光観察装置。

【００３６】このようにすれば、長波長および短波長デ
ィテクタのそれぞれの検出光路中に吸収フィルタを配置
して検出された前記長波長および短波長にかかる蛍光デ
ータと、前記長波長ディテクタ側に前記短波長検出に用
いた吸収フィルタを配して検出された長波長側での短波
長の漏れ蛍光データをそれぞれ記憶手段に記憶し、これ
ら記憶された蛍光データの差分から長波長側の補正され
たデータを求めるようになるので、この場合も長波長側
に漏れる短波長の蛍光分を取り除いた、純粋な長波長側
の蛍光データを得ることができ、精度の高い蛍光観察を
実現できる。

【００３７】（３）（２）記載の蛍光観察装置におい
て、前記吸収フィルタは、前記長波長および短波長ディ
テクタのそれぞれの検出光路中に出し入れ自在に設けら
れている。

【００３８】このようにすれば、吸収フィルタは、長波
長および短波長ディテクタのそれぞれの検出光路中に出
し入れ自在に設けられるようになるので、蛍光観察のた
めの操作を簡単にできる。

【００３９】

【発明の効果】以上述べたように、本発明によれば、長
波長側に漏れる短波長の蛍光分を取り除いた、純粋な長
波長側の蛍光データを得ることができ、これにより精度
の高い蛍光観察を実現できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の第１実施例の概略構成を示す図。

【図２】蛍光検出部の概略構成を示す図。

【図３】第１実施例の動作を説明するためのフローチャ
ート。

【図４】本発明の第２実施例の吸収フィルタの切り換え
構成を示す図。

【図５】本発明の第３実施例の吸収フィルタの切り換え
構成を示す図。

【符号の説明】

１…コントローラ、 ２…操作パネル、 ３…蛍光検出部、 ４…画像メモリ、 ５…画像モニタ、 １０…レーザー発振器、 １１…励起光選択フィルタ、 １２…ダイクロイックミラー、 １３…標本、 １４…ダイクロイックミラー、 １５…吸収フィルタ、 １６…短波長検出用のディテクタ、 １７…吸収フィルタ、 １８…長波長検出用のディテクタ、 １９、２０…フィルタ用スライダ、 ２１…ミラー、 ２２、２３…吸収フィルタ付きターレット。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 レーザ光によって励起された蛍光をダイ
   クロイックミラーを通して長波長と短波長のものとに分
   離するとともに、それぞれ吸収フィルタを通してデータ
   として検出する蛍光観察方法において、 短波長検出側および長波長検出側にそれぞれ吸収フィル
   タを配して前記長波長および短波長にかかる蛍光データ
   を検出し、 前記長波長検出側に前記短波長検出に用いた吸収フィル
   タを配して長波長側での短波長の漏れ蛍光データを検出
   し、 これら検出された蛍光データの差分から長波長側の補正
   されたデータを得ることを特徴とする蛍光観察方法。
2. 【請求項２】 レーザ光によって励起された蛍光をダイ
   クロイックミラーを通して長波長と短波長のものとに分
   離するとともに、それぞれ吸収フィルタを通して長波長
   および短波長ディテクタによりデータとして検出する蛍
   光観察装置において、 前記長波長および短波長ディテクタのそれぞれの検出光
   路中に吸収フィルタを配置して検出された前記長波長お
   よび短波長にかかる蛍光データを記憶する第１の記憶手
   段と、 前記長波長ディテクタ側に前記短波長検出に用いた吸収
   フィルタを配して検出された長波長側での短波長の漏れ
   蛍光データを記憶する第２の記憶手段と、 これら第１および第２の記憶手段に記憶された蛍光デー
   タの差分から長波長側の補正されたデータを出力する制
   御手段とを具備したことを特徴とする蛍光観察装置。
3. 【請求項３】 前記吸収フィルタは、前記長波長および
   短波長ディテクタのそれぞれの検出光路中に出し入れ自
   在に設けられることを特徴とする請求項２記載の蛍光観
   察装置。