JPH08322586A - 蛋白質の分泌生産方法 - Google Patents
蛋白質の分泌生産方法Info
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- JPH08322586A JPH08322586A JP8072166A JP7216696A JPH08322586A JP H08322586 A JPH08322586 A JP H08322586A JP 8072166 A JP8072166 A JP 8072166A JP 7216696 A JP7216696 A JP 7216696A JP H08322586 A JPH08322586 A JP H08322586A
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 これまで微生物において分泌生産が困難であ
った組換え蛋白質、とりわけ哺乳動物由来の組換え蛋白
質のペリプラズムへの効率よい分泌生産方法を提供す
る。 【解決手段】 グルタチオンレダクターゼを同一大腸菌
内で組換え蛋白質と同時に発現させることにより、組換
え蛋白質のペリプラズムへの分泌生産量を向上させる。
った組換え蛋白質、とりわけ哺乳動物由来の組換え蛋白
質のペリプラズムへの効率よい分泌生産方法を提供す
る。 【解決手段】 グルタチオンレダクターゼを同一大腸菌
内で組換え蛋白質と同時に発現させることにより、組換
え蛋白質のペリプラズムへの分泌生産量を向上させる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は蛋白質の生産方法に
関するものであり、さらに詳しくは大腸菌のペリプラズ
ムに蛋白質を分泌蓄積させるにおいて、分泌効率の高い
生産を可能ならしめる大腸菌形質転換株を用いた蛋白質
の分泌生産方法に関するものである。
関するものであり、さらに詳しくは大腸菌のペリプラズ
ムに蛋白質を分泌蓄積させるにおいて、分泌効率の高い
生産を可能ならしめる大腸菌形質転換株を用いた蛋白質
の分泌生産方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】近年、組換えＤＮＡ技術により、微生物
を宿主として有用蛋白質を生産することが可能になっ
た。主なものに菌体内生産方法、分泌生産方法が挙げら
れる。菌体内生産方法は細胞質内に目的蛋白質を生産蓄
積させる方法であり、高い生産量が得られることが知ら
れている。しかし、細胞質内に生産蓄積した蛋白質は天
然型アミノ酸配列のＮ−末端にメチオニンが付加した非
天然型であり、多量に生産された組換え蛋白質は通常イ
ンクルージョンボディーという不溶物となり、抽出操作
後に天然とは異なった高次構造を形成しやすい。そのた
め、菌体内生産方法においては蛋白質の高次構造を天然
型に変えるためのリフォールディングの工程が必要で、
このことは製造過程で繁雑な工程を付加する必要を意味
する。一方、分泌生産方法では、目的とする組換え蛋白
質はＮ−末端にシグナルペプチドが付加した融合蛋白質
（前駆体）として発現される。この融合蛋白質が細胞質
膜を透過する際に、シグナルペプチドは酵素的にプロセ
ッシングを受けて切断される。その結果、天然型蛋白質
が分泌される。分泌生産方法ではアミノ酸配列、高次構
造共に天然型の目的蛋白質を得ることが可能であり、菌
体内生産方法より優れている。しかし、分泌生産方法は
菌体内生産法に比べて膜透過及びプロセッシングの過程
が余分に必要なため、その生産量は低い。特に、哺乳類
由来の蛋白質を原核生物を使って分泌生産すると、原核
生物由来の蛋白質を分泌生産させた場合に比べ、その生
産効率が極めて低いことが知られ、より優れた分泌生産
方法が望まれていた。
を宿主として有用蛋白質を生産することが可能になっ
た。主なものに菌体内生産方法、分泌生産方法が挙げら
れる。菌体内生産方法は細胞質内に目的蛋白質を生産蓄
積させる方法であり、高い生産量が得られることが知ら
れている。しかし、細胞質内に生産蓄積した蛋白質は天
然型アミノ酸配列のＮ−末端にメチオニンが付加した非
天然型であり、多量に生産された組換え蛋白質は通常イ
ンクルージョンボディーという不溶物となり、抽出操作
後に天然とは異なった高次構造を形成しやすい。そのた
め、菌体内生産方法においては蛋白質の高次構造を天然
型に変えるためのリフォールディングの工程が必要で、
このことは製造過程で繁雑な工程を付加する必要を意味
する。一方、分泌生産方法では、目的とする組換え蛋白
質はＮ−末端にシグナルペプチドが付加した融合蛋白質
（前駆体）として発現される。この融合蛋白質が細胞質
膜を透過する際に、シグナルペプチドは酵素的にプロセ
ッシングを受けて切断される。その結果、天然型蛋白質
が分泌される。分泌生産方法ではアミノ酸配列、高次構
造共に天然型の目的蛋白質を得ることが可能であり、菌
体内生産方法より優れている。しかし、分泌生産方法は
菌体内生産法に比べて膜透過及びプロセッシングの過程
が余分に必要なため、その生産量は低い。特に、哺乳類
由来の蛋白質を原核生物を使って分泌生産すると、原核
生物由来の蛋白質を分泌生産させた場合に比べ、その生
産効率が極めて低いことが知られ、より優れた分泌生産
方法が望まれていた。
【０００３】近年、微生物の蛋白質分泌に関与する様々
な因子が明らかになり、それらを利用して蛋白質を効率
良く分泌生産する方法の構築を目指して研究が進められ
てきた。その一つにシグナルペプチドについての研究が
挙げられる。シグナルペプチドは分泌過程の初期におい
て重要な働きを持つことが知られている（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，ｐｐ．８１６４−８１６９，
１９９０）。微生物が蛋白質を分泌するには、前述のよ
うに細胞質内で合成された融合蛋白質が細胞質膜を透過
し、かつプロセッシングにより正しくシグナルペプチド
が切断されることが必要である。特開平６−２９６４９
１では、分子量約２２０００のヒト成長ホルモン（以
下、２２ＫｈＧＨ）を大腸菌のペリプラズム（細胞質膜
と外膜との間の間隙）に分泌させる際の好ましいシグナ
ルペプチドとしてアルカリフォスファタ−ゼまたはエン
テロトキシン由来のものを開示している。同時にその中
で、原核生物由来のシグナルペプチドを用いて幾つかの
真核性蛋白質を分泌させることを試みたところ、蛋白質
が合成されないものや細胞質内で蛋白質が発現しても分
泌されない例のあったことを報告している。このこと
は、分泌蛋白質の各々について適切なシグナルペプチド
を選択する必要があることを示している。今日まで、い
かなる蛋白質の分泌にも使用可能なシグナルペプチドは
見い出されてはいない。さらに、シグナルペプチドの配
列については、Ｎ−末端の正電荷領域のポジティブチャ
−ジと中央部疎水領域の疎水度が重要であることが近年
明らかになり（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，ｐ
ｐ．４８８２−４８８８，１９９２）、この知見に基づ
いた成功例が知られている。例えば、鵜高らはバチルス
・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）を宿主
とした用いた分泌生産において、バチルス・ブレビスの
ＭＷＰ（Ｍｉｄｄｌｅ Ｗａｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ）の
シグナルペプチドのＮ−末端正電荷領域に塩基性アミノ
酸（Ａｒｇ）を２残基挿入し、かつ中央部疎水性領域に
疎水性アミノ酸（Ｌｅｕ）を３残基挿入する改変を行
い、ヒト成長ホルモンの分泌効率を培地１Ｌあたり２０
０ｍｇまで向上させたことを報告している（特開平７−
５１０７２号公報）。しかし、このシグナルペプチドの
改変についても普遍的な指導原理は無く、試行錯誤によ
り好ましい配列を見い出さなければならないのが現状で
ある。また、シグナルペプチドは分泌蛋白質前駆体の細
胞質膜への移行に機能しているが、その次のステップで
ある分泌蛋白質が細胞質膜を横切って細胞質からペリプ
ラズムや培地中に輸送される過程には直接関与しない。
そのため、シグナルペプチドの改変は前駆体蛋白質の膜
への移行（局在化）効率を向上させることを期待できる
が、引き続く細胞質膜を横切って細胞質からペリプラズ
ムや培地中に輸送される過程、即ち膜透過のステップが
律速となっている場合にはほとんど効果が期待できな
い。つまり、分泌効率の改善にシグナルペプチドの改変
を使用することは細胞質膜への前駆体蛋白質のＮ末端部
分の移行には重要であるが、それ以後の過程に障害があ
る場合には改善効果を持たないことは良く知られてい
る。
な因子が明らかになり、それらを利用して蛋白質を効率
良く分泌生産する方法の構築を目指して研究が進められ
てきた。その一つにシグナルペプチドについての研究が
挙げられる。シグナルペプチドは分泌過程の初期におい
て重要な働きを持つことが知られている（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，ｐｐ．８１６４−８１６９，
１９９０）。微生物が蛋白質を分泌するには、前述のよ
うに細胞質内で合成された融合蛋白質が細胞質膜を透過
し、かつプロセッシングにより正しくシグナルペプチド
が切断されることが必要である。特開平６−２９６４９
１では、分子量約２２０００のヒト成長ホルモン（以
下、２２ＫｈＧＨ）を大腸菌のペリプラズム（細胞質膜
と外膜との間の間隙）に分泌させる際の好ましいシグナ
ルペプチドとしてアルカリフォスファタ−ゼまたはエン
テロトキシン由来のものを開示している。同時にその中
で、原核生物由来のシグナルペプチドを用いて幾つかの
真核性蛋白質を分泌させることを試みたところ、蛋白質
が合成されないものや細胞質内で蛋白質が発現しても分
泌されない例のあったことを報告している。このこと
は、分泌蛋白質の各々について適切なシグナルペプチド
を選択する必要があることを示している。今日まで、い
かなる蛋白質の分泌にも使用可能なシグナルペプチドは
見い出されてはいない。さらに、シグナルペプチドの配
列については、Ｎ−末端の正電荷領域のポジティブチャ
−ジと中央部疎水領域の疎水度が重要であることが近年
明らかになり（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，ｐ
ｐ．４８８２−４８８８，１９９２）、この知見に基づ
いた成功例が知られている。例えば、鵜高らはバチルス
・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）を宿主
とした用いた分泌生産において、バチルス・ブレビスの
ＭＷＰ（Ｍｉｄｄｌｅ Ｗａｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ）の
シグナルペプチドのＮ−末端正電荷領域に塩基性アミノ
酸（Ａｒｇ）を２残基挿入し、かつ中央部疎水性領域に
疎水性アミノ酸（Ｌｅｕ）を３残基挿入する改変を行
い、ヒト成長ホルモンの分泌効率を培地１Ｌあたり２０
０ｍｇまで向上させたことを報告している（特開平７−
５１０７２号公報）。しかし、このシグナルペプチドの
改変についても普遍的な指導原理は無く、試行錯誤によ
り好ましい配列を見い出さなければならないのが現状で
ある。また、シグナルペプチドは分泌蛋白質前駆体の細
胞質膜への移行に機能しているが、その次のステップで
ある分泌蛋白質が細胞質膜を横切って細胞質からペリプ
ラズムや培地中に輸送される過程には直接関与しない。
そのため、シグナルペプチドの改変は前駆体蛋白質の膜
への移行（局在化）効率を向上させることを期待できる
が、引き続く細胞質膜を横切って細胞質からペリプラズ
ムや培地中に輸送される過程、即ち膜透過のステップが
律速となっている場合にはほとんど効果が期待できな
い。つまり、分泌効率の改善にシグナルペプチドの改変
を使用することは細胞質膜への前駆体蛋白質のＮ末端部
分の移行には重要であるが、それ以後の過程に障害があ
る場合には改善効果を持たないことは良く知られてい
る。
【０００４】そこで、低い分泌効率の原因が細胞質膜を
横切って細胞質からペリプラズムや培地中に輸送される
過程にあると考えられる蛋白質の分泌生産の場合には、
シグナルペプチドの改変以外の改善法が必要となる。今
日、大腸菌の蛋白質分泌に関わる幾つかの蛋白質因子
（ＳｅｃＡ，ＳｅｃＢ，ＳｅｃＤ，ＳｅｃＥ，Ｓｅｃ
Ｆ，ＳｅｃＹ，ＳｅｃＧなど）の遺伝子が明らかにな
り、それぞれの分泌における機能が主にｉｎ ｖｉｔｒ
ｏで明らかになっている。しかし、その利用例はほとん
ど報告されていなかった。唯一、大腸菌のＳｅｃＹ／Ｅ
遺伝子の発現を増強することにより、インターロイキン
６（ＩＬ−６）の分泌生産能を向上させたことが最近報
告された（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，１２，ｐ
ｐ．１７８−１８０，１９９４）。これら分泌に関わる
蛋白質因子を用いた検討は、現在では実用までには至っ
ていない。このように異種蛋白質、特に哺乳類由来の蛋
白質を効率よく分泌生産することには様々な検討項目が
考えられるが、殊に分泌量の低い分泌蛋白質について
は、その分泌生産性を改善する普遍的方法はなく依然と
して多大な試行が必要である上に、その結果成功に至る
保証は何もない。
横切って細胞質からペリプラズムや培地中に輸送される
過程にあると考えられる蛋白質の分泌生産の場合には、
シグナルペプチドの改変以外の改善法が必要となる。今
