JPH08322915A - 病原体の失活方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は細菌、真菌類、胞子およびウィルス
に対し有効な病原体の失活方法を提供することを目的と
する。 【構成】 本発明による病原体の失活方法はペルオキシ
ダーゼ酵素を用いる。このペルオキシダーゼ酵素を過酸
化水素または過酸化水素および沃素陰イオンの原料と反
応させて反応生成物を生ぜしめ、これをペルオキシダー
ゼ酵素から分離し、次いで病原性生物を失活させるべく
使用する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】広義において本発明は病原体の失
活方法に関するものである。その目的で本発明の方法は
ペルオキシダーゼ酵素を用いる。

【０００２】

【従来の技術】水性環境にて酵素ペルオキシダーゼとド
ナー分子と過酸化物とを用いる化学系が米国特許第４，
４７６，２３１号；第４，４７３，５５０号；および第
４，５８８，５６８号に教示されている。ドナー分子が
沃化物である場合、ペルオキシダーゼは過酸化水素から
水への還元を触媒すると共に沃素陰イオンの酸化を伴
う。この系は酵素的に反応生成物および反応副生物を有
する水性環境を発生して、病原性生物を失活させる。こ
の化学系で発生した溶液は（１）酵素発生した活性成分
と、（２）初期濃度から減少したレベルの沃化物と、
（３）初期濃度から減少したレベルの過酸化物と、
（４）初期使用濃度における蛋白質ペルオキシダーゼと
を含有する。

【０００３】ペルオキシダーゼは各種の原料から分離す
ることができ、その性質は原料に応じて変化する。ペル
オキシダーゼの分子量はＮＡＤＨペルオキシダーゼの１
２，０００ダルトンからミエロペルオキシダーゼの１４
９，０００までの範囲である。米国特許第４，４７６，
２３１号；第４，４７３，５５０号；および第４，５８
８，５８６号に教示されたペルオキシダーゼは、酵素委
員会（Ｅ．Ｃ．）の分類１．１１．１．７に入るペルオ
キシダーゼである。価格および安定性の実際的配慮か
ら、Ｅ．Ｃ． １．１１．１．７の分類に入る好適ペル
オキシダーゼとして西洋ワサビペルオキシダーゼがあ
る。西洋ワサビペルオキシダーゼは約４０，０００ダル
トンの分子量を有する。

【０００４】たとえばミエロペルオキシダーゼおよびチ
トクロームＣペルオキシダーゼのような数種の例外を除
き、ペルオキシダーゼはグリコ蛋白である。１０，００
０ダルトンより大きい分子量を有するグリコ蛋白は、動
物で免疫原として作用することが知られている。西洋ワ
サビペルオキシダーゼは効果的な免疫原であると知ら
れ、この蛋白質に対する抗体を市販購入することができ
る。事実、ペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ可溶
性複合体が試薬として販売されており、（１）凍結もし
くはパラフィン埋込み組織セクションにおける免疫組織
学的用途、（２）電子顕微鏡、および（３）免疫ブロッ
トに使用される。ポリクローナルおよびモノクローナル
抗体の両者が西洋ワサビペルオキシダーゼに利用でき
る。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】ペルオキシダーゼと外
傷もしくは組織との反復接触は抗ペルオキシダーゼ抗体
を形成させる。抗−ペルオキシダーゼ抗体が動物内で形
成されると、その後のペルオキシダーゼに対する露呈は
アレルギー反応を生ぜしめる。この種のアレルギー反応
は、異物巨大分子により発生する即座型および遅延型の
アレルギー反応の全スペクトルを有しうる。これら反応
は剥離性皮膚炎、じんま疹および乾皮症、発熱、喘息お
よび過敏性を包含する。

【０００６】直接的にも或いは間接的にも動物もしくは
人間の外傷、組織もしくは器官と接触する滅菌剤は免疫
原性蛋白を含有してはならないことが明かである。した
がってペルオキシダーゼ免疫原性は、上記米国特許に記
載された組成物につき、この種の使用に対し問題であ
る。本出願は米国特許第４，４７６，２３１号；第４，
４７３，５５０号；および第４，５８８，５８６号に記
載された活性化学系を形成する方法を説明すると共に、
動物および人間におけるアレルギー反応の潜在力を最小
化もしくは排除する。本出願に記載された方法は細菌、
真菌類、胞子およびウィルスに対し効果的である。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明の基本的特徴は、
ペルオキシダーゼ酵素を用いて過酸化水素と沃化物との
水性原料よりなる基質の存在下に反応生成物を生成させ
ることである。次いで未反応基質および反応生成物を好
ましくは分離工程によりペルオキシダーゼ酵素から単離
して、病原体を失活させるための殺生物剤の独立源を形
成させる。本発明によれば、酵素ペルオキシダーゼを先
ず最初に固体の支持体に固定化させた後、これを水性過
酸化物および沃化物原料と反応させて反応生成物を発生
させ、次いでこれらを分離工程によりペルオキシダーゼ
から単離する。本発明の目的で、沃素陰イオンの酸化程
度が反応生成物を規定する。

