JPH08332085A

JPH08332085A - ビフィズス菌数計測用選択培地

Info

Publication number: JPH08332085A
Application number: JP14470295A
Authority: JP
Inventors: Hiroaki Mori; 浩晴森
Original assignee: Meiji Milk Products Co Ltd
Current assignee: Meiji Dairies Corp
Priority date: 1995-06-12
Filing date: 1995-06-12
Publication date: 1996-12-17

Abstract

(57)【要約】【構成】ビフィズス菌の増殖用寒天培地成分に、酢酸
又は酢酸ナトリウムと、塩化リチウムとを含有させてな
ることを特徴とする、ビフィズス菌数計測用選択培地。【効果】計測操作が簡単で、かつ、ビフィズス菌の選
択率及び検出率の高い選択培地を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ビフィズス菌の選択培
地に関するものであって、飲食品や医薬品、さらには腸
内フローラ中のビフィズス菌数の選択的計測に利用され
るものである。

【０００２】

【従来の技術】近年のビフィズス菌に関する基礎的研究
の成果と培養技術の進歩によって、ビフィズス菌を利用
したヨーグルトが日本を始め世界各国で市販されるよう
になり、その消費量は年々増加している。ビフィズス菌
の整腸作用は、一定量以上のビフィズス菌生菌を経口摂
取することにより達成されることが知られているが、ビ
フィズス菌は一般に酸素や酸（低ｐＨ）に弱く、ヨーグ
ルト中ではその生菌数が低下し易い。従って、ヨーグル
ト中のビフィズス菌を検出し、当該菌数を正確に計数す
ることは品質管理の面から非常に重要である。しかしな
がら、一般にヨーグルト中には幾種類かの乳酸菌が含ま
れ、この中からビフィズス菌のみを正確に検出し、計数
することは困難である。

【０００３】昭和５９年に全国はっ酵乳乳酸菌飲料協会
が自主的検査法として定めたはっ酵乳中のビフィズス菌
検査法では、ＢＬ寒天培地（Glucose blood liver aga
r）が培地として用いられている。しかし、この方法で
は、ストレプトコッカス（Streptococcus ）属やラクト
バシラス（Lactobacillus ）属の乳酸菌、及びビフィズ
ス菌のいずれもが当該ＢＬ寒天平板上で増殖するため、
平板上に出現した各種形状のコロニー数の計測とそれぞ
れの形状のコロニーに対するグラム染色標本の顕微鏡観
察によりビフィズス菌数を決定していた。このことか
ら、当該検査法では、ビフィズス菌のコロニー数がスト
レプトコッカス属やラクトバシラス属の乳酸菌のコロニ
ー数の１／１００以下の場合には、ビフィズス菌のコロ
ニーの検出自体が困難である。

【０００４】ビフィズス菌を選択的に増殖させることの
できる培地としては、ストレプトコッカス属やラクトバ
シラス属菌の増殖を抑制するために抗生物質を主要選択
剤として添加した培地（日本細菌学会誌，３３（６），
７５３（１９７８），食品衛生学会誌，１８，５３７
（１９７７））、ビフィズス菌に特異的に利用される糖
源（例えば、ガラクトオリゴ糖）とトリプチケースペプ
トン及び蛋白質分解物を組み合わせた選択培地（特開昭
６０−１１４１８６号公報）などの報告がある。しか
し、前者は、乳酸菌の増殖が抑制されると同時に、ビフ
ィズス菌自体の増殖も抑制されることがあり、正確なビ
フィズス菌数の計測には不適当である。特に、ヨーグル
ト中のビフィズス菌は酸素や酸（低ｐＨ）によるストレ
スを受けているため、これらの抗生物質に対する感受性
が高まり、増殖が著しく抑制される場合がある。後者
は、ビフィズス菌の検出率は高いものの、一部のビフィ
ズス菌以外の乳酸菌も増殖してコロニーを形成したり、
使用する糖源が非常に高価である等の問題がある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、飲食
品、医薬品、糞便等の様々な試料中のビフィズス菌数を
迅速且つ正確に計測できる選択培地を提供することにあ
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、抗生物質
以外の選択剤について鋭意研究を重ねた結果、短鎖脂肪
酸の中で特に酢酸が、ある濃度ではビフィズス菌の増殖
は抑制しないが、他の細菌に対しては抑制的に働くこと
を見いだし、さらに研究を重ねた結果、ビフィズス菌が
旺盛に増殖する非選択培地に、５０〜２００ｍＭの酢酸
又は酢酸ナトリウムと、５〜５０ｍＭの塩化リチウムと
を添加し、ｐＨを５．０〜５．８とすることによりビフ
ィズス菌のみを選択的に増殖させることができるのを見
いだし、本発明を完成するに至った。