日、大腸菌の蛋白質分泌に関わる幾つかの蛋白質因子
（ＳｅｃＡ，ＳｅｃＢ，ＳｅｃＤ，ＳｅｃＥ，Ｓｅｃ
Ｆ，ＳｅｃＹ，ＳｅｃＧなど）の遺伝子が明らかにな
り、それぞれの分泌における機能が主にｉｎ ｖｉｔｒ
ｏで明らかになっている。しかし、その利用例はほとん
ど報告されていなかった。唯一、大腸菌のＳｅｃＹ／Ｅ
遺伝子の発現を増強することにより、インターロイキン
６（ＩＬ−６）の分泌生産能を向上させたことが最近報
告された（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，１２，ｐ
ｐ．１７８−１８０，１９９４）。これら分泌に関わる
蛋白質因子を用いた検討は、現在では実用までには至っ
ていない。このように異種蛋白質、特に哺乳類由来の蛋
白質を効率よく分泌生産することには様々な検討項目が
考えられるが、殊に分泌量の低い分泌蛋白質について
は、その分泌生産性を改善する普遍的方法はなく依然と
して多大な試行が必要である上に、その結果成功に至る
保証は何もない。
【０００５】本発明者は大腸菌宿主を用いて哺乳類由来
の蛋白質を分泌させることを試みた。その中で、２２Ｋ
ｈＧＨは比較的よく分泌されたのに対し、分子量約２０
０００のヒト成長ホルモン（以下、２０ＫｈＧＨと略
す）は分泌生産量が極めて低かった。そこで、２０Ｋｈ
ＧＨの分泌生産性を改善するため、前述の既知の方法
（シグナルペプチドのアミノ酸配列の改変、Ｓｅｃ蛋白
質の発現）を用いて様々な検討を行なった。しかしなが
ら、いずれの検討においても効率よい分泌生産方法を見
い出すにはついに至らなかった。
の蛋白質を分泌させることを試みた。その中で、２２Ｋ
ｈＧＨは比較的よく分泌されたのに対し、分子量約２０
０００のヒト成長ホルモン（以下、２０ＫｈＧＨと略
す）は分泌生産量が極めて低かった。そこで、２０Ｋｈ
ＧＨの分泌生産性を改善するため、前述の既知の方法
（シグナルペプチドのアミノ酸配列の改変、Ｓｅｃ蛋白
質の発現）を用いて様々な検討を行なった。しかしなが
ら、いずれの検討においても効率よい分泌生産方法を見
い出すにはついに至らなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的とすると
ころは、これまで微生物において分泌生産が困難であっ
た組換え蛋白質、とりわけ哺乳動物由来の組換え蛋白質
のペリプラズムへの効率よい分泌生産方法を提供するこ
とにある。
ころは、これまで微生物において分泌生産が困難であっ
た組換え蛋白質、とりわけ哺乳動物由来の組換え蛋白質
のペリプラズムへの効率よい分泌生産方法を提供するこ
とにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上述した
既知の概念から逸脱した全く新しい分泌促進因子を見い
出すべく鋭意検討を重ねた結果、ついにグルタチオンレ
ダクタ−ゼ（以下ＧＲと略す）を大腸菌体内で組換え蛋
白質と共発現させることにより、目的蛋白質のペリプラ
ズムへの分泌量が著しく向上することを見い出し、この
知見に基づき本発明を完成した。
既知の概念から逸脱した全く新しい分泌促進因子を見い
出すべく鋭意検討を重ねた結果、ついにグルタチオンレ
ダクタ−ゼ（以下ＧＲと略す）を大腸菌体内で組換え蛋
白質と共発現させることにより、目的蛋白質のペリプラ
ズムへの分泌量が著しく向上することを見い出し、この
知見に基づき本発明を完成した。
【０００８】すなわち、本発明は、 （１） 大腸菌を宿主として組換え蛋白質をペリプラズ
ムに分泌生産させることにおいて、人為的にグルタチオ
ンレダクターゼを組換え蛋白質と共発現させることを特
徴とする組換え蛋白質の分泌生産方法。 （２） 大腸菌を宿主として分子量約２００００のヒト
成長ホルモンをペリプラズムに分泌生産させることにお
いて、人為的にグルタチオンレダクターゼを分子量約２
００００のヒト成長ホルモンと共発現させることを特徴
とする分子量約２００００のヒト成長ホルモンの分泌生
産方法。 （３） 組換え蛋白質をペリプラズムに分泌生産させる
ことのできる組換え体大腸菌であって、人為的にグルタ
チオンレダクターゼを組換え蛋白質と共発現しているこ
とを特徴とする組換え体大腸菌。 （４） 分子量約２００００のヒト成長ホルモンをペリ
プラズムに分泌生産させることのできる組換え体大腸菌
であって、人為的にグルタチオンレダクターゼを分子量
約２００００のヒト成長ホルモンと共発現していること
を特徴とする組換え体大腸菌。 を提供するものである。
ムに分泌生産させることにおいて、人為的にグルタチオ
ンレダクターゼを組換え蛋白質と共発現させることを特
徴とする組換え蛋白質の分泌生産方法。 （２） 大腸菌を宿主として分子量約２００００のヒト
成長ホルモンをペリプラズムに分泌生産させることにお
いて、人為的にグルタチオンレダクターゼを分子量約２
００００のヒト成長ホルモンと共発現させることを特徴
とする分子量約２００００のヒト成長ホルモンの分泌生
産方法。 （３） 組換え蛋白質をペリプラズムに分泌生産させる
ことのできる組換え体大腸菌であって、人為的にグルタ
チオンレダクターゼを組換え蛋白質と共発現しているこ
とを特徴とする組換え体大腸菌。 （４） 分子量約２００００のヒト成長ホルモンをペリ
プラズムに分泌生産させることのできる組換え体大腸菌
であって、人為的にグルタチオンレダクターゼを分子量
約２００００のヒト成長ホルモンと共発現していること
を特徴とする組換え体大腸菌。 を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
ＧＲは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素として要求し、酸化型
グルタチオンを還元型グルタチオンに還元するフラビン
（ＦＡＤ）酵素の一種で、広く動植物組織、微生物に存
在する酵素である。ＧＲにより生成する還元型グルタチ
オンは、細胞質内部の蛋白質その他のジスルフィドと反
応し、そのＳＨ基の還元状態を維持する機能、あるいは
過酸化水素を水に還元する解毒機能があることが知られ
ている。その他、大腸菌由来のＧＲを葉緑体中に発現さ
せた植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）は、光
により起こる酸化ストレスに対する抵抗性が増す（Ｐｌ
ａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３４,ｐｐ．１
２９−１３５、１９９３）ことなどが報告されている。
しかし、本発明のごとくＧＲの増強発現による分泌効率
への関与という知見はこれまでない。ＧＲ遺伝子と組換
え蛋白質遺伝子を共発現させる際には、両遺伝子を同一
レプリコンあるいは異なるレプリコンに存在させるいず
れの方法も可能である。レプリコンとはＤＮＡ複製の自
律的単位を意味する。同一のレプリコンに存在すると
は、両遺伝子が共に染色体内に存在するか、あるいは同
一のプラスミド内に存在することを意味する。異なるレ
プリコンに存在するとは、染色体とプラスミドあるいは
レプリコンの異なる２つのプラスミドにＧＲ遺伝子と組
換え蛋白質遺伝子が各々存在することを意味する。
ＧＲは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素として要求し、酸化型
グルタチオンを還元型グルタチオンに還元するフラビン
（ＦＡＤ）酵素の一種で、広く動植物組織、微生物に存
在する酵素である。ＧＲにより生成する還元型グルタチ
オンは、細胞質内部の蛋白質その他のジスルフィドと反
応し、そのＳＨ基の還元状態を維持する機能、あるいは
過酸化水素を水に還元する解毒機能があることが知られ
ている。その他、大腸菌由来のＧＲを葉緑体中に発現さ
せた植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）は、光
により起こる酸化ストレスに対する抵抗性が増す（Ｐｌ
ａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３４,ｐｐ．１
２９−１３５、１９９３）ことなどが報告されている。
しかし、本発明のごとくＧＲの増強発現による分泌効率
への関与という知見はこれまでない。ＧＲ遺伝子と組換
え蛋白質遺伝子を共発現させる際には、両遺伝子を同一
レプリコンあるいは異なるレプリコンに存在させるいず
れの方法も可能である。レプリコンとはＤＮＡ複製の自
律的単位を意味する。同一のレプリコンに存在すると
は、両遺伝子が共に染色体内に存在するか、あるいは同
一のプラスミド内に存在することを意味する。異なるレ
プリコンに存在するとは、染色体とプラスミドあるいは
レプリコンの異なる２つのプラスミドにＧＲ遺伝子と組
換え蛋白質遺伝子が各々存在することを意味する。
【００１０】本発明に用いるＧＲ遺伝子は、取得可能な
いかなる生物由来のものでも使用可能である。さらに、
ＧＲのｍＲＮＡに基づくｃＤＮＡ、また化学合成により
構築されたもの等の如何なるものでもよく、公知のもの
が使用可能である。大腸菌由来のＧＲ遺伝子は容易に取
得可能であり好適に使用できる。本発明において、大腸
菌由来のＧＲを用いる場合、大腸菌ＧＲ遺伝子は染色体
内に予め存在するものであるから、取得したＧＲ遺伝子
を染色体あるいはプラスミドに存在させ大腸菌由来ＧＲ
遺伝子の発現とは別に人為的に発現させることを意味す
る。
いかなる生物由来のものでも使用可能である。さらに、
ＧＲのｍＲＮＡに基づくｃＤＮＡ、また化学合成により
構築されたもの等の如何なるものでもよく、公知のもの
が使用可能である。大腸菌由来のＧＲ遺伝子は容易に取
得可能であり好適に使用できる。本発明において、大腸
菌由来のＧＲを用いる場合、大腸菌ＧＲ遺伝子は染色体
内に予め存在するものであるから、取得したＧＲ遺伝子
を染色体あるいはプラスミドに存在させ大腸菌由来ＧＲ
遺伝子の発現とは別に人為的に発現させることを意味す
る。
【００１１】本発明で分泌される組換え蛋白質は、大腸
菌において分泌可能な蛋白質であれば特に限定されな
い。例えば、２２ＫｈＧＨ、２０ＫｈＧＨ、β−ラクタ
マ−ゼなどが挙げられるが、特に２０ＫｈＧＨの生産に
顕著な効果がある。本発明者らは、大腸菌を用いた分泌
生産方法において、バチルス・アミロリキファシエンス
の中性プロテアーゼ由来のプロモーター、シグナルペプ
チド遺伝子を用いる２０ＫｈＧＨの生産方法を既に開示
している（特開平６−２６９２９２）。開示の方法によ
り、２０ＫｈＧＨの分泌生産量が１Ｌ培養液当たり約３
０ｍｇまで向上したが、さらに高い生産量を得られる菌
株の構築が切望されていた。
菌において分泌可能な蛋白質であれば特に限定されな
い。例えば、２２ＫｈＧＨ、２０ＫｈＧＨ、β−ラクタ
マ−ゼなどが挙げられるが、特に２０ＫｈＧＨの生産に
顕著な効果がある。本発明者らは、大腸菌を用いた分泌
生産方法において、バチルス・アミロリキファシエンス
の中性プロテアーゼ由来のプロモーター、シグナルペプ
チド遺伝子を用いる２０ＫｈＧＨの生産方法を既に開示
している（特開平６−２６９２９２）。開示の方法によ
り、２０ＫｈＧＨの分泌生産量が１Ｌ培養液当たり約３
０ｍｇまで向上したが、さらに高い生産量を得られる菌
株の構築が切望されていた。
【００１２】２０ＫｈＧＨは、現在臨床で現在使用され
ている２２ＫｈＧＨを構成する１９１個のアミノ酸配列
のうち、３２〜４６番目のアミノ酸配列（１５残基）が
欠失した１７６個のアミノ酸配列を有し、２２ＫｈＧＨ
のリスクとして指摘されている耐糖能異常、白血病原性
の低いｈＧＨとして近年、その生物学的特性に興味がも
たれ、新しい医薬品ｈＧＨとして期待されている蛋白質
である。また、２０ＫｈＧＨのアミノ酸配列のＮ−末端
から第１４番目のアミノ酸については、セリンとメチオ
ニンの２種類の報告がある。即ち、Ｍａｓｕｄａ，Ｎ．
ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｉｓｉｃａ Ａｃｔａ，９
４９，ｐ．１２５（１９８８）では、ｃＤＮＡ塩基配列
がＡＧＴ（セリンをコード）であり、Ｍａｒｔｉａｌ，
Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０５，ｐ．６
０２，（１９７９）では、ｍＲＮＡのＮ−末端から第１
４番目のアミノ酸をコードするＲＮＡ配列はＡＵＧ（メ
チオニンをコードする）である。本発明における２０Ｋ
ｈＧＨとは、第１４番目のアミノ酸がメチオニンあるい
はセリンである両アミノ酸配列を意味する。また、本発
明の２０ＫｈＧＨとしては、アミノ酸配列が１〜２個置
換・欠失・挿入・削除されたものも本発明の範疇であ
る。
ている２２ＫｈＧＨを構成する１９１個のアミノ酸配列
のうち、３２〜４６番目のアミノ酸配列（１５残基）が
欠失した１７６個のアミノ酸配列を有し、２２ＫｈＧＨ
のリスクとして指摘されている耐糖能異常、白血病原性
の低いｈＧＨとして近年、その生物学的特性に興味がも
たれ、新しい医薬品ｈＧＨとして期待されている蛋白質
である。また、２０ＫｈＧＨのアミノ酸配列のＮ−末端
から第１４番目のアミノ酸については、セリンとメチオ
ニンの２種類の報告がある。即ち、Ｍａｓｕｄａ，Ｎ．
ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｉｓｉｃａ Ａｃｔａ，９
４９，ｐ．１２５（１９８８）では、ｃＤＮＡ塩基配列
がＡＧＴ（セリンをコード）であり、Ｍａｒｔｉａｌ，
Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０５，ｐ．６
０２，（１９７９）では、ｍＲＮＡのＮ−末端から第１
