JPH08333392A - 生理活性ポリペプチド類 - Google Patents

生理活性ポリペプチド類

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JPH08333392A
JPH08333392A JP7160184A JP16018495A JPH08333392A JP H08333392 A JPH08333392 A JP H08333392A JP 7160184 A JP7160184 A JP 7160184A JP 16018495 A JP16018495 A JP 16018495A JP H08333392 A JPH08333392 A JP H08333392A
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group
amino acid
sequence
helix
gly
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JP7160184A
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Sumiko Denda
澄美子 伝田
Munehiro Iketani
宗大 池谷
Masami Onuma
真美 大沼
Kaori Wakita
かおり 脇田
Masahiro Tajima
正裕 田島
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Shiseido Co Ltd
Original Assignee
Shiseido Co Ltd
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Publication date
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  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 一定のアミノ酸配列が欠失したことに特徴を
有する修飾マキサディラン。マキサディランは吸血性昆
虫であるスナバエ(Lutzomyia longipalpis)の唾液腺に
見い出される。 【効果】 天然のマキサディランに比べて、活性の持続
時間が短縮し、特定の血管の拡張活性が優れている。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はプロテインエンジニアリ
ングに関し、より具体的には血管拡張性および高血管透
過性のポリペプチド、例えば、マキサディランに関連す
る生理活性ポリペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】マキサディラン（Ｍaxadilan）は、吸血
性昆虫であるスナバエ（Ｌutzomyia longipalpis）の唾
液腺に存在することが知られている。マキサディランは
動物の表皮に適用されたとき、かゆみや疼痛を伴うこと
なく紅斑をもたらし、有力な血管拡張薬の候補とみなさ
れている。このような生物学的な作用は、カルシトニン
遺伝子関連ペプチド（以下「ＣＧＲＰ」と略記する）の
作用と非常に類似していることが知られている。
【０００３】スナバエの唾液からのマキサディランの精
製およびそのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配
列、ならびに前記ヌクレオチド配列からなる遺伝子のク
ローニングおよび組換えマキサディランの発現は、例え
ば、国際出願公開第９１／００２９３号パンフレットや
Ｅ．Ａ．Ｌernerら、Ｊ．Ｂio．Ｃhem．２６７、１０６
２-１０６６ページ１９９２に公表されている。Ｌerner
らは、前記組換えマキサディランとグルタチオンＳ−ト
ランスフエラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質をコー
ドするＤＮＡをクローニングし、そして発現させて得ら
れる融合タンパク質をファクターＸaで開裂させ、マキ
サディランのＮ−末端システィン（天然マキサディラン
の最初のシスティン、すなわち配列表の配列番号１のＣ
ys−１に対応）に３つのアミノ酸残基からなるペプチド
断片（ＧＩＬ−）が配合したものとして得ている。
【０００４】この組換えマキサディランは、強力かつ長
期持続性の紅斑形成活性（以下、単に「紅斑活性」とい
う）を示す点でＣＧＲＰと共通するが、１分子当りＣＧ
ＲＰのほぼ５００倍の紅斑活性を示す点で注目されてい
る。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】以上のように、血管拡
張薬等の有力な候補としてマキサディラン自体、またそ
の組換えポリペプチドも提案されているが、さらに高活
性を示すかあるいは特有の生理活性を示すペプチド類を
提供する必要性は、依然として存在する。そこで、本発
明の目的は、新規生理活性ポリペプチド類を提供するこ
とにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、マキサデ
ィランおよびＣＧＲＰの血管拡張（紅斑形成）活性と分
子構造の相関性について研究してきたところ、両ペプチ
ドの活性はそれらの類似する特定の分子構造に由来する
ことを見い出した。例えば、マキサディランとＣＧＲＰ
はＮ末端（１-１０）における一次構造に類似性が見ら
れ、Ｃhon ＆ Ｆasman法によって推定される二次構造
（Ｎ−末端ループ構造、α-ヘリックス構造、β-シート
構造、α-ヘリックス構造）にも類似性がみられる（こ
れらの構造を模式図に示す図２を参照のこと）。特に、
Ｃ末端のペプチド部分がα-ヘリックスを形成でき、し
かも二次構造上、正荷電しうるアミノ酸残基が一方向に
偏在することがマキサディランの高い紅斑活性に寄与す
るものと推測される（図１参照）。さらに驚くべきこと
には、ＣＧＲＰの活性ドメインに相当するマキサディラ
ンのＮ−末端ループ構造を形成するアミノ酸配列部分の
存在の有無が前記活性に有意な影響を及ぼさないことを
見い出した。
【０００７】従って、本発明によれば、既存のマキサデ
ィランおよびその類似化合物と区別されるポリペプチド
誘導体であって、その鎖中に配列番号１に示されるアミ
ノ酸配列中の配列Ｉle（１１）〜Ｓer（２１）（以下、
Ｈelix（１）ともいう）と配列Ｖal（４７）〜Ａla（６
１）（以下、Ｈelix（２）ともいう）とを含んでなるポ
リペプチド誘導体が提供される。
【０００８】より具体的には、式（Ｉ） Ｒ1−Ｈelix（１）−Ｒ2−Ｈelix（２）−Ｒ3 （Ｉ） 式中、Ｒ1はＨelix（１）のＮ末端アミノ酸残基のアミ
ノ基を形成する水素原子もしくはそのアミノ保護基、配
列番号１に示される配列Ｇln（６）〜Ａla（１０）−で
示される基またはその配列中のアミノ酸残基１個以上が
他のアミノ酸残基により置換された基もしくはこれらの
基のＮ末端が修飾された基、ならびに配列Ｃys（１）〜
Ａla（１０）−で示される基もしくはその配列のアミノ
酸残基１個以上が他のアミノ酸残基により置換された基
またはこれらの基のＮ末端アミノ酸のアミノ基が修飾さ
れた基からなる群より選ばれる基を表し、Ｒ2は、Ｈeli
x（１）のＳer（２１）のカルボキシル基とＨelix
（２）のＶal（４７）のイミノ基とを介してＨelix
（１）とＨelix（２）を連結する基を表し、Ｒ3は、Ｈe
lix（２）のＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基を形
成するヒドロキシル基、アミノ基ならびに前記カルボキ
シル基の保護基もしくは該カルボキシル基とＮ−末端ア
ミノ酸で結合する未修飾もしくは修飾ペプチド残基から
なる群より選ばれる基を表すが、但し、Ｒ1が前記配列
Ｃys（１）〜Ａla（１０）−で示される基またはこの基
のＮ末端アミノ酸のアミノ基が修飾された基を表す場合
には、Ｒ2の連結基は配列番号１に示される配列Ａsn
（２２）〜Ｓer（４６）で示される基以外の基を表す、
のポリペプチド誘導体が提供される。
【０００９】
【発明の具体的な記述】本発明を説明する上で、本明細
書および添付図面に記載するα−アミノ酸の表示は、当
該技術分野で慣用されている下記の三文字記号および一
文字記号に基づいている。
【００１０】慣用名 三文字記号 一文字記号 アラニン Ａla Ａ アルギニン Ａrg Ｒ アスパラギン Ａsn Ｎ アスパラギン酸 Ａsp Ｄ システイン Ｃys Ｃ グルタミン Ｇln Ｑ グルタミン酸 Ｇlu Ｅ グリシン Ｇly Ｇ ヒスチジン Ｈis Ｈ イソロシイン Ｉle Ｉ ロイシン Ｌeu Ｌ リジン Ｌys Ｋ メチオニン Ｍet Ｍ フエニルアラニン Ｐhe Ｆ プロリン Ｐro Ｐ セリン Ｓer Ｓ スレオニン Ｔhr Ｔ トリプトファン Ｔrp Ｗ チロシン Ｔyr Ｙバリン Ｖal Ｖ ヌクレオチドは、各塩基の化学名によってそれぞれのヌ
クレオチドを特定する下記の標準的な略号が本明細書お
よび添付図面で使用されている。
【００１１】アデニン Ａ チミン Ｔ グアニン Ｇ シトシン Ｃ ウラシル Ｕ また、α−アミノ酸の三文字表示に続くカッコ内の数字
は、配列番号１で示されるアミノ酸配列内の各アミノ酸
残基の位置番号を表す。
【００１２】本発明により提供されるポリペプチド類
は、前述したようにその分子中に、マサキディランのペ
プチド配列をα−ヘリックスの車輪モデルで表した場合
に、それぞれ図１に示されるごとく、正電荷しうるアミ
ノ酸残基を一方向に偏在するように表わされる部分を含
むことが重要である。そのため、本発明のポリペプチド
類は、天然マキサディランの基本構造を構成する配列番
号１に示されるアミノ酸配列中の配列Ｉle（１１）〜Ｓ
er（２１）の部分（配列番号２参照）と配列Ｖal（４
７）〜Ａla（６１）の部分（配列番号３参照）を含むこ
とが必須である。
【００１３】従って、前者の配列をＨelix（１）とし、
後者の配列をＨelix（２）として表示すると、本発明の
ポリペプチド類は、一般式 Ｒ1−Ｈelix（１）−Ｒ2−Ｈelix（２）−Ｒ3 で表すことができ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3部分は、Ｈelix
