JPH08337600A - グルカゴンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 カルボキシル基と結合可能な官能基を有する
不溶性樹脂に、アミノ基保護スレオニンのカルボキシル
基を結合させて前記樹脂に29位のスレオニン残基を導入
する工程、該スレオニン残基の保護基を除去して得られ
た遊離のアミノ基に、グルカゴンのアミノ酸配列にした
がってアミノ基保護アミノ酸を順次ペプチド結合させて
28位のアスパラギン残基から１位のヒスチジン残基まで
一つずつ延長する工程、及び得られたペプチドを前記樹
脂から脱離させる工程を含む、グルカゴンの製造方法。 【効果】 化学合成手法により、グルカゴンを効率よく
大量に、しかも安価に製造することができる。したがっ
て、グルカゴンの工業的生産性が向上する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、医薬として有用なペプ
チドであるグルカゴンを化学合成手法を用いて効率的に
製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】グルカゴンは、膵臓のランゲルハンス島
Ａ細胞から分泌されるペプチドホルモンの一つであり、
インスリンとともに炭水化物の代謝に重要な役割を果た
している。インスリンが糖代謝を亢進させて血糖値を低
下させるの対し、グルカゴンは血中にブドウ糖を放出さ
せ、血糖値を上昇させる作用を有する。そのためグルカ
ゴンは成長ホルモン分泌機能検査、インスリノ−マ（島
細胞腫）の診断、肝糖原検査、低血糖時の救急処置、消
化管のＸ線及び内視鏡検査の前処置などに有用である。

【０００３】グルカゴンのアミノ酸配列は公知であり、
Ｎ末端ヒスチジンに始まり、Ｃ末端スレオニンに終わる
29個のアミノ酸残基からなる単鎖ペプチドである。グル
カゴンは、ヒト、ウシ、及びブタにおいてアミノ酸配列
が同一であるため、工業的には、ウシ又はブタからイン
スリンを抽出する際の副産物として単離・精製すること
により得られており（以下、このような抽出法によって
得られたグルカゴンを抽出グルカゴンという。）、既に
製剤化されて市販されている。

【０００４】しかしながら、医薬用インスリンの生産が
抽出法による生産から遺伝子組換えによる生産に変更さ
れたため、抽出グルカゴンを単独で生産するのは効率が
悪く、コストがかかるというのが現状である。そこで、
例えば、特開平３−２５４６９２号公報、特開平６−２
９２５９４号公報等において、遺伝子組換え技術を用い
たグルカゴン（以下、組換えグルカゴンという。）の生
産も検討されているが、未だ実用化には至っていない。
また、組換えグルカゴンは微生物を用いて生産されるた
め、安全性について細心の注意を払う必要があり、生産
後の処理が煩雑で、不経済であること等から工業的生産
においては十分満足できるものではない。

【０００５】また、グルカゴンの合成については、M.Fu
jinoら（Synthesis of the Nonacosapeputide correspo
nding to Mammalian Glucagon, Chem. Pharm. Bull., 2
6(2), 539-548(1978)）や、N.A.Abrahamら（A NEW PHAS
E STRATRGY FOR THE SYNTHESIS OF MAMMALIAN GLUCAGO
N, Tetrahedron Letters, 32.5, 577-580(1991) ）が報
告しているが、大量に合成された報告はない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、化学
合成手法により、グルカゴンを効率よく大量に、しかも
安価に製造する方法を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決すべく鋭
意研究を重ねた結果、工業的生産に適したグルカゴンの
製造方法を見出し、本発明を完成した。本発明は、下記
式(1) ： H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr- Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln- (1) Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH で表されるグルカゴンの製造方法であって、カルボキシ
ル基と結合可能な官能基を有する不溶性樹脂に、アミノ
基保護スレオニンのカルボキシル基を結合させて前記樹
脂に29位のスレオニン残基を導入する工程、該スレオニ
ン残基の保護基を除去して得られた遊離のアミノ基に、
上記式(1) のアミノ酸配列にしたがってアミノ基保護ア
ミノ酸を順次ペプチド結合させて28位のアスパラギン残
基から１位のヒスチジン残基まで一つずつ延長する工
程、及び得られたペプチドを前記樹脂から脱離させる工
程を含む製造方法（方法１）を提供する。

【０００８】また、本発明は、上記式(1) で表されるグ
ルカゴンの製造方法であって、前記グルカゴンを構成す
る１又は複数のフラグメント（ここで、フラグメントを
構成するアミノ酸残基の総数は２〜28個である。）であ
って末端アミノ基を保護したものを合成する工程、カル
ボキシル基と結合可能な官能基を有する不溶性樹脂に、
アミノ基保護スレオニン又は29位のスレオニン残基を含
む末端アミノ基保護フラグメントのカルボキシル基を結
合させる工程、前記樹脂に結合したスレオニン残基又は
フラグメントの末端アミノ基の保護基を除去して得られ
た遊離のアミノ基に、上記式(1) のアミノ酸配列にした
がって末端アミノ基保護フラグメント及び／又は末端ア
ミノ基保護アミノ酸を順次ペプチド結合させて１位のヒ
スチジン残基まで延長する工程、及び得られたペプチド
を前記樹脂から脱離させる工程を含む製造方法（方法
２）を提供する。

【０００９】更に、本発明は、上記式(1) で表されるグ
ルカゴンの製造方法であって、１位から12位のアミノ酸
残基に相当する下記一般式(7) ： Ｒ¹-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-OH (7) （式中、Ｒ¹は末端アミノ基の保護基である。）で表さ
れるペプチドと、13位から29位のアミノ酸残基に相当す
る下記式(8) ： Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr- OH (8) で表されるペプチドとを、トリプシン又はトリプシン様
酵素の存在下で反応させることを特徴とする製造方法
（方法３）を提供する。

【００１０】更に、本発明は、上記式(1) で表されるグ
ルカゴンの製造方法であって、１位から18位のアミノ酸
残基に相当する下記一般式(9) ： Ｒ¹-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr- Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-OH (9) （式中、Ｒ¹は末端アミノ基の保護基である。）で表さ
れるペプチドと、19位から29位のアミノ酸残基に相当す
る下記式(10)： H-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH (10) で表されるペプチドとを、トリプシン又はトリプシン様
酵素の存在下で反応させることを特徴とする製造方法
（方法４）を提供する。

【００１１】更に、本発明は、上記式(1) で表されるグ
ルカゴンの製造方法であって、１位から18位のアミノ酸
残基に相当する下記一般式(11)： Ｒ¹-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr- Ser-Lys(Ｒ⁶)-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-OH (11) （式中、Ｒ¹は末端アミノ基の保護基であり、Ｒ⁶はリジ
ンの側鎖のアミノ基の保護基である。）で表されるペプ
チドと、上記式(10)で表されるペプチドとを、トリプシ
ン又はトリプシン様酵素の存在下で反応させることを特
徴とする製造方法（方法５）を提供する。

【００１２】更に、本発明は、上記式(1) で表されるグ
ルカゴンの製造方法であって、前記グルカゴンを少なく
とも２個のフラグメントに分けて各フラグメントを液相
中で合成し、次いで液相中で各フラグメントを反応させ
てカップリングすることを特徴とする製造方法（方法
６）を提供する。本明細書において、アミノ酸、ペプチ
ド、保護基、溶媒その他に関して略号で表示する場合、
国際純正及び応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）、国際生化学
連合（ＩＢＵ）の規定或いは該当分野における慣用記号
に従うものとする。ただしアミノ酸等に関し光学異性体
がありうる場合は、特に明示しなければＬ体を示すもの
とする。以下、その例を示す。

【００１３】 Ｔｙｒ：チロシン残基 Ｇｌｙ：グリシ
ン残基 Ｓｅｒ：セリン残基 Ａｒｇ：アルギ
ニン残基 Ａｓｐ：アスパラギン酸残基 Ｌｙｓ：リジン
残基 Ｌｅｕ：ロイシン残基 Ｔｈｒ：スレオ
ニン残基 Ｐｈｅ：フェニルアラニン残基 Ｇｌｎ：グルタ
ミン残基 Ｖａｌ：バリン残基 Ａｓｎ：アスパ
ラギン残基 Ｈｉｓ：ヒスチジン残基 Ａｌａ：アラニ
ン残基 Ｔｒｐ：トリプトファン残基 Ｍｅｔ：メチオ
ニン残基 Ａｏｃ ：t-アミルオキシカルボニル基 Ｂｏｃ ：t-ブトキシカルボニル基 Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル基 Ｆｍｏｃ ：9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基 Ｂｚｌ ：ベンジル基 Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル基 Ｔｏｓ ：トシル基 ＯＭｅ ：メチルエステル ＯＢｚｌ ：ベンジルエステル ＯｃＨｅｘ：シクロヘキシルエステル ＯＢｕｔ ： t-ブチルエステル Ｂｕｔ ： t-ブチル基 ＯＮＰ ： p-ニトロフェニルエステル ＯＳｕ ： N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸 ＴＨＦ ：テトラヒドロフラン ＤＭＦ ：ジメチルホルムアミド ＤＣＣ ：ジシクロヘキシルカルボジイミド ＤＣＭ ：ジクロロメタン ＷＳＣ ： N-エチル-N’-ジメチルアミノプロピル-
カルボジイミド ＨＯＳｕ ： N-ヒドロキシコハク酸イミド ＨＯＢｔ ： 1-ヒドロキシベンゾトリアゾ-ル ＭｅＯＨ ：メタノール ＥｔＯＨ ：エタノール ＡｃＯＨ ：酢酸 ＤＩＥＡ ：ジイソプロピルエチルアミン方法１ 方法１は、上記式(1) で表されるグルカゴンを、いわゆ
るステップワイズ伸長法にて固相合成するものである。
より詳細には、メリフィ−ルド（ Merrifield.R.B.）の
方法［Solid phase peptide synthesis, J.Amer.Chem.S
oc., 85, 2149-2159 (1963) ］に従って行うことができ
る。まず、カルボキシル基と結合可能な官能基を有する
不溶性樹脂に、アミノ基保護スレオニンのカルボキシル
基を結合させて前記樹脂に29位のスレオニン残基を導入
する。次いで該スレオニン残基のアミノ基の保護基を除
去して得られた遊離のアミノ基に、上記式(1) で表され
るアミノ酸配列に従って、カルボキシル基を通常の方法
で活性化させたアミノ基保護アミノ酸を順次ペプチド結
合させてはそのアミノ基の保護基の除去するという操作
を繰り返して28位のアスパラギン残基から１位のヒスチ
ジン残基まで一つずつ延長する。続いて得られたペプチ
ドを前記樹脂から脱離させる。また、脱離させたペプチ
ドのＮ末端のアミノ基の保護基を除去し、側鎖に官能基
を有するアミノ酸残基の該官能基が保護されている場合
にはその保護基を除去することにより、グルカゴンを製
造することができる。

【００１４】方法１の固相合成は、溶媒の存在下に行
う。溶媒としては、ペプチド結合形成に使用し得ること
が知られている各種のもの、例えば、無水又は含水のジ
メチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド
（ＤＭＳＯ）、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、
ジクロロメタン（ＤＣＭ）、テトラヒドロフラン（ＴＨ
Ｆ）、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドン、ヘキサメチ
ルリン酸トリアミド（ＨＭＰＡ）等を、１種単独で、あ
るいは２種以上の混合溶媒として用いることができる。

