JPH08337596A - フォン・ウィレブラント因子の５２／４８ｋＤａポリペプチドフラグメントから誘導可能なペプチド - Google Patents

フォン・ウィレブラント因子の５２／４８ｋＤａポリペプチドフラグメントから誘導可能なペプチド

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JPH08337596A
JPH08337596A JP8024664A JP2466496A JPH08337596A JP H08337596 A JPH08337596 A JP H08337596A JP 8024664 A JP8024664 A JP 8024664A JP 2466496 A JP2466496 A JP 2466496A JP H08337596 A JPH08337596 A JP H08337596A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 フォン・ウィレブラント因子の５２／４８ｋ
Ｄａポリペプチドフラグメントから誘導でき、しかも、
そのアミノ酸配列が特定されており、血小板、ヘパリン
またはコラーゲンへのフォン・ウィレブラント因子の結
合を抑制するペプチドを提供する。 【解決手段】 フォン・ウィレブラント因子の５２／４
８ｋＤａポリペプチドフラグメントから誘導可能な特定
のアミノ酸配列グループから選ばれた少なくとも５種の
隣接したアミノ酸配列を有する一次ペプチド、又は前記
一次ペプチドの２以上の組み合わせからなるペプチドで
ある。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、血小板、ヘパリン
およびコラーゲンへのフォン・ウィレブラント因子（vW
F ）の結合を抑制するペプチドで、フォン・ウィレブラ
ント因子の５２／４８ｋＤａポリペプチドフラグメント
から誘導可能なものに関する。
【０００２】
【従来の技術】vWF は、脈管壁の損傷の部位における血
小板沈積の初期段階において中心的役割を演ずることが
知られている。血管の内皮細胞ライニングが破れると、
vWF を露出した副内皮は、そのあと副内皮への血小板の
接着を要求される。これはそこに存在するヘパリン様の
グリコサミノグリカンを含み得る複内皮の一つ以上の成
分に結合することによって行われる。vWF は、また血小
板を複内皮に接着させる血小板蛋白質(GP)Ｉb 受容体に
も結合する。vWF のGPＩb との結合は、今度はフィブリ
ノーゲンの血小板GPIIb ／IIIa受容体への結合とそれに
続く血小板凝集を誘発させる。脈管損傷または奇形の部
位における血小板の沈着は、冠状動脈閉塞および卒中な
どを含む多数の症状における血栓の形成において重要な
役割を演ずると考えられる。さらに、オートロガウスの
静脈セグメントまたは縫合の人造接合部の奉献台が使用
されたときに起こり得る動脈移植の接合部の閉塞にも多
分寄与する。血小板血栓形成は、また血管形成による脈
管閉塞をなくする試みを複雑にしがちな血栓形成にも寄
与し得る。それ故、損傷が自然に起こった場合でも、ま
た処置の結果誘発されたものである場合でも、脈管の損
傷の部位における血小板の沈着を防ぐ製品に対する要求
がある。本発明のペプチドは、これらの望ましくない血
小板沈着を防ぐ能力がある。フジマラらは、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー第261 巻第381
〜385 頁（1986年）「フォン・ウィレブラント因子：ア
ミノ酸残基449 で始まる還元されアルキル化された52／
48kDa フラグメントは血小板糖蛋白質Ｉb と相互作用す
る領域を含む」という論文で、フラグメントを完全に特
定するに必要なカルボキシ末端の配列を記載していな
い。また、この論文には、フラグメントの血小板への直
接結合の性質を示されていない。フジマラらは、ブラッ
ド第66巻第334a頁（1985年）「アミノ酸残基449 で始ま
るフォン・ウィレブラント因子の52／48kDa トリプシン
・フラグメントはリストセチンの不存在において血小板
GPＩb と結合する」という論文中で、フラグメントにつ
いても、血小板へのフラグメントの結合の原因となるア
ミノ酸配列についても充分には特定していない。サドラ
ーらは、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズUSA 第82巻第6394〜6398頁
（1985年）「ヒトのフォン・ウィレブラント因子をコー
ドする二つのcDNAのクローニングおよび形質化」という
論文において、vWF の部分的アミノ酸配列しか記載して
いない。ヒスチジンに富む糖蛋白質であるトロンビンII
I および、構造と機能においてvWF と無関係な蛋白質で
あるアポリ蛋白質Ｅのヘパリン結合に重要なものと考え
られる配列は、カルダンらのバイオケミカル・アンドバ
イオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ第13
4 巻第783 〜789 頁（1986年）「ヒト・アポリ蛋白質Ｅ
への高反応性ヘパリンの結合：二つのヘパリン結合領域
の同定」、コイデらのFebs．Lett．第194 巻第242 〜24
4 頁（1986年）「アンチトロンビンIII との配列の相同
によって示差されるヒスチジンに富む糖蛋白質のヘパリ
ン結合部位」、コイデらのFebs．Lett．第141 巻第222
〜224 頁（1982年）「ヘパリンとの高い親和性をもつア
ンチトロンビンと同族のヒト血漿のヒスチジンに富む糖
蛋白質のN ‐末端配列」、およびコイデらのプロシーデ
ィングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシズUSA 第81巻第289 〜293 頁（1984年）「アンチ
トロンビンIII トヤマ：ヘパリン結合能力に欠ける遺伝
的に異常なアンチトロンビンIII 中でのシステインによ
るアルギニン‐47の置換」の各論文によって公表されて
いる。ボッケンシュテットらは、Thombos. Haemostas.