４番目のアミノ酸をコードするＲＮＡ配列はＡＵＧ（メ
チオニンをコードする）である。本発明における２０Ｋ
ｈＧＨとは、第１４番目のアミノ酸がメチオニンあるい
はセリンである両アミノ酸配列を意味する。また、本発
明の２０ＫｈＧＨとしては、アミノ酸配列が１〜２個置
換・欠失・挿入・削除されたものも本発明の範疇であ
る。
【００１３】シグナルペプチドは、いかなる分泌蛋白質
由来のものでも使用可能であり、特に限定されないが、
蛋白質の種類により分泌されるに好ましいシグナルペプ
チドが選択される。２０ＫｈＧＨの分泌生産には、特開
平６−２６９２９２に記載のように、バチルス・アミロ
リキファシエンスの中性プロテア−ゼのシグナルペプチ
ドが好ましい。本発明者らは、バチルス・アミロリキフ
ァシエンスの中性プロテア−ゼのシグナルペプチドより
もさらに２０ＫｈＧＨの分泌に有利なアミノ酸配列を見
い出す目的で、Ｎ−末端の正電荷領域に塩基性アミノ酸
のリジン残基を付加し、さらに中央部疎水領域に疎水性
アミノ酸のロイシン残基を付加した改変シグナルペプチ
ドを有する２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドを比較例１に記
載のように系統的に構築した。該プラスミドで形質転換
した大腸菌を培養したところ、オリジナル配列よりも劣
るものと優れるものが認められた。しかし、実施例４に
示したように大腸菌内でＧＲと２０ＫｈＧＨを同時に発
現させると、全ての改変シグナルペプチドを含む形質転
換体において２０ＫｈＧＨの分泌量向上の効果が認めら
れた。最も高い分泌量が得られた改変シグナルペプチド
ｐＧＨＶ４５を配列表の配列番号１に示す。
由来のものでも使用可能であり、特に限定されないが、
蛋白質の種類により分泌されるに好ましいシグナルペプ
チドが選択される。２０ＫｈＧＨの分泌生産には、特開
平６−２６９２９２に記載のように、バチルス・アミロ
リキファシエンスの中性プロテア−ゼのシグナルペプチ
ドが好ましい。本発明者らは、バチルス・アミロリキフ
ァシエンスの中性プロテア−ゼのシグナルペプチドより
もさらに２０ＫｈＧＨの分泌に有利なアミノ酸配列を見
い出す目的で、Ｎ−末端の正電荷領域に塩基性アミノ酸
のリジン残基を付加し、さらに中央部疎水領域に疎水性
アミノ酸のロイシン残基を付加した改変シグナルペプチ
ドを有する２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドを比較例１に記
載のように系統的に構築した。該プラスミドで形質転換
した大腸菌を培養したところ、オリジナル配列よりも劣
るものと優れるものが認められた。しかし、実施例４に
示したように大腸菌内でＧＲと２０ＫｈＧＨを同時に発
現させると、全ての改変シグナルペプチドを含む形質転
換体において２０ＫｈＧＨの分泌量向上の効果が認めら
れた。最も高い分泌量が得られた改変シグナルペプチド
ｐＧＨＶ４５を配列表の配列番号１に示す。
【００１４】ＧＲ遺伝子は組換え蛋白質遺伝子と同時に
発現されるため、極度に強く発現されると大腸菌の生
育、分泌量に悪影響を及ぼす場合がある。そのような際
には、既知の情報に基づきＧＲ遺伝子の発現を低減する
ことで対応可能である。例えば、ＧＲ遺伝子の発現に誘
導型プロモ−タ−（ｔａｃプロモ−タ−、ｌａｃプロモ
−タ−など）を使用した際には誘導剤の添加濃度を低
下、あるいは誘導剤を添加しない方法やプロモータ−の
リプレッサ−遺伝子（例えば、ｔａｃプロモ−タ−に対
するｌａｃＩq）を用いる方法などが適宜使用可能であ
る。ＧＲ遺伝子の極端な過剰発現は、培養した大腸菌破
砕液の電気泳動分析を実施すれば容易に確認可能であ
る。
発現されるため、極度に強く発現されると大腸菌の生
育、分泌量に悪影響を及ぼす場合がある。そのような際
には、既知の情報に基づきＧＲ遺伝子の発現を低減する
ことで対応可能である。例えば、ＧＲ遺伝子の発現に誘
導型プロモ−タ−（ｔａｃプロモ−タ−、ｌａｃプロモ
−タ−など）を使用した際には誘導剤の添加濃度を低
下、あるいは誘導剤を添加しない方法やプロモータ−の
リプレッサ−遺伝子（例えば、ｔａｃプロモ−タ−に対
するｌａｃＩq）を用いる方法などが適宜使用可能であ
る。ＧＲ遺伝子の極端な過剰発現は、培養した大腸菌破
砕液の電気泳動分析を実施すれば容易に確認可能であ
る。
【００１５】本発明の組換え体大腸菌を作製するには、
上述したＧＲ遺伝子にプロモーターを連結したＤＮＡ及
び組換え蛋白質をコードする遺伝子の上流にプロモータ
ーおよびシグナル配列をコードするＤＮＡを連結したＤ
ＮＡを大腸菌内で複製可能な同一のまたは異なるベクタ
ーに組み込み、プラスミドを作製し、該プラスミドを宿
主大腸菌に形質転換により導入すればよい。また、ＧＲ
遺伝子にプロモーターを連結したＤＮＡ及び組換え蛋白
質をコードする遺伝子の上流にプロモーターおよびシグ
ナル配列をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡの両者を
染色体ＤＮＡに組み込む方法、或いは染色体ＤＮＡとプ
ラスミドに別々に組み込む方法により実施すればよい。
上述したＧＲ遺伝子にプロモーターを連結したＤＮＡ及
び組換え蛋白質をコードする遺伝子の上流にプロモータ
ーおよびシグナル配列をコードするＤＮＡを連結したＤ
ＮＡを大腸菌内で複製可能な同一のまたは異なるベクタ
ーに組み込み、プラスミドを作製し、該プラスミドを宿
主大腸菌に形質転換により導入すればよい。また、ＧＲ
遺伝子にプロモーターを連結したＤＮＡ及び組換え蛋白
質をコードする遺伝子の上流にプロモーターおよびシグ
ナル配列をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡの両者を
染色体ＤＮＡに組み込む方法、或いは染色体ＤＮＡとプ
ラスミドに別々に組み込む方法により実施すればよい。
【００１６】本発明において宿主として使用できる大腸
菌株としては、いかなるものでも良いが、好ましくは病
原性がなく、使用経験豊富な大腸菌株が好ましく、その
ようなものとして、ＪＭ１０９、ＨＢ１０１、Ｗ３１１
０（ＡＴＣＣ ２７３２５）などが好適に使用される。
尚、ＡＴＣＣ番号はアメリカン・タイプカルチャー・コ
レクション（American type culture collection）の保
有する微生物の番号であることを示し、ＡＴＣＣ ２７
３２５は請求により万人に対して有償で分譲される。
菌株としては、いかなるものでも良いが、好ましくは病
原性がなく、使用経験豊富な大腸菌株が好ましく、その
ようなものとして、ＪＭ１０９、ＨＢ１０１、Ｗ３１１
０（ＡＴＣＣ ２７３２５）などが好適に使用される。
尚、ＡＴＣＣ番号はアメリカン・タイプカルチャー・コ
レクション（American type culture collection）の保
有する微生物の番号であることを示し、ＡＴＣＣ ２７
３２５は請求により万人に対して有償で分譲される。
【００１７】かくしてＧＲ遺伝子を共発現させることで
蛋白質を効率良く分泌可能な大腸菌形質転換株が得られ
る。特に、２０ＫｈＧＨの分泌については分泌量向上効
果が高い。２０ＫｈＧＨを分泌生産する該菌株の例とし
てはＭＴ−１０７６５を挙げることができる。ＭＴ−１
０７６５は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５０２０として
茨城県つくば市東１丁目１番３号にある工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託されている。ＭＴ−１０７６
５株は、培養温度３０℃での培養が可能であるため培養
時間を短縮でき、２０ＫｈＧＨの分泌生産量も１Ｌ培養
液あたり７０ｍｇ以上に達した。大腸菌内に共発現され
たＧＲが異種蛋白質の分泌生産性を向上させる機構につ
いては明かではないが、分泌蛋白質が細胞質膜を通過す
る輸送の過程に必要である膜のプロトン勾配形成（プロ
トン駆動力）或いは酸化還元電位に関連する現象に関与
している可能性が考えられる。
蛋白質を効率良く分泌可能な大腸菌形質転換株が得られ
る。特に、２０ＫｈＧＨの分泌については分泌量向上効
果が高い。２０ＫｈＧＨを分泌生産する該菌株の例とし
てはＭＴ−１０７６５を挙げることができる。ＭＴ−１
０７６５は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５０２０として
茨城県つくば市東１丁目１番３号にある工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託されている。ＭＴ−１０７６
５株は、培養温度３０℃での培養が可能であるため培養
時間を短縮でき、２０ＫｈＧＨの分泌生産量も１Ｌ培養
液あたり７０ｍｇ以上に達した。大腸菌内に共発現され
たＧＲが異種蛋白質の分泌生産性を向上させる機構につ
いては明かではないが、分泌蛋白質が細胞質膜を通過す
る輸送の過程に必要である膜のプロトン勾配形成（プロ
トン駆動力）或いは酸化還元電位に関連する現象に関与
している可能性が考えられる。
【００１８】大腸菌形質転換株を培養するには、該菌株
が資化可能な炭素源、窒素源および無機塩類からなる培
地を用い公知の培養法により培養すればよく、培養法と
しては液体培養が好適に使用される。好ましい培地とし
ては、グリセロ−ルを０．２〜１．０％濃度に含む２倍
濃度のＬＢ培地（ポリペプトン２０ｇ／Ｌ，酵母エキス
１０ｇ／Ｌ）などが挙げられる。本発明の大腸菌形質転
換株を培養することにより、形質転換株のペリプラズム
中には、分泌蛋白質が蓄積される。該大腸菌形質転換株
のペリプラズムからの分泌蛋白質の調製は、通常のペリ
プラズムからのタンパク質の回収精製方法により行うこ
とが可能であり、例えば浸透圧ショック法（Ｎｏｓｓａ
ｌ Ｇ．Ｎ；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４１（１
３），ｐｐ．３０５５−３０６２，１９６６）等が実施
可能である。以上のようにして本発明の生産方法により
大腸菌形質転換株のペリプラズム中に目的蛋白質を効率
よく分泌蓄積させることができる。
が資化可能な炭素源、窒素源および無機塩類からなる培
地を用い公知の培養法により培養すればよく、培養法と
しては液体培養が好適に使用される。好ましい培地とし
ては、グリセロ−ルを０．２〜１．０％濃度に含む２倍
濃度のＬＢ培地（ポリペプトン２０ｇ／Ｌ，酵母エキス
１０ｇ／Ｌ）などが挙げられる。本発明の大腸菌形質転
換株を培養することにより、形質転換株のペリプラズム
中には、分泌蛋白質が蓄積される。該大腸菌形質転換株
のペリプラズムからの分泌蛋白質の調製は、通常のペリ
プラズムからのタンパク質の回収精製方法により行うこ
とが可能であり、例えば浸透圧ショック法（Ｎｏｓｓａ
ｌ Ｇ．Ｎ；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４１（１
３），ｐｐ．３０５５−３０６２，１９６６）等が実施
可能である。以上のようにして本発明の生産方法により
大腸菌形質転換株のペリプラズム中に目的蛋白質を効率
よく分泌蓄積させることができる。
【００１９】
【実施例】以下、本発明を具体例で説明するが、本発明
はこの例により何ら限定されるものではない。
はこの例により何ら限定されるものではない。
【００２０】［実施例１］ＧＲの共発現による蛋白質の分泌効率への影響 (1) 大腸菌ＧＲ遺伝子発現プラスミドｐＫＫＧＲ１の作
製 作製の方法は図１（図１）に示されている。Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株（ＡＴＣＣ ２３
７１６）の染色体ＤＮＡを調製した。配列番号２及び３
の合成オリゴヌクレオチドプライマーを使って、上記染
色体を鋳型とするＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ
Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法によるＧＲ遺伝子の増幅
を行った（Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．Ｂ．ｅｔ ａｌ；Ｍｅｔ
ｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１５５，ｐｐ．３３５−３
５０，１９８７）。この結果大腸菌ＧＲ遺伝子をコード
する配列を含むＤＮＡ断片を獲得した。このＤＮＡ断片
を制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで消化し、１３５２ｂ
ｐのＤＮＡ断片（１）を単離した。次に、ファルマシア
社から購入した発現プラスミドｐＫＫ２２３−３を制限
酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで消化し、単離した４．６ｋ
ｂのＤＮＡ断片（２）を上記ＤＮＡ断片（１）の存在下
でライゲートして大腸菌ＧＲ遺伝子発現プラスミドｐＫ
ＫＧＲ１を作製した。このプラスミドを使って大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株（宝酒造より購入）をＩｎｏｕｅ，Ｈ．らの
方法（Ｇｅｎｅ ９６，ｐｐ．２３−２８，１９９０）
により形質転換して大腸菌形質転換株（ＭＴ−１０７７
１）を得た。
製 作製の方法は図１（図１）に示されている。Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株（ＡＴＣＣ ２３
７１６）の染色体ＤＮＡを調製した。配列番号２及び３