【０００８】広義において本発明は、固定化ペルオキシ
ダーゼ酵素を固体の支持体に固定化し；固定化ペルオキ
シダーゼ酵素を過酸化水素および沃化物の原料と水性媒
体中で接触させて沃素陰イオンの酸化から反応生成物を
生成させ；前記反応生成物をペルオキシダーゼ酵素から
単離して前記ペルオキシダーゼ酵素とは独立した殺生物
剤として作用させ；病原性生物を前記反応生成物と接触
させることを特徴とする病原体の失活方法である。

【０００９】或いは、非固定化ペルオキシダーゼ酵素を
透析チューブに入れると共に、水性媒体における過酸化
水素および沃化物の原料を、沃素陰イオンの酸化から反
応生成物を生成させる目的で透析チューブを通して酵素
まで拡散させた後、前記反応生成物を透析チューブを通
して逆拡散させ、これにより非固定化ペルオキシダーゼ
から分離することもできる。この方法は可能であるが融
通性を与えず、固定化酵素の使用に固有のプロセス制御
を与えない。

【００１０】本発明の基本的特徴は、病原性生物を失活
させるための表面にペルオキシダーゼ反応生成物を施す
前に、ペルオキシダーゼをその反応生成物から物理的に
分離することにある。本発明は、この分離を達成するた
めの固定化酵素の使用につき説明する。酵素および蛋白
質は種々異なる手段によって固体支持体に固定化するこ
とができる。１つの方法は、蛋白質と固体支持体との間
の共有結合を確立することである。他の方法は、興味あ
る蛋白質にしっかり結合する固体支持体に対し薬剤を共
有結合させることである。この手段により、興味ある蛋
白質は結合剤と接触する際にしっかり結合される。固体
支持体に結合した後、酵素はその基質を固定化蛋白質と
接触させた際に反応を触媒することができる。固定化酵
素の触媒作用速度または比活性は典型的には、多くの因
子（少なくとも基質に対する拡散の制約）により溶液に
おける対応の比活性よりも低い。

【００１１】広範な種類の固体支持体が酵素を固定化す
べく使用されており、たとえば多孔質ガラス、紙、ウー
ル、金、銀、磁気粒子、ラテックス、アガロース、ポリ
（ヒドロキシメタクリレート）、ポリアクリルアミドお
よび他の多孔質ポリマーを包含する。典型的には固体支
持体は、先ず最初に固体支持体が蛋白質の特定反応基に
対し化学結合を形成しうる官能基を有するよう化学剤に
より改変（「活性化」）される。臭化シアノゲンが、蛋
白質を固定化すべくアガロース支持体と共に使用される
第１活性化剤の１種であった。現在では、広範な種類の
官能基化学系が存在し、酵素を固定化すべく固体支持体
に対し蛋白質を結合させるよう使用することができる。
これら薬品群はエポキシル誘導体、マレイミド、オキシ
ラン、ヒドラジド、クロル蟻酸ｐ−ニトロフェニルおよ
び他のハロアセチル誘導体、ジビニルスルホン、エピク
ロルヒドリン、並びにＮ−ヒドロキシスクシンイミドを
包含するスクシニミジルエステルを包含する。

【００１２】固定化酵素の使用には、カラムが最も一般
的な物理的形態である。カラム処理においては、酵素基
質を含有する液体を固定化酵素を含有する充填カラムに
通過させる。液体の流速を綿密に制御すると共に、カラ
ムの１端部に存在する入口ポートにポンプ輸送する。反
応の生成物をカラムの反対側における出口ポートにてカ
ラムから回収する。或いは、生成物を固定化酵素カラム
に逆ポンプ輸送することもできる。固定化酵素につき使
用される他の物理的形態はバッチ処理である。バッチ処
理は、固体マトリックスを反応基質を含有する溶液に懸
濁させ、次いで固体マトリックスをたとえば濾過のよう
な物理的技術により反応がその所望の完結段階に達した
後に除去することによって行われる。

【００１３】本発明によれば、固定化ペルオキシダーゼ
は殺生物性組成物を発生し、次いでこれを固定化酵素か
ら分離してペルオキシダーゼ酵素を含有しない殺生物剤
を得る。固定化ペルオキシダーゼは過酸化物と沃化物と
の間の反応を水性環境と接触する際に触媒して、沃化物
の初期濃度の相当量を酸化させることが観察された。さ
らに反応生成物の殺生物特性は、反応生成物を病原性生
物またはペルオキシダーゼ反応を生ぜしめた表面とは別
途かつ離間した表面を失活させるのに充分な時間にわた
り固定化酵素から除去しても維持される。