【０００７】以下、本発明について詳細に説明する。本
発明において「ビフィズス菌」としては、ビフィドバク
テリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、ビフ
ィドバクテリウム・インファンチス（Bifidobacterium
infantis）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifido
bacterium breve ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダ
ム（Bifidobacterium bifidum ）、ビフィドバクテリウ
ム・アドレッセンティス（Bifidobacterium adolescent
is）等を具体的に挙げることができるが、これらの種に
限定されるものではない。

【０００８】また、本発明において、「ビフィズス菌増
殖用寒天培地成分」とは、ビフィズス菌の増殖に適した
窒素源、炭素源、無機塩類、培地固化用の寒天等をい
う。窒素源としては、例えば、蛋白質加水分解物、酵母
エキス、もしくは魚肉エキス等を挙げることができる。
ここで「蛋白質加水分解物」とは、カゼイン等の動物性
蛋白の加水分解物と大豆蛋白等の植物性蛋白の加水分解
物の両者を含む。当該蛋白質加水分解物の培地中への添
加に際しては、前記動物性蛋白もしくは植物性蛋白を単
独で添加することができるが、両者を組み合わせて添加
することも可能である。また、当該蛋白質加水分解物
は、１０％（Ｗ／Ｖ）程度まで添加することが可能であ
るが、好ましい添加量は０．５〜２．０％（Ｗ／Ｖ）で
ある。酵母エキス及び肉エキスは０．１〜５．０％（Ｗ
／Ｖ）の範囲で添加することができるが、好ましい添加
量は０．１〜０．５％（Ｗ／Ｖ）である。上記窒素源
は、検出及び測定を企図する対象に応じて適宜組み合わ
せて使用することができる。

【０００９】炭素源としては、ビフィズス菌が旺盛に醗
酵可能なものであればいずれでもよく、例えば、グルコ
ース、ラクトース、フラクトース、ガラクトース等を挙
げることができる。これらは、検出及び測定を企図する
対象に応じて適宜組み合わせて使用することができる。
また、必要に応じて１価もしくは２価の無機塩類（塩化
リチウムを除く）を添加することができる。当該塩類の
うち、１価の塩類としては塩化ナトリウム、塩化カリウ
ム等を、２価の塩類としては塩化マグネシウム、塩化カ
ルシウム、硫酸マンガン等を挙げることができる。これ
ら塩類の添加量は、１価、２価それぞれの塩類を０．０
１〜０．５％（Ｗ／Ｖ）の範囲で培地中に添加するのが
適当である。

【００１０】発明者等は、まず、ＴＰＹＧ培地（トリプ
チケース（ＢＢＬ）８ｇ、フィトンペプトン（ＢＢＬ）
３ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、Ｌ−シス
テイン塩酸塩０．５ｇ、グルコース２０ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ
₄２ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄３ｇ、ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ０．
５ｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ１０ｍｇ、Ｈ₂Ｏ１０００
ｍｌ）を基礎培地とし、これに蟻酸、酢酸、プロピオン
酸、酪酸又は乳酸を５０〜４００ｍＭ添加し、各種腸内
細菌、乳酸菌及びビフィズス菌の増殖に及ぼす影響を調
べた。このうち、蟻酸と酪酸は、ビフィズス菌以外の細
菌よりビフィズス菌に対する増殖阻害作用の方が強かっ
た。プロピオン酸はビフィズス菌以外のいくつかの細菌
に対する増殖抑制作用が弱かった。結局、酢酸がビフィ
ズス菌の増殖を抑制せず、ビフィズス菌以外の細菌の増
殖を抑制するという選択性において最も優れていた。ビ
フィズス菌の増殖を抑制せず、ビフィズス菌以外の大部
分の細菌の増殖を抑制する酢酸濃度は５０〜２００ｍＭ
であり、また、この増殖抑制作用は培地ｐＨが低下する
ほど増大する。ビフィズス菌の増殖を阻害せず、それ以
外の大部分の細菌の増殖を抑制するための最適ｐＨ域は
５．０〜５．８であり、ｐＨ５．０未満ではビフィズス
菌の増殖が抑制され、５．８より高くなるとビフィズス
菌以外の多種の細菌について増殖が認められようにな
る。ただし、上記ｐＨ域においても乳酸桿菌の多くは増
殖性を示す。