（１）およびＨelix（２）の構造に、悪影響を与えない
限り、いかなる基からなるものであってもよい。しか
し、具体的なものとしては、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は上述に定
義されるものが好ましい。以下、これらの定義について
さらに詳細に説明する。
【００１４】Ｒ1がＨelix（１）のＮ末端アミノ酸残基
（Ｉle）のアミノ基を形成する水素原子とは、式（Ｉ）
のＨelix（１）のＮ末端アミノ酸残基には追加のアミノ
酸残基またはペプチド残基が結合していない状態を意味
する。また、Ｒ1がアミノ保護基を表す場合には、ペプ
チド化学の技術分野で周知のアミノ保護基が前記Ｉleの
アミノ基に結合している状態を意味する。これらの保護
基には各種アシル基やアルキル基が代表的なものとして
挙げられる。
【００１５】Ｒ1が配列番号１に示されるアミノ酸配列
中の配列Ｇln（６）〜Ａla（１０）で示される基（配列
番号４参照）を表わす場合には、本発明のポリペプチド
が、前記配列中のＣys（１）〜Ｃys（５）のいわゆるマ
キサディランの活性ドメイン（配列場合５参照）と推定
されるＮ末端ループ構造を欠くことを意味する。このよ
うなマキサディランの変異体が一定の生理活性を示すこ
とはまったく予期できないだけでなく、逆に、Ｈelix
（１）およびＨelix（２）の部分の少なくとも１つが、
マキサディラン様の生理活性（例えば、紅斑形成活性）
を示すのに、極めて重要な意義を有することも示唆す
る。従って、前述のように、該配列（Ｇln（６）〜Ａla
（１０）そのものを欠く場合だけでなく、該配列中のア
ミノ酸残基の１個以上がその配列を構成する対応のアミ
ノ酸残基以外のアミノ酸残基によって置換されたもので
あっても、関連の生理活性に実質的に悪影響を与えない
ものと推測されるので、これらもＲ1の定義に包含され
る。
【００１６】また、該基は、例えば本発明のポリペプチ
ド類を適当な融合タンパク質として産生し、産生した融
合タンパク質をプロセッシングして目的のポリペプチド
類を取得しようとする場合に、Ｎ末端アミノ酸残基に結
合した状態で残存する追加のペプチド残基を有するもの
であってもよい。追加のペプチド残基の具体的なものと
しては、使用する融合タンパク質の種類およびプロセッ
シング（切断）に用いるプロテアーゼの種類に応じて、
多種多様なものが包含されるので限定されないが、例え
ば、グルタチオＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を融
合タンパク質として用いた場合の、Ｇly−Ｓer−Ｉle−
Ｌeu−（配列番号６参照）、Ｇly−Ｉle−Ｌeu−、Ｇly
−Ｓer−およびＧly−Ｓer−Ｇly−を挙げることができ
る。さらにこれらのペプチドは、各アミノ酸残基の官能
基がアシル基、アルキル基、等で修飾されていてもよ
い。
【００１７】Ｒ1はまた、配列番号１に示されるアミノ
酸配列中の配列Ｃys（１）〜Ａla（１０）−で示される
基またはＣln（６）〜Ａla（１０）−の基について説明
した追加のペプチドもしくはその修飾されたペプチドで
あってもよい。この場合、Ｒ2の連結基が、配列場合１
に示されるアミノ酸配列中の配列Ａsn（２２）〜Ｓer
（４６）で示される基であるときには、それ自体既知の
マキサディランを包含することがある。従って、Ｒ1が
前記の配列Ｃys（１）〜Ａla（１０）−およびその関連
の基で示される場合には、Ｒ2は配列Ａsn（２２）〜Ｓe
r（４６）で示される基以外の基を表すポリペプチド類
のみが本発明に包含される。
【００１８】前記配列Ａsn（２２）〜Ｓer（４６）は、
図２に示されるように、いわゆるβ−シート構造、ラン
ダムコイル等をとりうる部分であり、この部分は本発明
のポリペプチド類が前述のような生理活性を示す上で必
ずしも必要な部分でない。
【００１９】従って、Ｒ2で定義される連結基には、Ｈe
lix（１）およびＨelix（２）を、それぞれのＳer（２
１）のカルボキシル基とＶal（４７）のイミノ基を介し
て連結でき、Ｈelix（１）およびＨelix（２）がとりう
る三次構造に悪影響を及ぼさない基はすべて包含され
る。しかし、マキサディラン様の活性を奏するために
は、Ｒ2が前記配列Ａsn（２２）〜Ｓer（４６）で示さ
れる基、または該基のアミノ酸残基が該配列を構成する
対応のアミノ酸残基以外のアミノ酸残基により置換され
た基もしくは該配列中のアミノ酸残基の１個〜１９個が
欠失した基を好ましいものとして挙げることができる。
【００２０】Ｒ3がＨelix（２）のＣ末端アミノ酸残基
（Ａla）のカルボキシル基を形成するヒドロキシル基を
表す場合には、Ｈelix（２）のＣ末端アミノ酸残基には
他の置換基、ペプチド残基等が結合していない状態を意
味し、また該カルボキシル基と一緒にカルバモイル基を
形成するアミノ基を表す場合には、生理活性ペプチドに
よく見られるように、Ｃ末端アミノ酸残基のカルボキシ
ル基がアミド化されている状態を本発明のポリペプチド
