JPH08332090A - 変異原性物質感知用遺伝子、融合遺伝子、組換プラスミド、形質転換体および変異原性試験法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 変異原性物質によりＤＮＡが損失した場合
に、その程度を発光の強度として検出する変異原性試験
法であって、微生物細胞の破砕の必要がなく、簡単な操
作で、しかも短時間で高感度に変異原性の有無が判定で
きる試験法を提案する。 【構成】 下記制限酵素地図で表わされる組換プラスミ
ドが導入された形質転換体を、検体を含む培地を用いて
培養した後、ルシフェラーゼの基質となる発光素を添加
して発光させる。 【化１】 （Ｐ／Ｏ−３４はリプレッサーとしてのｌｅｘＡタンパ
ク質が結合するオペレーターとｒｅｃＡ遺伝子のプロモ
ーターとからなる、配列番号３の変異原性物質感知用遺
伝子、ｌｕｘＡＢはルシフェラーゼをコードするｌｕｘ
ＡＢ遺伝子、Ａｍｐはアンピシリン耐性遺伝子、ｒｒｎ
ＢＴ１はターミネーター、ｐＢＲ３２２はプラスミドｐ
ＢＲ３２２由来の塩基配列）

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、変異原性物質感知用遺
伝子、この遺伝子を含む融合遺伝子、この融合遺伝子を
有する組換プラスミド、この組換プラスミドが導入され
た形質転換体、ならびにこの形質転換体を用いた変異原
性試験法に関する。

【０００２】

【従来の技術】変異原性物質はその多くが発ガン性物質
でもあることから、環境中の変異原性物質を測定するこ
とは安全性評価の重要な項目のひとつになりつつある。
しかし環境中には多種多様の化学物質が存在するため、
機器分析により個々の変異原性物質を分離定量すること
は不可能である。そのため細胞ＤＮＡに対する変異原性
を総括的に評価できるような、生物を使用した変異原性
試験法が必要となる。

【０００３】現在までに数多くの変異原性試験法が開発
され、様々な生物材料が使用されている。それらの中で
微生物を用いて検体の変異原性の有無を測定する変異原
性試験法は短時間・安価な材料で簡便に行えるという利
点を有しており、既にいくつかの試験法が開発・汎用さ
れている。現在世界中で最も汎用されている変異原性試
験法のひとつにエイムズテスト（Ａｍｅｓ−ｔｅｓｔ）
がある。この試験法はヒスチジン要求性サルモネラ変異
株の菌液を、検体を含む平板最少培地に塗布・培養した
ときに出現する復帰突然変異株のコロニー数から、検体
の変異原性の有無を判断するものである。しかし、この
試験法は、ヒスチジンを含んだサンプルを使用できない
ほか、培養に比較的長時間（４８時間以上）かかるとい
う問題点がある。

【０００４】上記エイムズテストの他にも、ＳＯＳクロ
モテスト（例えば、特開平５−２１１８６５号など）や
ウムテスト（ｕｍｕ−ｔｅｓｔ，Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒ
ｅｓ．，１４７：２１９−２２９（１９８５））などが
提案されている。これらの変異原性試験法は、「変異原
性物質を感知するＳＯＳ遺伝子」および「定量可能な酵
素をコードする遺伝子」からなる融合遺伝子を導入して
形質転換した微生物を用いた試験法であり、ＳＯＳ遺伝
子としてｓｆｉＡまたはｕｍｕＤＣ、酵素をコードする
遺伝子としてβ−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃ
Ｚを使用している。ＳＯＳ遺伝子とは変異原性物質など
の作用によりＤＮＡがダメージを受けたときに誘発され
る約２０種類のＤＮＡ修復遺伝子の総称であり（Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ．，４８：６０−９３（１９８
４））、非誘発状態（ＤＮＡが損なわれていない＝変異
原性物質が存在しない状態）においては、各ＳＯＳ遺伝
子の読みはｌｅｘＡリプレッサーのオペレーターへの結
合により抑えられているが、誘発状態においては、ｌｅ
ｘＡリプレッサーが分解されてＳＯＳ遺伝子からＳＯＳ
タンパクが作られ、このタンパクの働きにより損傷ＤＮ
Ａが修復される。従って上記変異原性試験法では、ＳＯ
Ｓ誘発状態においてｓｆｉＡまたはｕｍｕＤＣの制御下
で誘発されるβ−ガラクトシダーゼの活性を測定するこ
とにより、変異原性の有無を検出している。

【０００５】上記の変異原性試験法は、ＤＮＡの損傷を
直接感知するＳＯＳ遺伝子が読まれる頻度を変異原性の
指標としているので、復帰変異コロニーをカウントする
エイムズテストに比べて直接的、本質的である。しか
し、β−ガラクトシダーゼの活性の測定には、界面活性
剤やトルエン等による細胞破砕の操作が必要であり、ま
た酵素の基質であるｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシド等の多数の試薬類が必要であるなどの問
題点がある。さらに感度が十分に得られない場合もある
という問題点もある。この理由は、ＳＯＳ非誘発状態で
は各ＳＯＳ遺伝子の読みはｌｅｘＡリプレッサーのオペ
レーターへの結合により抑えられているが、その程度は
ＳＯＳ遺伝子の種類により異なっており、ほぼ完全に抑
えられている場合や、抑え方が不十分なためにかなりの
量のタンパク質が構成的に作られる場合もあるためであ
る。すなわち、各ＳＯＳ遺伝子のオペレーターは互いに
類似した塩基配列を有しているが、それぞれ他と少しず
つ異なっており、この違いによりオペレーターへのリプ
レッサーの結合力に違いが生じ、これにより変異原性物
質が存在しないとき（バックグラウンド）の読みの違い
を引き起こすからである。このように従来の変異原性試
験法では、感度を高くするために必要なオペレーターに
関する検討はなされていない。

【０００６】さらに別な試験法として、微生物の発光を
変異原性の指標とするマイクロトックス（Ｍｉｃｒｏｔ
ｏｘ）試験法（用水と廃水、３５：３５−３８（１９９
３））、ミュータトックス（Ｍｕｔａｔｏｘ）試験法
（Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓ．，７４：１１３−１２４
（１９８０））がある。しかし、前者は発光細菌の発光
量の減少を変異原性の指標とする試験法であり、また逆
に後者は発光能を失った発光細菌の変異株を使用して、
この変異株の発光量の増加を変異原性の指標とする試験
法であり、ＤＮＡの損傷を直接感知する遺伝子が読まれ
る頻度を変異原性の指標としている本発明とは原理的に
異なる。

【０００７】ところで、特表平４−５０３００３号に
は、水銀イオンにより特異的に誘発可能な遺伝子系（ｍ
ｅｒ−オペロン）と、生物発光能を付与する細菌性ルシ
フェラーゼ遺伝子（ｌｕｘＡＢ）とからなる融合遺伝子
を含むプラスミドベクターにより形質転換した微生物を
用いて、水銀を検出する方法が記載されている。この方
法では、水銀イオンにより特異的に誘発されたｍｅｒ−
オペロンによりｌｕｘＡＢが翻訳されてルシフェラーゼ
が生成され、この酵素による発光の有無または強度によ
り、水銀の検出または定量が行われる。しかし、上記公
報には、ルシフェラーゼによる発光を変異原性試験に利
用することは示唆されていない。