【００１１】そこで、本発明のビフィズス菌数計測用選
択培地には、これらの乳酸桿菌の増殖抑制剤として特定
濃度の塩化リチウムを必須成分として加えている。具体
的には、ビフィズス菌の増殖は抑制しないが、乳酸桿
菌、特にヨーグルトに使用されるラクトバシラス・デル
ブリュッキイ亜種ブルガリクス（Lactobacillus delbru
ekii subsp. bulgaricus）及びラクトバシラス・アシド
フィルス（Lactobacillus acidophilus ）の増殖を抑制
する濃度で添加するのが理想である。本発明においては
塩化リチウムは当該目的で培地中に５〜５０ｍＭの範囲
で添加する。そして好ましくは１０〜２５ｍＭの範囲で
添加する。当該濃度においては、ビフィズス菌の増殖は
抑制しないが、ラクトバシラス・デルブリュッキイ亜種
ブルガリクス及びラクトバシラス・アシドフィルスの増
殖を抑制する。塩化リチウムを５０ｍＭより多く添加す
ると、ビフィズス菌自体の増殖も抑制され、また、５ｍ
Ｍより少ないとラクトバシラス・デルブリュッキイ亜種
ブルガリクス及びラクトバシラス・アシドフィルスの増
殖抑制が不十分となり、ビフィズス菌数を正確に計測す
ることが困難となる。尚、本発明培地においては、上記
のごとく抗生物質を添加せず、選択剤としてビフィズス
菌の主要代謝産物である酢酸及び従来の選択培地の１／
５程度の塩化リチウムを添加している。従って、ヨーグ
ルト中で酸素や酸（低ｐＨ）によるストレスを受けたビ
フィズス菌をも正確に計測可能である。また、５０〜２
００ｍＭの酢酸を添加し、ｐＨを５．０〜５．８の酸性
とすることにより、グラム陰性菌はもとよりヒト腸内の
主要菌叢を形成するユウバクテリウム（Eubacterium
）、ペプトコッカス（Peptococcus ）あるいはクロス
トリジウム（Clostridium ）等のグラム陽性菌の増殖を
も抑制することが可能である。

【００１２】本発明培地の調製に際しては、上記ビフィ
ズス菌増殖用寒天培地成分（寒天を除く）を精製水中に
添加し、塩酸を用いて所定のｐＨとした後、培地固化用
の寒天２％程度を添加し、オートクレーブ滅菌を施す。
シャーレに分注固化させた本発明培地上に、適宜希釈し
たビフィズス菌含有試料を塗抹し、これを炭酸ガスもし
くは炭酸ガスと窒素ガスの混合ガスで置換した嫌気条件
下で、３７℃で４８〜７２時間培養する。培養後に出現
するコロニーを計数することにより、本発明の所期の目
的であるビフィズス菌の選択的菌数計測を実行すること
ができる。

【００１３】尚、本発明培地を適用する対象となる試料
の代表的なものとして、ビフィズス菌含有ヨーグルト及
びヒト糞便を挙げることができる。しかしながら、当該
試料に限らず、ビフィズス菌を含有する試料であれば、
いずれも本発明培地を適用することができる。

【００１４】

【実施例】以下に実施例を示し本発明をより具体的に説
明するが、これらによってなんら本発明が限定されるも
のではない。〔実施例１〕トリプチケース（ＢＢＬ）８（ｇ）フィトンペプトン（ＢＢＬ）３酵母エキス５Ｌ−システイン０．５グルコース２０Ｋ₂ＨＰＯ₄ ２ＫＨ₂ＰＯ₄ ３ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ０．５ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０１酢酸ナトリウム８．２塩化リチウム１寒天２２．５精製水１０００ｍｌ寒天を除く上記成分を精製水に溶解し、１Ｎ塩酸を用い
てｐＨ５．４に調整した。これに寒天を加え、１２１℃
で１５分間オートクレーブ滅菌した後、塗菌シャーレに
分注し平板を作成した。この寒天平板にビフィズス菌を
はじめとする各種細菌の希釈培養液を０．１ｍｌずつ塗
抹接種し、ガスパック法にて３７℃で４８時間嫌気培養
した際に形成されるコロニー数を計測した。