第54巻第59頁（1985年）「ヘパリン・セファロースを用
いるリストセチン依存の血小板結合能力をもつフォン・
ウィレブラント因子フラングメントの単離」という論文
において、本発明のvWF フラグメントと異なる295kDavW
F フラングメントを記載している。この論文は、ヘパリ
ンおよび血小板への結合の原因となる295kDaフラングメ
ント中に存在するそれらのアミノ酸配列を同定していな
い。ボッケンシュテットらは、ジャーナル・オブ・クリ
ニカル・インベスティゲーション第77巻第743 〜749 頁
（1986年）「血小板糖蛋白質Ｉb およびコラーゲンへの
フォン・ウィレブラント因子の結合の構造的基礎．二硫
化物還元および重合性フォン・ウィレブラント因子の限
定された蛋白質分解の影響」という論文で、本発明のそ
れと異なるvWF フラグメントを記述するのに配列データ
を用いていない。この論文は、フラグメントが還元およ
びアルキル化のあと、一旦その三級構造を失うと活性を
失うことを示している。ペプチドの線状配列および還元
されアルキル化された52／48kDa フラグメントが活性を
もつ本発明とは対照的である。サカリアッセンらは、ブ
ラッド第67巻第1515〜1518頁（1986年）「ヒトのフォン
・ウィレブラント因子の蛋白質分解フラグメントによる
流動中の血液中のフィブリル状コラーゲンへの血小板の
接合の仲介」という論文で、本発明のそれと異なるvWF
フラグメントを記述するのに配列データを用いていな
い。ガーマらは、ブラッド第67巻第1356〜1366頁（1986
年）「モノクローナル抗体を使用する血小板GPＩb およ
びGPIIb ／IIIaならびにコラーゲンと相互作用する異な
ったフォン・ウィレブラント因子の地図作成」という論
文において、本発明のそれとは異なるvWF フラグメント
を記載している。この論文は、アミノ酸配列によってvW
F フラグメントを説明しても居らず、またそのアミノお
よびカルボキシ末端の両方によってそのようなフラグメ
ントを特徴づけてもいない。また、この論文では、フラ
グメントの血小板への直接結合の性質は示されていな
い。ハウディークらは、ブラッド第67巻第1498〜1503頁
（1986年）「リストセチンの存在下でのコラーゲンおよ
び血小板へのトリプシン・フラグメントの結合によるフ
ォン・ウィレブラント因子上の官能領域の同一性」とい
う論文において、本発明のそれと異なるvWFフラグメン
トを記述するのに配列データを用いていない。また、こ
の論文では、vWF フラグメントの精製はなく、vWF フラ
グメントがコラーゲンまたは血小板からもとのままのvW
F を遮断するという証拠もない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、フォン・ウ
ィレブラント因子の５２／４８ｋＤａポリペプチドフラ
グメントから誘導でき、しかも、そのアミノ酸配列が特
定されており、血小板、ヘパリンおよびコラーゲンへの
フォン・ウィレブラント因子の結合を抑制するペプチド
を提供することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、フォン・ウィ
レブラント因子の５２／４８ｋＤａポリペプチドフラグ
メントから誘導でき、しかも、血小板、ヘパリンまたは
コラーゲンへのフォン・ウィレブラント因子の結合を抑
制するペプチドであり、このペプチドは下記の配列グル
ープ：LCDLAPEAPPPTLPP ; PEAPPPTLPPDMAQV ; VKYAGSQV
ASTSEVL ;SDPEHCQICHCDVVN ; CDVVNLTCEACQEPG ; CQEPG
GLVVPPSDAP ;PSDAPVSPSSLYVED ; RIASQVKYAGSQVAS ; PS
ELRRIASQVKYAG ;DMMERLRISQKWVRV ; EFEVLKAFVVDMMER ;
KAFVVDMMERLRISQ ;HDGSHAYIGLKDRKR ; QIFSKIDRPEASRI
A ; LYVEDISEPPLHDFY ;VSPSSLYVEDISEPP ; AYIGLKDRKRP
SELR ; KDRKRPSELRRIASQ ;ASRIALLLMASQEPQ ; RMSRNFVR
YVQGLKK ; VTLNPSDPEHCQICH ;CQICHCDVVNLTCEA ; IPVGI
GPHANLKQIR ; GPHANLKQIRLIEKQ ;SVDELEQQRDEIVSY ; EI
VSYLCDLAPEAPP ; PTLPPDMAQVTVGPG ;TVGPGLLGVSTLGPK ;
LIEKQAPENKAFVLS ; APENKAFVLSSVDEL ;SQEPQRMSRNFURY
V ; KYTLFQIFSKIDRPE ; ISEPPLHDFYCSRLL ;SQEPQRMSRNF
VRYV 及び LKQIRLIEKQAPENKから選ばれた少なくとも５
種の隣接したアミノ酸配列を有する一次ペプチド、又は
前記一次ペプチドの２以上の組み合わせからなるペプチ
ドを含む。本発明はさらに、前記ペプチドが、血小板へ
のフォン・ウィレブラント因子の結合を抑制するもの
で、しかも、下記の配列グループ：LCDLAPEAPPPTLPP ;
PEAPPPTLPPDMAQV ; VKYAGSQVASTSEVL ;SDPEHCQICHCDVVN
; CDVVNLTCEACQEPG ; CQEPGGLVVPPSDAP ;PSDAPVSPSSLY
VED ; RIASQVKYAGSQVAS ; PSELRRIASQVKYAG ;DMMERLRIS
QKWVRV ; EFEVLKAFVVDMMER ; KAFVVDMMERLRISQ ;HDGSHA
YIGLKDRKR ; QIFSKIDRPEASRIA ; LYVEDISEPPLHDFY ;VSP
SSLYVEDISEPP ; AYIGLKDRKRPSELR ; KDRKRPSELRRIASQ ;