【０００８】また特表平６−５０９７１２には、特異的
な物質にさらされることによって活性化される調節遺伝
子とｌｕｘ遺伝子とからなる融合遺伝子を含むプラスミ
ドベクターにより形質転換した微生物を用いて、水中の
不純物を検出する方法が記載されている。しかし、具体
的な実施例としてあげられているのは、上記と同様なｍ
ｅｒ−ｌｕｘ融合遺伝子による水銀の検出に関してのみ
であり、融合遺伝子を変異原性試験に使用することは示
唆されていない。

【０００９】さらにＸＥＮＯＭＥＴＲＩＸ社（アメリ
カ）が販売しているＰＲＯ−ＴＯＸｓｔｒｅｓｓ ｇｅ
ｎｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔは、変異原性物質や細胞毒性
物質に対して応答する１６種類のストレス遺伝子とｌａ
ｃＺ遺伝子とからなる融合遺伝子を用いて毒性評価を行
うものである。これらは「定量可能な酵素をコードする
遺伝子」として前記ｌａｃＺを使用しており、β−ガラ
クトシダーゼの活性の測定には前記と同様の問題点があ
る。また使用されている調節遺伝子は全て自然界に存在
するものであり、毒性に対する感度が低いという問題点
もある。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、変異
原性物質を高感度で感知することが可能な、自然界には
存在しない変異原性物質感知用遺伝子を提供することで
ある。本発明の他の目的は、上記変異原性物質感知用遺
伝子とルシフェラーゼをコードする遺伝子とからなり、
変異原性物質によりＤＮＡが損傷した場合に、その程度
を発光の強度として検出することができ、これにより種
々の化合物の変異原性の有無の判定に利用することがで
きる新規かつ有用な融合遺伝子を提供することである。
本発明の別の目的は、上記融合遺伝子を組込んだ組換プ
ラスミドを提供することである。本発明のさらに別の目
的は、上記組換プラスミドを宿主細菌に導入した形質転
換体を提供することである。本発明のさらに別の目的
は、上記形質転換体を用いて、細胞破砕の必要がなく、
簡単な操作で、しかも短時間で高感度に変異原性の有無
を判定することができる変異原性試験法を提案すること
である。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、次の変異原性
物質感知用遺伝子、融合遺伝子、組換プラスミド、形質
転換体および変異原性試験法である。 （１） リプレッサーとしてのｌｅｘＡタンパク質が結
合するオペレーターであって、配列表の配列番号１の塩
基配列で表わされるオペレーターからなることを特徴と
する変異原性物質感知用遺伝子（第一の変異原性物質感
知用遺伝子）。 （２） 上記（１）記載の変異原性物質感知用遺伝子と
ｒｅｃＡ遺伝子のプロモーターとからなる変異原性物質
感知用遺伝子であって、配列表の配列番号２の塩基配列
で表わされることを特徴とする変異原性物質感知用遺伝
子（第二の変異原性物質感知用遺伝子）。 （３） 上記（１）記載の変異原性物質感知用遺伝子と
ｒｅｃＡ遺伝子のプロモーターとを含む変異原性物質感
知用遺伝子であって、配列表の配列番号３の塩基配列で
表わされることを特徴とする変異原性物質感知用遺伝子
（第三の変異原性物質感知用遺伝子）。 （４） 上記（２）または（３）記載の変異原性物質感
知用遺伝子と、ルシフェラーゼをコードするｌｕｘＡＢ
遺伝子とを有し、前記変異原性物質感知用遺伝子の下流
に前記ｌｕｘＡＢ遺伝子が結合していることを特徴とす
る融合遺伝子。 （５） 上記（２）または（３）記載の変異原性物質感
知用遺伝子と、ルシフェラーゼをコードするｌｕｘＡＢ
遺伝子とを有し、前記変異原性物質感知用遺伝子の下流
に前記ｌｕｘＡＢ遺伝子が結合している融合遺伝子を有
することを特徴とする組換プラスミド。 （６） 上記（３）記載の変異原性物質感知用遺伝子
と、ルシフェラーゼをコードするｌｕｘＡＢ遺伝子とを
有し、前記変異原性物質感知用遺伝子の下流に前記ｌｕ
ｘＡＢ遺伝子が結合している融合遺伝子を有する組換プ
ラスミドであって、下記制限酵素地図（１）で表わされ
ることを特徴とする組換プラスミドｐＲＡＬ２０１。

【化２】 （地図中、Ｐ／Ｏ−３４は配列表の配列番号３の塩基配
列で表わされる変異原性物質感知用遺伝子、ｌｕｘＡＢ
はｌｕｘＡＢ遺伝子、Ａｍｐはアンピシリン耐性遺伝
子、ｒｒｎＢＴ１はｒｒｎＢＴ１ターミネーター、ｐＢ
Ｒ３２２はプラスミドｐＢＲ３２２由来の塩基配列を示
す。） （７） 上記（５）または（６）記載の組換プラスミド
が導入されたことを特徴とする形質転換体。 （８） 上記（７）記載の形質転換体を、検体を含む培
地を用いて培養した後、ルシフェラーゼの基質となる発
光素を添加して発光させることを特徴とする変異原性試
験法。

【００１２】本発明の第一の変異原性物質感知用遺伝子
は、配列表の配列番号１の塩基配列で表わされる遺伝子
であり、リプレッサーとしてのｌｅｘＡタンパク質（以
下、ｌｅｘＡリプレッサーという場合がある）が結合す
るオペレーターである。この第一の変異原性物質感知用
遺伝子の塩基配列は、ｒｅｃＡ遺伝子のオペレーター
（配列番号５参照）とは、下記に示すように下線部の４
箇所の塩基が異なっている。ｒｅｃＡ 遺伝子のオペレーター： TACTGTAT GAGC ATAC
AGTA 第一の変異原性物質感知用遺伝子：TACTGTAT ATAT ATAC
AGTA

【００１３】本発明の第一の変異原性物質感知用遺伝子
へのｌｅｘＡリプレッサーの結合力は強く、このため高
感度の変異原性試験が可能になる。この点については後
で詳しく述べる。なお、配列番号１の塩基配列はオペレ
ーターとしては公知である（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１６，Ｎｏ．１１，ｐ５
０８９−５１０５（１９８８））が、変異原性物質を感
知または検出する遺伝子として使用した例はない。

【００１４】本発明の第二の変異原性物質感知用遺伝子
は、配列表の配列番号２の塩基配列で表わされる遺伝子
であり、前記第一の変異原性物質感知用遺伝子とｒｅｃ
Ａ遺伝子のプロモーターとからなっている。すなわち、
配列番号２の塩基配列の存在位置1..6および23..28がｒ
ｅｃＡ遺伝子のプロモーターであり、存在位置5..24が
前記第一の変異原性物質感知用遺伝子である。

【００１５】プロモーターを含む変異原性物質感知用遺
伝子としては、第二の変異原性物質感知用遺伝子のよう
に第一の変異原性物質感知用遺伝子とプロモーターとか
らのみ構成されるＤＮＡ断片が最小単位となるが、例え
ば下記第三の変異原性物質感知用遺伝子のように、他の
塩基が追加されたＤＮＡ断片も変異原性物質感知用遺伝
子として使用することができる。