【００１５】また、方法１において用いる不溶性樹脂
は、カルボキシル基と結合可能な官能基を有する不溶性
樹脂であればいずれのものも使用できる。例えば、クロ
ルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、アミノメチル樹脂、
ベンズヒドリルアミン樹脂（ＢＨＡ樹脂）、p-メチルベ
ンズヒドリルアミン樹脂（ＭＢＨＡ樹脂）、４−アミノ
メチルフェノキシメチル樹脂、４−ヒドロキシメチルフ
ェノキシメチル樹脂、４−オキシメチルフェニルアセタ
ミドメチル樹脂（ＰＡＭ樹脂）等が挙げられるが、それ
らの中でもアミノ基を有する樹脂が好ましい。ここで、
不溶性樹脂とは、上記の溶媒に不溶性の樹脂をいう。ま
た、不溶性樹脂の主鎖は、例えば、スチレンとジビニル
ベンゼンのコポリマー等から構成される。樹脂へのアミ
ノ基保護アミノ酸の結合、及び合成されたグルカゴンの
樹脂からの脱離は、従来公知の方法で行うことができ
る。尚、グルカゴンを樹脂から脱離させる場合、該グル
カゴンの末端アミノ基の保護基の脱離に用いる試薬と同
じものを使用すると効率的である。したがって、例え
ば、末端アミノ基の保護基としてＦｍｏｃを使用する場
合、該保護基の脱離は、トリフルオロ酢酸等で行うこと
から、樹脂としては４−ヒドロキシメチルフェノキシメ
チル樹脂等を用いるのが好ましい。また、例えば、末端
アミノ基の保護基としてＢｏｃを使用する場合、該保護
基の脱離は、フッ化水素等で行うことから、樹脂として
は４−オキシメチルフェニルアセタミドメチル樹脂等を
用いるのが好ましい。

【００１６】方法１においては、17〜25位のアミノ酸残
基に対応する各アミノ酸のカップリングの反応性が他の
位置と比較して劣っている。したがって、実際にアミノ
酸残基を延長させる場合、収率を上げるためにはかかる
部分の各アミノ酸のカップリング反応を何度か繰り返し
て行う必要がある。しかしながら、不溶性樹脂として、
カルボキシル基と結合可能な官能基の含有量が、好まし
くは 0.5mmol以下、更に好ましくは 0.1〜0.4mmol のも
のを使用すると、かかる部分の反応性を向上させること
ができるので、カップリング反応を繰り返さなくても収
率を上げることができる。また、官能基の含有量を 0.5
mmol以下とすることにより、グルカゴン生成の主反応に
関与しない官能基の量を低く抑えることができることか
ら副反応が生じにくくなり、より純度の高いペプチドを
得ることができる。したがって、その後の精製操作が容
易になる。また、反応時間も短縮することができる。更
に、グルカゴンの合成に用いる各種アミノ酸又はフラグ
メント、各種試薬、溶媒の量も低く抑えることができる
ので、効率的であり、生産性が向上する。方法２ 方法２は、上記式(1) で表されるグルカゴンを、いわゆ
るステップワイズ伸長法とフラグメント縮合法とを組み
合わせた方法、即ち、１又は複数の末端アミノ基保護フ
ラグメントと、１又は複数のアミノ基保護アミノ酸（フ
ラグメントではないもの）とを用いてグルカゴンを固相
合成する方法である。ここで、フラグメントとは、アミ
ノ酸残基を少なくとも２個含むものをいい、この方法２
においては、フラグメントを少なくとも１個用いること
から、フラグメントを構成するアミノ酸残基の総数は最
低２個である。また、アミノ基保護アミノ酸（フラグメ
ントではないもの）を少なくとも１個用いることから、
１又は複数のフラグメントを構成するアミノ酸残基の総
数は最高28個である。まず、上記式(1) で表されるグル
カゴンを構成する１又は複数のフラグメントであって、
末端アミノ基を保護したものを合成する。次いで、アミ
ノ基保護スレオニンのカルボキシル基、又は合成した末
端アミノ基保護フラグメントの中に、29位のスレオニン
残基を含む末端アミノ基保護フラグメントがある場合に
は該フラグメントのカルボキシル基を、カルボキシル基
と結合可能な官能基を有する不溶性樹脂に結合させる。
続いて、前記樹脂に結合したスレオニン残基又はフラグ
メントの末端アミノ基の保護基を除去して得られた遊離
のアミノ基に、上記式(1) のアミノ酸配列にしたがって
末端アミノ基保護フラグメント及び／又は末端アミノ基
保護アミノ酸を順次ペプチド結合させて１位のヒスチジ
ン残基まで延長する。次に、得られたペプチドを前記樹
脂から脱離させる。また、脱離させたペプチドのＮ末端
のアミノ基の保護基を除去し、側鎖に官能基を有するア
ミノ酸残基の該官能基が保護されている場合にはその保
護基を除去することにより、グルカゴンを製造すること
ができる。

【００１７】この方法２は、溶媒の存在下で行い、溶媒
としては、方法１で例示したものと同様のものが挙げら
れる。また、不溶性樹脂としても、方法１で例示したも
のと同様のものが挙げられる。また、方法２において、
29位のスレオニン残基を含む末端アミノ基保護フラグメ
ントを不溶性樹脂に結合させる場合、29位のスレオニン
残基のカルボキシル基を結合させてもよく、また、下記
一般式(2) ： Ｒ¹-Ｘ-Asp-Thr( Ｒ³)-Ｒ² (2) （式中、Ｒ¹は末端アミノ基の保護基であり、Ｒ²は末端
カルボキシル基の保護基であり、Ｒ³はスレオニン残基
の側鎖の水酸基の保護基であり、Ｘは化学結合、Met、
又はLeu-Met である。）で表されるペプチドのアスパラ
ギン酸残基の側鎖のカルボキシル基を不溶性樹脂に結合
させてもよい。上記一般式(2) で表されるペプチドを用
いる場合、不溶性樹脂としては、最終的に得られたグル
カゴンを該樹脂から脱離させた時に樹脂への結合に関与
する上記アスパラギン酸のカルボキシル基がアミド化さ
れて、アスパラギン残基となるような樹脂を用いる。そ
のような不溶性樹脂としては、例えば、ベンズヒドリル
アミン樹脂、メチルベンズヒドリルアミン樹脂等が挙げ
られ、比較的安価なものを使用することができる。

【００１８】また、この方法２において、フラグメント
として19位から25位のアミノ酸残基に相当する下記一般
式(3) ： Ｒ¹-Ala-Gln-Asp(Ｒ⁴)-Phe-Val-Gln-Trp-OH (3) （式中、Ｒ¹は前記のとおりであり、Ｒ⁴はアスパラギン
酸残基の側鎖のカルボキシル基の保護基である。）で表
されるヘプタペプチドを用いるのが好ましい。上記方法
１で述べたように、17〜25位の各アミノ酸のカップリン
グの反応性は比較的低いが、上記一般式(3)で表される
ヘプタペプチドを用いることにより、カップリングを繰
り返さなくても収率を上げることができ、効率的であ
る。しかも副反応も低減することができるのでより高純
度のペプチドを得ることができることから、その後の精
製操作が容易になる。したがって、精製の回数や時間を
減らすことができ、精製に用いる溶媒の量も低減するこ
とができ、生産性が向上する。また、カップリングを繰
り返さなくてよいことから、アミノ基保護アミノ酸、反
応試薬、溶媒等の使用量を低減することができ、経済的
にも有利である。

【００１９】更に、方法２において、フラグメントとし
て、17位から25位のアミノ酸残基に相当する下記一般式
(4) ： Ｒ¹-Arg(Ｒ⁵)-Arg(Ｒ⁵)-Ala-Gln-Asp(Ｒ⁴)-Phe-Val-Gln-Trp-OH (4) （式中、Ｒ¹及びＲ⁴は前記のとおりであり、Ｒ⁵はアル
ギニン残基の側鎖のグアニジノ基の保護基である。）で
表されるノナペプチドを用いるのも、上記一般式(3) で
表されるヘプタペプチドを用いた場合と同様の理由で好
ましい。

【００２０】更に、方法２において、フラグメントとし
て、19位から24位のアミノ酸残基に相当する下記一般式
(5) ： Ｒ¹-Ala-Gln-Asp(Ｒ⁴)-Phe-Val-Gln-OH (5) （式中、Ｒ¹及びＲ⁴は前記のとおりである。）で表され
るヘキサペプチドを用いるのも、上記一般式(3) で表さ
れるヘプタペプチドを用いた場合と同様の理由で好まし
い。また、かかるヘキサペプチドにはトリプトファン残
基が含まれていないことから、その合成が容易である。

【００２１】更に、方法２において、フラグメントとし
て、17位から24位のアミノ酸残基に相当する下記一般式
(6) ： Ｒ¹-Arg(Ｒ⁵)-Arg(Ｒ⁵)-Ala-Gln-Asp( Ｒ⁴)-Phe-Val-Gln-OH (6) （式中、Ｒ¹、Ｒ⁴及びＲ⁵は前記のとおりである。）で
表されるオクタペプチドを用いるのも、上記一般式(5)
で表されるヘキサペプチドを用いた場合と同様の理由で
好ましい。方法３ 方法３は、１位から12位のアミノ酸残基に相当する上記
一般式(7) で表されるペプチドと、13位から29位のアミ
ノ酸残基に相当する上記式(8) で表されるペプチドと
を、トリプシン又はトリプシン様酵素の存在下で反応さ
せるものである。

【００２２】トリプシンは、タンパク質分解酵素の一つ
である。タンパク質分解酵素は、主としてペプチド結合
の開裂に使用されてきたが、その逆反応であるペプチド
結合の生成反応にも関与し得ることは古くから知られて
いる。しかし、そのようなタンパク質分解酵素を用いた
ペプチド結合生成反応は主にオリゴペプチド等に使用さ
れ、ほとんど直鎖ペプチドに限られている。

【００２３】本発明で用いるトリプシンは、国際生化学
連合(I.U.B) 酵素委員会に酵素番号EC.3.4.21.4 として
登録されており、ウシ膵から得られる酵素である。トリ
プシンは、フナコシ社等から市販されている。この反応
は、通常、pH４〜10、好ましくはpH５〜８の緩衝液を含
む媒質中で行われる。また、反応は、通常、０〜50℃、
好ましくは20〜40℃の範囲で行う。

【００２４】緩衝液としては、pH値が上記範囲内のもの
であればその種類は特に限定されることなくいずれのも
のも使用することができる。例えば、トリス塩酸緩衝
液、マツクイルベイン緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸アン
モニウム緩衝液、アトキンス＆パンチン氏緩衝液、ベロ
ナール緩衝液等が挙げられる。上記のような緩衝液を反
応媒質として使用する場合、該緩衝液は、通常、水混和
性有機溶媒と混合して使用される。その水混和性有機溶
媒としては、例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルイ
ミダゾリジノン（ＤＭＩ）、ヘキサメチルホスホリルト
リアミド（ＨＭＰＡ）、メタノール（ＭｅＯＨ）、エタ
ノール（ＥｔＯＨ）等が挙げられ、中でも、特にジメチ
ルホルムアミド、メタノール、及びエタノールが好まし
い。これらの有機溶媒は１種単独で、又は２種以上の組
み合わせで使用することができる。上記緩衝液と水混和
性有機溶媒の混合割合は、緩衝液対有機溶媒の容積比
で、一般的には２：８乃至８：２の範囲であり、好まし
くは５：７乃至７：５の範囲である。

【００２５】トリプシン又はトリプシン様酵素の使用量
は、特に制限はなく、反応条件に応じて適宜変えること
ができる。また、反応は、トリプシン又はトリプシン様
酵素を、一般的な方法、例えば、担体結合法、架橋法、
包括法、その他の方法により固定化した固定化酵素を利
用して行うことができる。担体結合法において用いる担
体としては、例えば、セルロース、デキストラン、アガ
ロース等の多糖類の誘導体、ポリアクリルアミドゲル、
多孔性ガラス等が挙げられる。架橋法において用いる架
橋試薬としては、例えば、グルタールアルデヒド、ビス
ジアゾベンジジン、N,N-ポリメチレンビスヨードアセト
アミド、N,N-エチレンビスマレインイミド等が挙げられ
る。包括法で用いる素材としては、例えば、ポリアクリ
ルアミドゲル、ポリアクリルアルコールゲル、デンプ
ン、コンニャク粉、ナイロン、ポリウレア、ポリスチレ
ン、エチルセルロース、コロジオン、硝酸セルロース等
が挙げられる。但し、固定化法は何らこれらに限定され
るものではない。