【００１４】本発明のペルオキシダーゼはインターナシ
ョナル・ユニオン・オブ・バイオケミストリーおよびイ
ンターナショナル・ユニオン・オブ・ピュア・アンド・
アプライド・ケミストリーにより酵素委員会同定番号
Ｅ．Ｃ． １．１１．１．７として同定される。ペルオ
キシダーゼは広範な種類の原料から得ることができる。
最も安価かつ最も丈夫な本発明に適するペルオキシダー
ゼは西洋ワサビペルオキシダーゼであるが、ラクトペル
オキシダーゼも使用することができる。市販入手される
ペルオキシダーゼは乾燥粉末として凍結乾燥させ、使用
前に固体支持体に付着させねばならない。ペルオキシダ
ーゼ用の固体支持体として使用するのに適した材料組成
には制限がない。予備活性化した固定支持体を購入し
て、これを所定条件下でペルオキシダーゼと混合して固
定化酵素を発生させることができる。

【００１５】活性化した固体支持体は種々の市販原から
入手できる。これら材料は一般に、蛋白質におけるアミ
ノ、カルボキシル、スルフヒドリルもしくはアルギニル
基と反応する官能基により誘導化された多孔質高分子骨
格で構成される。大表面積を有して固体支持体に対する
蛋白質の結合を最大化させる固体相材料を選択するのが
好適である。さらに、好適固体相はカラムに充填した際
に急速な流量を可能にする。ペルオキシダーゼの固定化
につき好適な固体相材料の例はカルボキシル化ラテック
ス粒子、調節気孔ガラス、アミノエチルポリアクリルア
ミドゲル、アジピン酸ジヒドラジドアガロース、アミノ
−ベンジルオキシメチルセルロース、ブロモアセチルセ
ルロースおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドアガロー
スを包含する。

【００１６】本発明のドナー分子は、酵素ペルオキシダ
ーゼ用の基質として作用する沃素陰イオンである。本発
明の沃素陰イオンに適する原料は沃化ナトリウムおよび
沃化カリウム、並びに沃素の他の塩類を包含する。簡単
な沃素の塩は比較的安価であるという利点を有する。沃
素イオンは、水性環境に溶解させて過酸化水素の存在下
に固定化酵素と接触させねばならない。沃素イオンを含
有する緩衝剤を使用して溶液を平衡化させ、固定化酵素
を平衡化させた後に反応を開始させるのが適している。
本発明に使用する沃素陰イオンの範囲は０．１５〜５．
０ｍｇ／ｍＬの範囲である。沃素陰イオンの好適範囲は
０．５〜２．０ｍｇ／ｍＬであってｐＨ、イオン強度お
よび過酸化物濃度の関数である。

【００１７】過酸化水素もしくはメチルは、この反応の
基質として作用する酸化剤である。過酸化物は溶液中で
沃化物よりも安定性の低い分子であり、過酸化物をこの
反応に最後の成分として添加するのが好適である。本発
明に適する過酸化物の濃度範囲は０．００５〜０．１５
０％（ｗ／ｗ）である。過酸化物の好適範囲は水性環境
のｐＨおよび沃化物の濃度と共に変化するが、典型的に
は０．０１〜０．２％の範囲である。過酸化水素の先駆
体として作用しうる適する材料は金属過酸化物、過炭酸
塩、過硫酸塩、過燐酸塩、ペルオキシエステル、尿素過
酸化物、ペルオキシ酸、アルキルペルオキシド、アシル
ペルオキシドおよび過硼酸塩を包含する。これら物質の
２種もしくはそれ以上の混合物も使用することができ
る。過炭酸ナトリウムが、水中に溶解させた際に約２９
％（ｗ／ｗ）の過酸化水素を供給すると共に一般に安全
と見られる薬品で構成されるため特に適している。

【００１８】沃素陰イオンの初期濃度の少なくとも２５
％を酸化させて、許容しうるレベルの殺生物活性を有す
る反応生成物を得なければならない。沃素陰イオンにつ
き好適な酸化範囲は沃素陰イオンの初期濃度の７５〜９
５％である。水まで還元して許容しうるレベルの殺生物
活性を有する反応生成物を得ねばならない過酸化水素の
比率については要件が存在しない。しかしながらモル対
モルの基準で、酵素還元せねばならない過酸化水素の量
は沃素陰イオンの初期モル濃度の少なくとも１２．５％
に等しい。還元すべき過酸化水素の好適量は沃素陰イオ
ンの初期濃度の４０〜２００％に等しい。

【００１９】本発明に適する緩衝剤は燐酸塩、クエン酸
塩、炭酸塩およびグッデ（Goode)緩衝剤を包含する。ｐ
Ｈを±０．１０ｐＨ単位の範囲内に６〜５５℃の一定温
度下で制御する能力を持った緩衝剤が本発明につき使用
するのに適する。固定化酵素調製物はカラム形態または
バッチ工程で用いることができる。バッチ操作には、反
応が平衡に達するまで反応を混合しながら進行させねば
ならない。平衡点は、沃素陰イオンの濃度が毎時１．０
％より高い濃度で変化しない反応の点である。カラム操
作については、カラムからの流出液をカラム流出液が上
記平衡に達するまでカラムに逆ポンプ輸送することもで
きる。或いは、カラムに対する流速を反応がその平衡濃
度に達するまで調整することもできる。