がとることを意味する。また、Ｒ3は、Ｒ1について言及
したように、本発明のポリペプチドが融合タンパク質と
して産生され、産生された融合タンパク質をプロセッシ
ング処理して得る場合には、Ｒ1について説明したよう
な融合タンパク質に由来するペプチド残基であってもよ
い。これらのペプチド残基は、それらのＮ末端アミノ酸
残基のアミノ基を介して前記Ａlaのカルボキシル基とペ
プチド結合を形成して存在する。具体的なペプチド（ま
たはアミノ酸残基）としては、−Ｇlyもしくは−Ｇly−
ＬysまたはこれらのＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル
基のアミド、エステル化基を挙げることができる。Ｒ1
が、配列番号１のアミノ酸配列の中、いわゆるＮ末端ル
ープ構造（Ｃys（１）〜Ｃys（５）を欠くポリペプチド
類、すなわち、Ｒ1がＧln（６）〜Ａla（１０）のＮ末
端にＣys（１）〜Ｃys（５）以外のペプチド残基が結合
した基を表すものの代表例としては次のポリペプチドを
挙げることができる。
【００２１】 ＧＳＧ−ＱＦＲＫＡＩＤＤＣＱＫＱＡＨＨＳＮＶＬＱＴＳＶＱＴＴＡＴＦＴ ６ 10 15 20 25 30 35 ＳＭＤＴＳＱＬＰＧＮＳＶＦＫＥＣＭＫＱＫＫＫＥＦＫＡＧＫ 40 45 50 55 60 （ここで、数値は、配列番号１のアミノ酸位置番号に対
応する。このポリペプチドは、配列番号７にアミノ酸の
三文字表示で示す。なお、以後、このポリペプチドはＮ
spと称する。）Ｒ2が配列番号１の配列Ａsn（２２）〜
Ｓer（４５）のアミノ酸残基が１部欠失した基を表わす
ものの代表例としては、Ｌeu（２４）〜Ｌeu（４２）が
欠失したもの（以下、Ｍ６５と称する）を挙げることが
できる。
【００２２】 ＧＳ−ＣＤＡＴＣＱＦＲＫＡＩＤＤＣＱＫＱＡＨＨＳＮＶ− １ ５ 10 15 20 23 ＰＧＮＳＶＦＫＥＣＭＫＱＫＫＫＥＦＫＡＧＫ 43 45 50 55 60 （ここで、数値は、Ｎspについて説明したのと同じ意味
を表す。このポリペプチドは配列番号８にアミノ酸を三
文字表示して示す。） Ｒ2が配列番号１の配列Ａsn（２２）〜Ｓer（４５）の
アミノ酸残基の１部が欠失し、かつその中のアミノ酸残
基が他のアミノ酸残基により置換されたものの代表例と
して、Ｌeu（２４）〜Ｔhr（３３）が欠失し、そしてＰ
he（３４）がＡrgで置換されたもの（以下、Ｍ９８と称
する）を挙げることができる。
【００２３】 ＧＳ−ＣＤＡＴＣＱＦＲＫＡＩＤＤＣＱＫＱＡＨＨＳＮＶ− １ ５ 10 15 20 23 ＲＴＳＭＤＴＳＱＬＰＧＮＳＶＦＫＥＣＭＫＱＫＫＫＥＦＫＡＧＫ 35 40 45 50 55 60 （ここで、数値は、Ｎspについて説明したのと同じ意味
を表す。このポリペプチドは配列番号９にアミノ酸を三
文字表示して示す。） 本発明のポリペプチド類は、配列表に示される各配列を
参照に、それ自体既知のペプチド合成法（例えば、新生
化学実験講座、“タンパク質ＶＩ合成および発現”、日
本生化学会編、東京化学同人発行、１９９２参照）、な
らびに目的とするポリペプチドをコードする遺伝子のク
ローニングベクターを用いる方法、さらには配列番号１
で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子の部位特異
的突然変異誘発法を用いる欠失変異体の調製方法に、従
って製造することができる。
【００２４】こうして提供される本発明のポリペプチド
類は、ウサギへの皮内注射によるイン・ビボ（in viv
o）試験により、ＣＧＲＰと同等の紅斑活性を示すと共
に、天然型マキサディランよりやや低い紅斑形成活性を
示すが、一般的に活性の持続時間が天然型に比べて短縮
される点、さらに注入された血管周囲の太い血管の拡張
活性に優れている点に特徴を有する。このことは、本発
明のポリペプチド類がＣＧＲＰや天然型マキサディラン
とは異なる特異な血管拡張薬として使用できる可能性の
あることを示唆する。
【００２５】
【実施例】以下、実施例によって本発明をさらに具体的
に説明する。
【００２６】例１：Ｍ６５の生産Ｍ６５発現ベクター（pＳＤ-Ｍ６５）の作製 １）pＧＥＸ-２Ｔ-ＩＬ-Ｍaxの構築 上述のＬernerら、Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．２６７、１０６
２-１０６６、１９９２、に記載の方法に従い、発現ベ
クターpＧＥＸ-２Ｔ（Ｐharmacia）にマキサディランの
cＤＮＡ配列［配列番号１の配列Ｃys-１〜Ａla-６１を
コードする遺伝子、「ＭＡＸ（６０Ｋ、６１Ａ）」と略
記する］を挿入し、pＧＥＸ-２Ｔ-ＩＬ-Ｍax-ＧＫを作
製した。この発現ベクターを、図３に略図的に示す。以
下の各工程は図４〜７を参照されたい。
【００２７】２）Ｍ１３-Ｍ４３Ｂの作製 pＧＥＸ-２Ｔ-ＩＬ-Ｍax-ＧＫを鋳型としてポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により、部位特異的変異の導入
を行った。
【００２８】このＰＣＲ法では、５′プライマーとし