ASRIALLLMASQEPQ ; RMSRNFVRYVQGLKK ; VTLNPSDPEHCQIC
H ;CQICHCDVVNLTCEA ; IPVGIGPHANLKQIR ; GPHANLKQIRL
IEKQ ;SVDELEQQRDEIVSY ; EIVSYLCDLAPEAPP ; PTLPPDMA
QVTVGPG ;TVGPGLLGVSTLGPK ; LIEKQAPENKAFVLS 及び AP
ENKAFVLSSVDELから選ばれた少なくとも５種の隣接した
アミノ酸配列を有する一次ペプチド、又は前記一次ペプ
チドの２以上の組み合わせからなるペプチドを含むもの
でもある。特に好ましいのは、そのペプチドが、LCDLAP
EAPPPTLPP という配列を有することを特徴とする、血小
板へのフォン・ウィレブラント因子の結合を抑制するペ
プチドである。その他にまた好ましいのは、そのペプチ
ドが、PEAPPPTLPPDMAQV という配列を有することを特徴
とする、血小板へのフォン・ウィレブラント因子の結合
を抑制するペプチドである。その他にまた好ましいの
は、そのペプチドが、LYVEDISEPPLHDFY という配列を有
することを特徴とする、血小板へのフォン・ウィレブラ
ント因子の結合を抑制するペプチドである。その他にま
た好ましいのは、血小板へのフォン・ウィレブラント因
子の結合を抑制するペプチドのうちの少くとも二つのア
ミノ酸の配列サブセットのペプチドである。その他にま
た好ましいのは、血小板へのフォン・ウィレブラント因
子の結合を抑制するペプチドのアミノまたはカルボキシ
末端から伸びるどの結合にも一つ以上のＲおよび／また
はＫ残基をもつペプチドである。本発明はさらに、前記
ペプチドが、ヘパリンへのフォン・ウィレブラント因子
の結合を抑制するもので、しかも、下記の配列グルー
プ：KDRKRPSELRRIASQ ; LIEKQAPENKAFVLS ; SQEPQRMSRN
FURYV ;KYTLFQIFSKIDRPE ; DMMERLRISQKWVRV ; LYVEDIS
EPPLHDFY ;ISEPPLHDFYCSRLL ; SQEPQRMSRNFVRYV ; IPVG
IGPHANLKQIR ;GPHANLKQIRLIEKQ ; TVGPGLLGVSTLGPK 及
び LKQIRLIEKQAPENKから選ばれた少なくとも５種の隣接
したアミノ酸配列を有する一次ペプチド、又は前記一次
ペプチドの２以上の組み合わせからなるペプチドを含む
ものでもある。特に好ましいのは、そのペプチドが、KD
RKRPSELRRIASQ という配列を有することを特徴とする、
ヘパリンへのフォン・ウィレブラント因子の結合を抑制
するペプチドである。その他にまた好ましいのは、ヘパ
リンへのフォン・ウィレブラント因子の結合を抑制する
ペプチドのうち少くとも二つのアミノ酸の配列サブセッ
トのペプチドである。その他にまた好ましいのは、ヘパ
リンへのフォン・ウィレブラント因子の結合を抑制する
ペプチドのアミノまたはカルボキシ末端から伸びるどの
結合にも、一つ以上のＲおよび／またはＫ残基をもつペ
プチドである。説明のとおり、本発明は、血小板、ヘパ
リンおよびコラーゲンへのvWF の結合を抑制する52／48
kDa ポリペプチドフラグメントを包含する。この特殊な
フラグメントは、還元性条件下で、52／48kDa ダブレッ
ト（即ち、52／48kDa の分子量を有するダブレット）と
して、SDS-ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（SDS-PA
GE）中を移動する、vWF のトリプシン・フラグメントと
して単離された。アミノ末端の配列、VTLNPSDPEHCQはダ
ブレットの両方の構成員とも同一であることがわかって
いる。このアミノ末端配列はフジマラらによってジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー第261 巻第
381 〜385 頁（1986年）に発表された。この公表された
アミノ末端配列は、さらにダブレット構成員同志の間の
差異は、単に炭水化物の組成だけであって、約2050個の
アミノ酸残基のもとのままのvWF ポリペプチドの内部の
このペプチドの位置を、449 という残基で始まるものと
して確定したことの証拠であった。そのアミノおよびカ
ルボキシ末端の両方による52／48kDa フラグメントの特
徴づけは、組換えDNA 技法によるフラグメントの表現に
必須のヌクレオチド配列の同定を可能にする。そのよう
な方法の使用によって、フラグメントは、フラグメント
をつくるためのヌクレオチド配列が、当業者に公知の方
法によってその中へ挿入されるようなバクテリヤ、酵母
または他の細胞によって製造される。ペプチドフラグメ
ントのアミノおよびカルボキシ末端を知ることによって
のみこのフラグメントをコードづけするヌクレオチド配
列が単離できるので、フジマラらのジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー第261 巻第381 〜385 頁
（1986年）に述べた52／48kDa フラグメントのアミノ末
端配列だけの同定は、52／48kDa フラグメントを表現す
ることを当業者にとって不可能にする。52／48kDa フラ
グメントの組換えDNA 表現のためにアミノ末端配列とと
もに要求されるカルボキシ末端配列は、下記の方法で決
定された。52／48kDa フラグメントを製造したと同一の
トリプシン消化によって製造されたvWF の55kDa フラグ
メントはアミノ末端配列としてNSMVLDVAFVLEを有するこ
とがわかった。この55kDa フラグメントのアミノ末端配
列は、すでにそのアミノ末端配列が決定された52／48kD
a フラグメントへのカルボキシ末端であることがわかっ