【００２０】沃素陰イオンの濃度、過酸化物、ｐＨおよ
び反応時間が沃素陰イオンの酸化程度（すなわち反応生
成物の量）を決定する。反応が開始した後、沃素陰イオ
ンの濃度は酸化するにつれて低下する。反応条件は沃素
陰イオンの濃度が少なくとも２５％だけ減少するよう制
御すべきであり、９５％程度減少してもよい。沃化物酸
化のレベルはｐＨおよび過酸化物の濃度と共に変化す
る。沃化物酸化の好適範囲は７５〜９５％である。反応
条件を制御して、過酸化水素の濃度が沃素陰イオンの初
期濃度の少なくとも１２．５％に等しい量だけ減少させ
ねばならない。過酸化物還元の好適範囲は、沃素陰イオ
ンの初期濃度の少なくとも４０％に等しい量である。

【００２１】反応生成物は、濾過もしくは磁気分離のよ
うな簡単な方法により固定化酵素から容易に分離され
る。反応生成物が固定化酵素から分離された後、これを
眼組織を含む動物もしくは人間組織に直接施すことがで
きる。哺乳動物組織に対する反応生成物の施用は侵襲性
手術の際の洗浄剤として、または外傷滅菌剤として、全
身滅菌剤として、或いは火傷の滅菌剤としての使用を包
含する。或いは反応生成物はたとえば金属、プラスチッ
ク、鉱物、天然および合成繊維、並びに紙もしくは高分
子膜のような固体表面に施すこともできる。分離した反
応生成物を生存してない或いは生存する組織に施すに
は、流体を適する容器により単に移送し、次いで反応生
成物を所望の表面上に付着させて容易に行われる。

【００２２】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに説明す
る。 実施例１ 臭化シアノゲン（シグマ・ケミカル・カンパニー社、カ
タログＮｏ．Ｃ−１１５０）と１，１′−カルボニルジ
ミダゾール（シグマ・ケミカル・カンパニー社、カタロ
グＮｏ．Ｃ−８７７８）活性化アガロースゲルとを西洋
ワサビペルオキシダーゼに結合させた。これらゲルに結
合した固定化酵素の量を、カップリング反応の前後にお
ける２８０および４０５ｎｍでの全吸光度を定量して推
定した。これらゲルに対する酵素固定化の前後における
酵素活性の量を、沈澱用基質１，１′−クロル−４−ナ
フトール（シグマ・ケミカル・カンパニー社、カタログ
Ｎｏ．Ｃ−６７８８）により測定した。

【００２３】１ｇの臭化シアノゲン活性化ゲルを１０ｍ
Ｌの１０ミリモル燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）
で膨潤させた。５ｍＬの１，１′−カルボニルジミダゾ
ール活性化ゲルと１０ｍＬの膨潤した臭化シアノゲン活
性化ゲルとをそれぞれ別の１５ｍＬ遠沈管に添加し、遠
心分離器にて１，５００ｒｐｍで５分間にわたり遠心分
離した。上澄液を注ぎ出し、１０ｍＬの燐酸塩緩衝液を
添加した。これらゲルを充分懸濁して見えた時点から少
なくとも２０秒間にわたり混合した。５ｍＬの再編成し
たゲル懸濁物を新たな遠沈管に添加した。５ｍＬの燐酸
塩緩衝液を各ゲルを含有する各遠沈管に添加し、遠心分
離器で遠心分離した。上澄液を注ぎ出し、ゲルを１０ｍ
Ｌの燐酸塩緩衝液に再懸濁させた。この懸濁、遠心分離
および上澄液除去の手順を各ゲルにつきさらに５回反復
した。第５回目の洗浄を完了した後、上澄液を静かに注
ぎ出し、各ゲルを１０ミリモルの燐酸塩緩衝液（ｐＨ
６．０）により全量で５ｍＬまで再懸濁した。これらゲ
ルを冷凍機内に１晩貯蔵した。

【００２４】

【表１】

【００２５】ビオチーム・ラボラトリース社（サンジエ
ゴ、ＣＡ）からの種類ＩＩ西洋ワサビペルオキシダーゼ
（ＨＲＰ）の保存溶液を１０ｍｇ／ｍＬの濃度で作成し
た。５ｍＬのＨＲＰ保存溶液を８℃にて（Ａ）５ｍＬの
臭化シアノゲン活性化ゲル（ＣＢ−ゲルおよび（Ｂ）５
ｍＬの１，１′−カルボニルジミダゾール活性化ゲル
（ＣＩ−ゲル）に添加し、これら溶液を緩徐に８℃にて
１０時間混合した。ゲルを１，５００ｒｐｍにて１０分
間にわたり遠心分離した。各上澄液を別々に回収し、各
上澄液と酵素保存溶液とを水で１０倍希釈し、その吸光
度を２８０および４０５ｎｍにて測定した。これら測定
の結果を表Ｉに示す。