【００１６】本発明の第三の変異原性物質感知用遺伝子
は、配列表の配列番号３の塩基配列で表わされる遺伝子
であり、前記第一の変異原性物質感知用遺伝子とｒｅｃ
Ａ遺伝子のプロモーターとを含んでおり、前記第二の変
異原性物質感知用遺伝子に他の塩基が追加された構成に
なっている。すなわち、配列番号３の塩基配列の存在位
置3..8および25..30がｒｅｃＡ遺伝子のプロモーターで
あり、存在位置7..26が前記第一の変異原性物質感知用
遺伝子である。つまり、存在位置3..30が前記第二の変
異原性物質感知用遺伝子であり、それ以外が他の塩基で
ある。

【００１７】第三の変異原性物質感知用遺伝子におい
て、存在位書1..2および31..37の他の塩基（ＡＣ〜ＴＧ
ＣＴＴＣＡ）は、ｒｅｃＡ遺伝子においてｌｅｘＡリプ
レッサーの結合によりＤＮアーゼによる分解から保護さ
れる部分、およびメッセンジャーＲＮＡの合成開始点ま
での部分である（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７８：４２０２−４２０８（１９
８１））。

【００１８】本発明の第一ないし第三の変異原性物質感
知用遺伝子をプラスミドに導入するには、配列の両端に
制限酵素により切断される配列（リンカー）を追加した
ＤＮＡ断片を用いることにより行うことができる。例え
ば、配列番号４に示すように、第三の変異原性物質感知
用遺伝子の一方の末端にＢａｍＨＩリンカー（存在位置
3..8）、他方の末端にＳａｌＩリンカー（存在位置46..
51）を導入したＤＮＡ断片（Ｐ／Ｏ−３４Ｘという）を
用いることにより、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ切断部位
を有するプラスミドに導入することができる。

【００１９】比較のため、下記にｒｅｃＡ遺伝子のプロ
モーターおよびオペレーター（ｒｅｃＡＰ／Ｏという、
配列番号６参照）の配列、ならびにＰ／Ｏ−３４Ｘの配
列を示す。

【化３】

【００２０】本発明の第一ないし第三の変異原性物質感
知用遺伝子は、自然界には存在しないので、化学合成に
より製造する。

【００２１】本発明の融合遺伝子を構成するｌｕｘＡＢ
遺伝子は、ｌｕｘＡ遺伝子の下流にｌｕｘＢ遺伝子が結
合している遺伝子である。ｌｕｘＡＢ遺伝子はルシフェ
ラーゼ酵素をコードする遺伝子であり、ｌｕｘＡ遺伝子
およびｌｕｘＢ遺伝子がそれぞれルシフェラーゼのサブ
ユニットをコードしている。ｌｕｘＡ遺伝子およびｌｕ
ｘＢ遺伝子の塩基配列は公知であり、配列番号７の配列
の中に記載されている。すなわち配列番号７の存在位置
137..1201がｌｕｘＡ遺伝子であり、存在位置1231..220
2がｌｕｘＢ遺伝子である。

【００２２】配列番号７に記載したｌｕｘＡＢ遺伝子を
含むＤＮＡ断片は、市販の微生物の染色体ＤＮＡから切
出すことができる。この場合、ｌｕｘＡ遺伝子の前、ｌ
ｕｘＡ遺伝子とｌｕｘＢ遺伝子との間、ｌｕｘＢ遺伝子
の後に、ｌｕｘＡ遺伝子およびｌｕｘＢ遺伝子以外の他
の塩基が結合しているが、このようなＤＮＡ断片をその
ままｌｕｘＡＢ遺伝子として使用することができる。ま
た酵素処理などにより他の塩基の一部または全部を除去
したり、場合によっては別の塩基を付加したものを使用
することもできる。

【００２３】配列番号７に記載したＤＮＡ断片を得る具
体的な方法としては、例えばＡＴＣＣからＮｏ．３３８
４３のカタログ番号で市販されているビブリオ ハルベ
イ（Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ）の染色体ＤＮＡを
精製した後、ＨｉｎｄIIIで切断して約４ｋｂのＤＮＡ
断片を得、この断片をＳａｌＩおよびＰｖｕIIで切断し
た約２．４ｋｂのＤＮＡ断片として得ることができる
（Biochemistry 23:3663-3667(1984), J. Bacteriol.,
174:8094-8101(1992))。

【００２４】本発明の融合遺伝子は、前記のような第二
または第三の変異原性物質感知用遺伝子の下流に、上記
のようなｌｕｘＡＢ遺伝子が結合した融合遺伝子であ
る。このような融合遺伝子を有する組換プラスミドを宿
主細菌に導入することにより、本発明の形質転換体を得
ることができる。

【００２５】このような本発明の形質転換体では、通常
はｌｅｘＡリプレッサーが配列番号１の塩基配列を有す
るオペレーターに強固に結合しており、ｌｕｘＡＢ遺伝
子の発現はほぼ完全に抑制されている。ところが、変異
原性物質によりＤＮＡが損傷を受けてＳＯＳ誘発状態に
なると、ｒｅｃＡの産生するタンパク質がｌｅｘＡリプ
レッサーの自己分解能（プロテアーゼ活性）を活性化す
ることにより、リプレッサータンパク質が自己分解す
る。このようなＳＯＳ誘発状態になると、ｒｅｃＡ遺伝
子のプロモーターの下流にあるｌｕｘＡＢ遺伝子の翻訳
が開始され、ルシフェラーゼが生産される。ここにルシ
フェラーゼの基質となる発光素（ルシフェリン）を添加
すると、発光が生じる。

【００２６】発光の強度は変異原性物質の濃度と正の相
関関係があるので、発光の強度を測定することにより、
または発光の有無により、変異原性物質の有無、または
相対的な濃度の高低を検出することができる。このよう
に、変異原性物質感知用遺伝子は、変異原性物質を感知
するセンサーとして作用し、ｌｕｘＡＢ遺伝子は感知し
た変異原性を容易に検出可能な光に変換する発光源とし
て作用している。

【００２７】本発明の組換プラスミドは前記融合遺伝子
を含むものであるが、宿主細菌中でプラスミドとして存
在するためには、自律複製を可能とするＤＮＡ領域が設
けられる。またクローニング時の微生物検出用のマーカ
ーとして薬剤耐性遺伝子を設けるのが好ましく、例えば
アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺
伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性
遺伝子等が使用できる。変異原性試験に使用する形質転
換体を得る場合に好ましく利用できる組換プラスミドと
しては、前記制限酵素地図（１）で表される組換プラス
ミドｐＲＡＬ２０１があげられる。

【００２８】組換プラスミドｐＲＡＬ２０１は、次のよ
うにして得ることができる。前記方法によりビブリオ
ハルベイ（ＡＴＣＣ３３８４３）からｌｕｘＡＢ遺伝子
を含む約２．４ｋｂのＤＮＡ断片（ＳａｌＩ〜ＰｖｕII
断片）を得る。次にＰｖｕII切断末端にＳａｌＩリンカ
ーをライゲーションした後、ＳａｌＩで切断し、両末端
がＳａｌＩで切断された約２．４ｋｂのＤＮＡ断片を得
る。