【００２６】上記一般式(8) で表されるペプチドとして
は、方法１〜方法２によりグルカゴンを製造する際の中
間体を用いることができる。また、上記一般式(7) で表
されるペプチドは、例えば、方法１に準じて、ステップ
ワイズ伸長法により固相合成することができる。この方
法３によれば、予め精製した上記一般式(7) で表される
ペプチドフラグメント及び上記一般式(8) で表されるペ
プチドフラグメントを使用することから、酵素反応によ
りグルカゴンを合成した後の精製操作が容易になる。即
ち、精製の回数を少なくすることができるので、精製に
使用する溶媒の量を低減することができ、時間も短縮す
ることができる。その上、精製によるロスも低減するこ
とができ、収率を上げることができる。また、酵素反応
を利用することから、反応が特異的で、ラセミ化などの
副反応が生じにくい。

【００２７】この方法３においては、未反応物とともに
副生成物を酵素分解し、回収して再利用することができ
る。方法４ 方法４は、１位から18位のアミノ酸残基に相当する上記
一般式(9) で表されるペプチドと、19位から29位のアミ
ノ酸残基に相当する上記式(10)で表されるペプチドと
を、上記方法３と同様にトリプシン又はトリプシン様酵
素の存在下で反応させるものである。上記一般式(10)で
表されるペプチドとしては、方法１によりグルカゴンを
製造する際の中間体を用いることができる。また、上記
一般式(9)で表されるペプチドは、例えば、方法１に準
じて、ステップワイズ伸長法により固相合成することが
できる。この方法４は、上記方法３と同様の利点があ
る。方法５ 方法５は、１位から18位のアミノ酸残基に相当する上記
一般式(11)で表されるペプチドと、19位から29位のアミ
ノ酸残基に相当する上記式(10)で表されるペプチドと
を、上記方法３と同様にトリプシン又はトリプシン様酵
素の存在下で反応させるものである。上記一般式(11)で
表されるペプチドは、例えば、方法１に準じて、ステッ
プワイズ伸長法により固相合成することができる。この
方法の利点は、上記方法３と同様である。また、トリプ
シンによる分解反応を受けなくなるので、より高い収率
が得られるというメリットがある。方法６ 方法６は、グルカゴンを少なくとも２個のフラグメント
に分けて各フラグメントを液相中で合成し、次いで液相
中で各フラグメントを反応させてカップリングする、即
ち液相合成にてグルカゴンを製造するものである。この
方法６で用いる溶媒としては、方法１で例示したものと
同様のものが挙げられる。この方法６は、不溶性樹脂が
不要であり、アミノ基保護アミノ酸や、反応試薬、溶媒
等の使用量を低減することができる。また、製造設備の
規模を拡大することができるので、大量製造も可能であ
る。

【００２８】上記の本発明のグルカゴンの製造方法１〜
６においては、全て、アミノ酸のペプチド結合に関与す
るアミノ基への保護基の結合及び該保護基の脱離、並び
にアミノ酸のペプチド結合に関与するカルボキシル基の
活性化が必要である。また、必要に応じてアミノ酸の側
鎖の官能基にも保護基を結合する。これらの操作は、公
知の方法に従って行うことができる。例えば、「ザ．ペ
プチド(The Peptides)」第1巻(1966年)[Schreder and L
uhke著、Academic Press ,NewYork,U.S.A.] 、あるいは
「ペプチド合成」［泉屋ら著、丸善株式会社(1975年)］
に記載された方法に従い、例えば、アジド法、酸クロラ
イド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性
エステル法（P-ニトロフエニルエステル法、Ｎ−ヒドロ
キシコハク酸イミドエステル法、シアノメチルエステル
法等）、ウッドワ−ド試薬Ｋを用いる方法、カルボイミ
ダゾ−ル法、酸化還元法、ＤＣＣ−アデイテイブ（ＨＯ
ＮＢ、ＨＯＢｔ、ＨＯＳｕ）法等に従って行うことがで
き、固相合成及び液相合成のいずれにも適用できる。

【００２９】本発明のグルカゴンの製造において、アミ
ノ基を保護する場合に用いる保護基としては、通常用い
られているものを挙げることができ、例えばベンジルオ
キシカルボニル（Ｚ）、 t-ブトキシカルボニル（Ｂo
c）、t-アミルオキシカルボニル（Ａoc）、イソボニル
オキシカルボニル、p-メトキシベンジルオキシカルボニ
ル、2-クロル-ベンジルオキシカルボニル、アダマンチ
ルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイ
ル、ホルミル、o-ニトロフェニルスルフェニル、ジフェ
ニルホスフィノチオイルなどの基が挙げられる。アミノ
基への保護基の結合及び脱離は、上記のような従来公知
の方法で行うことができる。

【００３０】また、本発明のグルカゴンの製造におい
て、カルボキシル基を保護する場合に用いる保護基とし
ては、通常用いられているものを挙げることができ、例
えば、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエス
テル、ブチルエステル、tert−ブチルエステル等のアル
キルエステル、ベンジルエステル、p-ニトロベンジルエ
ステル、メチルベンジルエステル、p-クロロベンジルエ
ステル、ベンズヒドリルエステル、ベンジルオキシカル
ボニルヒドラジド、tert-ブチルオキシカルボニルヒド
ラジド、トリチルヒドラジド等が挙げられる。これらの
中で好ましいものは、である。カルボキシル基への保護
基の結合及び脱離は、上記のような従来公知の方法で行
うことができる。

【００３１】ペプチド結合に関与するカルボキシル基の
活性化も、上記のような従来公知の方法にて行うことが
でき、用いられる試薬等も公知のものから適宜選択し得
る。例えば、カルボキシル基を活性化するために、該カ
ルボキシル基と種々の試薬を反応させて、例えば、対応
する酸クロライド、酸無水物又は混合酸無水物、アジ
ド、活性エステル（例えば、ペンタクロロフェノ−ル、
p-ニトロフェノ−ル、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、
Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾ−ル、Ｎ−ヒドロキシ−
５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等との
エステル）等を形成させればよい。

【００３２】本発明においてグルカゴンの製造に用いる
アミノ酸の中で、側鎖に官能基を有するものについて
は、ペプチド結合形成反応中はその官能基は保護されて
いるのが好ましく、特に、Ｈis、Ｔyr、Ｔhr、Ｌys、Ａ
sp、Ａrg及びＳerについては、その側鎖の官能基を保護
しておくのが好ましい。官能基の保護は、通常用いられ
ている方法で保護基を結合させることにより行われる。
グルカゴンの合成終了後、それらの保護基は脱離され
る。尚、側鎖カルボキシル基が保護されていない場合は
反応に関与すべき官能基をあらかじめ対称酸無水物法、
活性エステル法等で活性化し、ペプチド結合形成反応を
行うのが望ましい。

【００３３】Ｈisのイミノ基の保護基としては、例え
ば、ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）、トシル（Ｔo
s）、ベンジル（Ｂzl）、ベンジルオキシカルボニル
（Ｚ）、トリチル等の基が挙げられる。Ｓer及びＴhrの
水酸基は、例えば、エステル化又はエ−テル化によって
保護することができるが、必ずしも保護する必要はな
い。エステル化によって導入される保護基としては、例
えば、アセチル等の低級アルカノイル基、ベンゾイル等
のアロイル基、ベンゾイルオキシカルボニル、エチルオ
キシカルボニル等の炭酸から誘導される基等が好適に用
いられる。またエ−テル化によって導入される保護基と
しては、例えば、ベンジル（Ｂzl）、テトラヒドロピラ
ニル、tert−ブチル等の基が好適に用いられる。

【００３４】Ｔyrの水酸基の保護基としては、例えばベ
ンジル（Ｂzl）、ブロモベンジルオキシカルボニル（Ｂ
ｒＺ）、ジクロロベンジルオキシ（Ｃｌ₂-Ｂzl）、ベン
ジルオキシカルボニル（Ｚ）、アセチル、トシル（Ｔo
s）等の基が挙げられる。Ｌysのアミノ基の保護基とし
ては、例えば、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、クロ
ロベンジルオキシカルボニル（Ｃｌ−Ｚ）、ジクロロベ
ンジルオキシ（Ｃｌ₂-Ｂzl）、t-ブトキシカルボニル
（Ｂoc）、トシル（Ｔos）等の基が挙げられる。

【００３５】Ａrgのグアニジノ基の保護基としては、例
えば、トシル（Ｔos）、ニトロ、ベンジルオキシカルボ
ニル（Ｚ）、t-アミルオキシカルボニル等の基が挙げら
れる。Ａspのカルボキシル基の保護は、例えば、ベンジ
ルアルコ−ル、メタノ−ル、エタノ−ル、tert−ブタノ
−ル、シクロヘキサノール等によるエステル化により行
われる。

【００３６】また、必要に応じてＴrpのインドリル基も
保護される。Ｔrpの保護基としては、例えば、ホルミ
ル、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、4-メトキシ-2,
3,6-トリメチルベンゼンスルホニル、2,2,2-トリクロロ
エチルオキシカルボニル等の基が挙げられる。また、必
要に応じてＭetのチオメチル基も保護される。Ｍetを保
護する方法としては、予めメチルスルホキシドにしてお
き、後に還元する方法がある。

【００３７】尚、ペプチド結合の形成反応は、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、カルボジ
イミダゾール等のカルボジイミド試薬やピロリン酸テト
ラエチル、ベンゾトリアゾ−ル−Ｎ−ヒドロキシトリス
ジメチルアミノホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩
（Ｂｏｐ試薬）等の縮合剤の存在下に実施し得る場合も
ある。

【００３８】合成されたグルカゴンは、通常の方法に従
い脱塩、精製することができる。例えば、ＤＥＡＥ−セ
ルロ−ス等のイオン交換クロマトグラフィ−、セファデ
ックスＬＨ−２０、セファデックスＧ−２５等の分配ク
ロマトグラフィ−、シリカゲル等の順相クロマトグラフ
ィ−、ＯＤＳ−シリカゲル等の逆相クロマトグラフィ
−、高速液体クロマトグラフィ−等が挙げられる。

【００３９】このようにして得られたグルカゴンは必要
に応じて医薬品として許容され得る塩、例えば、酢酸
塩、塩酸塩、リン酸塩等にすることができる。

【００４０】

【実施例】以下、本発明を実施例を挙げてより具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。以下の実施例において、得られた純粋ペプチドの同
定は、高速液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）の保持
時間の測定、旋光度の測定及びアミノ酸分析により行っ
た。これらの測定は、特に示さない限り、下記の測定法
及び測定条件により行った。 ・高速液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ） 高速液体クロマトグラフィ−分析には、ＬＣ−Ｍｏｄｕ
ｌｅ−１（日本ウォ−タ−ズ・リミテッド社製）を用い
た。

【００４１】（ＨＰＬＣ分析条件） カラム：TSK GEL ODS-120T（4.6×250mm） 溶 媒：0.1%ＴＦＡ−アセトニトリル（アセトニトリル
を20％から50％に毎分１％変化させる直線勾配グラジェ
ント） 流 速：1ml/min 検出波長：２２０ｎｍ ・旋光度 旋光度の測定には、ＤＩＣ−３７０（日本分光工業社
製）を用いた。

【００４２】（旋光度測定条件） 光線： Ｎａランプ 589nm 温度： ２０℃ 層長： 100mm 濃度： １％（０．１Ｍ−酢酸中） ・アミノ酸分析 アミノ酸分析は、得られたペプチドを6N-HCl（０．１％
フェノ−ル含有）中で110℃、20時間加水分解した後
に、日立アミノ酸分析装置Ｌ−８５００型（日立製作所
製）を用いて行った。 〔実施例１−１〕方法１によるグルカゴンの固相合成 まず、Ｂｏｃ−Ｔhr（Ｂzl）−ＰＡＭ樹脂（ペプチド研
究所社製、アミノ基含量：0.36 mmol/g、4-オキシメチ
ルフェニルアセトアミドメチル樹脂）２０ｇを、ＤＣＭ
200ml（２回）、50％ＴＦＡ含有ＤＣＭ溶液 300ml（３
０分）、イソプロピルアルコ−ル 200ml（１回）、Ｍｅ
ＯＨ200ml（２回）、10％ＴＥＡ含有ＤＣＭ 200ml（２
回）、ＭｅＯＨ 200ml（２回）、ＤＣＭ 200ml（２回）
の順に攪拌下で処理し、また、各処理毎に濾過を行っ
た。このようにして、Ｂｏｃ−Ｔhr（Ｂzl）−ＰＡＭ樹
脂の末端アミノ基の保護基を除去した。

