JPH08320314A - アスコルビン酸の影響を受けない、過酸化水素の検出方法 - Google Patents

アスコルビン酸の影響を受けない、過酸化水素の検出方法

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JPH08320314A
JPH08320314A JP8125369A JP12536996A JPH08320314A JP H08320314 A JPH08320314 A JP H08320314A JP 8125369 A JP8125369 A JP 8125369A JP 12536996 A JP12536996 A JP 12536996A JP H08320314 A JPH08320314 A JP H08320314A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 アスコルビン酸の影響を最小限に抑えて、生
体液中の過酸化水素を検出する方法の提供。 【解決手段】 酸化還元指示薬と、鉄と配位結合したク
レアチニンやグアニジンである遷移金属錯体とを用いる
工程を含む、過酸化水素を検出する方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、指示薬、および鉄
と配位結合したクレアチニン、または鉄と配位結合した
グアニジンのいずれかである遷移金属錯体に生体液もし
くは水溶液を接触させることによって、生体液または水
溶液中の過酸化水素の濃度を比色分析的に測定する新規
な方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】血液、血清および尿のような生体液中の
過酸化水素の検出は、様々な異常の診断に役立つ。過酸
化水素は、分析対象物と酵素との数多くの反応の副生物
として生成される。生体液中の過酸化水素の検出のため
の試験は、電子を指示薬に伝達して偽陰性の結果を生じ
得る強力な還元剤である、アスコルビン酸塩の存在によ
って複雑化される。指示薬の試薬組成物中に、ある種の
金属イオン錯体、例えばＦｅ−ＨＥＤＴＡを含ませるこ
とは、アスコルビン酸塩の干渉を本質的に排除するが、
これらの金属イオン錯体は、それ自体、過酸化物と酸化
可能な染料との呈色反応を触媒することができ、該反応
が、ある状況下では、金属イオン錯体が介在する染料の
追加的な酸化のために、偽陽性の、または誤って高い検
定結果を生じることがある。
【０００３】鉄を除く様々な遷移金属のクレアチニン錯
体の発見を引用している文献が存在する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、生体
液中の過酸化水素を検出する方法を提供することにあ
る。更に、本発明は、分析対象物を化合物と反応させて
過酸化水素を生成することによって、この分析対象物を
検出する方法を提供する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、（ａ）過酸化
水素を含む疑いがある溶液に、遷移金属錯体および酸化
還元指示薬を加える工程、（ｂ）色変化を測定して過酸
化水素の存在または濃度を検知する工程を含む、過酸化
水素を検出する方法に関する。遷移金属錯体は、鉄と配
位結合したクレアチニン、または鉄と配位結合したグア
ニジンである。鉄と配位結合したクレアチニンは、式
（Ｉ）：
【０００６】
【化３】
【０００７】（式中、ＸおよびＹは、独立に、クレアチ
ニン、塩化物イオン、フッ化物イオン、臭化物イオン、
ヨウ化物イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、過塩素酸
イオン、硝酸イオン、シュウ酸イオン、硫化物イオン、
アンモニウム、グルコン酸イオン、シアン化物イオン、
チオシアン酸イオン、カテコール、トロポロン、フェノ
ール、ピリジン、ならびに酢酸イオン、クエン酸イオ
ン、酒石酸イオン、マロン酸、ホウ酸、コハク酸、グリ