【００２６】吸光度の結果は、施した蛋白質の上限値約
４０％がゲルに結合したことを示す。これは、回収蛋白
質と添加蛋白質との比を吸光度測定により決定して計算
される。これは、約２０ｍｇのＨＲＰが各種のゲルに結
合したことを示す。ゲルに施した酵素活性の全量と比較
して固定化酵素により示される酵素活性の量を測定し、
その結果を表ＩＩに示す。

【００２７】

【表２】

【００２８】酵素活性の単位は、２００μＬの基質１，
１′−クロル−４−ナフトール（シグマ・ケミカル・カ
ンパニー社、カタログＮｏ．Ｃ−６７８８）と１０μＬ
の試料とを用いて２５℃で肉眼検出しうる沈殿物を形成
するのに要する時間を測定して決定した。相対的全酵素
単位の量は、試料希釈率に試料容積を掛算すると共に沈
殿物を観察するのに要する時間で割算して計算した。ゲ
ルに施した未結合のＨＲＰは１ｍｇ当り３５．６単位の
相対的「比活性」を有した。固定化酵素は、ＣＢ−ゲル
およびＣＩ−ゲルにつきそれぞれ１ｍｇ当り５．６２お
よび３．３１単位の相対的比活性を示した。これらの活
性測定は、異なる種類の酵素を比較するのに有用である
が、実際にはこれら測定は対して重要でない。

【００２９】固定化酵素を緩衝液から物理的に分離し、
これを貯蔵して酵素活性が「未結合」、すなわち緩衝液
とは結合するが固体マトリックスとは結合しないかどう
かを決定すべく貯蔵した。固定化酵素試料における未結
合ペルオキシダーゼ活性の推定値は、固定化酵素の試料
を遠心分離すると共にペルオキシダーゼ活性を１０μＬ
の上澄液で測定することにより決定した。ＣＩ−ゲルお
よびＣＢ−ゲルの未希釈上澄液は、２５℃にて２時間培
養した後にも沈殿物を発生しなかった。これは、ゲルに
おける未結合もしくは可溶性ペルオキシダーゼ活性の量
が固定化酵素に基づく活性の０．０４％未満であること
を意味する。

【００３０】実施例２ 西洋ワサビペルオキシダーゼを０．１０モルの酢酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ５．０）に２０ｍｇ／ｍＬの濃度で
溶解させ、冷凍機で貯蔵した。１０ｍＬのペルオキシダ
ーゼ溶液を５ｍＬのアフィゲル１０（ビオラド・ラボテ
リトース社、ハーキュリース、カリフォルニア、カタロ
グＮｏ．１５３−６０４６）と混合した。このゲルスラ
リーを４℃にて４時間混合し、次いでカップリング反応
を３５μｍの多孔質支持円盤を備えた１．５×１０ｃｍ
カラムにゲル懸濁物を注ぎ入して停止させた。ゲルを支
持円盤上に載置し、反応液を重力により排液させた。水
を固体支持体が乾燥する直前にカラムに添加した。１０
０ｍＬの０．０１０モルのエタノールアミン−塩酸混合
物（ｐＨ８．０）をゲル中に重力下で濾過させた。１０
０ｍＬの０．５０モル燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
５）をカラムに対し重力下で流過させた。３回の順次の
１００ｍＬづつのｐＨ７．５燐酸塩緩衝混合物をカラム
に流過させ、燐酸塩緩衝液のモル濃度は０．３、０．２
０および０．１０モルとした。最後に、ゲルを１０ｍＬ
の０．１０モル硫酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に
て貯蔵した。

【００３１】固定化ペルオキシダーゼと沃素陰イオンと
過酸化物との間の反応を次のように開始させた。固定化
酵素スラリーを活性が１ｍＬ当り０．０５相対単位とな
る濃度まで水により希釈した。固定化酵素を１ｍＬ当り
の活性を可溶性ペルオキシダーゼの活性と比較して測定
し、その際基質４−クロル−１−ナフト−ル（シグマ・
ケミカル・カンパニー社、セントルイス、ＭＯ；カタロ
グＮｏ．Ｃ−９７８８）での肉眼観察しうる沈殿物を発
生するのに要する時間を測定した。水における１ｍＬの
固定化酵素スラリーを２０ミリモルのクエン酸−燐酸緩
衝液（ｐＨ５．０）における沃化ナトリウムの１．２５
ｍｇ／ｍＬ保存溶液８ｍＬに添加した。１ｍＬの０．５
％過酸化水素溶液をこの混合物に添加し、得られた懸濁
物を小磁気攪拌機により２０℃にて１時間混合した。