【００２９】次にｐＢＲ３２２プラスミド（コード番号
ＤＮＡ−００３で東洋紡績（株）から市販されている）
をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断した後、電気泳動に
より３．２ｋｂのＤＮＡ断片を回収する。これとは別
に、ｐＫＫ２３２−８プラスミド（コード番号２７−４
９２５−０１でファルマシア社から市販されている）を
ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断した後、ｒｒｎＢＴ１
ターミネーターを含む約０．９ｋｂのＤＮＡ断片を回収
する。

【００３０】次に、ｐＢＲ３２２プラスミドから得た上
記３．２ｋｂのＤＮＡ断片と、ｐＫ２３２−８プラスミ
ドから得た上記約０．９ｋｂのＤＮＡ断片とのライゲー
ションを行う。得られたプラスミドをＢａｍＨＩおよび
ＳａｌＩで切断し、ここにＢａｍＨＩリンカーおよびＳ
ａｌＩリンカーを導入した第三の変異原性物質感知用遺
伝子を組込む。このプラスミドをＳａｌＩで切断した
後、前記約２．４ｋｂのｌｕｘＡＢ遺伝子を含むＤＮＡ
断片を組込むことにより、目的とするプラスミドｐＲＡ
Ｌ２０１が得られる。

【００３１】組換プラスミドの宿主細菌への導入は、エ
レクトロポーレーション法、カルシウムおよびルビジウ
ム処理による方法、ヘルパープラスミドを用いた伝達に
よる方法等によって、容易に行うことができる。宿主細
菌としては、組換プラスミドが安定に維持され、かつＳ
ＯＳ修復能を有する細菌を用いることができる。このよ
うな宿主細菌としては、一連の腸内細菌、例えばＳａｌ
ｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ， Ａｌｃａ
ｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ， Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ， Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃ
ｌｏａｃａｅ，Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｒｕｃｋｅｒｉなど
があげられるが、中でもサルモネラチフィムリウム（Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）から作
成された変異株、例えば財団法人発酵研究所（ＩＮＳＴ
ＩＴＵＴＥ ＦＯＲ ＦＥＲＭＥＮＴＡＴＩＯＮ， Ｏ
ＳＡＫＡ（ＩＦＯ））からＮｏ．１４２０９のカタログ
番号で市販されているサルモネラ チフィムリウム Ｔ
Ａ１５３５や、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）からＮｏ．
５３３３８のカタログ番号で市販されているエセリシア
コリ ＭＣ１０６１が好ましい。

【００３２】上記のようにして得られた形質転換体を用
いて変異原性試験を行うには、変異原性の有無を判定し
たい検体を含む培地を用いて形質転換体を培養し、ルシ
フェラーゼの基質となる発光素を添加して発光させるこ
とにより行うことができる。検出される変異原性物質の
種類は限定されず、例えば、検体中にメタンスルホン酸
メチル、メタンスルホン酸エチル、マイトマイシンＣ、
４−ニトロキノリン−１−オキシド、ナリジキシン酸、
９−アミノアクリジン、２−ニトロフルオレン、Ｎ−エ
チル−Ｎ′−ニトロ−ニトロソグアニジン、β−プロピ
オラクトン、２−（２−フリル）−３−（５−ニトロ−
２−フリル）アクリルアミド、２−メトキシ−６−クロ
ロ−９−〔３−（２−クロロ−エチル）−アミノプロピ
ルアミノ〕アクリジン・塩酸塩、ストレプトゾトシン、
２−アミノアントラセン、アフラトキシンＢ１、３，４
−ベンゾ（ａ）ピレン、７，１２−ジメチルベンツ
（ａ）アントラセン、３−アミノ−１−メチル−５Ｈ−
ピリド（４，３−ｂ）インドールアセテート、３−アミ
ノ−１，４−ジメチル−５Ｈ−ピリド（４，３−ｂ）イ
ンドールアセテートまたはこれらの混合物、あるいはこ
れまでに知られていない変異原性物質があげられる。

【００３３】培養は形質転換体に適した条件で行われる
が、例えばサルモネラ チフィムリウム ＴＡ１５３５
の場合は、３７℃の定温下で、大腸菌の培養に一般的に
使用される栄養培地、例えばＬＢ培地など、で行うのが
好ましい。培地は液体培地でも固体培地でもよいが、液
体培地が好ましい。培養時間は１〜１６時間が適当であ
る。

【００３４】このようにして培養した後添加する発光素
としては、ｎ−デシルアルデヒド、ｎ−ノニルアルデヒ
ド等の長鎖アルデヒドなどがあげられる。検体中に変異
原性物質が含まれていた場合には、既に説明したように
ルシフェラーゼが生産されているので、発光素が分解さ
れて発光が生じる。この発光を検出することにより、変
異原性の有無を判定する指標とすることができる。

【００３５】変異原性物質を含まないバックグラウンド
（コントロール）試験では、ｌｅｘＡリプレッサーがオ
ペレーターに強固に結合してｌｕｘＡＢ遺伝子の発現を
抑制しているので、ルシフェラーゼが生産されず、この
ため発光は生じないか、または比較的弱い発光が生じる
だけである。従って、検体を試験に供した際の発光の有
無または発光強度の変化により変異原性の有無またはＤ
ＮＡ損傷の程度を判定することができる。この場合、バ
ックグラウンドの発光量に対する検体の発光量の比は、
バックグラウンドの発光量が抑えられているため大きく
なっているので、感度の高い試験が可能となる。

【００３６】試験結果の判定は、バックグラウンドより
も発光強度が大きくなった場合は、それだけＤＮＡの損
傷が大きいと判定することができる。通常、バックグラ
ウンドに対して発光強度が２倍以上になった場合は、変
異原性ありと判定することができる。なお、変異原性試
験として世界で最も汎用されているエイムズテストにお
いては、コロニー数が変異原性の指標とされており、感
度（既存変異原性物質の最少検出濃度）は「バックグラ
ウンド時の２倍のコロニー数を与える変異原性物質濃
度」と定義されている（Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓ．，
３１：３４７−３６３（１９７５））。またウムテスト
（Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓ．，１４７：２１９−２２
９（１９８５））、ＳＯＳクロモテスト（Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７９：５９７１−５９７
５（１９８２））では変異原性の指標がβ−ガラクトシ
ダーゼ活性である点がエイムズテストと異なるが、「バ
ックグラウンドの２倍のβ−ガラクトシダーゼ活性を与
える変異原性物質濃度」と定義されている。このように
本発明の変異原性の有無の判定基準は従来の方法と同様
とすることができるが、前記のようにバックグラウンド
の発光量に対する検体の発光量の比が大きくなっている
ので、本発明の変異原性試験法は従来の試験法に比べて
感度は上昇している。

【００３７】発光は、ルシフェラーゼの活性が高く維持
される条件で行うのが好ましく、通常温度３０〜３７
℃、ｐＨ７前後の条件で行うのが好ましい。

【００３８】発光はルミノメーターなどの装置により容
易に測定することができる。この場合、培養後の培地を
直接発光測定に供することができるので細菌の破砕は必
要なく、このため試験操作は簡単である。また発光は微
量でも定量可能であり、またＤＮＡの損失を直接感知す
る遺伝子が読まれる頻度を変異原性の指標としており、
しかもバックグラウンドの発光量が抑えられているの
で、高感度で変異原性物質の検出が可能である。