セロール−２−リン酸イオン、サリチル酸、シュウ酸お
よびリンゴ酸のような緩衝剤よりなる群から選ばれる）
で示される構造を有する。
【０００８】鉄に配位結合させたグアニジンは、式（I
I）：
【０００９】
【化４】
【００１０】（式中、ＸおよびＹは、独立に、上記の鉄
クレアチニン錯体についてのものと同じ群から選ばれ、
Ｒ1 およびＲ2 の少なくとも一方は、アルキルおよびア
リール基よりなる群から選ばれ、各々相互に独立したも
のである。Ｒ1 およびＲ2 の基の例は、Ｃn Ｈ2n+1（こ
こで、ｎは１〜２０、好ましくは１〜１２の整数であ
る）のようなアルキル基、ＯＣ2 Ｈ4 （ＯＣ2 Ｈ4 ）
n-2 ＯＣＨ2 ＣＨ3 （ｎは前記の通りである）、または
Ｃ5 Ｈ4 Ｚ、Ｃ4 Ｈ3 ＺおよびＣ11Ｈ6 Ｚ（ここで、Ｚ
はＯ、Ｓ、ＮもしくはＣＨである）のようなアリール基
である。このアリール基としては、例えばフェニル（Ｚ
＝ＣＨ）、ピリジル（Ｚ＝Ｎ）、フリル（Ｚ＝Ｏ）、チ
エニル（Ｚ＝Ｓ）、アセナフチル（Ｚ＝ＣＨ）等が挙げ
られる。）で示される構造を有する。
【００１１】場合により、Ｒ1 およびＲ2 は、アルコー
ル（−ＯＨ）、アミン（−ＮＨ2 ）、カルボニル（−Ｃ
＝Ｏ）、スルホン酸（−ＳＯ3 Ｈ）、カルボン酸（−Ｃ
Ｏ2Ｈ）、フッ素（−Ｆ）、塩素（−Ｃｌ）、臭素（−
Ｂｒ）、ヨウ素（−Ｉ）、ホスホン酸〔−Ｐ（Ｏ）（Ｏ
Ｈ）2 〕およびリン酸〔−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）2 〕のよ
うな水溶性を高める１個以上の官能基で置換されていて
もよい。特に好適な鉄クレアチニン錯体は、ＸおよびＹ
がともに塩化物イオンであるか、またはＸおよびＹがと
もに酢酸イオンであるそれらである。特に好適な鉄グア
ニジン錯体は、ＸおよびＹがともに硫酸イオン（−ＳＯ
4 ）であるか、またはＸおよびＹがともに酢酸イオンで
あり、そして／あるいはＲ1 がＨであって、Ｒ2 がスル
ホン酸置換アルキル基（−ＣＨ2 ＣＨ2 −ＳＯ3 Ｈ）で
あるか、Ｒ1 がＨであって、Ｒ2がアミン−およびカル
ボン酸−置換アルキル基〔−（ＣＨ2 ）3 ＣＨ（ＮＨ
2 ）ＣＯ2 Ｈ〕（アルギニン）であるか、またはＲ1 が
Ｈであって、Ｒ2 がカルボン酸置換アリール基〔−Ｃ6
Ｈ3 （ＣＯ2 Ｈ）2 〕であるそれらである。
【００１２】過酸化水素を含有する溶液は、生体液また
は水溶液であってよい。酸化還元指示薬および遷移金属
錯体は、それらが適用された試験片を用いて溶液に導入
してよい。
【００１３】鉄クレアチニンおよび鉄グアニジン錯体の
ペルオキシダーゼ活性やアスコルビン酸オキシダーゼ活
性は、以前は未知であった。本開示は、アスコルビン酸
イオンのデヒドロアスコルビン酸イオンへの酸化によっ
てアスコルビン酸干渉を除去するための、鉄錯体の用途
を初めて記載するものである。
【００１４】過酸化水素は、酵素の存在下で起こる数多
くの反応によって生成される。それは、例えば下記で示
される。 過酸化水素の存在または濃度の決定は、生体液中の基質
の存在または濃度を決定する一つの方法である。
【００１５】表１は、基質および酵素、ならびにそれら
が生成する生成物の例を列挙しているが、本発明の方法
はここに列記のものに限定して適用されるものではな
い。
【００１６】
【表１】
【００１７】過酸化水素の検出は、過酸化水素とペルオ
キシダーゼと酸化還元指示薬との反応によって実施する
ことが多い： Ｈ2 Ｏ2 ＋ペルオキシダーゼ＋指示薬 −−−−−＞ 色彩
【００１８】例えば、グルコース活性は、グルコースオ
キシダーゼという酵素の存在下でグルコースを反応させ
て、過酸化水素を生成することによって測定され得る。
その後、過酸化水素はペルオキシダーゼと反応して指示
薬の酸化を触媒、過酸化水素の濃度に正比例する比色分
析の応答を生じる。しかしながら、生体液中の過酸化水
素を検出する試験は、電子を指示薬に伝達して偽陰性の
結果を生じ得る、強力な還元剤であるアスコルビン酸イ