【００３２】反応生成物を固定化酵素から分離して、病
原性生物を失活させるべく使用した。１時間の後、懸濁
物をディスクフィルタによりガラス壜中へ濾過した。ガ
ラス壜を密封すると共に室温で貯蔵した。濾過してから
１分間の後、０．７５ｍＬの反応生成物を壜から抜取
り、１ｍＬ当り１０⁷ コロニー形成単位（ｃｆｕ）の濃
度にてノルマル塩水に０．１ｍＬのスタフィロコッカス
・アウレウスの懸濁物を含有する試験管に添加した。成
分を混合すると共に２５℃にて１０分間保温した。０．
５ｍＬを試験から抜取り、中和剤として０．２５％チオ
硫酸ナトリウムを含有する２５ｍＬのタイプチケース
（typticase ）大豆ブロス（ＴＳＢ）に添加した。ＴＳ
Ｂは７．３の最終ｐＨを有し、１７ｇのカゼインの脾液
消化物と３ｇの大豆ミールのパパイン消化物と５ｇの塩
化ナトリウムと２．５ｇのグルコースと２．５ｇの二塩
基性燐酸カリウムと１０００ｍＬの蒸留水とで構成し
た。この混合物を３日間にわたり３７℃にてて保温し、
増殖の徴候につき検査した。

【００３３】固定化酵素反応生成物の試料を抜取り、上
記と同様に１、１５、３０、４５、６０、９０、１２０
および１８０分間で試験した。生存性の比較を行い、固
定化酵素の反応生成物の代りに水を用いた。この実験の
結果を表ＩＩＩに示す。

【００３４】

【表３】

【００３５】実施例３ 西洋ワサビペルオキシダーゼを水中に４０ｍｇ／ｍＬの
濃度で溶解させた。１０ｍＬのペルオキシダーゼ溶液を
１０ｍＬのアィゲル１０２（ビオラド・ラボラトリース
社、ハーキュリース、カリホルニア；カタログＮｏ．１
５３−２４０１）と混合し、１０ｍＬの２０ミリモル燐
酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で希釈した。ゲルスラリー
と酵素溶液とをロッカーアームで４℃にて３０分間混合
することにより温度を平衡化させた。２種の溶液を合
し、ｐＨを１Ｎ塩酸（ＨＣｌ）で５．０に調整した。５
０ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩を溶液に添加し、ｐＨを直ち
に１．０Ｎ ＨＣｌにより５．０に調整した。反応物を
ロッカーアームで４０℃にて２４時間混合した。

【００３６】ゲル懸濁物を３５μｍの多孔質支持円盤を
備えた２．５×１０ｃｍカラムに注ぎ入れてカップリン
グ反応を停止させた。支持円盤にゲルを載置し、反応液
を重力により排液させた。固体支持体が乾燥する直前に
水をカラムに添加した。１００ｍＬの０．５０モルのク
エン酸−燐酸塩緩衝液（ｐＨ５．０）を重力でカラムに
流過させた。３回の順次の１００ｍＬづつのｐＨ５．０
クエン酸−燐酸塩緩衝混合物をカラムに流過させ、燐酸
塩緩衝液のモル濃度をそれぞれ０．３、０．２０および
０．１０とした。最後に、ゲルを２０ｍＬの０．１０モ
ルのクエン酸−燐酸塩緩衝液（ｐＨ５．０）で貯蔵し
た。

【００３７】固定化ペルオキシダーゼと沃素陰イオンと
過酸化物との間の反応を次のように開始させた。固定化
酵素スラリーを水によりその活性が上記したように１ｍ
Ｌ当り０．０５単位となる濃度まで希釈した。水におけ
る１ｍＬの固定化酵素スラリーを２０ミリモルのクエン
酸−燐酸塩緩衝液（ｐＨ５．０）における沃化ナトリウ
ムの５．０ｍｇ／ｍＬ保存溶液８ｍＬに添加した。１ｍ
Ｌの０．１％過酸化水素溶液をこの混合物に添加し、得
られた懸濁物に小磁気撹拌棒により２０℃にて２時間混
合した。反応生成物を固定化酵素から分離し、病原性生
物を失活させるべく使用した。

【００３８】２時間の後、懸濁物をディスクフィルタで
ガラス壜中へ濾過した。このガラス壜を密封すると共に
室温で貯蔵した。濾過してから５分間の後、０．５０ｍ
Ｌの反応生成物を壜から抜取り、１ｍＬ当り１０⁷ ｃｆ
ｕの濃度にてノルマル塩水におけるイー・コリの０．０
５０ｍＬの懸濁物を含有する試験管に添加した。各成分
を混合し、２５℃にて１０分間にわたり保温した。０．
２５ｍＬを試料から抜取り、実施例２で上記したように
２５ｍＬのＴＳＢに添加した。

【００３９】固定化酵素反応生成物の試料を抜取り、上
記と同様に３０、６０、９０、１２０および１８０分間
にて試験した。固定化酵素の反応生成物の代りに水を用
いる生存率の比較を行った。生存率の比較は、１０分間
においてのみ試料を採取した。この実験の結果を表ＩＶ
に示す。