【００３９】

【発明の効果】本発明の変異原性物質感知用遺伝子は、
リプレッサーが強固に結合する特定の塩基配列を有して
いるので、変異原性物質が存在しない場合は、下流の遺
伝子の翻訳はほとんど起こらない。このため変異原性物
質の高感度の検出が可能である。また本発明の融合遺伝
子は、上記変異原性物質感知用遺伝子の下流にルシフェ
ラーゼをコードするｌｕｘＡＢ遺伝子が結合しているの
で、変異原性物質によりＤＮＡが損傷した場合に、その
程度を発光の強度により高感度に検出可能であり、この
ため変異原性試験に利用することができる。また本発明
の組換プラスミドは、上記融合遺伝子を含み、変異原性
試験に用いる形質転換体を調製する際にベクターとして
利用することができる。

【００４０】また本発明の形質転換体は、上記組換プラ
スミドを保持し、変異原性試験に利用することができ
る。さらに本発明の変異原性試験法によれば、上記形質
転換体を用いることにより、細胞破砕の必要はなく、簡
単な操作で、しかも短時間で高感度に変異原性試験を行
うことができる。

【００４１】

【実施例】次に本発明の実施例について説明する。実施
例で使用したプラスミドおよび微生物は次の通りであ
る。

【００４２】１）ビブリオ ハルベイ（Ｖｉｂｒｉｏ
ｈａｒｖｅｙｉ）（ＡＴＣＣ３３８４３） ＡＴＣＣ Ｎｏ．３３８４３のカタログ番号でＡＴＣＣ
から市販されているビブリオ ハルベイを使用した。こ
の菌体の染色体ＤＮＡ中にはｌｕｘＡＢ遺伝子が含まれ
ており、ＨｉｎｄIIIにより約４ｋｂのＤＮＡ断片とし
て切出されることがわかっている（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ２３：３６６３−３６６７（１９８４））。

【００４３】２）エセリシア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ）ＲＲ１ ベセスダ・リサーチ社からライブラリー エフィシェン
シィ^TM ＲＲ１コンピテントセルの品名で市販されてお
り、コスモバイオ社を通して入手可能である。 ３）ｐＢＲ３２２プラスミド 東洋紡（株）から市販されている。コードＮｏ．ＤＮＡ
−００３。 ４）ｐＫＫ２３２−８プラスミド ファルマシア社から市販されている。コードＮｏ．２７
−４９２５−０１。

【００４４】５）エセリシア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より５３３３８のカタログ
番号で市販されている。 ６）サルモネラ チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＴＡ１５３５ 財団法人発酵研究所〔ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＦＯＲ Ｆ
ＥＲＭＥＮＴＡＴＩＯＮ，ＯＳＡＫＡ（ＩＦＯ）〕か
ら、Ｎｏ．１４２０９のカタログ番号で市販されてい
る。この株は本来エイムズテストに用いるためにサルモ
ネラ チフィムリウム ＬＴ−２株から作成された変異
株であり（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，
７０：７８２−７８６（１９７３））、ヒスチジン要求
性、膜の変異ｒｆａ、切出し修復能を支配するｕｖｒＢ
遺伝子の欠損という３種類の変異を有する。膜変異によ
り化学物質の細胞膜透過性が良く、さらにｕｖｒＢ欠損
によりＤＮＡ修復能が損なわれているため変異原性物質
に対する感受性が良くなっている。このことから、この
株は前述の変異原性試験ウムテストにおいてもｕｍｕＤ
Ｃ−ｌａｃＺ融合遺伝子を含むプラスミドの宿主として
使用されている（Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓ．，１４
７：２１９−２２９（１９８５））。

【００４５】実施例１ １）変異原性物質感知用遺伝子の製造 配列番号４の塩基配列で表わされるＤＮＡ断片を、合成
することにより得た。このＤＮＡ断片は第三の変異原性
物質感知用遺伝子にＢａｍＨＩリンカーおよびＳａｌＩ
リンカーが導入されているものであり、プラスミドをＢ
ａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断することにより、プラス
ミドに第三の変異原性物質感知用遺伝子を組込むことが
できる。

【００４６】２）ｌｕｘＡＢ遺伝子の単離ｌｕｘＡＢ 遺伝子をビブリオ ハルベイ（ＡＴＣＣ３３
８４３）の染色体ＤＮＡから、ＨｉｎｄIIIにより約４
ｋｂのＤＮＡ断片として切出した。クローニングは文献
（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３：３６６３−３６６
７（１９８４））を参照し、ショットガン法により行
い、下記制限酵素地図（３）に示すプラスミドを得た。

【化４】 （地図中、ｌｕｘＡＢ、ＡｍｐおよびｐＢＲ３２２は前
記と同じものを示す。）

【００４７】すなわち、ビブリオ ハルベイ（ＡＴＣＣ
３３８４３）の染色体ＤＮＡを精製し、ＨｉｎｄIIIに
より切断した後、ｐＢＲ３２２プラスミドと混合してラ
イゲーションを行った。ライゲーション溶液を、ＣａＣ
ｌ₂処理により作成したエセリシア コリ ＲＲ１のコ
ンピテントセル（加えたＤＮＡを取込む状態にある細
胞）と混合し、トランスフォーメーションを行った後、
適当量の菌液をＬＢプレートに植菌した。一晩３７℃で
培養後、プレートの蓋に発光のための基質として２０μ
ｌのｎ−デシルアルデヒドを添加し、コロニーを蒸気に
さらしたところ、発光コロニーが確認された。これらの
１つを取り液体培養後プラスミドを精製した。得られた
プラスミドを制限酵素により切断し、切断パターンを調
べたところ、ｐＢＲ３２２にｌｕｘＡＢ遺伝子が正しく
組込まれ、前記地図（３）に示すプラスミドが得られて
いることがわかった。

【００４８】３）融合遺伝子およびプラスミドｐＲＡＬ
２０１の作成 前記地図（３）のプラスミドにおいて、発光に必要なｌ
ｕｘＡＢ遺伝子はＳａｌＩ〜ＰｖｕIIの２．４ｋｂの部
分に含まれることがわかっている（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ．，１７４：８０９４−８１０１（１９９２））。
従って、前記地図（３）のプラスミドをＰｖｕIIで切断
し、切断末端にＳａｌＩリンカーをライゲーションし
た。これをＳａｌＩで切断し、アガロースゲル電気泳動
で行った後、２．４ｋｂのＤＮＡ断片を含むバンド部分
を切出し、ＤＮＡを精製した。

【００４９】次にｐＢＲ３２２プラスミドをＢａｍＨＩ
およびＰｓｔＩで切断した後、電気泳動により３．２ｋ
ｂのＤＮＡ断片を回収した。これとは別に、ｐＫＫ２３
２−８プラスミドをＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断し
た後、ｒｒｎＢＴ１ターミネーターを含む約０．９ｋｂ
のＤＮＡ断片を回収した。次にｐＢＲ３２２プラスミド
から得た上記３．２ｋｂのＤＮＡ断片と、ｐＫＫ２３２
−８プラスミドから得た上記約０．９ｋｂのＤＮＡ断片
とをライゲーションし、下記制限酵素地図（４）に示す
プラスミドｐＲＡＬ１０を得た。