て、次式 ５′-ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＧＴＧＡＴＧＣＡＡＣＡＴＧＣＣＡＡＴＴＴＣＧＡ Ａ ＢamＨl ＡＧＧＣＣＡＴＣＧＡＴＧ-３′ Ｃlal で示されるＧＳ-ＡsＣl（４５mer）（配列番号１０）を
用い、そして３′プライマーとして、次式 ５′-ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＣＴＴＴＡＡＡＴＴＣＣ-３′ ＥcoＲl で示されるＫＡＧＫ（２８mer）（配列番号１１）を用
い、Ａstec ＰＣ-７００プラグラム式恒温槽中で９４
℃１分の熱変性、５５℃１分のプライマーのアニーリン
グ、次いで７２℃２分のＤＮＡ合成を３０サイクル行っ
た。なお、反応溶液の組成は、０.１pmolの鋳型ＤＮ
Ａ、２００μＭのｄＮＴＰ、５０pmolの５′および３′
プライマー、２.５ＵのＴaqポリメラーゼ（宝酒造）、
Ｔaqポリメラーゼ用バッファー（宝酒造）（合計１００
μｌ）であった。
【００２９】こうして得られたＰＣＲ反応産物を制限酵
素ＢamＨl、ＥcoＲlで切断した後、アガロースゲル電気
泳動で分離し、ゲルから２００bp断片（ＰＣＲで増幅さ
れた部分）を精製した。その断片をサブクローニング用
ベクターＭ１３mp１０にライゲーション後、イー・コリ
ー（Ｅ．coli）ＪＭ１０５に導入し、トランスフォーム
されたクローンのＲＦ（二本鎖）ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ
を調製した。一本鎖ＤＮＡの塩基配列決定を行い、目的
のＤＮＡができていたクローンを選択した。塩基配列決
定はＭ１３dideoxy法（東洋紡 Ｓequenaseキット）で
行い、日立蛍光ＤＮＡシーケンサーを使用して解析し
た。以上により、アミノ酸配列を変えずに塩基配列を置
換し制限酵素Ｃlal切断部位を導入したＭ１３-Ｍ４３Ｂ
を得た。
【００３０】３）Ｍ１３-ＰＣＲ２２の作製 Ｍ１３-Ｍ４３ＢのＲＦ ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法
により、部位特異的変異の導入を行った。
【００３１】このＰＣＲ法では、５′プライマーとし
て、次式 ５′-ＣＣＡＴＣＧＡＴＧＡＣＴＧＣＣＡＧＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＡＴＣＡＴ Ａ Ｃlal ＧＣＡＡＴＧＴＴＣＴＧＣＡＧ-３′ Ｐstl で示されるＣ-Ｐ（４７mer）（配列番号１２）を用い、
３′プライマーとして、上記ＫＡＧＫ（２８mer）を用
い、上記条件下でＰＣＲを行った。
【００３２】ＰＣＲ産物をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理
によりＤＮＡ末端を平滑化した後、ＥcoＲlで切断し、
アガロースゲル電気泳動で１７０bp断片を精製した。こ
れをベクターＭ１３mp１０（マルチクローニングサイト
の中のＳmalとＥcoＲlで切断したもの）にライゲーショ
ン後、Ｅ．coli ＪＭ１０５に導入し、トランスフォー
ムされたクローンのＲＦ（二本鎖）ＤＮＡ、一本鎖ＤＮ
Ａを調製した。一本鎖ＤＮＡの塩基配列決定を行い、目
的のＤＮＡができていたクローンを選択した。こうし
て、マキサディランの推定二次構造の中でＮ末端側α-
ヘリックスとβ-シートの境目付近（Ｌeu（２４）、Ｇl
n（２５））に、アミノ酸配列を変えずに制限酵素Ｐst
１切断部位を導入したＭ１３-ＰＣＲ２２を得た。な
お、５′プライマーの長さの制限（５０bp以上の長いプ
ライマーＤＮＡの合成は困難）により、ＭaxのＮ末端か
らＣlaＩサイトまでの配列は除いてある。
【００３３】４）Ｍ１３-Ｍ４３Ｄの作製 上記で得たＭ１３-ＰＣＲ２２ではＭaxのＮ末端部分か
らＣlalサイトまでが欠けているのでＣlalサイトでつな
いでＭax全長を作製した。
【００３４】具体的には、Ｍ１３-ＰＣＲ２２のＲＦ
ＤＮＡをＣlalとＥcoＲlで切断し、アガロースゲル電気
泳動で１７０bp断片（ＣlalサイトからＣ末端まで、Ｐs
tlサイトを含む）を精製した。これをＭ１３-Ｍ４３Ｂ
（ＣlalとＥcoＲlで切断したもの。ＭaxのＮ末端からＣ
lalサイトまでを含むベクター）にライゲーション後、
Ｅ．coli ＪＭ１０５に導入し、トランスフォームされ
たクローンのＲＦ ＤＮＡを調製した。
【００３５】５）Ｍ１３-Ｍ６５の作製 Ｍ１３-Ｍ４３ＤからＭaxのβシート部分に相当する配
列（ＰstlサイトとＢstＸlサイトの間）を取り除いてフ
レームが合うようにつなぎ合わせた。
【００３６】具体的には、Ｍ１３-Ｍ４３ＤのＲＦ Ｄ
ＮＡをＰstlで不完全に（２箇所のサイトがあるが１箇
所だけを切断するように）切断し、さらにＢatＸlで切
断後、それらの切断端（３′突出末端）をＴ４ ＤＮＡ
ポリメラーゼで消化して平滑化した。この平滑末端のセ
ルフライゲーションにより環状化したものを、Ｅ．coli
ＪＭ１０５に導入し、トランスフォームされたクローン