【００４３】次いで、得られたＴhr（Ｂzl）−ＰＡＭ樹
脂に、Ｂoc−Ａsn−ＯＨ 15mmol 、ＨＯＢｔ 15mmol 、
ＤＣＭ 100ml及びＤＭＦ 20mlを加えて攪拌し、さらに
ＤＣＣ（１Ｍ−ＤＣＭ溶液）15mlを加えて２時間反応さ
せた。その後、反応混合液を濾過し、ＭｅＯＨ 200ml
（２回）、ＤＣＭ 200ml（２回）の順に攪拌下で処理
し、また、各処理毎に濾過を行った。処理後、これに、
さらに、Ｂoc−Ａsn−ＯＨ8mmol 、ＨＯＢｔ 8mmol 、
ＤＣＭ 100ml及びＤＭＦ 20mlを加えて攪拌し、ＤＣＣ
（１Ｍ−ＤＣＭ溶液）8mlを加えて１時間反応させた。
その後、反応混合液を濾過し、ＭｅＯＨ 200ml（２
回）、ＤＣＭ 200ml（２回）の順に攪拌下で処理し、ま
た、各処理毎に濾過を行った。このようにして、Ｂoc−
Ａsn−Ｔhr（Ｂzl）−ＰＡＭ樹脂を得た。

【００４４】尚、未反応のＴhr（Ｂzl）−ＰＡＭ樹脂
は、20％無水酢酸含有ＤＣＭ溶液100mlを加えて５分間
攪拌した後濾過して、次いでＭｅＯＨ 200ml（２回）、
ＤＣＭ200ml（２回）の順に攪拌下で処理した。各処理
毎に濾過した。このようにして副反応が進まないように
した。次に、得られたＢoc−Ａsn−Ｔhr（Ｂzl）−ＰＡ
Ｍ樹脂を 50％ＴＦＡ含有ＤＣＭ溶液 300ml（３０分）、
イソプロピルアルコ−ル 200ml（１回）、ＭｅＯＨ200ml
（２回）、10％ＴＥＡ含有ＤＣＭ 200ml（２回）、Ｍｅ
ＯＨ 200ml（２回）ＤＣＭ 200ml（２回）の順に攪拌下
で処理し、また、各処理毎に濾過を行った。このように
して、末端アミノ基の保護基を除去してＡsn−Ｔhr（Ｂ
zl）−ＰＡＭ樹脂を得た。

【００４５】上記のようにして得られたＡsn−Ｔhr（Ｂ
zl）−ＰＡＭ樹脂に27位のアミノ酸残基に相当するＢoc
−Ｍet−ＯＨ 15mmol 、ＨＯＢｔ 15mmol 、ＤＣＭ 100
ml及びＤＭＦ 20mlを加えて攪拌し、さらにＤＣＣ（１
Ｍ−ＤＣＭ溶液）15mlを加えて２時間反応させた。その
後、反応混合液を濾過し、ＭｅＯＨ 200ml（２回）、Ｄ
ＣＭ 200ml（２回）の順に攪拌下で処理し、また、各処
理毎に濾過を行った。これに、さらに、Ｂoc−Ｍet−Ｏ
Ｈ 8mmol 、ＨＯＢｔ 8mmol 、ＤＣＭ 100ml及びＤＭＦ
20mlを加えて攪拌し、ＤＣＣ（１Ｍ−ＤＣＭ溶液）8ml
を加えて１時間反応させた。その後、反応混合液を濾過
し、ＭｅＯＨ 200ml（２回）、ＤＣＭ 200ml（２回）の
順に攪拌下で処理し、また、各処理毎に濾過を行った。
このようにして、Ｂoc−Ｍet−Ａsn−Ｔhr（Ｂzl）−Ｐ
ＡＭ樹脂を得た。

【００４６】尚、未反応のＡsn−Ｔhr（Ｂzl）−ＰＡＭ
樹脂は、20％無水酢酸含有ＤＣＭ溶液 100mlを加えて５
分間攪拌し、濾過した後ＭｅＯＨ 200ml（２回）、ＤＣ
Ｍ200ml（２回）の順に攪拌下で処理した。各処理毎に
濾過を行った。このようにして、副反応が進まないよう
にした。以下、下記に示すアミノ基保護アミノ酸を用い
て上記と同様の方法で順次26位から１位までのアミノ酸
残基をカップリングした。 アミノ アミノ基保護アミノ酸 使用量 酸順序 (mmol) ２６ Ｂoc−Ｌeu−ＯＨ １５＋８ ２５ Ｂoc−Ｔrp−ＯＨ １５＋８ ２４ Ｂoc−Ｇln（Ｘan）−ＯＨ １５＋８×２ ２３ Ｂoc−Ｖal−ＯＨ １５＋８×３ ２２ Ｂoc−Ｐhe−ＯＨ １５＋８×６ ２１ Ｂoc−Ａsp（ＯcＨｅx）−ＯＨ １５＋８×３ ２０ Ｂoc−Ｇln（Ｘan）−ＯＨ １５＋８×３ １９ Ｂoc−Ａla−ＯＨ １５＋８×３ １８ Ｂoc−Ａrg（Ｔos）−ＯＨ １５＋８×４ １７ Ｂoc−Ａrg（Ｔos）−ＯＨ １５＋８×４ １６ Ｂoc−Ｓer（Ｂzl ）−ＯＨ １５＋８×２ １５ Ｂoc−Ａsp（ＯcＨｅｘ）−ＯＨ １５＋８×２ １４ Ｂoc−Ｌeu−ＯＨ １５＋８×２ １３ Ｂoc−Ｔyr（Ｂr-Ｚ）−ＯＨ １５＋８×３ １２ Ｂoc−Ｌys（Ｃl-Ｚ）−ＯＨ １５＋８ １１ Ｂoc−Ｓer（Ｂzl ）−ＯＨ １５＋８×２ １０ Ｂoc−Ｔyr（Ｂr-Ｚ）−ＯＨ １５＋８×２ ９ Ｂoc−Ａsp（ＯcＨx）−ＯＨ １５＋８ ８ Ｂoc−Ｓer（Ｂzl ）−ＯＨ １５＋８ ７ Ｂoc−Ｔhr（Ｂzl ）−ＯＨ １５＋８ ６ Ｂoc−Ｐhe−ＯＨ １５＋８ ５ Ｂoc−Ｔhr（Ｂzl ）−ＯＨ １５＋８ ４ Ｂoc−Ｇly−ＯＨ １５＋８ ３ Ｂoc−Ｇln（Ｘan）−ＯＨ １５＋８ ２ Ｂoc−Ｓer（Ｂzl ）−ＯＨ １５＋８ １ Ｂoc−Ｈis（Ｂom）−ＯＨ １５＋８ このようにして、Ｈis(Ｂom）−Ｓer(Ｂzl）−Ｇln−Ｇ
ly−Ｔhr（Ｂzl）−Ｐhe−Ｔhr（Ｂzl）−Ｓer（Ｂzl）
−Ａsp（ＯcＨｅx）−Ｔyr（Ｂr-Ｚ）−Ｓer(Ｂzl）−
Ｌys(Ｃl-Ｚ）−Ｔyr(Ｂr-Ｚ）−Ｌeu−Ａsp（ＯcＨｅ
x）−Ｓer（Ｂzl）−Ａrg（Ｔos）−Ａrg（Ｔos）−Ａl
a−Ｇln−Ａsp（ＯcＨｅx）−Ｐhe−Ｖal-Ｇln−Ｔrp−
Ｌeu−Ｍet−Ａsn−Ｔhr（Ｂzl）−ＰＡＭ樹脂 50.93g
を得た。

【００４７】上記の保護ペプチド−ＰＡＭ樹脂 50ｇに
アニソ−ル 75ml及び1,2-エタンジチオール 75mlを加
え、さらに無水フッ化水素 600mlを加えて０℃で１時間
撹拌した。その後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残
渣をエ−テルで洗浄し、これに10％酢酸 1250mlを加え
てペプチドを抽出した。得られた抽出液を以下に示す条
件で逆相カラムクロマトグラフィーにより精製後、さら
に分取用高速液体クロマトグラフィーを用いたイオン交
換クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーによ
り精製した。得られた溶出液を凍結乾燥し、精製グルカ
ゴン 1.00gを得た。 ・逆相カラムクロマトグラフィー カラム：ＯＤＳ−１０２０ＴＴ（30×420mm） 溶 媒：平衡化 15％アセトニトリル−0.1％ＴＦＡ 溶出 35％アセトニトリル−0.1％ＴＦＡ 流 速：５ml/min ・イオン交換クロマトグラフィー（分取用高速液体クロ
マトグラフィー） カラム：TSK GEL SP-5PW（21.5×150mm） 溶 媒：35％イソプロピルアルコール−50mM酢酸緩衝液
（pH 5.3） 流 速：５ml/min ・逆相カラムクロマトグラフィー（分取用高速液体クロ
マトグラフィー） カラム：TSK GEL ODS-120T（550×600mm） 溶 媒：29％イソプロピルアルコール−0.1％ＴＦＡ 流 速：30ml/min また、上記精製ペプチドについて、高速液体クロマトグ
ラフィ−（ＨＰＬＣ）の保持時間の測定、旋光度の測定
及びアミノ酸分析を行った。その結果を下記に示す。 ・ＨＰＬＣの保持時間：２７．２分 ・［α］_D ：−３５．３° ・アミノ酸分析 Asp(4) 3.94, Thr(3) 2.65, Ser(4) 2.90, Glu(3) 2.9
8, Gly(1) 1.07, Ala(1) 1.00, Val(1) 1.01, Met(1)
0.97, Leu(2) 2.06, Tyr(2) 1.93, Phe(2) 1.92,His(1)
1.05, Arg(2) 1.95 〔実施例１−２〕樹脂として、Ｂｏｃ−Ｔhr（Ｂzl）−
ＰＡＭ樹脂（渡辺化学工業株式会社製、アミノ基含有
量：0.74 mmol/g ）２０ｇを用い、アミノ基保護アミノ
酸として下記のものを用いた以外は実施例１−１と同様
の方法で保護ペプチド−ＰＡＭ樹脂66.19g を得た。 アミノ アミノ基保護アミノ酸 使用量 酸順序 (mmol) ２８ Ｂoc−Ａsn（Ｘan）−ＯＨ ３０＋１５ ２７ Ｂoc−Ｍet−ＯＨ ３０＋１５ ２６ Ｂoc−Ｌeu−ＯＨ ３０＋１５ ２５ Ｂoc−Ｔrp−ＯＨ ３０＋１５×２ ２４ Ｂoc−Ｇln（Ｘan）−ＯＨ ３０＋１５×２ ２３ Ｂoc−Ｖal−ＯＨ ３０＋１５×３ ２２ Ｂoc−Ｐhe−ＯＨ ３０＋１５×７ ２１ Ｂoc−Ａsp（ＯcＨex）−ＯＨ ３０＋１５×１２ ２０ Ｂoc−Ｇln（Ｘan）−ＯＨ ３０＋１５×７ １９ Ｂoc−Ａla−ＯＨ ３０＋１５×４ １８ Ｂoc−Ａrg（Ｔos）−ＯＨ ３０＋１５×６ １７ Ｂoc−Ａrg（Ｔos）−ＯＨ ３０＋１５×８ １６ Ｂoc−Ｓer（Ｂzl ）−ＯＨ ３０＋１５×３ １５ Ｂoc−Ａsp（ＯcＨex）−ＯＨ ３０＋１５×４ １４ Ｂoc−Ｌeu−ＯＨ ３０＋１５×２ １３ Ｂoc−Ｔyr（Ｂr-Ｚ）−ＯＨ ３０＋１５×３ １２ Ｂoc−Ｌys（Ｃl-Ｚ）−ＯＨ ３０＋１５×２ １１ Ｂoc−Ｓer（Ｂzl ）−ＯＨ ３０＋１５×２ １０ Ｂoc−Ｔyr（Ｂr-Ｚ）−ＯＨ ３０＋１５×２ ９ Ｂoc−Ａsp（ＯcＨex）−ＯＨ ３０＋１５ ８ Ｂoc−Ｓer（Ｂzl ）−ＯＨ ３０＋１５ ７ Ｂoc−Ｔhr（Ｂzl ）−ＯＨ ３０＋１５ ６ Ｂoc−Ｐhe−ＯＨ ３０＋１５ ５ Ｂoc−Ｔhr（Ｂzl ）−ＯＨ ３０＋１５ ４ Ｂoc−Ｇly−ＯＨ ３０＋１５ ３ Ｂoc−Ｇln（Ｘan）−ＯＨ ３０＋１５ ２ Ｂoc−Ｓer（Ｂzl ）−ＯＨ ３０＋１５ １ Ｂoc−Ｈis（Ｂom）−ＯＨ ３０＋１５×３ 得られた保護ペプチド−ＰＡＭ樹脂50ｇにアニソ−ル 8
8ml及び1,2-エタンジチオール 88mlを加え、さらに無水
フッ化水素 800mlを加えて０℃で１時間撹拌した。反応
後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残渣をエ−テルで
洗浄し、これに 10％酢酸 250mlを加えてペプチドを抽
出した。