【化５】 （地図中、ｒｒｎＢＴ１、ＡｍｐおよびｐＢＲ３２２は
前記と同じものを示す。）

【００５０】上記プラスミドｐＲＡＬ１０をＢａｍＨＩ
およびＳａｌＩで切断し、ここに前記１）で得た変異原
性物質感知用遺伝子を組込んだ。このプラスミドをＳａ
ｌＩで切断した後、前記２．４ｋｂのｌｕｘＡＢ遺伝子
を含むＤＮＡ断片を組込み、制限酵素地図（１）で示さ
れるプラスミドｐＲＡＬ２０１を得た。

【００５１】４）形質転換体の作成 上記３）で得たプラスミドｐＲＡＬ２０１を、塩化カル
シウム法によりエセリシア コリ ＭＣ１０６１に導入
して形質転換し、形質転換体エセリシア コリＭＣ１０
６１（ｐＲＡＬ２０１）を得た。またｐＲＡＬ２０１を
ＢＩＯ−ＲＡＤ社製のジーンパルサーを用いてエレクト
ロポレーション法によりサルモネラチフィムリウム Ｔ
Ａ１５３５に導入して形質転換し、形質転換体サルモネ
ラチフィムリウム ＴＡ１５３５（ｐＲＡＬ２０１）を
得た。

【００５２】実施例２ 実施例１の４）で得た２種類の形質転換体を用いて、次
のようにして変異原性試験を行った。使用した変異原性
物質は以下の１４種類である。 代謝活性化の不必要なもの（８種類）：試験菌としてエ
セリシア コリ ＭＣ１０６１（ｐＲＡＬ２０１）を使
用。Methyl methane sulfonate (MMS),Mitomicin C (MM
C),4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO),Ethyl methane s
ulfonate (EMS),β-Propiolactone (β-PL),2-(2-Fury
l)-3-(5-nitro-2-furyl) acrylamide (AF-2),2-Methoxy
-6-chloro-9-[3-(2-chloro-ethyl)-aminopropylamino]
acridine・HCl(ICR-191),Streptozotocin (SZ),

【００５３】代謝活性化の必要なもの（６種類）：試験
菌としてサルモネラ チフィムリウム ＴＡ１５３５
（ｐＲＡＬ２０１）を使用。2-Aminoanthracene (2-A
A),Aflatoxin B1 (AFTB1),3,4-Benzo(a)pyrene (B(a)
P),7,12-Dimethylbenz(a) anthracene (DMBA),3-Amino-
1-methyl-5H-pryido(4,3-b) indole acetate (Trp-P-
1),3-Amino-1,4-dimethyl-5H-pyrido(4,3-b) indole ac
etate (Trp-P-2)

【００５４】試験方法は、まず試験菌を５ｍｌのＬＢ培
地に植菌し、３７℃で一晩培養した。この培養液１ｍｌ
を新しい１００ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で２時
間培養した後、培養液を５ｍｌずつ試験管に分注した。
これらの試験管に上記変異原性物質を種々の濃度となる
よう加えた。なお、Ｓ９混合物による代謝活性化が必要
な変異原性物質の場合には、培養液を３．５ｍｌずつ分
注し、５００μｌのＳ９混合物（オリエンタル酵母
（株）、コード番号６３６−００２２１）を加えた後、
変異原性物質を添加した。３７℃でさらに２時間培養を
続けた後、培養液を新しいＬＢ培地で２００倍に希釈
し、その２００μｌを発光測定に使用した。

【００５５】発光は予めエタノールで２００倍に希釈し
たｎ−デシルアルデヒド１０μｌを分注した発光測定用
のキュベットに、前記希釈培養液２００μｌを添加する
ことにより開始させた。発光量の測定は、発光開始後５
秒〜１５秒までの１０秒間にかけて行った。測定にはタ
ーナーデザイン社製のルミノメーターＭｏｄｅｌ ２０
ｅ（商標）を、ｄｅｌａｙ ｔｉｍｅ ５ｓｅｃ，ｉｎ
ｔｅｇｒａｔｅ ｔｉｍｅ １０ｓｅｃの条件で使用し
た。なお、以上の操作は全て室温下で行った。また発光
量は変異原性物質を加えないとき（バックグラウンド、
コントロール）のサンプルの発光量を１とした時の相対
発光量（ＯＤ６００＝１に換算）として表した。なお、
最少検出濃度は既存法であるエイムズテスト、ウムテス
ト、ＳＯＳクロモテストに従って、バックグラウンドの
２倍の発光量を与える変異原性物質濃度として表した。

【００５６】試験の結果、全ての変異原性物質に対し
て、変異原性物質の濃度に対応した発光量の増加が確認
された。図１には、そのうちの３種類の変異原性物質
（ＭＭＣ，ＭＭＳ，４ＮＱＯ）に対して得られた結果を
示す。また上記１４種類の変異原性物質に対して得られ
た感度を既存法の感度（トキシコロジーフォーラム Ｖ
ｏｌ．８（５），５８０−５８６，１９８５）とともに
表１に示す。

【００５７】

【表１】 以上の結果より、全ての変異原性物質について既存法と
同等またはそれ以上の感度が得られていることがわか
る。

【００５８】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：binding-site 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：S 配列 TACTGTATAT ATATACAGTA 20

【００５９】配列番号：2 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 存在位置：1..6 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：binding-site 存在位置：5..24 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：promoter 存在位置：23..28 特徴を決定した方法：S 配列 TTGATACTGT ATATATATAC AGTATAAT 28

【００６０】配列番号：3 配列の長さ：37 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 存在位置：3..8 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：binding-site 存在位置：7..26 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：promoter 存在位置：25..30 特徴を決定した方法：S 配列 ACTTGATACT GTATATATAT ACAGTATAAT TGCTTCA 37

【００６１】配列番号：4 配列の長さ：53 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：cleavage-site 存在位置：3..8 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：promoter 存在位置：11..16 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：binding-site 存在位置：15..34 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：promoter 存在位置：33..38 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：cleavage-site 存在位置：46..51 特徴を決定した方法：S 配列 CCGGATCCAC TTGATACTGT ATATATATAC AGTATAATTG CTTCAGTCGA CCC 53

【００６２】配列番号：5 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：binding-site 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：S 配列 TACTGTATGA GCATACAGTA 20

【００６３】配列番号：6 配列の長さ：37 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 存在位置：3..8 特徴を決定した方法：S 配列の特徴 特徴を表す記号：binding-site 存在位置：7..26 特徴を決定した方法：S 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 存在位置：25..30 特徴を決定した方法：S 配列 ACTTGATACT GTATGAGCAT ACAGTATAAT TGCTTCA 37