のＲＦ ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡを調製した。一本鎖
ＤＮＡの塩基配列決定を行い、目的のＤＮＡができてい
たクローンを選択した。
【００３７】６）pＳＤ-Ｍ６５の作製 目的の配列になっていたＭ１３-Ｍ６５のＤＮＡを発現
ベクターpＧＥＸ-２Ｔに組換えた。
【００３８】具体的には、Ｍ１３-Ｍ６５のＲＦ ＤＮ
ＡをＢamＨlとＥcoＲlで切断後、アガロースゲル電気泳
動で１４０bp断片（Ｍ６５遺伝子全長）を精製した。こ
れをベクターpＧＥＸ-２Ｔとライゲーション後、Ｅ．co
li ＨＢ１０１に導入した。こうしてＭ６５の発現ベク
ターpＳＤ-Ｍ６５で形質転換したＥ．coli ＨＢ１０１
を得た。
【００３９】なお、上記１）〜６）の各段階のＰＣＲ
法、遺伝子組換え法、形質転換法等はそれ自体既知の標
準的方法で実施でき、必要があれば、遺伝子工学ハンド
ブック、実験医学別冊、羊土社版、１９９１、を参照さ
れたい。
【００４０】Ｍ６５の生産 pＳＤ-Ｍ６５で形質転換ししたＥ．coli ＨＢ１０１を
ＬＢ培地中、３７℃にて３時間培養増殖させた。菌株の
対数増殖期に、１０9細胞当り１ｍＭのイソプロピル-β
-Ｄ-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培地へ添加
し、ＧＳＴ-Ｍ６５融合タンパク質の生産を誘導し、さ
らに５時間培養を続けた。
【００４１】遠心分離により集菌後、菌体をＰＢＳで洗
浄し、超音波処理して菌体を破砕した。処理物を遠心分
離（８０００rpm、１０分）し、上清を得た。上清に
は、細胞の総タンパク質当り約５％の目的タンパク質が
含まれていた。この上清をＧＳＴ-アフィニティーカラ
ム（グルタチオン-セファロース４Ｂ、Ｐharmacia）で
処理してＧＳＴ-Ｍ６５融合タンパク質を単離した。
【００４２】ＧＳＴ-Ｍ６５融合タンパク質の２ｍｇ／
ｍｌの５０ｍＭ ＴrisＣl（pＨ８.０）１５０ｍＭ Ｎa
Ｃl ２.５ｍＭ ＣaＣl２溶液に１ｍｌ当り１０μｇのト
ロンビン（持田製薬）を加え、３７℃で１時間インキュ
ベートした。処理液をＧＳＴ-アフィニティーカラム
（上述）で処理し、切り離されたＭ６５を溶出した。溶
出液を逆相ＨＰＬＣ［カプセルパックＣ８・ＳＧ３０
０、６×３５ｍｍ、資生堂、溶出液：０.１％トリフル
オロ酢酸−水／アセトニトリル（１-６０％）］で処理
した。吸光度２１４ｎｍでタンパク質画分を検出し、目
的の画分を合わせて凍結乾燥した。
【００４３】得られたポリペプチドＭ６５をＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ（１０〜２０％ゲル）で純度および分子量を確認
後、ペブチドシーケンサー（ＡＢＩ４７１Ａ）でＣys以
外の全アミノ酸配列を決定し、Ｍ６５が次のアミノ酸配
列（配列番号８参照）からなることを確認した。なお、
分子量はＭＡＬＤＩ（マススペクトル）により４２３７
を示した。
【００４４】 ＧＳ−ＣＤＡＴＣＱＦＲＫＡＩＤＤＣＱＫＱＡＨＨＳＮＶ− ＰＧＮＳＶＦＫＥＣＭＫＯＫＫＫＥＦＫＡＧＫＭ９８の生産 Ｍ９８は配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する。
【００４５】上記で得られたサブクローニングベクター
Ｍ１３−Ｍ４３Ｄおよび発現ベクターpＳＤ−Ｍ６５を
使用して、図８および図９に示すようにＭ９８の発現ベ
クターを構築することができる。このように構築した発
現ベクターをＥ．coli ＨＢ１０１に導入した形質転換
体を、上記Ｍ６５の生産に用いたのと同様の方法によつ
て培養し、菌体を処理し、目的ポリペプチドを単離する
ことによりＭ９８を得た。
【００４６】Ｎspの生産 Ｎspは配列番号７のアミノ酸配列を有する。
【００４７】１）Ｎsp断片の作製（図１０参照） 上記のように構築したpＳＤ-Ｍ４３Ｂベクター０.５ｍ
ｇを制限酵素Ｎsplで切断した後、その反応産物を宝酒
造ＤＮＡ Ｂlunting kitにより処理し、３′突出末端を
平滑化した。これをアガロースゲル電気泳動で分離し、
ゲルから〜２５０bp断片を精製した。
【００４８】２）Ｍ１３mp１１−Ｎspの作製 上記断片を宝酒造ＢamＨl linker ３′-d（pＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ）-５′ とライゲーションした後、制限酵素ＢamＨlとＥcoＲlで
切断した。これをアガロースゲル電気泳動で分離し、ゲ
ルから〜１８０bp断片を精製した。これをベクターＭ１
３mp１１（マルチクロニングサイト中のＢamＨlとＥco
Ｒlで切断したもの）にライゲーションの後、Ｅ．coll
ＪＭ１０５に導入し、トランスフォームされたクロー
ンのＤＮＡの塩基配列を確認した。塩基配列決定はＭ１
３dideoxy 法（東洋紡Ｓequensing kit）で行い、日立
蛍光ＤＮＡシーケンサーで解析した。
【００４９】３）pＧＥＸ-２t-Ｈ-Ｎspの作製 目的の配列になっていたＭ１３mp１１-ＮspのＤＮＡを
発現ベクターpＧＥＸ−２t−Ｈに組み換えた。
【００５０】pＧＥＸ-２t-Ｈ-Ｎspで形質転換されたＥ.