の合成オリゴヌクレオチドプライマーを使って、上記染
色体を鋳型とするＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ
Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法によるＧＲ遺伝子の増幅
を行った（Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．Ｂ．ｅｔ ａｌ；Ｍｅｔ
ｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１５５，ｐｐ．３３５−３
５０，１９８７）。この結果大腸菌ＧＲ遺伝子をコード
する配列を含むＤＮＡ断片を獲得した。このＤＮＡ断片
を制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで消化し、１３５２ｂ
ｐのＤＮＡ断片（１）を単離した。次に、ファルマシア
社から購入した発現プラスミドｐＫＫ２２３−３を制限
酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで消化し、単離した４．６ｋ
ｂのＤＮＡ断片（２）を上記ＤＮＡ断片（１）の存在下
でライゲートして大腸菌ＧＲ遺伝子発現プラスミドｐＫ
ＫＧＲ１を作製した。このプラスミドを使って大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株（宝酒造より購入）をＩｎｏｕｅ，Ｈ．らの
方法（Ｇｅｎｅ ９６，ｐｐ．２３−２８，１９９０）
により形質転換して大腸菌形質転換株（ＭＴ−１０７７
１）を得た。
【００２１】(2) ２２ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＷ
３００の作製 作製の方法は図２（図２）に示されている。枯草菌にお
ける２２ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐｈＧＨ５２６（Ｎａ
ｋａｙａｍａ，Ａ．ｅｔ ａｌ；Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．
８，ｐｐ．１２３−１３４，１９８８）を制限酵素Ｓ
ｔｕＩとＢｇｌＩＩで消化して、２２ＫｈＧＨ遺伝子の
Ｎ−末端側の大部分を含むＤＮＡ断片（３）を単離し
た。一方、ＭＴ−１０７１２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３６
１）から抽出調製したヒト２０ＫｈＧＨ分泌プラスミド
ｐＧＨＷ３（特開平６ー２６９２９２）を制限酵素Ｓｔ
ｕＩとＢｇｌＩＩで消化して、ベクターフラグメント
（４）を得た。このベクターフラグメント（４）と上記
ＤＮＡ断片（３）をライゲートし、２２ＫｈＧＨ分泌プ
ラスミドｐＧＨＷ３００を得た。このプラスミドを使い
大腸菌ＨＢ１０１株（宝酒造より購入）を形質転換して
ＭＴ−１０７７３を得た。ＭＴ−１０７７３は、受託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−５０１９として工業技術院生命工学
工業技術研究所に寄託されている。
３００の作製 作製の方法は図２（図２）に示されている。枯草菌にお
ける２２ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐｈＧＨ５２６（Ｎａ
ｋａｙａｍａ，Ａ．ｅｔ ａｌ；Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．
８，ｐｐ．１２３−１３４，１９８８）を制限酵素Ｓ
ｔｕＩとＢｇｌＩＩで消化して、２２ＫｈＧＨ遺伝子の
Ｎ−末端側の大部分を含むＤＮＡ断片（３）を単離し
た。一方、ＭＴ−１０７１２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３６
１）から抽出調製したヒト２０ＫｈＧＨ分泌プラスミド
ｐＧＨＷ３（特開平６ー２６９２９２）を制限酵素Ｓｔ
ｕＩとＢｇｌＩＩで消化して、ベクターフラグメント
（４）を得た。このベクターフラグメント（４）と上記
ＤＮＡ断片（３）をライゲートし、２２ＫｈＧＨ分泌プ
ラスミドｐＧＨＷ３００を得た。このプラスミドを使い
大腸菌ＨＢ１０１株（宝酒造より購入）を形質転換して
ＭＴ−１０７７３を得た。ＭＴ−１０７７３は、受託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−５０１９として工業技術院生命工学
工業技術研究所に寄託されている。
【００２２】(3) ヒト成長ホルモン分泌とＧＲの共発現 プラスミドｐＧＨＷ３は２０ＫｈＧＨ（以下、ヒト成長
ホルモンをｈＧＨと略記することがある）のＮ−末端１
４番目のアミノ酸がセリンをコードするＤＮＡ塩基配列
を持つ。本研究の発明者らはＮ−末端から１４番目のア
ミノ酸がメチオニンをコードするＤＮＡ塩基配列を持つ
２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＷ３０を作製した。
詳しくは、プラスミドｐＧＨＷ３を鋳型として、配列番
号１７の合成オリゴヌクレオチドと市販のＭ４プライマ
ーを使ったＰＣＲ増幅を行ない約０．６ｋｂｐのＤＮＡ
断片を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｔｕＩとＢｇ
ｌＩＩで消化し、プラスミドｐＧＨＷ３の同部位と置換
してＮ−末端１４番目のアミノ酸がメチオニンをコード
するＤＮＡ塩基配列を持つ２０ＫｈＧＨ分泌プラスミド
ｐＧＨＷ３０を作製した。更に、このプラスミドｐＧＨ
Ｗ３０により大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ ２７３２
５）を形質転換した大腸菌形質転換株（ＭＴ−１０７７
２）を得た。この形質転換株よりｐＧＨＷ３０プラスミ
ドを常法により抽出精製した。大腸菌ＪＭ１０９株をＩ
ｎｏｕｅ，Ｈ．らの方法（Ｇｅｎｅ，９６，ｐｐ．２３
−２８，１９９０）によりｐＧＨＷ３０とｐＫＫＧＲ
１、又はｐＧＨＷ３００とｐＫＫＧＲ１の組み合わせで
形質導入した。形質導入株はアンピシリン及びテトラサ
イクリンをそれぞれ１０μｇ／ｍｌずつ含むＬＢ寒天培
地で３０℃で培養しコロニ−生成させた。単離した形質
転換株をアンピシリン１００μｇ／ｍｌ及びテトラサイ
クリン１０μｇ／ｍｌを含む２倍濃度のＬＢ培地（ポリ
ペプトン２０ｇ／Ｌ，酵母エキス１０ｇ／Ｌ）中で、培
養温度３０℃で２４時間培養した。ｐＫＫ２２３−３あ
るいはｐＫＫＧＲ１プラスミドはｔａｃプロモ−タ−を
有するため、これらのプラスミドを有する形質転換体の
培養には、培養開始時の１ｍＭ ＩＰＴＧの添加の有無
による影響を検討した。培養後、浸透圧ショック法（Ｎ
ｏｓｓａｌ Ｇ．Ｎ；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４
１（１３），ｐｐ．３０５５−３０６２，１９６６）に
よりペリプラズム画分に分泌されたｈＧＨを回収し、該
ペリプラズム画分溶液中の濃度を、ｈＧＨに対する抗体
を用いた酵素免疫測定法（Ｋａｔｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ；
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１６，ｐ．１５５４，１９７
６）に従い測定した。ペリプラズム画分溶液の調製は以
下の通りに行った。即ち、培養液を遠心分離することに
より菌体を沈殿画分に回収し、元の培養液量の１０分の
１量の等張液（２０％シュークロース、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０））
に懸濁した。該懸濁液を３０分間放置後、遠心分離して
菌体を回収した。次に、回収菌体を４℃の冷水に懸濁す
ることにより菌体のペリプラズム中に存在する蛋白質を
抽出した。懸濁液を遠心分離して菌体成分を除去し、上
清（抽出成分）をペリプラズム画分として回収した。ペ
リプラズム画分に回収されたｈＧＨ濃度を上記の酵素免
疫測定法により測定し、その測定値から培養培地１Ｌあ
たりのｈＧＨ分泌量を換算した。結果を表１（表１）及
び表２（表２）に示す。
ホルモンをｈＧＨと略記することがある）のＮ−末端１
４番目のアミノ酸がセリンをコードするＤＮＡ塩基配列
を持つ。本研究の発明者らはＮ−末端から１４番目のア
ミノ酸がメチオニンをコードするＤＮＡ塩基配列を持つ
２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＷ３０を作製した。
詳しくは、プラスミドｐＧＨＷ３を鋳型として、配列番
号１７の合成オリゴヌクレオチドと市販のＭ４プライマ
ーを使ったＰＣＲ増幅を行ない約０．６ｋｂｐのＤＮＡ
断片を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｔｕＩとＢｇ
ｌＩＩで消化し、プラスミドｐＧＨＷ３の同部位と置換
してＮ−末端１４番目のアミノ酸がメチオニンをコード
するＤＮＡ塩基配列を持つ２０ＫｈＧＨ分泌プラスミド
ｐＧＨＷ３０を作製した。更に、このプラスミドｐＧＨ
Ｗ３０により大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ ２７３２
５）を形質転換した大腸菌形質転換株（ＭＴ−１０７７
２）を得た。この形質転換株よりｐＧＨＷ３０プラスミ
ドを常法により抽出精製した。大腸菌ＪＭ１０９株をＩ
ｎｏｕｅ，Ｈ．らの方法（Ｇｅｎｅ，９６，ｐｐ．２３
−２８，１９９０）によりｐＧＨＷ３０とｐＫＫＧＲ
１、又はｐＧＨＷ３００とｐＫＫＧＲ１の組み合わせで
形質導入した。形質導入株はアンピシリン及びテトラサ
イクリンをそれぞれ１０μｇ／ｍｌずつ含むＬＢ寒天培
地で３０℃で培養しコロニ−生成させた。単離した形質
転換株をアンピシリン１００μｇ／ｍｌ及びテトラサイ
クリン１０μｇ／ｍｌを含む２倍濃度のＬＢ培地（ポリ
ペプトン２０ｇ／Ｌ，酵母エキス１０ｇ／Ｌ）中で、培
養温度３０℃で２４時間培養した。ｐＫＫ２２３−３あ
るいはｐＫＫＧＲ１プラスミドはｔａｃプロモ−タ−を
有するため、これらのプラスミドを有する形質転換体の
培養には、培養開始時の１ｍＭ ＩＰＴＧの添加の有無
による影響を検討した。培養後、浸透圧ショック法（Ｎ
ｏｓｓａｌ Ｇ．Ｎ；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４
１（１３），ｐｐ．３０５５−３０６２，１９６６）に
よりペリプラズム画分に分泌されたｈＧＨを回収し、該
ペリプラズム画分溶液中の濃度を、ｈＧＨに対する抗体
を用いた酵素免疫測定法（Ｋａｔｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ；
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１６，ｐ．１５５４，１９７
６）に従い測定した。ペリプラズム画分溶液の調製は以
下の通りに行った。即ち、培養液を遠心分離することに
より菌体を沈殿画分に回収し、元の培養液量の１０分の
１量の等張液（２０％シュークロース、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０））
に懸濁した。該懸濁液を３０分間放置後、遠心分離して
菌体を回収した。次に、回収菌体を４℃の冷水に懸濁す
ることにより菌体のペリプラズム中に存在する蛋白質を
抽出した。懸濁液を遠心分離して菌体成分を除去し、上
清（抽出成分）をペリプラズム画分として回収した。ペ
リプラズム画分に回収されたｈＧＨ濃度を上記の酵素免
疫測定法により測定し、その測定値から培養培地１Ｌあ
たりのｈＧＨ分泌量を換算した。結果を表１（表１）及
び表２（表２）に示す。
【００２３】
【表１】
【００２４】
【表２】 ２０ＫｈＧＨ、２２ＫｈＧＨのいずれの蛋白質の分泌に
於いても、ＧＲを共発現させることにより、ｈＧＨ分泌
プラスミド単独よりも高い分泌量が得られた。発現プラ
スミドｐＫＫ２２３−３プラスミドをｈＧＨ分泌プラス
ミドと同じ菌体内に存在させた場合には２０ＫｈＧＨ、
２２ＫｈＧＨの分泌量は共に低下した。しかし、ＧＲ発
現プラスミドｐＫＫＧＲ１をｈＧＨ分泌プラスミドと同
じ菌体内に存在させた場合には２０ＫｈＧＨ、２２Ｋｈ
ＧＨの分泌量は共に著しく増加した。このことから、Ｇ
Ｒが共発現することにより分泌量が向上していることが
わかる。発現プラスミドｐＫＫ２２３−３の共存がｈＧ
Ｈ分泌プラスミドの単独存在よりもｈＧＨの分泌量が低
下する理由は明らかではないが、ｐＫＫ２２３−３がｈ
ＧＨ分泌プラスミドと同じｐＢＲ３２２由来の複製オリ
ジンを持つために複製競合や和合性の低下が生じた可能
性が考えられる。また、ｐＫＫ２２３−３の薬剤耐性マ
ーカーであるβ−ラクタマーゼは分泌蛋白質であり、ｈ
ＧＨ前駆体と分泌の膜透過過程で競合が生じたことも考
えられる。この宿主ＪＭ１０９を用いたｐＫＫＧＲ１プ
ラスミドと成長ホルモン分泌プラスミドの両プラスミド
で形質導入した株においては、ＧＲの発現のための誘導
剤（ＩＰＴＧ）の添加が必要であった。
於いても、ＧＲを共発現させることにより、ｈＧＨ分泌
プラスミド単独よりも高い分泌量が得られた。発現プラ
スミドｐＫＫ２２３−３プラスミドをｈＧＨ分泌プラス
ミドと同じ菌体内に存在させた場合には２０ＫｈＧＨ、
２２ＫｈＧＨの分泌量は共に低下した。しかし、ＧＲ発
現プラスミドｐＫＫＧＲ１をｈＧＨ分泌プラスミドと同