【００４８】抽出液から、実施例１−１と同様の方法で
精製グルカゴン 520mgを得た。また、上記精製グルカゴ
ンについて、高速液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）
の保持時間の測定、旋光度の測定及びアミノ酸分析を行
った。その結果を下記に示す。 ・ＨＰＬＣの保持時間：２９．５分 ・［α］_D ：−３５．４° ・アミノ酸分析 Asp(4) 3.92, Thr(3) 2.64, Ser(4) 2.89, Glu(3) 2.9
7, Gly(1) 1.07, Ala(1) 1.00, Val(1) 1.01, Met(1)
0.95, Leu(2) 2.06, Tyr(2) 1.91, Phe(2) 1.92,His(1)
1.05, Lys(1) 0.98, Arg(2) 1.93 〔実施例１−３〕樹脂として、Ｂｏｃ−Ｔhr（Ｂzl）−
ＰＡＭ樹脂（渡辺化学工業株式会社製、アミノ基含有
量：0.56 mmol/g ）２０ｇを用い、Ｂｏｃ−Ｍet−ＯＨ
及びＢｏｃ−Ｔrp−ＯＨのかわりにそれぞれＢｏＣ−Ｍ
et（Ｏ）−ＯＨ及びＢｏｃ−Ｔrp（ＣＨＯ）−ＯＨ用い
た以外は実施例１−１と同様の方法で保護ペプチド−Ｐ
ＡＭ樹脂58.98gを得た。

【００４９】得られた保護ペプチド−ＰＡＭ樹脂 50ｇ
にp-クレゾール 26ｇ、ジメチルスルファイド 220ml、
及びp-チオクレゾール 8.6ｇを加え、さらに無水フッ化
水素 85mlを加えて０℃で２時間撹拌した。無水フッ化
水素を減圧下留去後、再度無水フッ化水素 700mlを加え
て０℃で１時間撹拌した。反応後、無水フッ化水素を減
圧下留去、残渣をエ−テルで洗浄し、これに 10％酢酸
250mlを加えてペプチドを抽出した。

【００５０】抽出液から、実施例１−１と同様の方法で
精製ペプチド 610mgを得た。また、上記精製ペプチドに
ついて、高速液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）の保
持時間の測定、旋光度の測定及びアミノ酸分析を行っ
た。その結果を下記に示す。 ・ＨＰＬＣの保持時間：２９．２分 ・［α］_D ：−３５．２° ・アミノ酸分析 Asp(4) 3.93, Thr(3) 2.64, Ser(4) 2.90, Glu(3) 3.0
2, Gly(1) 1.08, Ala(1) 1.00, Val(1) 1.01, Met(1)
0.97, Leu(2) 2.05, Tyr(2) 1.92, Phe(2) 1.93,His(1)
1.07, Lys(1) 0.99, Arg(2) 1.94 〔実施例２〕方法２によるグルカゴンの固相合成 まず、ＢＨＡ樹脂（ペプチド研究所社製、アミノ基含有
量0.36 mmol/g、ベンズヒドリルアミン樹脂）２０ｇ
を、ＤＣＭ 200ml（２回）、10％ＴＥＡ含有ＤＣＭ 200
ml（２回）、ＭｅＯＨ 200ml（２回）、ＤＣＭ 200ml
（２回）の順に攪拌下で処理し、また、各処理毎に濾過
を行った。

【００５１】上記のような処理を行った樹脂に、アミノ
酸順序27〜29位のアミノ酸残基に相当する下記式： Ｂoc−Ｍet−Ａsp−Ｔhr（Ｂzl）−ＯＢzl で表されるトリペプチド 15mmol 、ＨＯＢｔ 15mmol 、
ＤＣＭ 100ml及びＤＭＦ20mlを加えて攪拌し、さらにＤ
ＣＣ（１Ｍ−ＤＣＭ溶液）15mlを加えて２時間反応させ
た。その後、反応混合液を濾過し、ＭｅＯＨ 200ml（２
回）、ＤＣＭ 200ml（２回）の順に攪拌下で処理し、ま
た、各処理毎に濾過を行った。このようにして、Ｂoc−
Ｍet−Ａsp−Ｔhr（Ｂzl）−ＯＢzl−ＢＨＡ樹脂を得
た。

【００５２】26位のアミノ酸残基からは、実施例１−１
と同様の方法で１位のアミノ酸残基まで１個ずつアミノ
酸残基を延長し、Ｈ−Ｈis(Ｂom）−Ｓer(Ｂzl）−Ｇln
−Ｇly−Ｔhr（Ｂzl）−Ｐhe−Ｔhr（Ｂzl）−Ｓer（Ｂ
zl）−Ａsp（ＯcＨｅx）−Ｔyr（Ｂr-Ｚ）−Ｓer(Ｂz
l）−Ｌys(Ｃl-Ｚ）−Ｔyr(Ｂr-Ｚ）−Ｌeu−Ａsp（Ｏc
Ｈｅx）−Ｓer（Ｂzl）−Ａrg（Ｔos）−Ａrg（Ｔos）
−Ａla−Ｇln−Ａsp（ＯcＨｅx）−Ｐhe−Ｖal-Ｇln−
Ｔrp−Ｌeu−Ｍet−Ａsp−Ｔhr（Ｂzl）−ＯＢzl−ＢＨ
Ａ樹脂 50.93gを得た。

【００５３】得られた保護ペプチド−ＢＨＡ樹脂から、
実施例１−１と同様の方法でペプチドの抽出及び精製を
行って、精製グルカゴン0.89gを得た。尚、上記で用い
たBoc-Met-Asp-Thr(Bzl)-OBzl は下記(1) 及び(2) の操
作によって製造した。 (1) Boc-Asp(OBut)-Thr(Bzl)-OBzl の合成 H-Thr(Bzl)-OBzl・1/2(COOH)₂ 6.89g(0.02mol)をTHF 10
0ml-DMF 100mlに溶解し、0℃で、Ｎ−メチルモルフォリ
ンを加えて中和した。

【００５４】Boc-Asp(OBut)-OH 5.79g(0.02mol) をTHF
100mlに溶解し、ドライアイス−エタノ−ルで-20℃に冷
却し、Ｎ−メチルモルフォリン 2.2ml(0.02mol)を滴下
した後クロロギ酸イソブチル 2.64ml(0.02mol)を滴下
し、-20℃で1分間撹拌して、混合酸無水物の溶液を調製
した。この溶液を前記の溶液に加え、0℃で5分間、室温
で30分間撹拌した後、減圧濃縮した。残渣に酢酸エチル
を加え、有機層を1N-HClで2回、飽和食塩水で1回、飽和
炭酸水素ナトリウム水溶液で2回、飽和食塩水で2回の順
で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮した。そ
の後、シリカゲルクロマトグラフィー｛ワコーゲルC-10
0(3x24cm) 、展開溶媒：酢酸エチル／ヘキサン(1/4)｝
にて精製を行った。目的物の溶出画分を集め減圧濃縮
し、真空乾燥を行って、油状物 8.95g(収率78%)を得
た。この油状物のＴＬＣのRf (BuOH/AcOH/H₂O=4/1/5)
は0.92であった。このようにしてBoc-Asp(OBut)-Thr(Bz
l)-OBzl を合成した。 (2) Boc-Met-Asp-Thr(Bzl)-OBzl の合成 上記(1) で得られたBoc-Asp(OBut)-Thr(Bzl)-OBzl(油状
物) 8.95g(15.68mmol)を、DCM 8mlに溶解した。次いで0
℃でTFA 10mlを添加し、室温で30分間撹拌した後、エー
テル-ヘキサン(1:1)を加えた。生じた沈殿物を濾取、真
空乾燥することにより、粉末状のH-Asp-Thr(Bzl)-OBzlH
・TFAを得た。得られた粉末をTHF 100mlに溶解し、0℃
でＮ−メチルモルフォリンを加えて中和した。

【００５５】Boc-Met-OH 3.91g(15.68mmol) をTHF50ml
に溶解し、ドライアイス−エタノ−ルで-20℃に冷却
し、Ｎ−メチルモルフォリン 1.8ml(15.68mmol)を滴下
した後クロロギ酸イソブチル2.07ml(15.68mmol) を滴下
して、-20℃で1分間撹拌して混合酸無水物の溶液を調製
した。この溶液を前記の溶液に加え、0℃で5分間、室温
で30分間撹拌した後、減圧濃縮した。残渣に酢酸エチル
を加え、有機層を1N-HClで2回、飽和食塩水で2回の順で
洗浄し、減圧濃縮した。その後真空乾燥を行って、油状
物 9.69g(収率95%)を得た。この油状物のＴＬＣのRf値
(BuOH/AcOH/H₂O=4/1/5) は 0.85 であった。このように
してBoc-Met-Asp-Thr(Bzl)-OBzl を合成した。 〔実施例３〕方法２によるグルカゴンの固相合成 実施例１−１において得られる中間体 Ｈ−Ｌeu−Ｍet
−Ａsn−Ｔhr（Ｂzl）−ＰＡＭ樹脂 1.48gに、グルカゴ
ンのアミノ酸配列の19〜25位のアミノ酸残基に相当する
下記式： Ｂoc−Ａla−Ｇln−Ａsp（ＯＢzl）−Ｐhe−Ｖal−Ｇln
−Ｔrp−ＯＨ で表されるヘプタペプチド 15mmol 、ＨＯＢｔ 15mmol
、ＤＣＭ 100ml及びＤＭＦ 20mlを加えて攪拌し、さら
にＤＣＣ（１Ｍ−ＤＣＭ溶液）15mlを加えて２時間反応
させた。反応後、混合液を濾過し、ＭｅＯＨ 200ml（２
回）、ＤＣＭ 200ml（２回）の順に攪拌下で処理し、ま
た、各処理毎に濾過を行った。このようにして、Ｂoc−
Ａla−Ｇln−Ａsp（ＯcＨｅx）−Ｐhe−Ｖal-Ｇln−Ｔr
p−Ｌeu−Ｍet−Ａsn−Ｔhr（Ｂzl ）−ＰＡＭ樹脂を得
た。

【００５６】上記樹脂に、実施例１−１の方法と同様に
して18位から１位までアミノ酸残基を順次１個ずつ結合
して延長し、Ｈ−Ｈis(Ｂom）−Ｓer(Ｂzl ）−Ｇln−
Ｇly−Ｔhr（Ｂzl ）−Ｐhe−Ｔhr（Ｂzl ）−Ｓer（Ｂ
zl ）−Ａsp（ＯcＨｅx）−Ｔyr（Ｂr-Ｚ）−Ｓer(Ｂzl
）−Ｌys(Ｃl-Ｚ）−Ｔyr(Ｂr-Ｚ）−Ｌeu−Ａsp（Ｏc
Ｈｅx）−Ｓer（Ｂzl ）−Ａrg（Ｔos）−Ａrg（Ｔos）
−Ａla−Ｇln−Ａsp（ＯＢzl）−Ｐhe−Ｖal-Ｇln−Ｔr
p−Ｌeu−Ｍet−Ａsn−Ｔhr（Ｂzl ）−ＰＡＭ樹脂50g
を得た。