coli ＨＢ１０１をＬＢ培地中、３７℃にて３時間培養
した。菌体の対数増殖期に１ｍＭのイソプロピル-β-Ｄ
-ガラクシド（ＩＰＴＧ）を培地へ添加し、ＧＳＴ-Ｎsp
融合タンパク質の生産を誘導し、さらに５時間の培養を
続けた。
【００５１】遠心分離により集菌後、超音波処理し菌体
を破砕した。処理物を１２０００rpmで２０分遠心し、
得られた上清をＰharmaciaグルタチオン-セファロース
４Ｂへ添加した。カラム内でトロンビン処理し溶出する
ことにより切り離されたＮsp粗画分を得た。この溶出液
を逆相ＨＰＬＣ（資生堂カプセルパックＣ８.ＳＧ３０
０.６×３５ｍｍ）により精製した。
【００５２】得られたポリペプチドＮspをＳＤＳ-ＰＡ
ＧＥゲルで純度および分子量を確認後、ペプチドシーケ
ンサー（ＡＢＩ４７１Ａ）でＮ末端より２０アミノ酸ま
で確認した。また、分子量はＭＡＬＤＩ（マススペクト
ル）により確認した。
【００５３】生物学的活性のアッセイ Ｍ６５、Ｍ９８およびＮspの生物学的活性をＧＳＩＬ−
Ｍax［マキサディラン（配列番号１のアミノ酸配列）の
Ｎ末端にＧＳＩＬ−が結合したもの、同時係属出願：平
成５年１２月１２日付特願平５−３４４２７５号参照］
およびＣＧＲＰの生物学的活性と対比しながら示す。
【００５４】１）上記各ペプチド類について、Ｌerner
ら、Ｊ．Ｂio．Ｃhem．，Ｖol．２６７、１０６３ペー
ジに記載の方法に従い、ウサギ皮膚での紅斑形成活性を
評価した。
【００５５】剃毛した白ウサギの皮内に、生理食塩水を
用い各種濃度で溶解した試料の希釈液を５０μｌずつ注
射した。注射後、３０分および２時間目にウサギの皮膚
に形成した紅斑を観察した。
【００５６】２）上記各試料の希釈液を白ウサギの皮下
血管内へ注射し、各試料の出血性および周囲の太い血管
の拡張活性を観察した。
【００５７】結果を下記表にまとめて記載する。
【００５８】
【表１】
【００５９】
【発明の効果】本発明によれば、マキサディランおよび
ＣＧＲＰの生物学的活性と二次構造との関連性を示す知
見に基づき、特に、多様な血管拡張作用および抗血栓形
成作用を示す新規ポリペプチド（タンパク質）が提供さ
れる。
【００６０】
【表２】
【００６１】
【表３】
【００６２】
【表４】
【００６３】
【表５】
【００６４】
【表６】
【図面の簡単な説明】
【図１】マキサディランの推定ヘリックス部分を車輪モ
デルで示す図である。
【図２】マキサディランとＣＧＲＰの二次構造を模式的
に表した図である。
【図３】マキサディラン遺伝子の発現ベクターの略図で
ある。
【図４】ベクターＭ１３-Ｍ４３Ｂの構築のための工程
図である。
【図５】ベクターＭ１３ＰＣＲ２２の構築のための工程
図である。
【図６】ベクターＭ１３-Ｍ４３Ｄの構築のための工程
図である。
【図７】発現ベクターpＳＤ-Ｍ６５の構築のための工程
図である。
【図８】ベクターＭ１３-Ｍ９８の構築のための工程図
である。
【図９】pＳＤ-Ｍ９８の構築のための工程図である。
【図１０】Ｎsp断片の作製のための工程図である。
フロントページの続き (72)発明者 脇田 かおり 神奈川県横浜市金沢区福浦２−12−１ 株 式会社資生堂第２リサーチセンター内 (72)発明者 田島 正裕 神奈川県横浜市金沢区福浦２−12−１ 株 式会社資生堂第２リサーチセンター内

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式（Ｉ） Ｒ1−Ｈelix（１）−Ｒ2−Ｈelix（２）−Ｒ3 （Ｉ） 上式中、Ｈelix（１）は配列番号１に示されるアミノ酸
    配列中の配列Ｉle（１１）〜Ｓer（２１）の基を表し、 Ｈelix（２）は配列番号１に示されるアミノ酸配列中の
    配列Ｖal（４７）〜Ａla（６１）の基を表し、 Ｒ1はＨelix（１）のＮ末端アミノ酸残基（Ｉle）のア
    ミノ基を形成する水素原子もしくは該残基のアミノ保護
    基、配列番号１に示されるアミノ酸配列中の配列Ｇln
    （６）〜Ａla（１０）または該配列中のアミノ酸残基１
    個以上が他のアミノ酸残基により置換された基、ならび
    に配列番号１に示されるアミノ酸配列中の配列Ｃys
    （１）〜Ａla（１０）−で示される基もしくは該基中の
    アミノ酸残基１個以上が他のアミノ酸残基により置換さ
    れた基またはこれらの基のＮ末端アミノ酸のアミノ基に