【００６４】配列番号：7 配列の長さ：2403 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ヒ゛フ゛リオ ハルヘ゛イ（Vibrio herveyi) 配列の特徴 特徴を表す記号：cleavage-site 存在位置：1..6 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：peptide 存在位置：137..1201 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：peptide 存在位置：1231..2202 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：cleavage-site 存在位置：2398..2403 特徴を決定した方法：S 配列 GTCGACTTTA TCGAGCCTGA TTTTGAACAA CTCACCATCG CGACTGTGAA TGAACGTCGC 60 TTGAAAGCGG AAATTGAAAG CCGTACGCCA GAAATGGCTT AGGTCTTATC GTAATACCAA 120 CAAATAAGGA AATGTT ATG AAA TTT GGA AAC TTC CTT CTC ACT TAT CAG CCA 172 Met Lys Phe Gly Asn Phe Leu Leu Thr Tyr Gln Pro 1 5 10 CCT GAG CTA TCT CAG ACC GAA GTG ATG AAG CGA TTG GTT AAT CTG GGC 220 Pro Glu Leu Ser Gln Thr Glu Val Met Lys Arg Leu Val Asn Leu Gly 15 20 25 AAA GCG TCT GAA GGT TGT GGC TTC GAC ACC GTT TGG TTG CTA GAG CAC 268 Lys Ala Ser Glu Gly Cys Gly Phe Asp Thr Val Trp Leu Leu Glu His 30 35 40 CAC TTC ACT GAA TTT GGG TTG TTA GGG AAT CCT TAT GTT GCT GCC GCA 316 His Phe Thr Glu Phe Gly Leu Leu Gly Asn Pro Tyr Val Ala Ala Ala 45 50 55 60 CAC CTA TTA GGT GCG ACA GAA ACG CTC AAC GTT GGC ACT GCA GCT ATC 364 His Leu Leu Gly Ala Thr Glu Thr Leu Asn Val Gly Thr Ala Ala Ile 65 70 75 GTA TTG CCG ACT GCC CAT CCG GTT CGA CAA GCA GAA GAC GTA AAC CTA 412 Val Leu Pro Thr Ala His Pro Val Arg Gln Ala Glu Asp Val Asn Leu 80 85 90 CTG GAT CAA ATG TCA AAA GGA CGA TTC CGT TTT GGT ATT TGT CGC GGT 460 Leu Asp Gln Met Ser Lys Gly Arg Phe Arg Phe Gly Ile Cys Arg Gly 95 100 105 TTG TAC GAT AAA GAT TTT CGT GTC TTT GGT ACA GAC ATG GAT AAC AGC 508 Leu Tyr Asp Lys Asp Phe Arg Val Phe Gly Thr Asp Met Asp Asn Ser 110 115 120 CGA GCC TTA ATG GAC TGT TGG TAT GAC TTG ATG AAA GAA GGC TTC AAT 556 Arg Ala Leu Met Asp Cys Trp Tyr Asp Leu Met Lys Glu Gly Phe Asn 125 130 135 140 GAA GGC TAT ATC GCG GCG GAT AAC GAA CAT ATT AAG TTC CCG AAA ATC 604 Glu Gly Tyr Ile Ala Ala Asp Asn Glu His Ile Lys Phe Pro Lys Ile 145 150 155 CAA CTG AAT CCA TCG GCT TAC ACA CAA GGT GGT GCT CCT GTT TAT GTC 652 Gln Leu Asn Pro Ser Ala Tyr Thr Gln Gly Gly Ala Pro Val Tyr Val 160 165 170 GTC GCG GAG TCA GCA TCA ACG ACA GAA TGG GCT GCA GAG CGT GGC CTA 700 Val Ala Glu Ser Ala Ser Thr Thr Glu Trp Ala Ala Glu Arg Gly Leu 175 180 185 CCA ATG ATT CTA AGC TGG ATC ATC AAC ACT CAC GAG AAG AAA GCG CAG 748 Pro Met Ile Leu Ser Trp Ile Ile Asn Thr His Glu Lys Lys Ala Gln 190 195 200 CTT GAT CTT TAC AAC GAA GTC GCG ACT GAA CAT GGC TAC GAT GTG ACT 796 Leu Asp Leu Tyr Asn Glu Val Ala Thr Glu His Gly Tyr Asp Val Thr 205 210 215 220 AAG ATT GAC CAC TGT TTG TCT TAC ATC ACC TCC GTC GAT CAT GAC TCA 844 Lys Ile Asp His Cys Leu Ser Tyr Ile Thr Ser Val Asp His Asp Ser 225 230 235 AAT AGA GCC AAA GAT ATT TGC CGC AAC TTC TTG GGC CAT TGG TAC GAC 892 Asn Arg Ala Lys Asp Ile Cys Arg Asn Phe Leu Gly His Trp Tyr Asp 240 245 250 TCA TAC GTG AAT GCC ACC AAG ATT TTT GAC GAC TCT GAC CAA ACA AAA 940 Ser Tyr Val Asn Ala Thr Lys Ile Phe Asp Asp Ser Asp Gln Thr Lys 255 260 265 GGT TAC GAC TTC AAT AAA GGT CAA TGG CGT GAT TTT GTG TTG AAA GGC 988 Gly Tyr Asp Phe Asn Lys Gly Gln Trp Arg Asp Phe Val Leu Lys Gly 270 275 280 CAC AAA GAC ACC AAT CGC CGA ATT GAT TAC AGC TAC GAA ATC AAC CCA 1036 His Lys Asp Thr Asn Arg Arg Ile Asp Tyr Ser Tyr Glu Ile Asn Pro 285 290 295 300 GTA GGG ACG CCT GAA GAG TGT ATC GCG ATT ATC CAG CAA GAT ATT GAT 1084 Val Gly Thr Pro Glu Glu Cys Ile Ala Ile Ile Gln Gln Asp Ile Asp 305 310 315 GCG ACG GGT ATT GAC AAT ATT TGT TGT GGT TTT GAA GCA AAC GGT TCT 1132 Ala Thr Gly Ile Asp Asn Ile Cys Cys Gly Phe Glu Ala Asn Gly Ser 320 325 330 GAA GAA GAA ATT ATC GCA TCT ATG AAG CTA TTC CAG TCT GAT GTG ATG 1180 Glu Glu Glu Ile Ile Ala Ser Met Lys Leu Phe Gln Ser Asp Val Met 335 340 345 CCA TAT CTC AAA GAA AAA CAG TAATTAATAT TTTCTAAAAG GAAAGAGAC ATG 1233 Pro Tyr Leu Lys Glu Lys Gln Met 350 355 1 AAA TTT GGA TTA TTC TTC CTC AAT TTT ATG AAT TCA AAG CGT TCT TCT 1281 Lys Phe Gly Leu Phe Phe Leu Asn Phe Met Asn Ser Lys Arg Ser Ser 5 10 15 GAT CAA GTC ATC GAA GAA ATG TTA GAT ACC GCA CAT TAC GTA GAT CAG 1329 Asp Gln Val Ile Glu Glu Met Leu Asp Thr Ala His Tyr Val Asp Gln 20 25 30 TTG AAG TTT GAC ACG TTG GCT GTT TAC GAA AAC CAT TTC TCG AAC AAT 1377 Leu Lys Phe Asp Thr Leu Ala Val Tyr Glu Asn His Phe Ser Asn Asn 35 40 45 GGT GTG GTT GGT GCC CCA CTA ACA GTG GCT GGT TTT TTA CTT GGT ATG 1425 Gly Val Val Gly Ala Pro Leu Thr Val Ala Gly Phe Leu Leu Gly Met 50 55 60 65 ACA AAG AAC GCC AAA GTG GCT TCG TTG AAT CAC GTC ATT ACC ACG CAT 1473 Thr Lys Asn Ala Lys Val Ala Ser Leu Asn His Val Ile Thr Thr His 70 75 80 CAT CCA GTA CGT GTG GCG GAA GAA GCG TGT CTA CTT GAC CAA ATG AGT 1521 His Pro Val Arg Val Ala Glu Glu Ala Cys Leu Leu Asp Gln Met Ser 85 90 95 GAA GGC CGT TTT GCC TTT GGC TTT AGT GAT TGT GAA AAG AGT GCA GAT 1569 Glu Gly Arg Phe Ala Phe Gly Phe Ser Asp Cys Glu Lys Ser Ala Asp 100 105 110 ATG CGC TTC TTT AAT CGA CCA ACG GAT TCT CAG TTT CAG TTG TTC AGT 1617 Met Arg Phe Phe Asn Arg Pro Thr Asp Ser Gln Phe Gln Leu Phe Ser 115 120 125 GAG TGT CAC AAG ATC ATC AAT GAT GCA TTC ACT ACT GGG TAC TGC CAT 1665 Glu Cys His Lys Ile Ile Asn Asp Ala Phe Thr Thr Gly Tyr Cys His 130 135 140 145 CCA AAC AAT GAT TTT TAT AGT TTT CCT AAA ATC TCC GTT AAC CCA CAC 1713 Pro Asn Asn Asp Phe Tyr Ser Phe Pro Lys Ile Ser Val Asn Pro His 150 155 160 GCG TTC ACT GAA GGC GGT CCT GCG CAA TTT GTG AAT GCG ACG AGC AAA 1761 Ala Phe Thr Glu Gly Gly Pro Ala Gln Phe Val Asn Ala Thr Ser Lys 165 170 175 GAA GTG GTT GAA TGG GCG GCT AAG TTA GGG CTT CCA CTC GTG TTT AGA 1809 Glu Val Val Glu Trp Ala Ala Lys Leu Gly Leu Pro Leu Val Phe Arg 180 185 190 TGG GAC GAC TCA AAC GCT CAA AGA AAA GAA TAC GCC GGT TTG TAC CAC 1857 Trp Asp Asp Ser Asn Ala Gln Arg Lys Glu Tyr Ala Gly Leu Tyr His 195 200 205 GAA GTT GCT CAG GCA CAT GGT GTC GAT GTT AGT CAG GTT CGA CAC AAG 1905 Glu Val Ala Gln Ala His Gly Val Asp Val Ser Gln Val Arg His Lys 210 215 220 225 CTG ACG CTG CTG GTC AAC CAA AAT GTA GAT GGT GAA GCA GCA AGG GCA 1953 Leu Thr Leu Leu Val Asn Gln Asn Val Asp Gly Glu Ala Ala Arg Ala 230 235 240 GAA GCT CGC GTG TAT TTG GAA GAG TTT GTC CGT GAA TCT TAC TCA AAT 2001 Glu Ala Arg Val Tyr Leu Glu Glu Phe Val Arg Glu Ser Tyr Ser Asn 245 250 255 ACC GAC TTT GAG CAA AAA ATG GGA GAG CTG TTG TCA GAA AAT GCC ATC 2049 Thr Asp Phe Glu Gln Lys Met Gly Glu Leu Leu Ser Glu Asn Ala Ile 260 265 270 GGT ACT TAT GAA GAA AGT ACT CAG GCA GCG CGA GTT GCG ATT GAG TGT 2097 Gly Thr Tyr Glu Glu Ser Thr Gln Ala Ala Arg Val Ala Ile Glu Cys 275 280 285 TGT GGT GCC GCG GAC CTA TTG ATG TCT TTT GAG TCG ATG GAA GAT AAA 2145 Cys Gly Ala Ala Asp Leu Leu Met Ser Phe Glu Ser Met Glu Asp Lys 290 295 300 305 GCG CAG CAA AGA GCG GTT ATC GAT GTG GTA AAC GCC AAC ATC GTC AAA 2193 Ala Gln Gln Arg Ala Val Ile Asp Val Val Asn Ala Asn Ile Val Lys 310 315 320 TAC CAC TCG TAACGTTTAA CTGATGCTGA AGGGGCAGCG ATGCCCCTTA 2242 Tyr His Ser TATCACCATT CTTTTCGCCG ATAGCGCTAA CTAATAGAGG CATTTATATG GACGTACTTT 2302 CAGCGGTTAA GCAGGAAAAC ATCGCAGCGA GCACAGAAAT CGATGACTTG ATTTTCATGG 2362 GAACTCCTCA GCAATGGTCA TTGCAGGAAC AAAAACAGCT G 2403