【００４０】

【表４】

【００４１】実施例４ １０ｍＬのカルボキシル化ラテックス粒子（シグマ・ケ
ミカル・カンパニー社、セントルイス、ＭＯ；カタログ
Ｎｏ．ＣＬＢ−４）の２．５％（ｗ／ｗ）懸濁物を５０
ｍＬのネジ栓プラスチック壜に入れ、遠心分離器（セン
トラー７Ｒ、インターナショナル・エクイップメント・
カンパニー社）にて毎分２，５００回転（ｒｐｍ）で５
分間遠心分離した。上澄液を注ぎ出し、粒子を機械的攪
拌により４０ｍＬの１０ミリモル硼酸ナトリウム（ｐＨ
８．５）に再懸濁させた。これら工程はビーズを洗浄す
るのに役立つ。正常工程を全部で３回反復し、最終懸濁
物を０．１０モル燐酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で作成
した。洗浄工程をさらに０．１０モル燐酸ナトリウム
（ｐＨ７．５）により４回反復し、最終懸濁物をビーズ
が０．１０モル燐酸ナトリウム（ｐＨ７．５）にて２．
５％（ｗ／ｖ）となるよう作成した。

【００４２】新たに作成したカルボジイミドの２％溶液
を作成し、１５ｍＬのこの溶液を１２ｍＬの２．５％
（ｗ／ｖ）カルボキシル化ビーズに添加した。この懸濁
物をロッカーアームにて室温で２時間にわたり混合し
た。次いで懸濁物を遠心分離し、過酸化水素溶液の代り
に水を用いた全比較試料は１晩にわたり増殖を示した。
これら試料を固定化ペルオキシダーゼからの反応生成物
と共に４５℃にて６０分間にわたり保温した場合、Ｂ．
ステアロターモフィルスまたはＢ．ズブチリスのいずれ
でも増殖は観察されなかった。同様な実験を１０分間の
時間で反復した場合、両生物は増殖を示した。

【００４３】

【発明の効果】以上詳細に説明したように、本発明によ
る病原体の失活方法を用いることにより、動物もしくは
人間の体内に抗体を形成させることなく、アレルギー反
応の潜在力を最小化もしくは排除したうえで、病原体を
失活させることができる効果を有する。