    さらにＣ−末端アミノ酸のカルボキシル基を介して未修
    飾または修飾されたペプチド残基が結合した基からなる
    群より選ばれる基を表し、 Ｒ2はＨelix（１）のＳer（２１）のカルボキシル基と
    Ｈelix（２）のＶal（４７）のイミノ基とを介してＨel
    ix（１）とＨelix（２）を連結する基を表し、そしてＲ
    3はＨelix（２）のＣ末端アミノ酸残基（Ａla）のカル
    ボキシル基を形成するヒドロキシル基、該カルボキシル
    基と一緒にカルバモイル基を形成するアミノ基、ならび
    に該カルボキシル基の保護基、該カルボキシル基とＮ末
    端アミノ酸を介して結合する未修飾または修飾されたペ
    プチド残基、からなる群より選ばれる基を表すが、但
    し、 Ｒ1が該配列Ｃys（１）〜Ａla（１０）−で示される基
    または該基のＮ末端アミノ酸のアミノ基にさらにＣ末端
    アミノ酸のカルボキシル基を介して未修飾または修飾さ
    れたペプチド残基が結合した基を表す場合には、Ｒ2の
    連結基は配列番号１に示されるアミノ酸配列中の配列Ａ
    sn（２２）〜Ｓer（４６）で示される基以外の基を表
    す、のポリペプチド類。
  2. 【請求項２】 Ｒ2の連結基が配列番号１のアミノ酸配
    列中の配列Ａsn（２２）〜Ｓer（４６）で示される基、
    または該基のアミノ酸残基の１個以上が他のアミノ酸残
    基により置換された基もしくはアミノ酸残基の１個〜１
    ９個が欠失した基である請求項１記載のポリペプチド
    類。
  3. 【請求項３】 Ｒ1が配列番号１に示されるアミノ酸配
    列中の配列Ｃys（１）〜Ａla（１０）−で示される基ま
    たは該基のＮ末端アミノ酸のアミノ基へさらにＧly−Ｓ
    er−Ｉle−Ｌeu−、Ｇly−Ｉle−Ｌeu−、Ｇly−Ｓer−
    およびＧly−Ｓer−Ｇly−からなる群から選ばれるペプ
    チド残基が結合した基であり、かつＲ2がＡsn（２２）
    〜Ｓer（４６）で示される基以外の基である請求項２記
    載のポリペプチド類。
  4. 【請求項４】 Ｒ1が配列番号１に示されるアミノ酸配
    列中の配列Ｇln（６）〜Ａla（１０）−で示される基ま
    たは該基のアミノ酸残基の１個以上が他のアミノ酸残基
    により置換された基、あるいは該基のＮ末端アミノ酸の
    アミノ基へさらにＧly−Ｓer−Ｉle−Ｌeu−、Ｇly−Ｉ
    le−Ｌeu−、Ｇly−Ｓer−およびＧly−Ｓer−Ｇly−か
    らなる群より選ばれるペプチド残基が結合した基である
    請求項２記載のポリペプチド類。
  5. 【請求項５】 Ｒ1が前記配列Ｇln（６）〜Ａla（１
    ０）−で示される基または該基のＮ末端アミノ酸のアミ
    ノ基へさらにＧly−Ｓer−Ｉle−Ｌeu−、Ｇly−Ｉle−
    Ｌeu−、Ｇly−Ｓer−およびＧly−Ｓer−Ｇly−からな
    る群より選ばれるペプチド残基が結合した基であり、Ｒ
    2が前記配列Ａsn（２２）〜Ｓer（４６）で示される基
    である請求項４記載のポリペプチド。
  6. 【請求項６】 Ｒ3がＨelix（２）のＣ末端アミノ酸残
    基（Ａla）のカルボキシル基を形成するヒドロキシル
    基、該カルボキシル基と一緒にカルバモイル基を形成す
    るアミノ基、ならびに該カルボキシル基とＮ末端アミノ
    酸のアミノ基を介して結合する−Ｇly、−Ｇly−Ｌys
    およびこれらのカルバモイル化基からなる群より選ばれ
    る請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチド類。
  7. 【請求項７】 配列番号７、配列番号８または配列番号
    ９に示される請求項１記載のポリペプチド類。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020522476A (ja) * 2017-06-02 2020-07-30 アムジエン・インコーポレーテツド ペプチドｐａｃ１アンタゴニスト

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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