じ菌体内に存在させた場合には２０ＫｈＧＨ、２２Ｋｈ
ＧＨの分泌量は共に著しく増加した。このことから、Ｇ
Ｒが共発現することにより分泌量が向上していることが
わかる。発現プラスミドｐＫＫ２２３−３の共存がｈＧ
Ｈ分泌プラスミドの単独存在よりもｈＧＨの分泌量が低
下する理由は明らかではないが、ｐＫＫ２２３−３がｈ
ＧＨ分泌プラスミドと同じｐＢＲ３２２由来の複製オリ
ジンを持つために複製競合や和合性の低下が生じた可能
性が考えられる。また、ｐＫＫ２２３−３の薬剤耐性マ
ーカーであるβ−ラクタマーゼは分泌蛋白質であり、ｈ
ＧＨ前駆体と分泌の膜透過過程で競合が生じたことも考
えられる。この宿主ＪＭ１０９を用いたｐＫＫＧＲ１プ
ラスミドと成長ホルモン分泌プラスミドの両プラスミド
で形質導入した株においては、ＧＲの発現のための誘導
剤（ＩＰＴＧ）の添加が必要であった。
【００２５】［実施例２］β−ラクタマーゼの分泌効率にＧＲの共発現が与える影
響 ファルマシア社から購入した発現プラスミドｐＫＫ２２
３−３上には薬剤耐性マーカーとしてβ−ラクタマーゼ
遺伝子が存在している。β−ラクタマーゼは大腸菌の細
胞質内で発現された後にペリプラズム空間に分泌されて
蓄積する。プラスミドｐＫＫＧＲ１はｐＫＫ２２３−３
にＧＲ遺伝子が組み込まれた点のみが相違点であり、プ
ラスミド上の残りの部分はβ−ラクタマーゼの発現領域
も含めてｐＫＫ２２３−３と完全に同じである。従っ
て、プラスミドｐＫＫＧＲ１によって発現したβ−ラク
タマーゼの分泌量をｐＫＫ２２３−３と比較することに
よって、ＧＲの共発現がβ−ラクタマーゼの分泌効率に
与える影響を知ることができる。それぞれのプラスミド
で形質転換したＪＭ１０９株を上述のｈＧＨ生産菌と同
様の方法で培養後、ペリプラズム画分溶液を調製し、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クマシーブリリアントブルーＲ
２５０による染色後、デンシトメーターによりβ−ラク
タマーゼ（３２．０ｋＤａ）のバンドを測定して、ペリ
プラズム画分総蛋白量に対するβ−ラクタマーゼ含有比
率（％）を調べた。結果を表３（表３）に示す。
響 ファルマシア社から購入した発現プラスミドｐＫＫ２２
３−３上には薬剤耐性マーカーとしてβ−ラクタマーゼ
遺伝子が存在している。β−ラクタマーゼは大腸菌の細
胞質内で発現された後にペリプラズム空間に分泌されて
蓄積する。プラスミドｐＫＫＧＲ１はｐＫＫ２２３−３
にＧＲ遺伝子が組み込まれた点のみが相違点であり、プ
ラスミド上の残りの部分はβ−ラクタマーゼの発現領域
も含めてｐＫＫ２２３−３と完全に同じである。従っ
て、プラスミドｐＫＫＧＲ１によって発現したβ−ラク
タマーゼの分泌量をｐＫＫ２２３−３と比較することに
よって、ＧＲの共発現がβ−ラクタマーゼの分泌効率に
与える影響を知ることができる。それぞれのプラスミド
で形質転換したＪＭ１０９株を上述のｈＧＨ生産菌と同
様の方法で培養後、ペリプラズム画分溶液を調製し、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クマシーブリリアントブルーＲ
２５０による染色後、デンシトメーターによりβ−ラク
タマーゼ（３２．０ｋＤａ）のバンドを測定して、ペリ
プラズム画分総蛋白量に対するβ−ラクタマーゼ含有比
率（％）を調べた。結果を表３（表３）に示す。
【００２６】
【表３】 β−ラクタマーゼの大腸菌ペリプラズムへの分泌も、Ｇ
Ｒの共発現よりに促進されることが確認された。
Ｒの共発現よりに促進されることが確認された。
【００２７】［実施例３］大腸菌ＯｍｐＡ由来分泌シグナルペプチドを使った２０
ＫｈＧＨの分泌生産 大腸菌ＯｍｐＡ由来シグナルペプチドを持つ２０ＫｈＧ
ＨとＧＲの共発現 転写プロモーターはバチルス・アミロリキファシエンス
の中性プロテアーゼ由来で、シグナルペプチドは大腸菌
外膜蛋白質ＯｍｐＡ遺伝子由来である２０ＫｈＧＨ分泌
プラスミドｐＧＨＷ４０をＧＲ発現プラスミドｐＫＫＧ
Ｒ１と共に実施例１と同様の方法で大腸菌ＪＭ１０９株
に形質導入した。得られた形質導入株を実施例１と同様
の方法で培養後、ペリプラズム画分を抽出し、酵素免疫
法により分泌された２０ＫｈＧＨ量を測定した。結果を
表４（表４）に示す。
ＫｈＧＨの分泌生産 大腸菌ＯｍｐＡ由来シグナルペプチドを持つ２０ＫｈＧ
ＨとＧＲの共発現 転写プロモーターはバチルス・アミロリキファシエンス
の中性プロテアーゼ由来で、シグナルペプチドは大腸菌
外膜蛋白質ＯｍｐＡ遺伝子由来である２０ＫｈＧＨ分泌
プラスミドｐＧＨＷ４０をＧＲ発現プラスミドｐＫＫＧ
Ｒ１と共に実施例１と同様の方法で大腸菌ＪＭ１０９株
に形質導入した。得られた形質導入株を実施例１と同様
の方法で培養後、ペリプラズム画分を抽出し、酵素免疫
法により分泌された２０ＫｈＧＨ量を測定した。結果を
表４（表４）に示す。
【００２８】
【表４】 ２０ＫｈＧＨの分泌に関しては、バチルス・アミロリキ
ファシエンスの中性プロテアーゼ由来のシグナルペプチ
ドが好ましく（表１（表１））、ＧＲの共発現により顕
著な分泌量の増加が得られる。しかし、大腸菌ＯｍｐＡ
由来のシグナルペプチドを持つ分泌プラスミドで形質転
換した株においても、分泌量は中性プロテアーゼ由来の
シグナルペプチドを使用した際の分泌量には劣るが、Ｇ
Ｒの共発現により分泌効率の大幅な改善が認められた。
また、実施例２に示したように、ＧＲの共発現による分
泌促進効果はβ−ラクタマーゼのシグナルペプチドを持
つβ−ラクタマーゼの分泌にも効果があることから、特
定のシグナルペプチドの種類に限定されないことがわか
る。
ファシエンスの中性プロテアーゼ由来のシグナルペプチ
ドが好ましく（表１（表１））、ＧＲの共発現により顕
著な分泌量の増加が得られる。しかし、大腸菌ＯｍｐＡ
由来のシグナルペプチドを持つ分泌プラスミドで形質転
換した株においても、分泌量は中性プロテアーゼ由来の
シグナルペプチドを使用した際の分泌量には劣るが、Ｇ
Ｒの共発現により分泌効率の大幅な改善が認められた。
また、実施例２に示したように、ＧＲの共発現による分
泌促進効果はβ−ラクタマーゼのシグナルペプチドを持
つβ−ラクタマーゼの分泌にも効果があることから、特
定のシグナルペプチドの種類に限定されないことがわか
る。
【００２９】［比較例１］バチルス・アミロリキファシエンスの中性プロテアーゼ
由来改変型シグナルペプチドを利用した２０ＫｈＧＨの
生産 (1)中性プロテアーゼ由来シグナルペプチド改変用２０
ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＶ２の構築 バチルス・アミロリキファシエンスの中性プロテアーゼ
由来シグナルペプチド内に任意のアミノ酸残基を挿入す
るためにシグナルペプチド配列内部に制限酵素認識部位
を導入して、同時にプラスミド全体をコンパクト化した
シグナルペプチド改変用プラスミドｐＧＨＶ２を作製し
た。作製方法は図３（図３）及び４（図４）に示した。
ｐＧＨＷ３０を制限酵素ＳａｃＩで消化後、Ｋｌｅｎｏ
ｗ ｅｎｚｙｍｅで末端を平滑化し、制限酵素ＢａｍＨ
Ｉを作用させて中性プロテアーゼ遺伝子のプロモーター
とシグナルペプチド及び２０ＫｈＧＨ遺伝子を含む約
０．８５ｋｂｐのＤＮＡ断片（５）を調製した。このＤ
ＮＡ断片（５）を市販のクローニングベクターｐＵＣ１
１９の制限酵素ＳｍａＩとＢａｍＨＩで処理したベクタ
ー部位（６）に組み込みｐＧＨＶ１を作製した（図３
（図３））。このｐＧＨＶ１を鋳型として配列番号４の
合成オリゴヌクレオチドと市販のＭ４プライマーを使っ
たＰＣＲ増幅を行い中性プロテアーゼ遺伝子プロモータ
ー部位からなる約１００ｂｐのＤＮＡ断片（７）を得
た。また、配列番号５の合成オリゴヌクレオチドと市販
のＲＶプライマーを使ってＰＣＲ増幅を行い、中性プロ
テアーゼのシグナルペプチドと２０ＫｈＧＨ遺伝子を含
む約７００ｂｐのＤＮＡ断片（８）を得た。このＰＣＲ
増幅により分泌シグナルペプチド内に任意のアミノ酸残
基を挿入できるように制限酵素ＮｄｅＩとＳｐｅＩの認
識部位を含むように配列番号５のプライマーを設計し
た。増幅したＤＮＡ断片（７）と（８）を図４（図４）
に示したように、それぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩとＮｄｅ
Ｉ、ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して、市販のクロ
ーニングベクターｐＵＣ１１８をＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩで消化して得たベクター部位（９）に組み込み、
ｐＧＨＶ２を作製した（図４（図４））。このプラスミ
ドがコードする中性プロテアーゼ由来のシグナルペプチ
ドは、制限酵素ＳｐｅＩとＮｄｅＩ認識部位を挿入した
ことによりＮ末から８残基目のセリン（Ｓｅｒ）残基が
スレオニン（Ｔｈｒ）残基に置換されている。
由来改変型シグナルペプチドを利用した２０ＫｈＧＨの
生産 (1)中性プロテアーゼ由来シグナルペプチド改変用２０
ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＶ２の構築 バチルス・アミロリキファシエンスの中性プロテアーゼ
由来シグナルペプチド内に任意のアミノ酸残基を挿入す
るためにシグナルペプチド配列内部に制限酵素認識部位
を導入して、同時にプラスミド全体をコンパクト化した
シグナルペプチド改変用プラスミドｐＧＨＶ２を作製し
た。作製方法は図３（図３）及び４（図４）に示した。
ｐＧＨＷ３０を制限酵素ＳａｃＩで消化後、Ｋｌｅｎｏ
ｗ ｅｎｚｙｍｅで末端を平滑化し、制限酵素ＢａｍＨ
Ｉを作用させて中性プロテアーゼ遺伝子のプロモーター
とシグナルペプチド及び２０ＫｈＧＨ遺伝子を含む約
０．８５ｋｂｐのＤＮＡ断片（５）を調製した。このＤ
ＮＡ断片（５）を市販のクローニングベクターｐＵＣ１
１９の制限酵素ＳｍａＩとＢａｍＨＩで処理したベクタ
ー部位（６）に組み込みｐＧＨＶ１を作製した（図３
（図３））。このｐＧＨＶ１を鋳型として配列番号４の
合成オリゴヌクレオチドと市販のＭ４プライマーを使っ
たＰＣＲ増幅を行い中性プロテアーゼ遺伝子プロモータ
ー部位からなる約１００ｂｐのＤＮＡ断片（７）を得
た。また、配列番号５の合成オリゴヌクレオチドと市販
のＲＶプライマーを使ってＰＣＲ増幅を行い、中性プロ
テアーゼのシグナルペプチドと２０ＫｈＧＨ遺伝子を含
む約７００ｂｐのＤＮＡ断片（８）を得た。このＰＣＲ
増幅により分泌シグナルペプチド内に任意のアミノ酸残
基を挿入できるように制限酵素ＮｄｅＩとＳｐｅＩの認
識部位を含むように配列番号５のプライマーを設計し
た。増幅したＤＮＡ断片（７）と（８）を図４（図４）
に示したように、それぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩとＮｄｅ
Ｉ、ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して、市販のクロ
ーニングベクターｐＵＣ１１８をＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩで消化して得たベクター部位（９）に組み込み、
ｐＧＨＶ２を作製した（図４（図４））。このプラスミ
ドがコードする中性プロテアーゼ由来のシグナルペプチ
ドは、制限酵素ＳｐｅＩとＮｄｅＩ認識部位を挿入した
ことによりＮ末から８残基目のセリン（Ｓｅｒ）残基が
スレオニン（Ｔｈｒ）残基に置換されている。
【００３０】(2) 改変分泌シグナル配列を持つ２０Ｋｈ
ＧＨ分泌プラスミドの作製 シグナルペプチド配列内の正電荷領域と疎水領域を増強
するために、正電荷アミノ酸としてリジン（Ｌｙｓ）残
基を、疎水性アミノ酸としてロイシン（Ｌｅｕ）残基を
挿入した。この際、疎水領域を構成する疎水性アミノ酸
残基数には分泌効率に至適値があることが水島らにより
報告（Ｈｉｋｉｔａ，Ｃ．＆ Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，
Ｓ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，ｐｐ．４８
８２−４８８８，１９９２）されているため挿入するロ
イシン残基数を変化させた配列番号６から１０までに示
したリンカーＤＮＡを合成した。この合成リンカーをｐ
ＧＨＶ２の制限酵素ＮｄｅＩとＳｐｅＩで挟まれた領域
と置換して、シグナルペプチド配列内に異なるロイシン
残基数を持つ２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドを作製した
（ｐＧＨＶ３，ｐＧＨＶ４，ｐＧＨＶ５，ｐＧＨＶ６，
ｐＧＨＶ７；図５（図５））。改変されたシグナルペプ
チド配列内のアミノ酸配列は、ＡＢＩ社の蛍光プローブ
ＤＮＡシークエンスキットを使って、シグナルペプチド
配列内のアミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列を解読す
ることにより確認した。アミノ酸置換後は上記ｐＧＨＶ
２のスレオニン残基をセリン残基に再置換し、挿入残基
以外はオリジナル配列を維持するようにした。
ＧＨ分泌プラスミドの作製 シグナルペプチド配列内の正電荷領域と疎水領域を増強
するために、正電荷アミノ酸としてリジン（Ｌｙｓ）残
基を、疎水性アミノ酸としてロイシン（Ｌｅｕ）残基を
挿入した。この際、疎水領域を構成する疎水性アミノ酸
残基数には分泌効率に至適値があることが水島らにより
報告（Ｈｉｋｉｔａ，Ｃ．＆ Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，