【００１５】その結果を表１に示した。

【００１６】

【表１】

【００１７】供試したビフィズス菌はいずれも本培地上
で良く増殖し、対照として用いたＢＬ寒天培地上に出現
したコロニー数とほぼ同数のコロニーが検出された。一
方、ビフィズス菌以外の供試菌は、サッカロミセス・セ
レビシエー（Saccharomycescerevisiae）を除くいずれ
もが本培地上でコロニーを形成しなかった。さらに本培
地上に出現したサッカロミセス・セレビシエーのコロニ
ーは極めて小さいピンポイントコロニーであり、本培地
は強い選択性を示した。〔実施例２〕健常な成人男子６名（２５〜４５歳）より新鮮糞便を採
取し、これに９倍量の上記の嫌気性希釈液（腸内菌の世
界，光岡知足編，３２２（１９８０），叢文社）を加
え、嫌気性条件下、ホモジナイザーを用いて十分に均質
化した。これをさらに前記嫌気性希釈液を用いて適宜希
釈した後、実施例１で用いたものと同じ培地上に０．１
ｍｌずつ塗抹接種し、３７℃で４８時間嫌気培養した。
培養後、培地上に出現したコロニー数を計測するととも
に、鏡検によりビフィズス菌のコロニー数及び夾雑菌数
を調べた。また、ビフィズス菌数を比較するため、ＢＬ
寒天培地を用いた際のビフィズス菌コロニー数を計測し
た。

【００１８】その結果を表２に示した。

【００１９】

【表２】

【００２０】本培地におけるビフィズス菌選択率（総菌
数に占めるビフィズス菌数の割合）は、６試料中４試料
で１００％となり、残りの２試料についても８０％以上
を示し、本培地の強い選択性が確認された。尚、ビフィ
ズス菌以外の夾雑菌はユウバクテリウム属菌であった。
一方、本培地におけるビフィズス菌検出率（ＢＬ寒天培
地でのビフィズス菌数に対する本培地でのビフィズス菌
数の比率）は８１．０〜１４６．７％となり、非選択培
地のＢＬ寒天培地と同程度のビフィズス菌数が計測可能
であった。〔実施例３〕実施例１で示したものと同じ培地を用い
て、国内で市販されているビフィズス菌入りヨーグルト
（５品種）中のビフィズス菌数を計測した。すなわち、
これらのヨーグルトを滅菌生理食塩水を用いて適宜希釈
し、本培地上に０．１ｍｌずつ塗抹し、３７℃で４８時
間嫌気培養した際に認められる総コロニー数を計測する
とともに、鏡検によりビフィズス菌のコロニー数及び夾
雑菌数を調べた。また、ビフィズス菌数を比較するた
め、ＢＬ寒天培地を用いた際のビフィズス菌コロニー数
を計測した。

【００２１】結果を表３に示した。

【００２２】

【表３】

【００２３】本培地におけるビフィズス菌選択率は、い
ずれも１００％となり、他の乳酸菌コロニーの形成は全
く認められず、本培地の強い選択性が確認された。ま
た、本培地におけるビフィズス菌検出率は、９０．９〜
１１１．１％となり、ＢＬ寒天培地とほぼ同数のビフィ
ズス菌数が計測可能であった。

【００２４】

【発明の効果】ＢＬ寒天培地、抗生物質を用いた選択培
地あるいは糖の資化能の差を利用した培地よりなる従来
のビフィズス菌数の選別測定法は、煩雑かつ熟練を要
し、検出率も必ずしも安定したものではなかった。これ
らの欠点を補う本発明培地は、計測操作が簡単で熟練を
要せず、選択率及び検出率も極めて高い。したがって、
本発明はビフィズス菌を含有する種々の食品、飲料、医
薬品、飼料、あるいは糞便等のビフィズス菌数計測法と
して幅広く用いることができる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ビフィズス菌の増殖用寒天培地成分に、
酢酸又は酢酸ナトリウムと、塩化リチウムとを含有させ
てなることを特徴とする、ビフィズス菌数計測用選択培
地。
【請求項２】酢酸又は酢酸ナトリウムを５０〜２００
ｍＭ含有することを特徴とする、請求項１記載のビフィ
ズス菌数計測用選択培地。
【請求項３】塩化リチウムを５〜５０ｍＭ含有するこ
とを特徴とする、請求項１記載のビフィズス菌数計測用
選択培地。
【請求項４】ｐＨを５．０〜５．８とすることを特徴
とする、請求項１記載のビフィズス菌数計測用選択培
地。