オンの存在によって複雑化される。本発明の遷移金属錯
体は、過酸化水素と反応して、過酸化水素の存在下での
み指示薬の酸化を触媒するにすぎない。アスコルビン酸
イオンは、本発明の遷移金属錯体を用いて実施される過
酸化水素の検出には全く干渉を生じない。 Ｈ2 Ｏ2 ＋遷移金属錯体＋指示薬 −−−−−＞ 色彩
【００１９】酸化還元指示薬（「レドックス」指示薬）
は、還元形態では酸化形態とは異なる色彩を有し、可逆
的に酸化でき、また還元できる物質である。本発明の遷
移金属錯体とともに用い得る酸化還元指示薬の例は、ベ
ンジジン、ｏ−トリジン、アルキル基が１〜６個の炭素
原子を有する３，３’，５，５’−テトラアルキルベン
ジジン（例えば３，３’，５，５’−テトラメチルベン
ジジン（「ＴＭＢ」））、ｏ−ジアニシジン、２，７−
ジアミノフルオレン、ビス−（Ｎ−エチルキノリン−２
−オン）アジン、（Ｎ−メチルベンゾチアゾール−２−
オン）−（１−エチル−３−フェニル−５−メチルトリ
アゾール−２−オン）アジン、２，２’−アジノビス
（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、４
−アミノアンチピリン、ヨウ化カリウム、またはそれら
の組合せである。
【００２０】検査試料のpHは、好ましくは約３〜約９の
範囲、より好ましくは約４．５〜約８．２の範囲内であ
る。過酸化水素は、過酸化水素の濃度が約０．１〜約１
００mM（mM）、好ましくは約１〜約２０mMの範囲内であ
る検査試料中で検出され得る。
【００２１】
【実施例】本方法が新規であることおよび実用的な過酸
化水素の検出法であることを立証するために、下記の実
施例およびデータを列挙する。実施例１および２は、過
酸化水素の検出のための乾燥試薬の例である。実施例３
は、グルコースとグルコースオキシダーゼとの反応によ
り生成する過酸化水素の検出を介してグルコースを検出
する乾燥試薬の例である。実施例４は、様々な遷移金属
錯体のペルオキシダーゼ活性の試験を示す。
【００２２】実施例１：過酸化水素の検出のための試薬 試薬紙を２種類の浸漬液の成分で順次含浸し、浸漬の間
に乾燥することによって、乾燥試薬紙を作成した。次い
で、試薬紙を６０℃で約７分間乾燥した。用いた紙担体
は、Whatman ３ＭＭであった。浸液１は、鉄クレアチニ
ンおよび緩衝剤を含有し、クレアチニン４．５２ｇ（グ
ラム）、塩化第二鉄六水和物２．７０ｇおよびマロン酸
２．０ｇに水１００ml（ミリリットル）を加え、混合物
を一晩攪拌することによって調製した。次いで、１規定
ＮａＯＨを用いて溶液をpH４．６に調整した。最終濃度
は、塩化第二鉄１００mM、クレアチニン４００mMおよび
マロン酸２５０mMであった。浸液２は、アセトニトリル
中にレドックス指示薬の３，３’，５，５’−テトラメ
チルベンジジン（「ＴＭＢ」）を８０mMの濃度で含有す
るものであった。
【００２３】試薬片は、上記の浸液処理した紙で作成し
た。次いで、様々なレベルの過酸化水素を含有する尿に
試験片を浸漬し、６６０nm（ナノメートル）での反射率
を、浸漬の１分後にAdvanced Research Rapid Scanner
という計器で測定した。反射率の値を、試薬の反応性を
算出するために測定した。異なる比重、すなわち１．０
０５、１．０１５および１．０２３ｇ／mlの３様の尿プ
ールを用いて、試薬の反応性を決定した。
【００２４】試薬の色彩は、過酸化水素の濃度に正比例
する。図１は、過酸化水素の濃度と、鉄クレアチニン試
薬で得られたＫ／Ｓ値との間に観察された線形の用量応
答を示す。Ｋ／Ｓは、反射率から、指示薬による吸光度
に比例する単位への換算であって、等式Ｋ／Ｓ＝（１−
Ｒ）2 ／２Ｒ〔Ｒは６６０nmでの反射率（１分後）〕に
従って算出した。
【００２５】表２は、３．０mg／dl（ミリグラム／デシ
リットル）の過酸化水素（０．８８mM）に対する試薬反
応性は、３種類の尿プールのすべてで明確に整合したこ
とを示している。アスコルビン酸イオンの酸化が多少起