た。この情報が与えられることによって、52／48kDa フ
ラグメントのカルボキシ末端は、55kDa フラグメントの
アミノ末端配列のすぐ前のところで終わることが決定さ
れ得る。55kDa フラグメントのアミノ末端配列について
の知識とサドラーらの発表した部分的アミノ酸配列の知
識に基づいて、52／48kDa フラグメントのカルボキシ末
端領域のアミノ酸配列が決定された。このカルボキシ末
端領域は、もとのvWF ポリペプチドの中の729 というア
ミノ酸残基よりさきに伸びないことが決定された。52／
48kDa フラグメントを特徴づけるために使用されるもと
のvWF ポリペプチドを含むアミノ酸の番号づけの基礎の
説明については、フジマラらのジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー第261 巻第381 〜385 頁（19
86年）の論文を参照のこと。このような情報によって、
ヌクレオチド系列は、52／48kDa フラグメントの表現の
ために適当なベクトル中に挿入できる。vWF フラグメン
トをクローン化するための組換えDNA 技法の説明につい
ては、ギンスバーグらのサイエンス第228 巻第1401〜14
06頁（1985年）およびサドラーらの論文を参照のこと。
トリプシン分解のための精製vWF は、ファルチャーおよ
びツインマーマンがプロシーディングス・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシズUSA 第79巻第16
78〜1652頁（1982年）に述べているように、セファロー
ズ４Ｂ（ファーマーシア社）に結合した抗‐vWF モノク
ローナル抗体を使用する免疫吸着クロマトグラフィによ
って市販の因子VIII濃縮物（アーマー ファーマシュー
ティカル、カンカキー、イリノイ州）から得た。抗体に
結合したvWF は、0.1M L- リシンHCl および0.02％NaN3
を含むpH6.8 の0.01M イミダゾール、0.15M NaCl緩衝液
に溶かした3M NaSCNによって溶出した。溶出されたvWF
は0.05M トリス、0.15M NaCl、pH7.35（TBS ）に対して
強力に透析し、次にアミコンPM-30 膜（アミコン・コー
ポレイション、デンバース、マサチュセッツ州）による
限外濾過によって濃縮した。室温で30分間10,000×g で
遠心分離したのち、調製品は、一方にTSK G4000 SW、他
方にG3000 SWを入れた、直列につないだ２本のバイオラ
ッドカラム（60×2.15cm）を使ったHPLCサイズ、排出ク
ロマトグラフィーにかけた。カラムは5 ％ジメチルスル
フォキンドを含むpH5.5 の0.2M酢酸ナトリウムで平衡化
し、4ml ／分の流速で流した。トリプシン消化は、2500
トリプシン単位（子牛、すい臓タイプＩ、15,000単位／
mg、シグマ社）／mgのvWF を使用して、37℃で2 時間0.
02％NaN3を含むpH7.0の0.2M酢酸ナトリウム緩衝液中で
行った。生成したフラグメントは、HPLCサイズ排出クロ
マトグラフィーで三つの主な溜分（Ａ、ＢおよびＣで示
す）に分離した。主として溜分Ｂに含まれる52／48kDa
ダブレット、ならびに他の溜分13kDa 、22kDa 、41kDa
（すべて溜分Ｂから）および55kDa （溜分Ｃから）の単
離はHPLCクロマトフォーカシング、塩勾配溶離、および
サイズ排出クロマトグラフィーによってすべて6Mの尿素
の存在で実施した。蛋白質の還元およびS-カルボキシメ
チル化は、蛋白質と等量（w ／w ）のジチオスレイトー
ルで１時間37℃で処理し、つぎに30分間室温（22〜25
℃）で暗所で2.7 倍過剰（w ／w ）のヨードアセドアミ
ドで処理して達成した。すべての試料は最後に、0.05M
トリス、0.15M NaClから成るpH7.35の緩衝液に対して強
力に透析し、限外濾過（アミコン・コーポレイション、
デンバース、マサチュセッツ州）によって濃縮し、貯蔵
の前に−70℃で再び透析した。vWF のトリプシンフラグ
メントは、この少し前に説明したように、還元性および
非還元性の条件下で、5 〜15％または10〜15％の線状勾
配ゲルを使用して、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS-PAG
E）の存在下におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動
によって分析した。ゲルは、クーマシー ブリリアント
ブルーＲ（バイオラッド・ラボラトリーズ）によって
着色した。それぞれの精製フラグメントのNH2 末端配列
分析は、気相シーケネーター（470A型、アプライド・バ
イオシステムズ社、フォスター シティー、カリフォル
ニア州）を使って行った。フェニルチオヒダントインア
ミノ酸誘導体の同定は、製造者の説明書にしたがって、
ゾルバックスPTH カラム（E.I.デュポン・ド・ヌモアー
社）を使用して、HPLCシステム（パーキン・エルマー
社、ノーウォーク、コネティカット州）中で逆相クロマ
トグラフィーによって達成した。52／48フラグメントの
カルボキシ末端領域から始まる長いペプチド15アミノ酸
残基は、ホートンらのプロシーディングス オブ ナシ
ョナルアカデミー オブサイエンシズ第82巻第5131〜51
35頁（1985年）「多数のペプチドの迅速固相合成のため
の一般的方法：個々のアミノ酸のレベルにおける抗原‐
抗体相互作用の特異性」という論文に述べられている方
法で合成した。ペプチドの固相合成のためのよく知られ
た方法において、所望のペプチドは、（架橋ポリスチレ
ンから遊動され、化学会社から入手できる）ベンズヒド
リルアミンまたはクロルメチル化樹脂のような不溶性支
持体から出発して組み立てられる。アルファ‐アミノ窒
素上および他の反応性部位上に保護基をもつ所望のポリ