Ｓ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，ｐｐ．４８
８２−４８８８，１９９２）されているため挿入するロ
イシン残基数を変化させた配列番号６から１０までに示
したリンカーＤＮＡを合成した。この合成リンカーをｐ
ＧＨＶ２の制限酵素ＮｄｅＩとＳｐｅＩで挟まれた領域
と置換して、シグナルペプチド配列内に異なるロイシン
残基数を持つ２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドを作製した
（ｐＧＨＶ３，ｐＧＨＶ４，ｐＧＨＶ５，ｐＧＨＶ６，
ｐＧＨＶ７；図５（図５））。改変されたシグナルペプ
チド配列内のアミノ酸配列は、ＡＢＩ社の蛍光プローブ
ＤＮＡシークエンスキットを使って、シグナルペプチド
配列内のアミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列を解読す
ることにより確認した。アミノ酸置換後は上記ｐＧＨＶ
２のスレオニン残基をセリン残基に再置換し、挿入残基
以外はオリジナル配列を維持するようにした。
【００３１】(3) 改変シグナルペプチドを持つ２０Ｋｈ
ＧＨ分泌プラスミドを使った２０ＫｈＧＨの生産 得られた改変シグナルペプチドを持つ２０ＫｈＧＨ分泌
プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株に形質導入した菌株を
実施例１と同様に培養し、ペリプラズム画分を抽出して
２０ＫｈＧＨ含有量を測定し、培養液１Ｌあたりの生産
量に換算した値を表５（表５）に示した。表中の略号
は、Ｌｙｓ残基をＫ、Ｌｅｕ残基をＬで示している。各
記号の前の数字は挿入後の正電荷領域、及び疎水領域に
存在するリジン残基及びロイシン残基の数を示してい
る。
ＧＨ分泌プラスミドを使った２０ＫｈＧＨの生産 得られた改変シグナルペプチドを持つ２０ＫｈＧＨ分泌
プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株に形質導入した菌株を
実施例１と同様に培養し、ペリプラズム画分を抽出して
２０ＫｈＧＨ含有量を測定し、培養液１Ｌあたりの生産
量に換算した値を表５（表５）に示した。表中の略号
は、Ｌｙｓ残基をＫ、Ｌｅｕ残基をＬで示している。各
記号の前の数字は挿入後の正電荷領域、及び疎水領域に
存在するリジン残基及びロイシン残基の数を示してい
る。
【００３２】
【表５】
【００３３】［実施例４］グルタチオンレダクターゼ（ＧＲ）の共発現とシグナル
ペプチドの改変が２０ＫｈＧＨの分泌に与える効果 (1) シグナルペプチド改変２０ＫｈＧＨ分泌プラスミド
の薬剤耐性マーカーの変更 実施例１と同様にＧＲ発現プラスミドと改変シグナルペ
プチドを持つ２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドを同じ宿主菌
体内に取り込ませて、ＧＲの共発現が２０ＫｈＧＨの分
泌に与える影響を測定するために、改変シグナルペプチ
ドを持つ２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドの持つ薬剤耐性マ
ーカーをアンピシリンからテトラサイクリンへ変更する
必要があった。シグナルペプチドを改変したプラスミド
（ｐＧＨＷ３０，ｐＧＨＶ２，ｐＧＨＶ３，ｐＧＨＶ
４，ｐＧＨＶ５，ｐＧＨＶ６，ｐＧＨＶ７）について全
て同じ操作をするためにｐＧＨＶ５についてのみ記述す
る。まず、市販のクローニングベクターｐＢＲ３２２の
テトラサイクリン遺伝子上流に存在する制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩとＨｉｎｄＩＩＩに挟まれた領域にｐＧＨＶ２の中
性プロテアーゼ由来のプラスミドと改変したシグナルペ
プチドを持つ２０ＫｈＧＨ前駆体をコードする制限酵素
ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで挟まれた約０．８５ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片を直列に挿入するが、中性プロテアーゼ
プロモーターからのリードスルーを防ぐために、２０Ｋ
ｈＧＨをコードするＤＮＡ配列の直後にｔｒｐＡターミ
ネーター配列を付加した。詳しくは、配列番号１１に示
したｔｒｐＡのターミネーターを含む合成リンカーをｐ
ＧＨＶ５の制限酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩで挟まれた部
位に挿入し、ｐＧＨＶ１５を得た（図６（図６））。次
に、ｐＧＨＶ１５を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩ
Ｉで切り出し、約０．８５ｋｂｐのＤＮＡ断片（１０）
を得た。一方、ｐＢＲ３２２を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨ
ｉｎｄＩＩＩで切り出し、ベクター部位（１１）を回収
した。ＤＮＡ断片（１０）とベクター部位（１１）をラ
イゲートして、ｐＧＨＶ２５を作製した（図７（図
７））。しかし、このプラスミドはテトラサイクリン耐
性遺伝子のＨｉｎｄＩＩＩから上流の−３５配列を欠如
しているために、アンピシリン耐性のみ示し、テトラサ
イクリン耐性能を示さなかった。そこで、テトラサイク
リン遺伝子上流に−３５配列を挿入するため、配列番号
１２に示したＤＮＡリンカーを合成し、ｐＧＨＶ２５の
制限酵素ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで挟まれた部位に挿
入し、ｐＧＨＶ３５を作製した（図８（図８））。更
に、ｐＧＨＶ３５の持つアンピシリン耐性遺伝子を欠如
させるために、アンピシリン耐性遺伝子をプロモーター
領域から挟み込むように制限酵素ＥｃｏＲＩとＶｓｐＩ
で挟まれた約０．８ｋｂｐの領域を削除してｐＧＨＶ４
５を作製した（図９（図９））。他の改変シグナルペプ
チドを持つ２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドについても同様
な操作を行いｐＧＨＶ４２，ｐＧＨＶ４３，ｐＧＨＶ４
４，ｐＧＨＶ４６，ｐＧＨＶ４７を作製した。
ペプチドの改変が２０ＫｈＧＨの分泌に与える効果 (1) シグナルペプチド改変２０ＫｈＧＨ分泌プラスミド
の薬剤耐性マーカーの変更 実施例１と同様にＧＲ発現プラスミドと改変シグナルペ
プチドを持つ２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドを同じ宿主菌
体内に取り込ませて、ＧＲの共発現が２０ＫｈＧＨの分
泌に与える影響を測定するために、改変シグナルペプチ
ドを持つ２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドの持つ薬剤耐性マ
ーカーをアンピシリンからテトラサイクリンへ変更する
必要があった。シグナルペプチドを改変したプラスミド
（ｐＧＨＷ３０，ｐＧＨＶ２，ｐＧＨＶ３，ｐＧＨＶ
４，ｐＧＨＶ５，ｐＧＨＶ６，ｐＧＨＶ７）について全
て同じ操作をするためにｐＧＨＶ５についてのみ記述す
る。まず、市販のクローニングベクターｐＢＲ３２２の
テトラサイクリン遺伝子上流に存在する制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩとＨｉｎｄＩＩＩに挟まれた領域にｐＧＨＶ２の中
性プロテアーゼ由来のプラスミドと改変したシグナルペ
プチドを持つ２０ＫｈＧＨ前駆体をコードする制限酵素
ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで挟まれた約０．８５ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片を直列に挿入するが、中性プロテアーゼ
プロモーターからのリードスルーを防ぐために、２０Ｋ
ｈＧＨをコードするＤＮＡ配列の直後にｔｒｐＡターミ
ネーター配列を付加した。詳しくは、配列番号１１に示
したｔｒｐＡのターミネーターを含む合成リンカーをｐ
ＧＨＶ５の制限酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩで挟まれた部
位に挿入し、ｐＧＨＶ１５を得た（図６（図６））。次
に、ｐＧＨＶ１５を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩ
Ｉで切り出し、約０．８５ｋｂｐのＤＮＡ断片（１０）
を得た。一方、ｐＢＲ３２２を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨ
ｉｎｄＩＩＩで切り出し、ベクター部位（１１）を回収
した。ＤＮＡ断片（１０）とベクター部位（１１）をラ
イゲートして、ｐＧＨＶ２５を作製した（図７（図
７））。しかし、このプラスミドはテトラサイクリン耐
性遺伝子のＨｉｎｄＩＩＩから上流の−３５配列を欠如
しているために、アンピシリン耐性のみ示し、テトラサ
イクリン耐性能を示さなかった。そこで、テトラサイク
リン遺伝子上流に−３５配列を挿入するため、配列番号
１２に示したＤＮＡリンカーを合成し、ｐＧＨＶ２５の
制限酵素ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで挟まれた部位に挿
入し、ｐＧＨＶ３５を作製した（図８（図８））。更
に、ｐＧＨＶ３５の持つアンピシリン耐性遺伝子を欠如
させるために、アンピシリン耐性遺伝子をプロモーター
領域から挟み込むように制限酵素ＥｃｏＲＩとＶｓｐＩ
で挟まれた約０．８ｋｂｐの領域を削除してｐＧＨＶ４
５を作製した（図９（図９））。他の改変シグナルペプ
チドを持つ２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドについても同様
な操作を行いｐＧＨＶ４２，ｐＧＨＶ４３，ｐＧＨＶ４
４，ｐＧＨＶ４６，ｐＧＨＶ４７を作製した。
【００３４】(2) 改変シグナルペプチドを持つ２０Ｋｈ
ＧＨ分泌プラスミドとＧＲ発現プラスミドでの２０Ｋｈ
ＧＨの分泌 得られたテトラサイクリン耐性マーカーを持つ改変シグ
ナルペプチドを持つ２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドとＧＲ
発現プラスミドｐＫＫＧＲ１を同時に大腸菌ＪＭ１０９
株に形質導入した菌株をＩＰＴＧ（１ｍＭ）を含む培養
液中に添加して実施例１と同様に培養し、ペリプラズム
画分を抽出して２０ＫｈＧＨ含有量を測定し、培養液１
Ｌあたりの生産量に換算した値を表６（表６）に示し
た。表中の略号は、Ｌｙｓ残基をＫ、Ｌｅｕ残基をＬで
示している。各記号の前の数字は挿入後の正電荷領域及
び疎水領域に存在するリジン残基及びロイシン残基の数
を示している。
ＧＨ分泌プラスミドとＧＲ発現プラスミドでの２０Ｋｈ
ＧＨの分泌 得られたテトラサイクリン耐性マーカーを持つ改変シグ
ナルペプチドを持つ２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドとＧＲ
発現プラスミドｐＫＫＧＲ１を同時に大腸菌ＪＭ１０９
株に形質導入した菌株をＩＰＴＧ（１ｍＭ）を含む培養
液中に添加して実施例１と同様に培養し、ペリプラズム
画分を抽出して２０ＫｈＧＨ含有量を測定し、培養液１
Ｌあたりの生産量に換算した値を表６（表６）に示し
た。表中の略号は、Ｌｙｓ残基をＫ、Ｌｅｕ残基をＬで
示している。各記号の前の数字は挿入後の正電荷領域及
び疎水領域に存在するリジン残基及びロイシン残基の数
を示している。
【００３５】
【表６】 改変シグナルペプチドを持つ２０ＫｈＧＨ分泌プラスミ
ドの中で最も高い分泌量を示したものはｐＧＨＶ４５で
あった。
ドの中で最も高い分泌量を示したものはｐＧＨＶ４５で
あった。
【００３６】［実施例５］改変シグナルペプチドを持つ２０ＫｈＧＨ遺伝子とＧＲ
遺伝子を同一プラスミド内に持つ分泌プラスミドでの２
０ＫｈＧＨの生産 (1) 改変シグナルペプチドを持つ２０ＫｈＧＨ遺伝子と
ＧＲ遺伝子を同一プラスミド内に持つ分泌プラスミドｐ
ＧＨＶ４５ＧＲの作製 ｐＫＫＧＲ１のｔａｃプロモーター、ＧＲ遺伝子及びＴ
ｒｒｎＢターミネーターを含む領域を配列番号１３，１
４に示した合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして
ＰＣＲ増幅して約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片（１２）を
得た。このＤＮＡ断片の両端には制限酵素ＡｖａＩとＡ
ｃｃＩＩＩの認識配列が存在するようにプライマーを設
計した。ｐＧＨＶ４５を制限酵素ＡｖａＩとＡｃｃＩＩ
Ｉで消化した部位に、ＧＲ遺伝子発現領域を含むＤＮＡ
断片（１２）を挿入してｐＧＨＶ４５ＧＲを作製した
（図１０（図１０））。
遺伝子を同一プラスミド内に持つ分泌プラスミドでの２
０ＫｈＧＨの生産 (1) 改変シグナルペプチドを持つ２０ＫｈＧＨ遺伝子と
ＧＲ遺伝子を同一プラスミド内に持つ分泌プラスミドｐ
ＧＨＶ４５ＧＲの作製 ｐＫＫＧＲ１のｔａｃプロモーター、ＧＲ遺伝子及びＴ
ｒｒｎＢターミネーターを含む領域を配列番号１３，１
４に示した合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして
ＰＣＲ増幅して約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片（１２）を