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２の結果を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:42）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 リプレッサーとしてのｌｅｘＡタンパク
   質が結合するオペレーターであって、配列表の配列番号
   １の塩基配列で表わされるオペレーターからなることを
   特徴とする変異原性物質感知用遺伝子。
2. 【請求項２】 請求項１記載の変異原性物質感知用遺伝
   子とｒｅｃＡ遺伝子のプロモーターとからなる変異原性
   物質感知用遺伝子であって、配列表の配列番号２の塩基
   配列で表わされることを特徴とする変異原性物質感知用
   遺伝子。
3. 【請求項３】 請求項１記載の変異原性物質感知用遺伝
   子とｒｅｃＡ遺伝子のプロモーターとを含む変異原性物
   質感知用遺伝子であって、配列表の配列番号３の塩基配
   列で表わされることを特徴とする変異原性物質感知用遺
   伝子。
4. 【請求項４】 請求項２または３記載の変異原性物質感
   知用遺伝子と、 ルシフェラーゼをコードするｌｕｘＡＢ遺伝子とを有
   し、前記変異原性物質感知用遺伝子の下流に前記ｌｕｘ
   ＡＢ遺伝子が結合していることを特徴とする融合遺伝
   子。
5. 【請求項５】 請求項２または３記載の変異原性物質感
   知用遺伝子と、 ルシフェラーゼをコードするｌｕｘＡＢ遺伝子とを有
   し、前記変異原性物質感知用遺伝子の下流に前記ｌｕｘ
   ＡＢ遺伝子が結合している融合遺伝子を有することを特
   徴とする組換プラスミド。
6. 【請求項６】 請求項３記載の変異原性物質感知用遺伝
   子と、 ルシフェラーゼをコードするｌｕｘＡＢ遺伝子とを有
   し、前記変異原性物質感知用遺伝子の下流に前記ｌｕｘ
   ＡＢ遺伝子が結合している融合遺伝子を有する組換プラ
   スミドであって、 下記制限酵素地図（１）で表わされることを特徴とする
   組換プラスミドｐＲＡＬ２０１。 【化１】 （地図中、Ｐ／Ｏ−３４は配列表の配列番号３の塩基配
   列で表わされる変異原性物質感知用遺伝子、ｌｕｘＡＢ
   はｌｕｘＡＢ遺伝子、Ａｍｐはアンピシリン耐性遺伝
   子、ｒｒｎＢＴ１はｒｒｎＢＴ１ターミネーター、ｐＢ
   Ｒ３２２はプラスミドｐＢＲ３２２由来の塩基配列を示
   す。）
7. 【請求項７】 請求項５または６記載の組換プラスミド
   が導入されたことを特徴とする形質転換体。
8. 【請求項８】 請求項７記載の形質転換体を、検体を含
   む培地を用いて培養した後、ルシフェラーゼの基質とな
   る発光素を添加して発光させることを特徴とする変異原
   性試験法。