ペプチドのカルボキシ末端にあるアミノ酸は、公知のペ
プチド結合技術を使用して溶液から樹脂に接合される。
アルファ‐アミノ基上の保護基は除去され（他の保護基
がある場合それはそのままで）、所望の配列の次のアミ
ノ酸（適切な保護基をもつ）が接合され、次々と進む。
所望のポリペプチドが完全に出来上がったときに、それ
は樹脂支持体から分離され、全ての保護基は除去され、
ポリペプチドが回収される。適当な保護基の例は、アル
ファ‐アミノ基のためのアルファ‐ターシャリー‐ブチ
ルオキシカルボニル；システインのチオール基のための
ベンジル、4-メトキシベンジルまたは4-メチルベンジ
ル；ヒスチジンおよびトリプトファンの環内窒素および
リシンのイプシロン‐アミノ基のためのアスパラギン酸
のベータ‐カルボン酸基、グルタミン酸のガンマ‐カル
ボン酸基およびセリン、スレオニンおよびチロシンの水
酸基；そのベンジルオキシカルボニルまたは2-クロルま
たは3,4-ジメトキシ‐誘導体; アスパラギンおよびグル
タミンのアミド窒素のためのp-ニトロフェニル；および
アルギニンのグアニジン基のためのニトロまたはトシル
である。この開示の目的のために、アミノ酸の認められ
た略記法を使用する。完全な表を下記に示す。 一字及び三字のアミノ酸略記 A Ala アラニン C Cys システイン D Asp アスパラギン酸 E Glu グルタミン酸 F Phe フェニルアラニン G Gly グリシン H His ヒスチジン I Ile イソロシイン K Lys リジン L Leu ロイシン M Met メチオニン N Asn アスパラギン P Pro プロリン Q Glu グルタミン R Arg アルギニン S Ser セリン T Thr スレオニン V Val バリン W Trp トリプトファン Y Tyr チロシン B Asx Asp またはAsn 、区別されない Z Glu Glu またはGlu 、区別されない X X 未決定または非定形的なアミノ酸 請求されたペプチドの長い15のアミノ残基のうち、5 個
および10個のアミノ酸の重複がある。例えば、請求され
たペプチドLCDLAPEAPPPTLPP とPEAPPPTLPPDMAQV は10個
のアミノ酸配列PEAPPPTLPPの重複を有する。別の例で
は、請求されたペプチドVKYAGSQVASTSEVL とPSELRRIASQ
VKYAG は、5 個のアミノ酸配列VKYAG の重複を有する。
この重複の意味は5 個のアミノ酸配列が請求されたペプ
チドの15個の長いアミノ酸残基中に見出される抑制作用
を与えるうるということである。それ故、請求されたペ
プチドのどれにも見出される二個のアミノ酸配列も、vW
F 結合のための抑制作用をもつだろうということは5 個
のアミノ酸配列の抑制作用から予知できる。血小板、フ
ィブリノーゲン結合および血小板凝固を抑制する少くと
も１つのＫおよび／またはＫ残基のペプチドへの添加が
これらのペプチドの抑制作用を増加させることが実験で
わかった。このような結合と凝固の抑制を促進するこの
能力から見て、ペプチドのアミノまたはカルボキシ末端
から伸びるＲおよび／またはＫ残基をもつペプチドは血
液中の血栓または凝血塊の形成をおそくし、または抑制
する（すなわち抗血栓作用）ことが望ましい場合はつい
でも有用性をもつものである。これらの種々の請求され
たペプチドは52／48kDa フラグメントから来るものであ
るから、GPIbおよびヘパリンのためには一つより多い結
合部位がありうる。それ故、これらの請求されたペプチ
ドの二個以上を結合させると強力な抑制剤となりうる。
本発明のペプチドの一種以上が、治療、診断またはその
他の用途のために医薬調合品に配合できる。静脈内投与
のためにそれらを調製するには、塩化ナトリウム（例え
ば0.35〜2.0M）、グリシンなどのような生理学的に共存
できる物質を含み、生理学的条件に共存できる緩衝され
たpHを有する水に溶かす。血栓形成の防止のために投与
する量は、患者の血栓形成のひどさに左右されるが、そ
れは個々の患者のために容易に決定できる。
【０００５】
【発明の実施の形態】下記の実施例は本発明の例示とし
て示される。本発明は、これらの実施例にのみ限定され
ない。実施例 １ 血小板へのvWF の結合の抑制 セファロースCL‐2Bクロマトグラフィーを使用して、二
価陽イオンを含まない血小板を調製し、125ul の培養容
積中、108 ／mlの濃度で使用した。125I‐vWFを、5ug
／mlの濃度で添加し、競争するリガンドLCDLAPEAPPPTLP
P を2.16ug／ulの濃度で加えた。次に、リストセチンを
0.75mg／mlの濃度で加えた。撹拌なしで室温で30分間培
養したあと、混合物の50ulずつの２つの分別量を、500u
l ザルシュテットマイクロヒュージ管（西ドイツ製）中
の20％蔗糖の300ul の２つの別々のクッション上にお
き、ベックマンマイクロヒュージＢ中で12000gで４分間
遠心分離して結合リガンドを、遊離のリガンドから分離
した。結合リガンドを含む管チップを切断し、ガンマ線
計数器で計数した。非特異的結合を標識したリガンドと
一緒に加えた標識なしのvWF の50倍過剰の存在下に定量
し、全体から非特異的結合を差し引くことによって特異
的結合を計算した。合成ペプチドLCDLAPEAPPPTLPP は、
血小板へのフォン・ウィレブラント因子の結合を完全に
抑制した。第１表に、本発明の範囲内の特異的ペプチド
およびそれらの血小板へのvWF の結合の抑制能力を表示
する。ペプチドの抑制能力は実施例１に述べた方法にし
たがって測定した。100 ％とは、どんな抑制性ペプチド
も存在しない場合に血小板に結合する放射性標識づけさ
れたvWF の量である。第１表中の100 ％より少ない数値