得た。このＤＮＡ断片の両端には制限酵素ＡｖａＩとＡ
ｃｃＩＩＩの認識配列が存在するようにプライマーを設
計した。ｐＧＨＶ４５を制限酵素ＡｖａＩとＡｃｃＩＩ
Ｉで消化した部位に、ＧＲ遺伝子発現領域を含むＤＮＡ
断片（１２）を挿入してｐＧＨＶ４５ＧＲを作製した
（図１０（図１０））。
【００３７】(2) 改変シグナルペプチドを持つ２０Ｋｈ
ＧＨ遺伝子とＧＲ遺伝子が同一プラスミド内に存在する
分泌プラスミドｐＧＨＶ４５ＧＲを使った２０ＫｈＧＨ
の生産 ｐＧＨＶ４５ＧＲを形質導入した大腸菌各種菌株を実施
例１と同様に培養し、ペリプラズム画分を抽出して２０
ＫｈＧＨ含有量を測定し、培養液１Ｌあたりの生産量
（ｍｇ）に換算した値を表７（表７）に示す。
ＧＨ遺伝子とＧＲ遺伝子が同一プラスミド内に存在する
分泌プラスミドｐＧＨＶ４５ＧＲを使った２０ＫｈＧＨ
の生産 ｐＧＨＶ４５ＧＲを形質導入した大腸菌各種菌株を実施
例１と同様に培養し、ペリプラズム画分を抽出して２０
ＫｈＧＨ含有量を測定し、培養液１Ｌあたりの生産量
（ｍｇ）に換算した値を表７（表７）に示す。
【００３８】
【表７】
【００３９】ＪＭ１０９を宿主とした場合には、実施例
１、実施例２、実施例３での２つの異なるプラスミドを
使用した場合の実験結果と異なり、ＩＰＴＧを培地中に
添加した場合、分泌量は逆に低下した。この分泌量が低
下した培養菌体の超音波破砕液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気
泳動により分析したところ、ＧＲが極端に高発現されて
いることが判明した。それに対して、ＩＰＴＧを培地中
に添加しない非誘導培養条件では高い分泌量が得られ
た。この培養菌体を同様に分析したところ、ＧＲの発現
量は、誘導培養条件のＧＲ発現量に比べ低いことが確認
された。これらの結果から、ＪＭ１０９宿主で２０Ｋｈ
ＧＨとＧＲ遺伝子を同一プラスミド内に存在させた形質
転換体においては、ＩＰＴＧを培地中に添加しない条件
が好ましいことが判明した。ＧＲはｔａｃプロモ−タ−
により発現されるが、宿主がＪＭ１０９の場合にはＩＰ
ＴＧ添加による誘導はＧＲの極端な高発現を生じ、分泌
量の低下を引き起こしたと考えられた。Ｗ３１１０を宿
主とした形質転換体は、表７（表７）に示した様にＩＰ
ＴＧの誘導、非誘導共に低い分泌量しか得られなかっ
た。この培養菌体の超音波破砕液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電
気泳動で分析したところ、ＧＲの極端な高発現が確認で
きた。ＨＢ１０１を宿主に使用した際も同様の結果を得
た。ＪＭ１０９とＷ３１１０という宿主の違いによる上
述のような差異が生じる原因として宿主の染色体上のｌ
ａｃＩqの有無が影響していることが予想された。即
ち、ＪＭ１０９はｔａｃプロモーターのリプレッサーと
して働くｌａｃＩq遺伝子を有しているのに対して、Ｗ
３１１０は同遺伝子を有していない。この仮説は、宿主
としてＲＢ７９１を用いた以下の実験により正しいこと
が確認された。ＲＢ７９１（ＡＴＣＣ ５３６２２）
は、Ｗ３１１０にｌａｃＩq遺伝子が染色体に組み込ま
れた菌株であり、その他は同一の性状の菌株である。こ
のＲＢ７９１を用いた場合、ＪＭ１０９と同様にＩＰＴ
Ｇ誘導の培養条件においては２０ＫｈＧＨの分泌量は低
下し、電気泳動でＧＲの高発現は確認された。ＩＰＴＧ
非誘導条件では高い分泌量が得られ、電気泳動でＧＲの
過剰な発現は無いことが確認された。
１、実施例２、実施例３での２つの異なるプラスミドを
使用した場合の実験結果と異なり、ＩＰＴＧを培地中に
添加した場合、分泌量は逆に低下した。この分泌量が低
下した培養菌体の超音波破砕液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気
泳動により分析したところ、ＧＲが極端に高発現されて
いることが判明した。それに対して、ＩＰＴＧを培地中
に添加しない非誘導培養条件では高い分泌量が得られ
た。この培養菌体を同様に分析したところ、ＧＲの発現
量は、誘導培養条件のＧＲ発現量に比べ低いことが確認
された。これらの結果から、ＪＭ１０９宿主で２０Ｋｈ
ＧＨとＧＲ遺伝子を同一プラスミド内に存在させた形質
転換体においては、ＩＰＴＧを培地中に添加しない条件
が好ましいことが判明した。ＧＲはｔａｃプロモ−タ−
により発現されるが、宿主がＪＭ１０９の場合にはＩＰ
ＴＧ添加による誘導はＧＲの極端な高発現を生じ、分泌
量の低下を引き起こしたと考えられた。Ｗ３１１０を宿
主とした形質転換体は、表７（表７）に示した様にＩＰ
ＴＧの誘導、非誘導共に低い分泌量しか得られなかっ
た。この培養菌体の超音波破砕液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電
気泳動で分析したところ、ＧＲの極端な高発現が確認で
きた。ＨＢ１０１を宿主に使用した際も同様の結果を得
た。ＪＭ１０９とＷ３１１０という宿主の違いによる上
述のような差異が生じる原因として宿主の染色体上のｌ
ａｃＩqの有無が影響していることが予想された。即
ち、ＪＭ１０９はｔａｃプロモーターのリプレッサーと
して働くｌａｃＩq遺伝子を有しているのに対して、Ｗ
３１１０は同遺伝子を有していない。この仮説は、宿主
としてＲＢ７９１を用いた以下の実験により正しいこと
が確認された。ＲＢ７９１（ＡＴＣＣ ５３６２２）
は、Ｗ３１１０にｌａｃＩq遺伝子が染色体に組み込ま
れた菌株であり、その他は同一の性状の菌株である。こ
のＲＢ７９１を用いた場合、ＪＭ１０９と同様にＩＰＴ
Ｇ誘導の培養条件においては２０ＫｈＧＨの分泌量は低
下し、電気泳動でＧＲの高発現は確認された。ＩＰＴＧ
非誘導条件では高い分泌量が得られ、電気泳動でＧＲの
過剰な発現は無いことが確認された。
【００４０】［実施例６］ｌａｃＩq遺伝子を持たない宿主菌株での利用 実施例５で大腸菌宿主として不適当であったＷ３１１０
及びＨＢ１０１を利用可能にするための検討を以下の記
述の通り実施した。(1) 改変シグナルペプチドを持つ２０ＫｈＧＨ遺伝子と
ＧＲ遺伝子を同一プラスミド内に持ち、ｌａｃＩq遺伝
子を持たない宿主（Ｗ３１１０あるいはＨＢ１０１）で
も有効な分泌プラスミドｐＧＨＲ１０の作製 ２０ＫｈＧＨ遺伝子発現領域と同一レプリコン上にｌａ
ｃＩq遺伝子を組み込むために市販の発現ベクターｐＴ
ｒｃ９９Ａ（ファルマシア社）のｌａｃＩq遺伝子を配
列番号１５，１６に示した合成オリゴヌクレオチドをプ
ライマーとしたＰＣＲ増幅を行いＤＮＡ断片（１３）を
得た。このＤＮＡ断片（１３）の両端には制限酵素Ｅｃ
ｏＴ１４ＩとＡｖａＩの認識部位が付加されるようにプ
ライマーを設計した。ｐＧＨＶ５６ＧＲを制限酵素Ｅｃ
ｏＴ１４ＩとＡｖａＩで消化し、ベクターフラグメント
（１４）を回収した。このベクターフラグメント（１
４）とｌａｃＩq遺伝子を含むＤＮＡ断片（１３）をラ
イゲートしてｐＧＨＲ１０を作製した（図１１（図１
１））。挿入したｌａｃＩq遺伝子はＲＢＳ配列（リボ
ゾーム結合領域）のみを含みプロモーター領域を持たな
いため、上流のテトラサイクリン耐性遺伝子のリードス
ルーにより転写発現される。
及びＨＢ１０１を利用可能にするための検討を以下の記
述の通り実施した。(1) 改変シグナルペプチドを持つ２０ＫｈＧＨ遺伝子と
ＧＲ遺伝子を同一プラスミド内に持ち、ｌａｃＩq遺伝
子を持たない宿主（Ｗ３１１０あるいはＨＢ１０１）で
も有効な分泌プラスミドｐＧＨＲ１０の作製 ２０ＫｈＧＨ遺伝子発現領域と同一レプリコン上にｌａ
ｃＩq遺伝子を組み込むために市販の発現ベクターｐＴ
ｒｃ９９Ａ（ファルマシア社）のｌａｃＩq遺伝子を配
列番号１５，１６に示した合成オリゴヌクレオチドをプ
ライマーとしたＰＣＲ増幅を行いＤＮＡ断片（１３）を
得た。このＤＮＡ断片（１３）の両端には制限酵素Ｅｃ
ｏＴ１４ＩとＡｖａＩの認識部位が付加されるようにプ
ライマーを設計した。ｐＧＨＶ５６ＧＲを制限酵素Ｅｃ
ｏＴ１４ＩとＡｖａＩで消化し、ベクターフラグメント
（１４）を回収した。このベクターフラグメント（１
４）とｌａｃＩq遺伝子を含むＤＮＡ断片（１３）をラ
イゲートしてｐＧＨＲ１０を作製した（図１１（図１
１））。挿入したｌａｃＩq遺伝子はＲＢＳ配列（リボ
ゾーム結合領域）のみを含みプロモーター領域を持たな
いため、上流のテトラサイクリン耐性遺伝子のリードス
ルーにより転写発現される。
【００４１】(2) 改変シグナルペプチドを持つ２０Ｋｈ
ＧＨ遺伝子とＧＲ遺伝子が同一プラスミド内に存在しｌ
ａｃＩq遺伝子によりＧＲの発現が制御される分泌プラ
スミドｐＧＨＲ１０を使った２０ＫｈＧＨの生産 ｐＧＨＲ１０を各々の大腸菌株に形質導入した大腸菌形
質転換株を実施例１と同様に培養し、ペリプラズム画分
を抽出して２０ＫｈＧＨ含有量を測定し、培養液１Ｌあ
たりの生産量（ｍｇ）に換算した値を表８（表８）に示
した。大腸菌形質転換株のうち、ｐＧＨＲ１０を大腸菌
Ｗ３１１０株に導入した菌株（ＭＴ−１０７６５）はＦ
ＥＲＭ ＢＰ−５０２０として工業技術院生命工学工業
技術研究所に寄託されている。ＨＢ１０１株は宝酒造よ
り購入した。ＬＥ３９２株（ＡＴＣＣ ３３５７２）は
アメリカン・タイプカルチャー・コレクションより購入
した。
ＧＨ遺伝子とＧＲ遺伝子が同一プラスミド内に存在しｌ
ａｃＩq遺伝子によりＧＲの発現が制御される分泌プラ
スミドｐＧＨＲ１０を使った２０ＫｈＧＨの生産 ｐＧＨＲ１０を各々の大腸菌株に形質導入した大腸菌形
質転換株を実施例１と同様に培養し、ペリプラズム画分
を抽出して２０ＫｈＧＨ含有量を測定し、培養液１Ｌあ
たりの生産量（ｍｇ）に換算した値を表８（表８）に示
した。大腸菌形質転換株のうち、ｐＧＨＲ１０を大腸菌
Ｗ３１１０株に導入した菌株（ＭＴ−１０７６５）はＦ
ＥＲＭ ＢＰ−５０２０として工業技術院生命工学工業
技術研究所に寄託されている。ＨＢ１０１株は宝酒造よ
り購入した。ＬＥ３９２株（ＡＴＣＣ ３３５７２）は
アメリカン・タイプカルチャー・コレクションより購入
した。
【００４２】
【表８】 ２０ＫｈＧＨ遺伝子発現領域とＧＲ遺伝子が同一レプリ
コン上に存在し、ＧＲの発現プロモ−タ−（ｔａｃ）に
よる発現を抑制するｌａｃＩq遺伝子を、同一プラスミ
ド上に存在させたｐＧＨＲ１０を利用することにより、
ｌａｃＩq遺伝子を染色体上に持たない宿主菌株の使用
も可能になった。
コン上に存在し、ＧＲの発現プロモ−タ−（ｔａｃ）に
よる発現を抑制するｌａｃＩq遺伝子を、同一プラスミ
ド上に存在させたｐＧＨＲ１０を利用することにより、
ｌａｃＩq遺伝子を染色体上に持たない宿主菌株の使用
も可能になった。
【００４３】
【発明の効果】本発明の方法により、微生物において分
泌生産が困難であった組換え蛋白質、とりわけ哺乳動物
由来の組換え蛋白質のペリプラズムへの効率よい分泌生
産が可能となる。また、本発明の方法は、大腸菌を宿主
としてた遺伝子組換え技術による２０ＫｈＧＨの生産性
を向上させることができる。
泌生産が困難であった組換え蛋白質、とりわけ哺乳動物
由来の組換え蛋白質のペリプラズムへの効率よい分泌生
産が可能となる。また、本発明の方法は、大腸菌を宿主
としてた遺伝子組換え技術による２０ＫｈＧＨの生産性
を向上させることができる。
【００４４】本発明の方法は、組換え蛋白質の菌体内生
産においても生産性を向上させる可能性がある。
産においても生産性を向上させる可能性がある。
【００４５】
【００４６】配列番号：１ 配列の長さ：３４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Gly Leu Gly Lys Lys Lys Lys Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser -30 -25 -20 Ser Ala Val Ala Ala Ser Phe Met Ser Leu Thr Ile Ser Leu Pro -15 -10 -5 Gly Val Gln Ala -1
【００４７】配列番号：２ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCTGAATTCA TGACTAAACA CTATG 25
【００４８】配列番号：３ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AAACTGCAGT TAACGCATTG TCACG 25
【００４９】配列番号：４ 配列の長さ：４３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGGGGATTTC ATATGGGTTT AGGTAAGAAA TTGACTAGTG CTG 43
【００５０】配列番号：５ 配列の長さ：４３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAGCACTAGT CAATTTCTTA CCTAAACCCA TATGAAATCC CCC 43
【００５１】配列番号：６ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TATGGGTTTA GGTAAGAAAA AGAAATTGTC TAG 33
【００５２】配列番号：７ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TATGGGTTTA GGTAAGAAAA AGAAACTCCT ACTGTCTAG 39