【００５７】得られた保護ペプチド−ＰＡＭ樹脂から、
実施例１−１と同様の方法でペプチドの抽出及び精製を
行って、精製グルカゴン0.89gを得た。尚、上記で用い
たBoc-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-OH は下記
(1) 〜(6) の操作によって製造した。 (1) Boc-Gln-Trp-OH の合成 H-Trp-OH 24.50g(0.12mmol)を水 200ml-DMF 100mlに溶
解し、0℃でＮ−メチルモルフォリン 13.2ml(0.12mol)
を加えて中和した。この溶液を、Boc-Gln-ONp36.73g(0.
1mol) のDMF溶液 200mlと混合し、最終液量を水 200ml-
DMF 500mlに調製した。次いで0℃で1時間、室温で一晩
撹拌した後減圧濃縮した。残渣に酢酸エチル、及び1N-H
Clを加えて水層を分離した後、有機層の沈殿物を濾取
し、エーテルで洗浄した。得られた粉末を90％MeOH−水
に溶解し、この溶液を陽イオン交換樹脂(AG 50W-x8)を
充填したカラムに通し、目的物の溶出画分を集め、減圧
濃縮した。残渣にエーテルを加えた後、生じた沈殿物を
濾取して真空乾燥を行って、Boc-Gln-Trp-OH 31.05g(
収率 72%)を得た。

【００５８】得られたBoc-Gln-Trp-OH の融点、旋光
度、ＴＬＣのRf及び元素分析値を下記に示す。 m.p. ：170.3 〜173.3℃ [α] _D ：＋1.4920°(c=1.0, メタノール) Rf ：0.81 (BuOH/AcOH/H₂O=4/1/5) 元素分析値 Ｃ₂₁Ｈ₂₈Ｎ₄Ｏ₆ 理論値 Ｃ:58.32% Ｈ:6.53% Ｎ:12.95% 測定値 Ｃ:58.40% Ｈ:6.48% Ｎ:12.78% (2) Boc-Val-Gln-Trp-OH の合成 上記(1) で得られたBoc-Gln-Trp-OH 31.05g(71.8mmol)
とエタンジチオール 3mlを0℃でTFA50ml に溶解し、室
温で30分間撹拌後、エーテル−ヘキサン(1:1)を加え、
生じた沈殿物を濾取、真空乾燥して、粉末状のH-Gln-Tr
p-OH・TFAを得た。得られた粉末をDMF300ml に溶解し、
0℃でＮ−メチルモルフォリンを加えて中和した。

【００５９】Boc-Val-OH 15.6g(71.8mmol)をDMF 150ml
に溶解し、ドライアイス−エタノールで-20℃に冷却
し、Ｎ−メチルモルフォリン 7.9ml(71.8mmol)を滴下
し、次いでクロロギ酸イソブチル 9.5ml(71.8mmol)を滴
下して、-20℃で1分間撹拌して混合酸無水物の溶液を調
製した。この溶液を前記の溶液に加えて0℃で5分間、室
温で30分間撹拌した後、減圧濃縮した。残渣に1N-HClを
加えて、生じた沈殿物を濾取して、水で洗浄した。得ら
れた粉末をDMF-エーテル-ヘキサンで再沈殿後、真空乾
燥を行い、Boc-Val-Gln-Trp-OH 29.71g(収率 78%)を得
た。

【００６０】得られたBoc-Val-Gln-Trp-OH の融点、旋
光度、ＴＬＣのRf及び元素分析値を下記に示す。 m.p. ：171.2〜175.9℃ [α] _D ：＋0.6754°(c=0.5, DMSO) Rf ：0.72 (BuOH/AcOH/H₂O=4/1/5) 元素分析値 Ｃ₂₆Ｈ₃₇Ｎ₅Ｏ₇ 理論値 Ｃ:58.74% Ｈ:7.02% Ｎ:13.17% 測定値 Ｃ:58.53% Ｈ:7.37% Ｎ:12.99% (3) Boc-Phe-Val-Gln-Trp-OH の合成 上記(2) で得られたBoc-Val-Gln-Trp-OH 29.71g(55.9mm
ol)とエタンジチオール 3mlを0℃でTFA50ml に溶解し、
室温で30分間撹拌した。次いでエーテルを加えて、生じ
た沈殿物を濾取、真空乾燥して、粉末状のH-Val-Gln-Tr
p-OH・TFAを得た。得られた粉末をDMF 200mlに溶解し、
0℃でＮ−メチルモルフォリンを加えて中和した。

【００６１】Boc-Phe-OH 14.9g(55.9mmol)をDMF 150ml
に溶解し、ドライアイス−エタノールで-20℃に冷却
し、Ｎ−メチルモルフォリン 6.2ml(55.9mmol)を滴下
し、ついでクロロギ酸イソブチル 7.4ml(55.9mmol)を滴
下し、-20℃で1分間撹拌して混合酸無水物の溶液を調製
した。この溶液を前記の溶液に加えて、0℃で5分間、室
温で30分間撹拌した後、減圧濃縮した。残渣に1N-HClを
加えて、生じた沈殿物を濾取して、水で洗浄した。得ら
れた粉末をDMF-エーテルで再沈殿後、真空乾燥を行っ
て、Boc-Phe-Val-Gln-Trp-OH 30.04g(収率 79%)を得
た。

【００６２】得られたBoc-Phe-Val-Gln-Trp-OH の融
点、旋光度、ＴＬＣのRf及び元素分析値を下記に示す。 m.p. ：145.7〜148.4℃（分解） [α] _D ：＋4.2208°(c=1.0, DMSO) Rf ：0.74 (BuOH/AcOH/H₂O=4/1/5) 元素分析値 Ｃ₃₅Ｈ₄₆Ｎ₆Ｏ₈ 理論値 Ｃ:61.93% Ｈ:6.83% Ｎ:12.38% 測定値 Ｃ:61.52% Ｈ:7.30% Ｎ:12.45% (4) Boc-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-OH の合成 上記(3) で得られたBoc-Phe-Val-Gln-Trp-OH 29.95g(4
4.1mmol)とエタンジチオール 3mlを0℃でTFA 50mlに溶
解し、室温で30分間撹拌後、エーテルを加えて生じた沈
殿物を濾取、真空乾燥し、粉末状のH-Phe-Val-Gln-Trp-
OH・TFAを得た。得られた粉末をDMF200ml に溶解し、0
℃でＮ−メチルモルフォリンを加えて中和した。

【００６３】Boc-Asp(OBzl)-OH 14.3g(44.1mmol)をDMF
150mlに溶解し、ドライアイス−エタノールで-20℃に冷
却し、Ｎ−メチルモルフォリン 4.9ml(44.1mmol)を滴下
した後クロロギ酸イソブチル 5.9ml(44.1mmol)を滴下
し、-20℃で1分間撹拌して混合酸無水物の溶液を調製し
た。この溶液を前記の溶液に加え0℃で5分間、室温で30
分間撹拌した後、減圧濃縮した。残渣に1N-HClを加え
て、生じた沈殿物を濾取して、水で洗浄した。得られた
粉末をDMF-エーテルで再沈殿後、真空乾燥を行って、Bo
c-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-OH 32.55g(収率 79%)を
得た。

【００６４】得られたBoc-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-
OH の融点、旋光度、ＴＬＣのRf及び元素分析値を下記
に示す。 m.p. ：178.6〜182.0℃（分解） [α] _D ：−9.5106°(c=0.5, DMSO) Rf ：0.86 (BuOH/AcOH/H₂O=4/1/5) 元素分析値 Ｃ₄₆Ｈ₅₇Ｎ₇Ｏ₁₁ 理論値 Ｃ:62.50% Ｈ:6.50% Ｎ:11.09% 測定値 Ｃ:62.11% Ｈ:7.93% Ｎ:11.02% (5) Boc-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-OH の合成 上記(4) で得られたBoc-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-OH
33.40g(37.8mmol)とエタンジチオール 3mlを0℃でTFA
50mlに溶解し、室温で30分間撹拌後、エーテルを加え
て、生じた沈殿物を濾取、真空乾燥し、粉末状のH-Asp
(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-OH・TFAを得た。得られた粉末
をDMF 200mlに溶解し、0℃でＮ−メチルモルフォリンを
加えて中和した。

【００６５】この溶液と、Boc-Gln-ONp 13.9g(37.8mmo
l)のDMF溶液 100mlを混合し、0℃で1時間、室温で一晩
撹拌した後、減圧濃縮した。残渣に1N-HClを加えて、生
じた沈殿物を濾取して、水で洗浄した。得られた粉末を
DMF-エーテルで再沈殿後、真空乾燥を行って、Boc-Gln-
Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-OH 31.70g(収率 83%)を得
た。

【００６６】得られたBoc-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-
Trp-OH の融点、旋光度、ＴＬＣのRf及び元素分析値を
下記に示す。 m.p. ：165.5〜168.6℃（分解） [α] _D ：−10.967°(c=1.0, DMSO) Rf ：0.79 (BuOH/AcOH/H₂O=4/1/5) 元素分析値 Ｃ₅₁Ｈ₆₅Ｎ₉Ｏ₁₃ 理論値 Ｃ:60.52% Ｈ:6.47% Ｎ:12.45% 測定値 Ｃ:60.20% Ｈ:6.80% Ｎ:11.90% (6) Boc-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-OH の合
成 上記(5) で得られたBoc-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Tr
p-OH 31.70g(31.3mmol)とエタンジチオール 3mlを0℃で
TFA 50mlに溶解し、室温で30分間撹拌後、エーテルを加
えて生じた沈殿物を濾取、真空乾燥し、粉末状のH-Gln-
Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-OH・TFAを得た。得られた
粉末をDMF 200mlに溶解し、0℃でＮ−メチルモルフォリ
ンを加えて中和した。

【００６７】Boc-Ala-OH 5.92g(31.3mmol)をDMF 150ml
に溶解し、ドライアイス−エタノールで-20℃に冷却
し、Ｎ−メチルモルフォリン 3.4ml(31.3mmol)を滴下し
た後クロロギ酸イソブチル 4.1ml(31.3mmol)を滴下し
て、-20℃で1分間撹拌して混合酸無水物の溶液を調製し
た。この溶液を前記の溶液に加え0℃で5分間、室温で30
分間撹拌した後、減圧濃縮した。残渣に1N-HClを加え
て、生じた沈殿物を濾取して、水で洗浄した。得られた
粉末をDMF-酢酸エチルで再沈殿、エーテルで洗浄後、真
空乾燥を行って、Boc-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-
Trp-OH 24.59g(収率73%)を得た。