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 固定化ペルオキシダーゼを過酸化水素、
   沃素陰イオンおよび緩衝剤と組合わせて用いることによ
   り酵素反応を生ぜしめて、（１）初期沃素陰イオンの少
   なくとも２５％を酸化し；（２）初期過酸化物の少なく
   とも５０％をその発生の２４時間以内に還元し；さらに
   （３）化学反応生成物を発生させて病原性微生物を失活
   させることを特徴とする病原体の失活方法。
2. 【請求項２】 固定化ペルオキシダーゼと過酸化水素と
   沃素陰イオンと緩衝剤との組合せにより発生する抗微生
   物反応生成物を可溶性もしくは固定化ペルオキシダーゼ
   を含有しない環境へ除去すると共に、前記抗微生物反応
   生成物を用いて病原性生物を失活させることを特徴とす
   る病原体の失活方法。
3. 【請求項３】 過酸化物の処方濃度が０．００５〜３．
   ０％の範囲であり、過酸化水素の好適範囲が０．０５〜
   １．５％であることを特徴とする請求項１および請求項
   ２に記載の病原体の失活方法。
4. 【請求項４】 沃素陰イオンの処方濃度が０．１５〜
   ５．０ｍｇ／ｍＬの範囲であり、沃素陰イオンの好適範
   囲が１．０〜２．５ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする
   請求項１および請求項２に記載の病原体の失活方法。
5. 【請求項５】 緩衝剤の処方濃度が、反応物のｐＨを
   ３．０〜８．０の範囲とするような濃度であることを特
   徴とする請求項１および請求項２に記載の病原体の失活
   方法。
6. 【請求項６】 固定化ペルオキシダーゼと過酸化水素と
   沃素陰イオンとの間の反応から発生する化学剤を用い
   て、眼組織を含む動物もしくは人間組織における病原性
   生物を失活させることを特徴とする請求項１および請求
   項２に記載の病原体の失活方法。
7. 【請求項７】 固定化ペルオキシダーゼと過酸化水素と
   沃素陰イオンとの間の反応から発生する化学剤を用い
   て、たとえば金属、プラスチック、鉱物、天然および合
   成繊維、並びに紙もしくは高分子膜のような固体表面に
   おける病原性生物を失活させることを特徴とする請求項
   １および請求項２に記載の病原体の失活方法。
8. 【請求項８】 固定化ペルオキシダーゼと過酸化水素と
   沃素陰イオンとの間の反応から発生する化学剤を侵襲性
   手術の際の洗浄剤として、外傷の滅菌剤として、全身の
   滅菌剤として、または火傷の滅菌剤として使用すること
   を特徴とする請求項１および請求項２に記載の病原体の
   失活方法。
9. 【請求項９】 ペルオキシダーゼ酵素を固体支持体に固
   定化し；固定化ペルオキシダーゼ酵素を過酸化水素およ
   び沃化物の原料と水性媒体中で接触させて沃素陰イオン
   の酸化から反応生成物を生成させ；前記反応生成物をペ
   ルオキシダーゼ酵素から単離して、前記ペルオキシダー
   ゼ酵素とは独立した殺生物剤として作用させ；病原性生
   物を前記反応生成物と接触させることを特徴とする病原
   体の失活方法。
10. 【請求項１０】 単離を分離により行うことを特徴とす
    る請求項９に記載の病原体の失活方法。
11. 【請求項１１】 ペルオキシダーゼ酵素を活性化ラテッ
    クス粒子、調節多孔質ガラス、ポリアクリルアミドゲ
    ル、アガロースゲル、誘導化セルロース、活性化磁気粒
    子、活性化金、活性化紙または他の活性化プラスチック
    よりなる群から選択される固体支持体に固定化すること
    を特徴とする請求項１０に記載の病原体の失活方法。
12. 【請求項１２】 ペルオキシダーゼまたは固体相をエポ
    キシル誘導体、マレイミド、オキシラン、ヒドラジド、
    クロル蟻酸ｐ−ニトロフェニルおよび他のハロアセチル
    誘導体、ジビニルスルホン、エピクロルヒドリン、並び
    にＮ−ヒドロキシスクシンイミドを包含するスクシニミ
    ジルエステルよりなる群から選択される化学剤を用いて
    活性化させることを特徴とする請求項１０に記載の病原
    体の失活方法。
13. 【請求項１３】 固定化ペルオキシダーゼ酵素を過酸化
    水素および沃化物の水性過酸化物原料と沃素陰イオンの
    初期濃度の少なくとも２５％が酸化されるまで接触させ
    続けると共に、前記反応の開始時点の前記水性原料にお
    ける沃素陰イオンの初期濃度が少なくとも０．１５ｍｇ
    ／ｍＬであることを特徴とする請求項９に記載の病原体
    の失活方法。
14. 【請求項１４】 固定化ペルオキシダーゼ酵素を過酸化
    水素および沃化物の水性過酸化物原料とバッチ操作もし
    くはカラム操作で接触させ、沃素陰イオンの濃度が毎時
    ０．１％より高く濃度変化しない平衡点に達するまで反
    応を持続させることを特徴とする請求項１３に記載の病
    原体の失活方法。
15. 【請求項１５】 固定化酵素を過酸化水素および沃化物
    の水性原料と固定化酵素カラムにて接触させることを特
    徴とする請求項１３に記載の病原体の失活方法。
16. 【請求項１６】 過酸化物の濃度が０．００５〜３．０
    ％の範囲であり、過酸化水素の好適範囲が０．０５〜
    １．５％の範囲であることを特徴とする請求項１３に記
    載の病原体の失活方法。
17. 【請求項１７】 沃素陰イオンの濃度が０．１５〜５．
    ０ｍｇ／ｍＬの範囲であり、沃素陰イオンの好適範囲が
    １．０〜２．５ｍｇ／ｍＬである範囲であることを特徴
    とする請求項１３に記載の病原体の失活方法。
18. 【請求項１８】 過酸化水素および沃化物の水性原料が
    燐酸塩、クエン酸塩、炭酸塩およびグッデ緩衝剤よりな
    る群から選択される緩衝剤をさらに含むことを特徴とす
    る請求項１７に記載の病原体の失活方法。
19. 【請求項１９】 固定化ペルオキシダーゼと過酸化水素
    と沃素陰イオンとの間の反応から発生する化学剤を用い
    て、眼組織を含む動物もしくは人間組織における病原性
    生物を失活させることを特徴とする請求項１３および請
    求項１４に記載の病原体の失活方法。
20. 【請求項２０】 固定化ペルオキシダーゼと過酸化水素
    と沃素陰イオンとの間の反応から発生する化学剤を用い
    て、たとえば金属、プラスチック、鉱物、天然および合
    成繊維、並びに紙もしくは高分子膜のような固体表面に
    おける病原性生物を失活させることを特徴とする請求項
    １３および請求項１４に記載の病原体の失活方法。
21. 【請求項２１】 ペルオキシダーゼ酵素を透析膜の一面
    に載せ；水性媒体における過酸化水素および沃化物の原
    料を透析管の透析液側に置くことにより、前記過酸化物
    および沃化物を透析管を介する拡散によりペルオキシダ
    ーゼ酵素と接触させ；前記反応生成物を透析管における
    透析液側の試料採取によりペルオキシダーゼ酵素から単
    離して、前記ペルオキシダーゼ酵素とは独立した殺生物
    剤として作用させ；病原性生物を前記反応生成物と接触
    させることを特徴とする病原体の失活方法。
22. 【請求項２２】 ペルオキシダーゼ酵素を過酸化水素お
    よび沃化物の水性過酸化物原料と沃素陰イオンの初期濃
    度の少なくとも２５％が酸化されるまで拡散により接触
    させ続けと共に、反応の開始時点の前記水性原料におけ
    る沃素陰イオンの初期濃度が少なくとも０．１５ｍｇ／
    ｍＬであることを特徴とする請求項２１に記載の病原体
    の失活方法。