【００５３】配列番号：８ 配列の長さ：４８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TATGGGTTTA GGTAAGAAAA AGAAATTGTT ACTTCTCCTA CTGTCTAG 48
【００５４】配列番号：９ 配列の長さ：５１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TATGGGTTTA GGTAAGAAAA AGAAATTGTT ACTTCTCCTA TTGCTGTCTA G 51
【００５５】配列番号：１０ 配列の長さ：５７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TATGGGTTTA GGTAAGAAAA AGAAATTGTT ACTTCTCCTA TTGTTACTTC TGTCTAG 57
【００５６】配列番号：１１ 配列の長さ：５７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATCCCTAAC TAATTAAGCC CGCCTAATGA GCGGGCTTTT TTTTGCGGCC GCTCTAG 57
【００５７】配列番号：１２ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTAGATTCTC ATGTTTGACA GCTTATCATC GATAAGCT 38
【００５８】配列番号：１３ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTCTCGGGC TGTGCAGGTC GTAAATC 27
【００５９】配列番号：１４ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGATCCGGAG CAAAAACAGG AAGGC 25
【００６０】配列番号：１５ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTCCTTGGC CGGAAGAGAG TCAATTCAGG 30
【００６１】配列番号：１６ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AAACCCGAGT CACTGCCCGC TTTCCAGTCG 30
【００６２】配列番号：１７ 配列の長さ：６２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTTCAGGCCT TCCCAACTAT ACCACTTTCG CGCCTATTCG ATAACGCAAT GCTACGTGCT 60 CA 62
【図１】図１はＧＲ発現プラスミドｐＫＫＧＲ１の作製
法を示した模式図である。
法を示した模式図である。
【図２】図２は２２ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＷ３
００の作製法を示した模式図である。
００の作製法を示した模式図である。
【図３】図３は中性プロテアーゼ由来のシグナルペプチ
ド改変に使用した２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＶ
２の作製法の一部を示した模式図である。
ド改変に使用した２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＶ
２の作製法の一部を示した模式図である。
【図４】図４は中性プロテアーゼ由来のシグナルペプチ
ド改変に使用した２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＶ
２の作製法の一部を示した模式図である。
ド改変に使用した２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＶ
２の作製法の一部を示した模式図である。
【図５】図５は改変した中性プロテアーゼ由来のシグナ
ルペプチドを持つ２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドの作製法
を示した模式図である。
ルペプチドを持つ２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドの作製法
を示した模式図である。
【図６】図６は薬剤耐性マーカーを有する２０ＫｈＧＨ
分泌プラスミドの作製法の一部を示した模式図である。
分泌プラスミドの作製法の一部を示した模式図である。
【図７】図７は薬剤耐性マーカーを有する２０ＫｈＧＨ
分泌プラスミドの作製法の一部を示した模式図である。
分泌プラスミドの作製法の一部を示した模式図である。
【図８】図８は薬剤耐性マーカーを有する２０ＫｈＧＨ
分泌プラスミドの作製法の一部を示した模式図である。
分泌プラスミドの作製法の一部を示した模式図である。
【図９】図９は薬剤耐性マーカーを有する２０ＫｈＧＨ
分泌プラスミドの作製法の一部を示した模式図である。
分泌プラスミドの作製法の一部を示した模式図である。
【図１０】図１０は改変シグナルペプチドを持つ２０Ｋ
ｈＧＨ遺伝子とＧＲ遺伝子を同一プラスミド内に含む分
泌プラスミドｐＧＨＶ４５ＧＲの作製法を示した模式図
である。
ｈＧＨ遺伝子とＧＲ遺伝子を同一プラスミド内に含む分
泌プラスミドｐＧＨＶ４５ＧＲの作製法を示した模式図
である。
【図１１】図１１は改変シグナルペプチドを持つ２０Ｋ
ｈＧＨ遺伝子とＧＲ遺伝子を同一プラスミド内に含み、
ｌａｃＩq遺伝子を持たない宿主菌株でも利用可能な分
泌プラスミドｐＧＲ１０の作製法を示した模式図であ
る。
ｈＧＨ遺伝子とＧＲ遺伝子を同一プラスミド内に含み、
ｌａｃＩq遺伝子を持たない宿主菌株でも利用可能な分
泌プラスミドｐＧＲ１０の作製法を示した模式図であ
る。
Ｐtac ｔａｃプロモーター領域 ＳＤ リボゾーム結合領域 ＴrrnB ｒｒｎＢ転写ターミネーター領域 Ａｍｐr アンピシリン耐性遺伝子領域 ｐＢＲ３２２ ｏｒｉ： ｐＢＲ３２２の複製オリジン
領域 ＧＲ グルタチオンレダクターゼ遺伝子 ＰNP バチルス・アミロリキファシエンスの
中性プロテアーゼ遺伝子のプロモーター領域 ＳＳ バチルス・アミロリキファシエンスの
中性プロテアーゼ遺伝子のシグナルペプチド及び改変型
シグナルペプチドをコードする領域 ２２ＫｈＧＨ 約２２０００のヒト成長ホルモン遺伝
子 ｐＵＢ１１０ ｏｒｉ： ｐＵＢ１１０の複製オリジン
領域 ＴNP バチルス・アミロリキファシエンスの
中性プロテアーゼ遺伝子の転写ターミネーター領域 ２０ＫｈＧＨ 約２００００のヒト成長ホルモン遺伝
子 Ｔｅｔr テトラサイクリン耐性遺伝子領域 ｌａｃＺ βーガラクトシダーゼ遺伝子領域 ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ： ＣｏｌＥ１の複製オリジン領
域 Ｔtrp ｔｒｐＡ遺伝子の転写ターミネーター
領域 ｌａｃＩq ｌａｃＩq遺伝子
領域 ＧＲ グルタチオンレダクターゼ遺伝子 ＰNP バチルス・アミロリキファシエンスの
中性プロテアーゼ遺伝子のプロモーター領域 ＳＳ バチルス・アミロリキファシエンスの
中性プロテアーゼ遺伝子のシグナルペプチド及び改変型
シグナルペプチドをコードする領域 ２２ＫｈＧＨ 約２２０００のヒト成長ホルモン遺伝
子 ｐＵＢ１１０ ｏｒｉ： ｐＵＢ１１０の複製オリジン
領域 ＴNP バチルス・アミロリキファシエンスの
中性プロテアーゼ遺伝子の転写ターミネーター領域 ２０ＫｈＧＨ 約２００００のヒト成長ホルモン遺伝
子 Ｔｅｔr テトラサイクリン耐性遺伝子領域 ｌａｃＺ βーガラクトシダーゼ遺伝子領域 ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ： ＣｏｌＥ１の複製オリジン領
域 Ｔtrp ｔｒｐＡ遺伝子の転写ターミネーター
領域 ｌａｃＩq ｌａｃＩq遺伝子
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｈ 21/04 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (19)
- 【請求項１】 大腸菌を宿主として組換え蛋白質をペリ
プラズムに分泌生産させることにおいて、人為的にグル
タチオンレダクターゼを組換え蛋白質と共発現させるこ
とを特徴とする組換え蛋白質の分泌生産方法。 - 【請求項２】 人為的に共発現されるグルタチオンレダ
クターゼが大腸菌由来であることを特徴とする請求項１
に記載の分泌生産方法。 - 【請求項３】 グルタチオンレダクターゼ遺伝子と組換
え蛋白質をコードする遺伝子が同一のレプリコンに存在
している請求項１項或いは請求項２に記載の分泌生産方
法。 - 【請求項４】 グルタチオンレダクターゼ遺伝子と組換
え蛋白質をコードする遺伝子が各々異なるレプリコンに
存在している請求項１項或いは請求項２に記載の分泌生
産方法。 - 【請求項５】 大腸菌を宿主として分子量約２００００
のヒト成長ホルモンをペリプラズムに分泌生産させるこ
とにおいて、人為的にグルタチオンレダクターゼを分子
量約２００００のヒト成長ホルモンと共発現させること
を特徴とする分子量約２００００のヒト成長ホルモンの
分泌生産方法。 - 【請求項６】 人為的に発現されるグルタチオンレダク
ターゼが大腸菌由来であることを特徴とする請求項５に
記載の分泌生産方法。 - 【請求項７】 グルタチオンレダクターゼ遺伝子と分子
量約２００００のヒト成長ホルモンをコードする遺伝子
が同一のレプリコンに存在している請求項５或いは請求
項６に記載の分泌生産方法。 - 【請求項８】 グルタチオンレダクターゼ遺伝子と分子
量約２００００のヒト成長ホルモンをコードする遺伝子
が各々異なるレプリコンに存在している請求項５或いは
請求項６に記載の分泌生産方法。 - 【請求項９】 分子量約２００００のヒト成長ホルモン
の分泌に関与するシグナルペプチドが配列表の配列番号
１に記載のアミノ酸配列である請求項５或いは請求項６
に記載の分泌生産方法。 - 【請求項１０】 組換え蛋白質をペリプラズムに分泌生
産させることのできる組換え体大腸菌であって、人為的
にグルタチオンレダクターゼを組換え蛋白質と共発現し
ていることを特徴とする組換え体大腸菌。 - 【請求項１１】 人為的に発現されるグルタチオンレダ
クターゼが大腸菌由来であることを特徴とする請求項１
０に記載の組換え体大腸菌。 - 【請求項１２】 グルタチオンレダクターゼ遺伝子と組
換え蛋白質をコードする遺伝子が同一のレプリコンに存
在している請求項１０或いは請求項１１に記載の組換え
体大腸菌。 - 【請求項１３】 グルタチオンレダクターゼ遺伝子と組
換え蛋白質をコードする遺伝子が各々異なるレプリコン
に存在している請求項１０或いは請求項１１に記載の組
換え体大腸菌。 - 【請求項１４】 分子量約２００００のヒト成長ホルモ
ンをペリプラズムに分泌生産させることのできる組換え
体大腸菌であって、人為的にグルタチオンレダクターゼ
を分子量約２００００のヒト成長ホルモンと共発現して
いることを特徴とする組換え体大腸菌。 - 【請求項１５】 人為的に発現されるグルタチオンレダ
クターゼが大腸菌由来であることを特徴とする請求項１
４に記載の組換え体大腸菌。 - 【請求項１６】 グルタチオンレダクターゼ遺伝子と分
子量約２００００のヒト成長ホルモンをコードする遺伝
子が同一のレプリコンに存在している請求項１４或いは
請求項１５に記載の組換え体大腸菌。 - 【請求項１７】 グルタチオンレダクターゼ遺伝子と分
子量約２００００のヒト成長ホルモンをコードする遺伝
子が各々異なるレプリコンに存在している請求項１４或
いは請求項１５に記載の組換え体大腸菌。 - 【請求項１８】 分子量約２００００のヒト成長ホルモ
ンの分泌に関与するシグナルペプチドが配列表の配列番
号１に記載のアミノ酸配列である請求項１４或いは請求
項１５に記載の組換え体大腸菌。 - 【請求項１９】 組換え体大腸菌がＦＥＲＭ ＢＰ−５
０２０である請求項１８に記載の組換え体大腸菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8072166A JPH08322586A (ja) | 1995-03-29 | 1996-03-27 | 蛋白質の分泌生産方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7-71033 | 1995-03-29 | ||
| JP7103395 | 1995-03-29 | ||
| JP8072166A JPH08322586A (ja) | 1995-03-29 | 1996-03-27 | 蛋白質の分泌生産方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08322586A true JPH08322586A (ja) | 1996-12-10 |
Family
ID=26412149
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8072166A Withdrawn JPH08322586A (ja) | 1995-03-29 | 1996-03-27 | 蛋白質の分泌生産方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08322586A (ja) |
-
1996
- 1996-03-27 JP JP8072166A patent/JPH08322586A/ja not_active Withdrawn
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