きていたが、１００mg／dlのアスコルビン酸の存在下
で、３．０mg／dlの過酸化水素に対して本試薬は反応性
であり続けた。
【００２６】
【表２】
【００２７】表３のデータは、鉄クレアチニンに代えて
セイヨウワサビのペルオキシダーゼを用いて作成したも
のであり、本発明に係る試薬とは鮮明に対比される。
【００２８】
【表３】
【００２９】ペルオキシダーゼの試薬は、１００mg／dl
のアスコルビン酸の存在下で、３．０mg／dlの過酸化水
素に対して、完全に非反応性であった。鉄クレアチニン
試薬の反応性は、pHの低下、および鉄に対するクレアチ
ニンの比率の増大とともに上昇した。尿中リン酸イオン
からの干渉がより少ないことから、４：１の配位子比
（クレアチニン：鉄）を選び、それによって、より整合
的な結果をすべての尿で与えた。４．５という試薬のpH
を選んだが、それは、１００mg／dlのグルコースとグル
コースオキシダーゼとの反応から予測される過酸化水素
の大まかな量である、３．０mg／dlの過酸化水素に対し
て適切な反応性を与えるからである。マロン酸は、pHを
制御するための緩衝剤として働き、クエン酸、酒石酸、
ホウ酸、コハク酸、グリセロール−２−リン酸、サリチ
ル酸、シュウ酸およびリンゴ酸のような他の緩衝剤と置
き換えることができる。
【００３０】実施例２ グアニジンの鉄キレートでも過酸化水素の反応性を観察
した。実施例１のとおりに実施した試験によって、反応
性を決定したが、４００mMクレアチニンに代えて、４０
０mMグアニジンを浸液１に用いた。尿素の比重は１．０
１５ｇ／mlであった。結果を表４に示す。
【００３１】
【表４】
【００３２】実施例３：グルコース検出のための試薬 実施例１のとおりに乾燥試薬紙を調製した。第一および
第二の浸液を実施例１のとおりに調製したが、第一の浸
液には５００単位／mlのグルコースオキシダーゼも加え
てから、pHを調整した。
【００３３】様々なレベルのグルコースを含有する尿に
試験片を浸漬し、１分後に得られた６６０nmでの反射率
を、試薬の反応性を算出するために測定した。
【００３４】試薬の色彩は、グルコースの濃度に正比例
する。１００mg／dlのグルコースまでの試薬反応性は、
３種類の尿プールのすべてで明確に整合した（表５）。
アスコルビン酸イオンの酸化が多少起きていたが、１０
０mg／dlのアスコルビン酸の存在下で、１００mg／dlの
グルコースに対して本試薬は反応性であり続けた。
【００３５】
【表５】
【００３６】実施例４：様々な鉄錯体を用いた過酸化水
素検出のための試薬 pH５．８で３．１mMの金属キレート、４４mMのマロン
酸、１４mMのジイソプロピル＝ジヒドロペルオキシドお
よび１１．６mMのＴＭＢを含有する３部の水対２部のア
セトニトリルの溶液について、レドックス指示薬である
ＴＭＢの酸化率を測定することによって、pH５．８での
ペルオキシダーゼ活性について様々な遷移金属錯体を試
験した。表６に示した結果は、ポリＬ−アルギニンおよ
びクレアチニンとの鉄（Ｆｅ2+およびＦｅ3+）錯体が最
も活性であることを示している。銅は、多少の反応性を
示すものの、はるかに低い程度に（１／１０）である。
これらの条件下では、ペルオキシダーゼ活性を示した金
属は、（与えられたリストでは）他には皆無であった。
結果を表６に示した。
【００３７】
【表６】
【００３８】表６に用いた略号に対する完全な化学名
は、ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸、ＨＥＤＴＡ：
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢
酸、ＤＴＰＡ：ジエチレントリアミン五酢酸、ＥＧＴ
Ａ：エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテ
ル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸、およびＣＤＴＡ：