【００６８】得られたBoc-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-
Trp-OH の融点、旋光度、ＴＬＣのRf及び元素分析値を
下記に示す。 m.p. ：190.33〜194.37℃（分解） [α] _D ：−15.652°(c=1.0, DMSO) Rf ：0.82 (BuOH/AcOH/H₂O=4/1/5) 元素分析値 Ｃ₅₄Ｈ₇₀Ｎ₁₀Ｏ₁₄ 理論値 Ｃ:59.88% Ｈ:6.51% Ｎ:12.93% 測定値 Ｃ:59.40% Ｈ:6.71% Ｎ:12.19% 〔実施例４〕方法２によるグルカゴンの固相合成 実施例１−１において得られた中間体 Ｈ−Ｌeu−Ｍet
−Ａsn−Ｔhr（Ｂzl）−ＰＡＭ樹脂 1.48gに、アミノ酸
配列の17〜25位のアミノ酸残基に相当する下記式： Ｂoc−Ａrg（Ｔｏｓ）−Ａrg（Ｔｏｓ）−Ａla−Ｇln−
Ａsp（ＯＢzl）−Ｐhe−Ｖal−Ｇln−Ｔrp−ＯＨ で表されるノナペプチド 15mmol 、ＨＯＢｔ 15mmol 、
ＤＣＭ 100ml及びＤＭＦ20mlを加えて攪拌し、さらにＤ
ＣＣ（１Ｍ−ＤＣＭ溶液）15mlを加えて２時間反応させ
た。反応後、反応混合液を濾過し、ＭｅＯＨ 200ml（２
回）、ＤＣＭ 200ml（２回）の順に攪拌下で処理した。
尚、各処理毎に濾過を行った。このようにして、Ｂoc−
Ａrg（Ｔｏｓ）−Ａrg（Ｔｏｓ）−Ａla−Ｇln−Ａsp
（ＯcＨｅx）−Ｐhe−Ｖal-Ｇln−Ｔrp−Ｌeu−Ｍet−
Ａsn−Ｔhr（Ｂzl）−ＰＡＭ樹脂を得た。

【００６９】上記樹脂に、実施例１−１の方法と同様に
して16位から１位までアミノ酸残基を順次１個ずつ結合
して延長し、Ｈ−Ｈis(Ｂom）−Ｓer(Ｂzl）−Ｇln−Ｇ
ly−Ｔhr（Ｂzl）−Ｐhe−Ｔhr（Ｂzl）−Ｓer（Ｂzl）
−Ａsp（ＯcＨｅx）−Ｔyr（Ｂr-Ｚ）−Ｓer(Ｂzl）−
Ｌys(Ｃl-Ｚ）−Ｔyr(Ｂr-Ｚ）−Ｌeu−Ａsp（ＯcＨｅ
x）−Ｓer（Ｂzl）−Ａrg（Ｔos）−Ａrg（Ｔos）−Ａl
a−Ｇln−Ａsp（ＯＢzl）−Ｐhe−Ｖal-Ｇln−Ｔrp−Ｌ
eu−Ｍet−Ａsn−Ｔhr（Ｂzl）−ＰＡＭ樹脂50gを得
た。

【００７０】得られた保護ペプチド−ＰＡＭ樹脂から、
実施例１−１と同様の方法でペプチドの抽出及び精製を
行って、精製グルカゴン0.89gを得た。尚、上記で用い
たBoc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-
Gln-Trp-OH は下記(1) 及び(2) の操作によって製造し
た。 (1) Boc-Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp
-OH の合成 上記実施例３の(6) で得られたBoc-Ala-Gln-Asp(OBzl)-
Phe-Val-Gln-Trp-OH 24.59g(22.7mmol)とエタンジチオ
ール 3mlを0℃でTFA 50mlに溶解し、室温で30分間撹拌
後、エーテルを加えて、生じた沈殿物を濾取、真空乾燥
し、粉末状のH-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-OH
・TFAを得た。得られた粉末をDMF 200mlに溶解し、0℃
でＮ−メチルモルフォリンを加えて中和した。

【００７１】Boc-Arg(Tos)-OH 9.80g(22.7mmol)をDMF 1
50mlに溶解し、ドライアイス−エタノールで-20℃に冷
却し、Ｎ−メチルモルフォリン 2.5ml(22.7mmol)を滴下
した後クロロギ酸イソブチル 3.0ml(22.7mmol)を滴下し
て、-20℃で1分間撹拌し、混合酸無水物の溶液を調製し
た。この溶液を前記の溶液に加えて、0℃で5分間、室温
で30分間撹拌した後、減圧濃縮した。残渣に1N-HClを加
えて、生じた沈殿物を濾取して、水で洗浄した。得られ
た粉末をDMF-酢酸エチルで再沈殿させ、沈殿物を濾取し
てエーテルで洗浄後、真空乾燥を行って、Boc-Arg(Tos)
-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-OH 24.11g(収率
76%)を得た。

【００７２】得られたBoc-Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(OBzl)
-Phe-Val-Gln-Trp-OH の融点、旋光度、ＴＬＣのRf及び
元素分析値を下記に示す。 m.p. ：194.2 〜197.6 ℃（分解） [α] _D ：−7.8009°(c=1.0, DMSO) Rf ：0.77 (BuOH/AcOH/H₂O=4/1/5) 元素分析値 Ｃ₆₇Ｈ₈₈Ｎ₁₄Ｏ₁₇S 理論値 Ｃ:57.75% Ｈ:6.36% Ｎ:14.07% 測定値 Ｃ:57.92% Ｈ:6.66% Ｎ:13.11% (2) Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Va
l-Gln-Trp-OH の合成 上記(1) で得られたBoc-Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(OBzl)-P
he-Val-Gln-Trp-OH 24.11g(17.3mmol)とエタンジチオー
ル 3mlを0℃でTFA 50mlに溶解し、室温で30分間撹拌
後、エーテルを加えて、生じた沈殿物を濾取、真空乾燥
し、粉末状のH-Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-G
ln-Trp-OH・TFAを得た。得られた粉末をDMF 200mlに溶
解し、0℃でＮ−メチルモルフォリンを加えて中和し
た。

【００７３】Boc-Arg(Tos)-OH 7.41g(17.3mmol)をDMF 1
50mlに溶解し、ドライアイス−エタノールで-20℃に冷
却し、Ｎ−メチルモルフォリン 1.9ml(17.3mmol)を滴下
した後クロロギ酸イソブチル 2.3ml(17.3mmol)を滴下し
て、-20℃で1分間撹拌し、混合酸無水物の溶液を調製し
た。この溶液を前記の溶液に加えて、0℃で5分間、室温
で30分間撹拌した後、減圧濃縮した。残渣に1N-HClを加
えて、生じた沈殿物を濾取して、水で洗浄した。得られ
た粉末をDMF-酢酸エチルで再沈殿させ、沈殿物をエーテ
ルで洗浄後、真空乾燥を行って、Boc-Arg(Tos)-Arg(To
s)-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-OH 24.70g( 収
率 84%)を得た。

【００７４】得られたBoc-Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(OBzl)
-Phe-Val-Gln-Trp-OH の融点、旋光度、ＴＬＣのRf及び
元素分析値を下記に示す。 m.p. ：192.2 〜194.4 ℃（分解） [α] _D ：−8.5057°(c=1.0, DMSO) Rf ：0.81 (BuOH/AcOH/H₂O=4/1/5) 元素分析値 Ｃ₈₀Ｈ₁₀₆Ｎ₁₈Ｏ₂₀S₂ 理論値 Ｃ:56.39% Ｈ:6.36% Ｎ:14.80% 測定値 Ｃ:56.48% Ｈ:6.71% Ｎ:14.15% 〔実施例５〕方法２によるグルカゴンの固相合成 実施例１−１において得られた中間体 Ｈ−Ｔrp−Ｌeu
−Ｍet−Ａsn−Ｔhr（Ｂzl）−ＰＡＭ樹脂 1.48gに、グ
ルカゴンのアミノ酸配列の19〜24位のアミノ酸残基に相
当する下記式： Ｂoc−Ａla−Ｇln−Ａsp（ＯＢzl）−Ｐhe−Ｖal−Ｇln
−ＯＨ で表されるヘキサペプチド 15mmol 、ＨＯＢｔ 15mmol
、ＤＣＭ 100ml及びＤＭＦ 20mlを加えて攪拌し、さら
にＤＣＣ（１Ｍ−ＤＣＭ溶液）15mlを加えて２時間反応
させた。反応後、反応混合液を濾過して、ＭｅＯＨ 200
ml（２回）、ＤＣＭ 200ml（２回）の順に攪拌下で処理
した。尚、各処理毎に濾過を行った。このようにして、
Ｂoc−Ａla−Ｇln−Ａsp（ＯcＨｅx）−Ｐhe−Ｖal-Ｇl
n−Ｔrp−Ｌeu−Ｍet−Ａsn−Ｔhr（Ｂzl ）−ＰＡＭ樹
脂を得た。

【００７５】上記樹脂に、実施例１−１の方法と同様に
して18位から１位までアミノ酸残基を順次１個ずつ結合
して延長し、Ｈ−Ｈis(Ｂom）−Ｓer(Ｂzl）−Ｇln−Ｇ
ly−Ｔhr（Ｂzl）−Ｐhe−Ｔhr（Ｂzl）−Ｓer（Ｂzl）
−Ａsp（ＯcＨｅx）−Ｔyr（Ｂr-Ｚ）−Ｓer(Ｂzl）−
Ｌys(Ｃl-Ｚ）−Ｔyr(Ｂr-Ｚ）−Ｌeu−Ａsp（ＯcＨｅ
x）−Ｓer（Ｂzl）−Ａrg（Ｔos）−Ａrg（Ｔos）−Ａl
a−Ｇln−Ａsp（ＯＢzl）−Ｐhe−Ｖal-Ｇln−Ｔrp−Ｌ
eu−Ｍet−Ａsn−Ｔhr（Ｂzl）−ＰＡＭ樹脂50gを得
た。

【００７６】得られた保護ペプチド−ＰＡＭ樹脂から、
実施例１−１と同様の方法でペプチドの抽出及び精製を
行って、精製グルカゴン0.89gを得た。尚、上記で用い
たBoc-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-OH は下記(1)
〜(5)の操作によって製造した。 (1) Z-Val-Gln-OH の合成 Z-Val-OH 25.13g(0.1mol) をTHF 200mlに溶解し、ドラ
イアイス−エタノールで-20℃に冷却し、Ｎ−メチルモ
ルフォリン 11ml(0.1mol)を滴下した後、クロロギ酸イ
ソブチル13.2ml(0.1mol) を滴下して、-20℃で1分間攪
拌して混合酸無水物の溶液を調製した。さらに、NHS 1
2.08g(0.105mol)のTHF溶液 150mlと混合し、室温で30分
間攪拌した。得られた反応混合液を、Ｎ−メチルモルフ
ォリン 33ml(0.3mol)で中和したH-Gln-OH 21.92g(0.15m
ol)の水溶液 500mlと混合し、室温で一晩撹拌して、THF
を留去した。エーテル、酢酸エチルの順で洗浄後、1N-H
ClでpH3に調製し、残渣に酢酸エチルを加え、1N-HClで1
回、水で2回の順で洗浄した。有機層を減圧濃縮し、残
渣にエーテルを加えて、生じた沈殿物を濾取し、真空乾
燥を行って、Z-Val-Gln-OH 21.63g(収率 57％)を得
た。

【００７７】得られたZ-Val-Gln-OH の融点、旋光度、
ＴＬＣのRf及び元素分析値を下記に示す。 m.p. ：187.9 〜190.03℃ [α] _D ：+0.9341°(c=1.0, DMF) Rf ：0.68 (BuOH/AcOH/H₂O=4/1/5) 元素分析値 Ｃ₁₈Ｈ₂₅Ｎ₃Ｏ₆ 理論値 Ｃ:56.98% Ｈ:6.64% Ｎ:11.08% 測定値 Ｃ:56.80% Ｈ:7.04% Ｎ:10.92% (2) Z-Phe-Val-Gln-OH の合成 上記(1) で得られたZ-Val-Gln-OH 8.47g(22.3mmol) を
メタノール100ml-50%酢酸300mlの混合溶液に溶解し、Pd
-C 1.2gを加え、窒素ガスを通した後、空気を置換して
水素ガスを導入し、接触還元を行った。これを室温で5.
5時間撹拌し、濾過、減圧濃縮後、残渣にエーテルを加
えて、生じた沈殿物を濾取し、真空乾燥を行って、粉末
状のH-Val-Gln-OH・AcOHを得た。得られた粉末を水 200
mlに溶解し、0℃でＮ−メチルモルフォリンを加えて中
和した。