はそれらのペプチドの抑制能力を反映する。第１表 ペプチド 血小板へのvWF 結合の％ 52／48kDa フラグメント 0 PEAPPPTLPPDMAQV 3 VKYAGSQVASTSEVL 46 RIASQVKYAGSQVAS 44 PSELRRIASQVKYAG 17 DMMERLRISQKWVRV 26 QIFSKIDRPEASRIA 31 LYVEDISEPPLHDFY 1 VSPSSLYVEDISEPP 18 VTLNPSDPEHCQICH 19 CQICHCDVVNLTCEA 16.5 SDPEHCQICHCDVVN 45 CDVVNLTCEACQEPG 16 LTCEACQEPGGLVVP 98 CQEPGGLVVPPSDAP 16 GLVVPPSDAPVSPSS 129 PSDAPVSPSSLYVED 4 ISEPPLHDFYCSRLL 86 CSRLLDLVFLLDGSS 90 DLVFLLDGSSRLSEA 65 LDGSSRLSEAEFEVL 74 RLSEAEFEVLKAFVV 214 EFEVLKAFVVDMMEP 13 KAFVVDMMERLRISQ 28 LRISQKWVRVAVVEY 110 KWVRVAVVEYHDGSH 133 AVVEYHDGSHAYIGL 100 HDGSHAYIGLKDRKR 11 AYIGLKDRKRPSELR 38 KDRKRPSELRRIASQ 12 SQVASTSEVLKYTLF 60 TSEVLKYTLFQIFSK 328 KYTLFQIFSKIDRPE 142 IDRPEASRIALLLMA 110 ASRIALLLMASQEPQ 12 SQEPQRMSRNFVRYV 152 RMSRNFVRYVQGLKK 24 FVRYVQGLKKKKVIV 331 IPVGIGPHANLKQIR 9 GPHANLKQIRLIEKQ 9 LKQIRLIEKQAPENK 163 LIEKQAPENKAFVLS 54 APENKAFVLSSVDEL 60 AFVLSSVDELEQQRD 54 SVDELEQQRDEIVSY 43 EQQRDEIVSYLCDLA 79 EIVSYLCDLAPEAPP 20 PTLPPDMAQVTVGPG 31 DMAQVTVGPGLLGVS 64 TVGPGLLGVSTLGPK 7実施例 ２ ヘパリンへのvWF 結合の抑制 プラスチック製のエッペンドルフ管中、125 l の培養容
積で分析を実施した。ヘパリン‐セファロースCL‐6B
（ファーマシア社）、125I‐vWF およびを子牛血清アル
ブミン(BSA) （シグマ社）を、それぞれ5 ％（v ／v
）、1ug ／mlおよび0.1 ％（w ／v ）の最終濃度で管
に加えた。次に、競争するリガンド、KDRKRPSELRRIASQ
、0.05M トリス‐0.15M NaCl‐HCl 緩衝液、pH7.3 （T
BS ）を、2.16ug／mlの濃度で培養混合物に加えた。時
々撹拌しながら室温で30分間培養したあと、混合物の50
ulずつの２つの分別量を、500ul ザルシュテット：マイ
クロヒュージ管（西ドイツ製）中の20％蔗糖の300ul の
２つの別々のクッション上におき、ベックマン、マイク
ロヒュージＢ中で12000gで４分間遠心分離して結合リガ
ンドを自由リガンドから分離した。結合リガンドを含む
管チップを切断し、ガンマ線計数器で計数した。非特異
的結合は、標識されたリガンドおよびヘパリン‐セファ
ロースC1‐6Bと一緒に加えた10mg／mlのヘパリンナトリ
ウム塩（豚の腸の粘膜、グレードII、162USP単位／mg
（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）の存在下に定
量し、特異的結合は全体から非特異的結合を差し引いて
計算した。合成ペプチドKDRKRPSELRRIASQ は、ヘパリン
へのフォン・ウィレブラント因子の結合を75％抑制し
た。第２表に、本発明の範囲内の特異的ペプチドおよび
そのヘパリンのvWF の結合の抑制能力を表示する。ペプ
チドの抑制能力は実施例２に述べた方法にしたがって測
定した。100 ％とは、抑制的なペプチドも存在しない場
合のヘパリンへ結合する放射性標識づけしたvWF の量で
ある。第２表中の100 ％より少ない数値はこれらのペプ
チドの抑制能力を反映している。 第２表ペプチド ヘパリンへのvWF 結合の％ 52／48kDa フラグメント 0 LIEKQAPENKAFVLS 53.5 SQEPQRMSRNFURYV 56 KYTLFQIFSKIDRPE 54.5 DMMERLRISQKWVRV 54.5 VTLNPSDPEHCQICH 83 SDPEHCQICHCDVVN 93 CQICHCDVVNLTCEA 92 CDVVNLTCEACQEPG 96 LTCEACQEPGGLVVP 116 CQEPGGLVVPPSDAP 91 GLVVPPSDAPVSPSS 160 PSDAPVSPSSLYVED 106 VSPSSLYVEDISEPP 91 LYVEDISEPPLHDFY 46 ISEPPLHDFYCSRLL 52 CSRLLDLVFLLDGSS 122 DLVFLLDGSSRLSEA 116 LDGSSRLSEAEFEVL 95 RLSEAEFEVLKAFVV 125 EFEVLKAFVVDMMEP 88 KAFVVDMMERLRISQ 116 LRISQKWVRVAVVEY 54 KWVRVAVVEYHDGSH 162 AVVEYHDGSHAYIGL 99 HDGSHAYIGLKDRKR 67 AYIGLKDRKRPSELR 84 PSELRRIASQVKYAG 84 RIASQVKYAGSQVAS 119 VKYAGSQVASTSEVL 103 SQVASTSEVLKYTLF 93 TSEVLKYTLFQIFSK 157 QIFSKIDRPEASRIA 94 IDRPEASRIALLLMA 81 ASRIALLLMASQEPQ 73 SQEPQRMSRNFVRYV 36 FVRYVQGLKKKKVIV 188 IPVGIGPHANLKQIR 24 GPHANLKQIRLIEKQ 24 LKQIRLIEKQAPENK 5 APENKAFVLSSVDEL 190 AFVLSSVDELEQQRD 113 SVDELEQQRDEIVSY 99 EQQRDEIVSYLCDLA 93 EIVSYLCDLAPEAPP 103 PTLPPDMAQVTVGPG 94 DMAQVTVGPGLLGVS 106 TVGPGLLGVSTLGPK 30実施例 ３ コラーゲンへのvWF 結合の抑制 コラーゲンへのvWF 結合 これらの研究用のvWF は、フ