１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’
−四酢酸である。
【図面の簡単な説明】
本発明の利点は、上記の詳細な説明を読み、添付の図面
を参照すれば明らかになるものと思われる。
【図１】過酸化水素の用量応答を示すグラフである。

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 溶液中の過酸化水素を検出する方法であ
    って、 （ａ）酸化還元指示薬、および式（Ｉ）： 【化１】 （式中、ＸおよびＹは、独立に、クレアチニン、塩化物
    イオン、フッ化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオ
    ン、硫酸イオン、リン酸イオン、過塩素酸イオン、硝酸
    イオン、シュウ酸イオン、硫化物イオン、アンモニウ
    ム、グルコン酸イオン、シアン化物イオン、チオシアン
    酸イオン、カテコール、トロポロン、フェノール、ピリ
    ジン、酢酸イオン、クエン酸イオン、酒石酸、マロン
    酸、ホウ酸、コハク酸、グリセロール−２−リン酸イオ
    ン、サリチル酸、シュウ酸およびリンゴ酸よりなる群か
    ら選ばれる）で示される構造を有する遷移金属錯体を該
    溶液に加える工程；ならびに （ｂ）色変化を測定して、過酸化水素の存在または濃度
    を検知する工程を含む方法。
  2. 【請求項２】 ＸおよびＹが塩化物イオンである、請求
    項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 ＸおよびＹが酢酸イオンである、請求項
    １記載の方法。
  4. 【請求項４】 酸化還元指示薬が、ベンジジン、ｏ−ト
    リジン、炭素原子数１〜６のアルキル基を有する３，
    ３’，５，５’−テトラアルキルベンジジン、ｏ−ジア
    ニシジン、２，７−ジアミノフルオレン、ビス−（Ｎ−
    エチルキノリン−２−オン）アジン、（Ｎ−メチルベン
    ゾチアゾール−２−オン）−（１−エチル−３−フェニ
    ル−５−メチルトリアゾール−２−オン）アジン、２，
    ２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−
    スルホン酸）、４−アミノアンチピリン、ヨウ化カリウ
    ム、およびそれらの組合せよりなる群から選ばれる、請
    求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 酸化還元指示薬が３，３’，５，５’−
    テトラメチルベンジジンである、請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】 該溶液が生体液または水溶液である、請
    求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 該溶液がアスコルビン酸イオンをも含有
    する、請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 過酸化水素の濃度が約０．１〜約１００
    mMの範囲内にある、請求項１記載の方法。
  9. 【請求項９】 過酸化水素の濃度が約１〜約５０mMの範
    囲内にある、請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 酸化還元指示薬および遷移金属錯体
    を、それらが適用された試験片を用いて該溶液に加え
    る、請求項１記載の方法。
  11. 【請求項１１】 溶液中の過酸化水素を検出する方法で
    あって、 （ａ）酸化還元指示薬、および式（II）： 【化２】 （式中、ＸおよびＹは、独立に、クレアチニン、塩化物
    イオン、フッ化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオ
    ン、硫酸イオン、リン酸イオン、過塩素酸イオン、硝酸
    イオン、シュウ酸イオン、硫化物イオン、アンモニウ
    ム、グルコン酸イオン、シアン化物イオン、チオシアン
    酸イオン、カテコール、トロポロン、フェノール、ピリ
    ジン、酢酸イオン、クエン酸イオン、酒石酸、マロン
    酸、ホウ酸、コハク酸、グリセロール−２−リン酸イオ
    ン、サリチル酸、シュウ酸およびリンゴ酸よりなる群か
    ら選ばれ、Ｒ1 およびＲ2 の少なくとも一方は、独立
    に、Ｃn Ｈ2n+1、（ＯＣ2 Ｈ4 ）n Ｈ、Ｃ5 Ｈ4 Ｚ、Ｃ
    4 Ｈ3 ＺおよびＣ11Ｈ6 Ｚ（ここで、ｎは１〜２０の整
    数であり、ＺはＯ、Ｓ、ＮまたはＣＨである）よりなる
    群から選ばれる）で示される構造を有する遷移金属錯体
    を該溶液に加える工程；ならびに （ｂ）色変化を測定して、過酸化水素の存在または濃度
    を検知する工程を含む方法。
  12. 【請求項１２】 ＸおよびＹが硫酸イオンである、請求
    項１１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 ＸおよびＹが酢酸イオンである、請求
    項１１記載の方法。
  14. 【請求項１４】 ｎが１〜１２の整数である、請求項１
    １記載の方法。
  15. 【請求項１５】 Ｒ1 およびＲ2 の少なくとも一方が、
    ヒドロキシル、アミノ、カルボニル、スルホ、カルボキ
    シル、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ホスホン酸
    基およびリン酸基よりなる群から選ばれる少なくとも１
    個の官能基で置換されている、請求項１１記載の方法。
  16. 【請求項１６】 Ｒ1 がＨであり、Ｒ2 がＣＨ2 ＣＨ2
    −ＳＯ3 Ｈである、請求項１５記載の方法。
  17. 【請求項１７】 Ｒ1 がＨであり、Ｒ2 がＣ6 Ｈ3 （Ｃ
    Ｏ2 Ｈ）2 である、請求項１５記載の方法。
  18. 【請求項１８】 Ｒ1 がＨであり、Ｒ2 が（ＣＨ2 ）3
    ＣＨ（ＮＨ2 ）ＣＯ2 Ｈである、請求項１５記載の方
    法。
  19. 【請求項１９】 酸化還元指示薬が、ベンジジン、ｏ−
    トリジン、炭素原子数１〜６のアルキル基を有する３，
    ３’，５，５’−テトラアルキルベンジジン、ｏ−ジア
    ニシジン、２，７−ジアミノフルオレン、ビス−（Ｎ−
    エチルキノリン−２−オン）アジン、（Ｎ−メチルベン
    ゾチアゾール−２−オン）−（１−エチル−３−フェニ
    ル−５−メチルトリアゾール−２−オン）アジン、２，
    ２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−
    スルホン酸）、４−アミノアンチピリン、ヨウ化カリウ
    ム、およびそれらの組合せよりなる群から選ばれる、請
    求項１１記載の方法。
  20. 【請求項２０】 酸化還元指示薬が３，３’，５，５’
    −テトラメチルベンジジンである、請求項１９記載の方
    法。
  21. 【請求項２１】 該溶液が生体液または水溶液である、
    請求項１１記載の方法。
  22. 【請求項２２】 該溶液がアスコルビン酸イオンをも含
    有する、請求項１１記載の方法。
  23. 【請求項２３】 過酸化水素の濃度が約０．１〜約１０
    ０mMの範囲内にある、請求項１１記載の方法。
  24. 【請求項２４】 過酸化水素の濃度が約１〜約５０mMの
    範囲内にある、請求項２３記載の方法。
  25. 【請求項２５】 酸化還元指示薬および遷移金属錯体
    を、それらが適用された試験片を用いて溶液に加える、
    請求項１１記載の方法。
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