レーカーおよびスペックがバイオケミカル・アンド・バ
イオフィジカル、リサーチ、コミュニケーションズ第80
巻、第849 〜857 頁（1978年）に記載したヨードゲン
（ピアス、ケミカル社、ロックフォード、イリノイ州）
を使う方法で125Iで放射性標識づけした。これけらの研
究に使用した調製品の比活性は、2.46〜8.55×10-4Ci／
mg（または9.13〜31.7×106 Bg／mg）の間に変化した。
使用したコラーゲン調製品は市販品（ホルモン‐ヘミ
ー、ミュンヘン、ドイツ連邦共和国）であり、酸に不溶
のミクロフィブリル状の馬のコラーゲン、タイプＩから
成るものであった。非コラーゲン性の不純物を含まない
ことは、SDS-PAGE（5 ％の架橋をもつ5 ％または7.5 ％
アクリルアミド）で分析し、5 ％ 2- メルカプトエタノ
ールで還元して定量した。ゲルはクマシーブリリアント
ブルーＲで着色した。タイプＩコラーゲンの定義づけ
は、屈折比色分析およびアミノ酸組織（コラーゲンコー
ポレーション社、パロ・アルト、カリフォルニア州、の
ジョン・マックファーソン博士が快く実施して下さっ
た）にもとづいた。各々の結合性混合物は、12.5ulのコ
ラーゲン懸濁物（等張グルコース溶液中１mg／ml、pH2.
7 ）、5ul の0.4M燐酸塩緩衝液（モノおよびジナトリウ
ム、pH7 ）および132.5ul の適切にうすめた[125I]vWF
を含む液ならびに、必要な場合は他の試験試薬を含み、
すべて0.02M トリス、0.15.M NaCl 緩衝液、pH7.4 中に
とかしたものであった。混合物は、また0.48％の子牛血
清アルブミン（分画Ｖ、カルバイオケム社、ラ・ジョ
ラ、カリフォルニア州）も含んだ。培養は、特に断って
いない限り、普通、室温（22〜25℃）で20分間行った。
各実験混合物の50ulの分別量は、次にアルブミンを含む
前記トリス緩衝液中20％蔗糖溶液300ul 上に、２つずつ
成層した。自由リガンドからの結合リガンドの分離は12
000gで８分間遠心分離で行い、その結果、不溶性コラー
ゲン・ミクロフィブリルはペレット化し、可不溶性のvW
F は、蔗糖層の上面に残った。コラーゲン・ペレットを
含むミクロ遠心分離量のチップを切断し、付随する放射
能を多重チャンネル、ガンマ、シンチレーション分光計
（パッカード・インストルーメンツ、ダウナーズ・グロ
ーブ、イリノイ州）で定量した。非飽和性（非特異的）
結合は、実験混合物に標識づけなしのvWF の過剰量を加
えることによって実験的に定量した。さらに、結合等温
線がスキャッチャード型の分析で評価された場合は、非
飽和性結合は、マイクロコンピューター支援プログラム
リガンドを使った全体結合等温線から適合パラメーター
として生成された。52／48kDa フラグメントによる抑制 もとの［125I］vWF のコラーゲンへの結合に対するトリ
プシン・フラグメントの影響を評価した。実験混合物は
前章に述べたようにして調製した。ただし、２ug／mlの
濃度で［125I］vWF を加える直前に1.25、2.55および5u
M の濃度で、その抑制能力を試験した52／48kDa フラグ
メント試料を加える点だけを変えた。コラーゲンへのフ
ォン・ウィレブラント因子の結合の52／48kDa フラグメ
ントの抑制能力は、上記の各濃度で90％より高かった。
【０００６】
【発明の効果】フォン・ウィレブラント因子の５２／４
８ｋＤａポリペプチドフラグメントから誘導でき、しか
も、そのアミノ酸配列が前述の如く特定された本発明の
ペプチドは、血小板、ヘパリンおよびコラーゲンへのフ
ォン・ウィレブラント因子の結合を抑制するのに有用で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 藤村吉博 奈良県奈良市菅原東町133−１ (72)発明者 リチャード エイ、ホーテン アメリカ合衆国、カリフォルニア州 92075、ソラナ ビーチ、フォード アベ ニュー 558 (72)発明者 ザベリオ エム、ルージェリー アメリカ合衆国、カリフォルニア州 92037、ラ ジョラ、ボーネイアー スト リート 644

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 フォン・ウィレブラント因子の５２／４
    ８ｋＤａポリペプチドフラグメントから誘導でき、しか
    も、血小板、ヘパリンまたはコラーゲンへのフォン・ウ
    ィレブラント因子の結合を抑制するペプチドであって、
    下記の配列グループ：LCDLAPEAPPPTLPP ; PEAPPPTLPPDM
    AQV ; VKYAGSQVASTSEVL ;SDPEHCQICHCDVVN ; CDVVNLTCE
    ACQEPG ; CQEPGGLVVPPSDAP ;PSDAPVSPSSLYVED ; RIASQV
    KYAGSQVAS ; PSELRRIASQVKYAG ;DMMERLRISQKWVRV ; EFE
    VLKAFVVDMMER ; KAFVVDMMERLRISQ ;HDGSHAYIGLKDRKR ;
    QIFSKIDRPEASRIA ; LYVEDISEPPLHDFY ;VSPSSLYVEDISEPP
    ; AYIGLKDRKRPSELR ; KDRKRPSELRRIASQ ;ASRIALLLMASQ
    EPQ ; RMSRNFVRYVQGLKK ; VTLNPSDPEHCQICH ;CQICHCDVV
    NLTCEA ; IPVGIGPHANLKQIR ; GPHANLKQIRLIEKQ ;SVDELE
    QQRDEIVSY ; EIVSYLCDLAPEAPP ; PTLPPDMAQVTVGPG ;TVG
    PGLLGVSTLGPK ; LIEKQAPENKAFVLS ; APENKAFVLSSVDEL ;
    SQEPQRMSRNFURYV ; KYTLFQIFSKIDRPE ; ISEPPLHDFYCSRL
    L ;SQEPQRMSRNFVRYV 及び LKQIRLIEKQAPENKから選ばれ
    た少なくとも５種の隣接したアミノ酸配列を有する一次
    ペプチド、又は前記一次ペプチドの２以上の組み合わせ
    からなるペプチドを含むことを特徴とするペプチド。
  2. 【請求項２】 前記ペプチドが、血小板へのフォン・ウ
    ィレブラント因子の結合を抑制するもので、しかも、下
    記の配列グループ：LCDLAPEAPPPTLPP ; PEAPPPTLPPDMAQ
    V ; VKYAGSQVASTSEVL ;SDPEHCQICHCDVVN ; CDVVNLTCEAC
    QEPG ; CQEPGGLVVPPSDAP ;PSDAPVSPSSLYVED ; RIASQVKY
    AGSQVAS ; PSELRRIASQVKYAG ;DMMERLRISQKWVRV ; EFEVL
    KAFVVDMMER ; KAFVVDMMERLRISQ ;HDGSHAYIGLKDRKR ; QI
    FSKIDRPEASRIA ; LYVEDISEPPLHDFY ;VSPSSLYVEDISEPP ;
    AYIGLKDRKRPSELR ; KDRKRPSELRRIASQ ;ASRIALLLMASQEP
    Q ; RMSRNFVRYVQGLKK ; VTLNPSDPEHCQICH ;CQICHCDVVNL
    TCEA ; IPVGIGPHANLKQIR ; GPHANLKQIRLIEKQ ;SVDELEQQ
    RDEIVSY ; EIVSYLCDLAPEAPP ; PTLPPDMAQVTVGPG ;TVGPG
    LLGVSTLGPK ; LIEKQAPENKAFVLS 及び APENKAFVLSSVDEL
    から選ばれた少なくとも５種の隣接したアミノ酸配列を
    有する一次ペプチド、又は前記一次ペプチドの２以上の
    組み合わせからなるペプチドを含むことを特徴とする請
    求項１記載のペプチド。
  3. 【請求項３】 前記配列 LCDLAPEAPPPTLPP を含むこと
    を特徴とする請求項２記載のペプチド。
  4. 【請求項４】 前記配列 PEAPPPTLPPDMAQV を含むこと
    を特徴とする請求項２記載のペプチド。
  5. 【請求項５】 前記配列 LYVEDISEPPLHDFY を含むこと
    を特徴とする請求項２記載のペプチド。
  6. 【請求項６】 前記配列が繰り返されていることを特徴
    とする請求項２〜５のいずれか１項に記載のペプチド。
  7. 【請求項７】 アミノ及び／又はカルボキシ末端におい
    て、少なくとも一種のアミノ酸Ｒ及び／又はＫを含むこ
    とを特徴とする請求項２〜６のいずれか１項に記載のペ
    プチド。
  8. 【請求項８】 アミノ及び／又はカルボキシ末端におい
    て、アミノ酸Ｒ及び／又はＫの少なくとも一種の組み合
    わせを含むことを特徴とする請求項２〜６のいずれか１
    項に記載のペプチド。
  9. 【請求項９】 前記ペプチドが52／48 kDaの分子量を有
    していることを特徴とする請求項２〜５のいずれか１項
    に記載のペプチド。
  10. 【請求項１０】 前記ペプチドが、ヘパリンへのフォン
    ・ウィレブラント因子の結合を抑制するもので、しか
    も、下記の配列グループ：KDRKRPSELRRIASQ ; LIEKQAPE
    NKAFVLS ; SQEPQRMSRNFURYV ;KYTLFQIFSKIDRPE ; DMMER
    LRISQKWVRV ; LYVEDISEPPLHDFY ;ISEPPLHDFYCSRLL ; SQ
    EPQRMSRNFVRYV ; IPVGIGPHANLKQIR ;GPHANLKQIRLIEKQ ;
    TVGPGLLGVSTLGPK 及び LKQIRLIEKQAPENKから選ばれた
    少なくとも５種の隣接したアミノ酸配列を有する一次ペ
    プチド、又は前記一次ペプチドの２以上の組み合わせか
    らなるペプチドを含むことを特徴とする請求項１記載の
    ペプチド。
  11. 【請求項１１】 前記配列 KDRKRPSELRRIASQ を含むこ
    とを特徴とする請求項１０記載のペプチド。
  12. 【請求項１２】 前記配列が繰り返されていることを特
    徴とする請求項１０又は１１記載のペプチド。
  13. 【請求項１３】 アミノ及び／又はカルボキシ末端にお
    いて、少なくとも一種のアミノ酸Ｒ及び／又はＫを含む
    ことを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか１項に記
    載のペプチド。
  14. 【請求項１４】 アミノ及び／又はカルボキシ末端にお
    いて、アミノ酸Ｒ及び／又はＫの少なくとも一種の組み
    合わせを含むことを特徴とする請求項１０〜１２のいず
    れか１項に記載のペプチド。
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