【００７８】Z-Phe-OH 10.01g(33.45mmol)をTHF 100ml
に溶解し、ドライアイス−エタノールで-20℃に冷却
し、Ｎ−メチルモルフォリン 3.7ml(33.45mmol)を滴下
した後クロロギ酸イソブチル 4.4ml(33.45mmol)を滴下
して、-20℃で1分間撹拌して混合酸無水物の溶液を調製
した。これを、NHS 4.23g(36.80mmol)のTHF溶液 50mlと
混合し、室温で30分間攪拌した。この溶液を、前記の水
溶液と混合し、室温で一晩撹拌し、THFを留去した。残
渣をエーテルで2回洗浄した後、1N-HClでpH3に調製し
た。生じた沈殿物を濾取し、水で洗浄した。濾取物をDM
F−エーテルで再沈殿させ、真空乾燥を行って、Z-Phe-V
al-Gln-OH 8.22g(収率 70%)を得た。

【００７９】得られたZ-Val-Gln-OH の融点、旋光度、
ＴＬＣのRf及び元素分析値を下記に示す。 m.p. ：231.7 〜233.5 ℃ [α] _D ：-24.222°(c=1.0, メタノール) Rf ：0.73 (BuOH/AcOH/H₂O=4/1/5) 元素分析値 Ｃ₂₇Ｈ₃₄Ｎ₄Ｏ₇ 理論値 Ｃ:61.58% Ｈ:6.51% Ｎ:10.64% 測定値 Ｃ:61.45% Ｈ:6.78% Ｎ: 9.96% (3) Boc-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-OH の合成 上記(2) で得られたZ-Phe-Val-Gln-OH 5.39g(10.2mmol)
をメタノール100ml-50%酢酸150mlの混合溶液に溶解
し、Pd-C 0.15gを加え、窒素ガスを通して空気を置換し
た後、水素ガスを導入し接触還元を行った。これを室温
で一晩撹拌し、濾過、減圧濃縮後、残渣にエーテルを加
えて。生じた沈殿物を濾取し、真空乾燥を行って、粉末
状のH-Phe-Val-Gln-OH・AcOHを得た。得られた粉末をDM
F100ml- 水300mlの混合溶媒に溶解し、0℃でＮ−メチル
モルフォリンを加えて中和した。

【００８０】Boc-Asp(OBzl)-OH 4.0g(12.24mmol)をDMF
50mlに溶解し、ドライアイス−エタノ−ルで-20℃に冷
却し、Ｎ−メチルモルフォリン 1.35ml(12.24mmol)を滴
下した後クロロギ酸イソブチル 1.6ml(12.24mmol)を滴
下して、-20℃で1分間撹拌して混合酸無水物の溶液を調
製した。この溶液を、NHS 2.1g(18.36mmol)のDMF溶液50
mlと混合し、室温で30分間攪拌した。得られた混合溶液
を、前記のH-Phe-Val-Gln-OH・AcOHの溶液と混合し、室
温で一晩撹拌した後減圧濃縮した。残渣に1N-HClを加え
て、生じた沈殿物を濾取して水で洗浄し、濾取物をDMF
−エーテルで再沈殿させ、真空乾燥を行った。さらに、
1N-HClで3回、水で1回の順で洗浄し、濾取物をメタノー
ル−エーテルで再沈殿させ、真空乾燥を行って、Boc-As
p(OBzl)-Phe-Val-Gln-OH 5.55g(収率 78%)を得た。

【００８１】得られたBoc-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-OH
の融点、旋光度、ＴＬＣのRf及び元素分析値を下記に示
す。 m.p. ：189.37 〜190.67℃ [α] _D ：-17.422°(c=1.0, DMF ) Rf ：0.79 (BuOH/AcOH/H₂O=4/1/5) 元素分析値 Ｃ₃₅Ｈ₄₇Ｎ₅Ｏ₁₀ 理論値 Ｃ:60.25% Ｈ:6.79% Ｎ:10.04% 測定値 Ｃ:60.10% Ｈ:6.90% Ｎ:10.23% (4) Boc-Ala-Gln-OH の合成 Boc-Ala-OH 18.92g(0.1mol)をTHF 200mlに溶解し、ドラ
イアイス−エタノールで-20℃に冷却し、Ｎ−メチルモ
ルフォリン 11ml(0.1mol)を滴下した後クロロギ酸イソ
ブチル 13.2ml(0.1mol)を滴下して、-20℃で１分間攪拌
して混合酸無水物の溶液を調製した。この溶液をNHS 1
2.08g(0.105mol)のTHF溶液 100mlと混合し、室温で30分
間攪拌した。得られた混合液を、Ｎ−メチルモルフォリ
ン 33ml(0.3mol)で中和したH-Gln-OH 21.92g(0.15mol)
の水溶液500mlと混合し、室温で一晩撹拌した後1N-HCl
でpH3に調製した。水層を酢酸エチルで2回洗浄し、ブタ
ノール抽出後、減圧濃縮して真空乾燥した後、シリカゲ
ルクロマトグラフィー｛ワコーゲルC-100(8×13cm),展
開溶媒:5%メタノール-酢酸エチル｝にて精製を行った。
目的物の溶出画分を集め、減圧濃縮し、残渣にエーテル
を加えて、生じた沈殿物を濾取し、真空乾燥を行って、
Boc-Ala-Gln-OH 22.63g(収率 71%)を得た。

【００８２】得られたBoc-Ala-Gln-OHの融点、旋光度、
ＴＬＣのRf及び元素分析値を下記に示す。 m.p. ：65.53〜68.77℃ [α] _D ：-21.272°(c=1.0, メタノール) Rf ：0.47 (BuOH/AcOH/H₂O=4/1/5) 元素分析値 Ｃ₁₃Ｈ₂₃Ｎ₃Ｏ₆ 理論値 Ｃ:49.20% Ｈ:7.31% Ｎ:13.24% 測定値 Ｃ:49.09% Ｈ:7.34% Ｎ:12.73% (5) Boc-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-OH の合成 上記(3) で得られたBoc-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-OH 4.1
1g(5.89mmol) を、0℃でTFA 10mlに溶解し、室温で30分
間撹拌後、エーテルを加えて、生じた沈殿物を濾取、真
空乾燥して粉末状のH-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-OH・TFA
を得た。得られた粉末をDMF40ml に溶解し、0℃で、Ｎ
−メチルモルフォリンを加えて中和した。

【００８３】上記(4) で得られたBoc-Ala-Gln-OH 2.8g
(8.84mmol)をDMF 40mlに溶解し、ドライアイス−エタノ
−ルで-20℃に冷却し、Ｎ−メチルモルフォリン 0.98ml
(8.84mmol)を滴下した後クロロギ酸イソブチル 1.17ml
(8.84mmol)を滴下して、-20℃で1分間撹拌して、混合酸
無水物の溶液を調製した。この溶液を前記の溶液に加え
て、0℃で5分間、室温で30分間撹拌した後、減圧濃縮し
た。残渣に1N-HClを加えて、生じた沈殿物を濾取して、
水で洗浄した。得られた粉末をDMF−酢酸エチルで再沈
殿させ、エーテルで洗浄後、真空乾燥を行って、Boc-Al
a-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-OH 5.13g( 収率 97%)を
得た。

【００８４】得られたBoc-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-
Gln-OHの融点、旋光度、ＴＬＣのRf及び元素分析値を下
記に示す。 m.p. ：230.0 〜235.0℃(分解) [α] _D ：-10.799°(c=0.5, DMF） Rf ：0.63 (BuOH/AcOH/H₂O=4/1/5) 元素分析値 Ｃ₄₃Ｈ₆₀Ｎ₈Ｏ₁₃ 理論値 Ｃ:57.58% Ｈ:6.74% Ｎ:12.49% 測定値 Ｃ:57.34% Ｈ:6.92% Ｎ:12.70% また、上記(3) で合成したBoc-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-
OH は、下記の(6) 〜(8) によっても合成することがで
きる。 (6) Boc-Val-Gln-OH の合成 H-Gln-OH 14.60ｇ(0.1mol)を水 500mlに溶解し、０℃で
Ｎ−メチルモルフォリン22ml(0.2mol)を添加して中和し
た。得られた水溶液をBoc-Val-OSu 15.72ｇ(50mmol)の
THF 溶液 300mlと混合し、最終液量を1500ml(THF：水＝
１：１) に調整した後、室温で一晩攪拌した。THF を留
去後、水層をエーテルで洗浄し、１Ｎ塩酸でpH３に調節
して、酢酸エチル−ブタノール(2:1) で抽出した。有機
層を水で２回洗浄した後、減圧濃縮した。次いで残渣に
エーテルを加えて生じた沈殿物を濾取し、真空乾燥し
た。このようにして、Boc-Val-Gln-OH 11.74ｇ（収率66
％）を得た。

【００８５】得られたBoc-Val-Gln-OH の融点、旋光
度、ＴＬＣのRf及び元素分析値を下記に示す。 m.p. ：88.7〜92.13 ℃ [α] _D ：−19.848°(c=1.0, メタノール) Rf ：0.77 (BuOH/AcOH/H₂O=4/1/5) 元素分析値 Ｃ₁₅Ｈ₂₇Ｎ₃Ｏ₆ 理論値 Ｃ:52.16% Ｈ:7.88% Ｎ:12.17% 測定値 Ｃ:52.09% Ｈ:7.63% Ｎ:11.91% (7) Boc-Phe-Val-Gln-OH の合成 上記(6) で得られたBoc-Val-Gln-OH 10.44g(28.6mmol)
を０℃でTFA 15mlに溶解し、室温で30分間攪拌した。次
いでエーテルを添加し、生じた沈殿物を濾取して、真空
乾燥した。このようにして粉末状のH-Val-Gln-OH・TFA
を得た。得られた粉末を、水 500mlに溶解し、０℃でＮ
−メチルモルフォリンを加えて中和した。

【００８６】上記で得られた水溶液を、Boc-Phe-OSu 2
0.70ｇ（57.2mmol) のTHF 溶液 500mlと混合し、室温で
一晩攪拌した。THF を留去後、水層をエーテルで洗浄
し、１Ｎ塩酸でpH３に調整し、酢酸エチル−ブタノール
(2:1) で抽出した。有機層を水で２回洗浄した後、減圧
濃縮した。残渣にエーテルを加えて生じた沈殿物を濾取
し、真空乾燥を行った。このようにして、Boc-Phe-Val-
Gln-OH 9.93ｇ（収率70％）を得た。

【００８７】得られたBoc-Phe-Val-Gln-OHの融点、旋光
度、ＴＬＣのRf及び元素分析値を下記に示す。 m.p. ：163.0 〜165.5 ℃ [α] _D ：−22.210°(c=1.0, メタノール) Rf ：0.75 (BuOH/AcOH/H₂O=4/1/5) 元素分析値 Ｃ₂₄Ｈ₃₆Ｎ₄Ｏ₇ 理論値 Ｃ:58.52% Ｈ:7.37% Ｎ:11.37% 測定値 Ｃ:58.42% Ｈ:7.29% Ｎ:11.31% (8) Boc-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-OH の合成 上記(7) で得られたBoc-Phe-Val-Gln-OH 8.93ｇ(18.1m
mol)を０℃でTFA 15mlに溶解し、室温で30分間攪拌し
た。次いでエーテルを添加して生じた沈殿物を濾取し、
真空乾燥した。このようにして、粉末状のH-Phe-Val-Gl
n-OH・TFA を得た。得られた粉末をDMF 100 ml−水 300
mlの混合溶媒に溶解し、０℃でＮ−メチルモルフォリン
を加えて中和した。

【００８８】上記で得られた溶液を、Boc-Asp(OBzl)-OS
u 11.4 ｇ（27.2mmol) のDMF 溶液500mlと混合し、室
温で一晩攪拌した。得られた反応混合液を減圧濃縮し
た。残渣に１Ｎ塩酸を添加して、生じた沈殿物を濾取
し、水洗した。更にDMF −エーテルで再沈殿させ、沈殿
物を濾取し、真空乾燥を行った。このようにして、Boc-
Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-OH 9.80 ｇ（収率78％）を得
た。

【００８９】得られたBoc-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-OHの
融点、旋光度、ＴＬＣのRf及び元素分析値を下記に示
す。 m.p. ：181.53 〜184.03℃ [α] _D ：−29.919°(c=1.0, メタノール) Rf ：0.79 (BuOH/AcOH/H₂O=4/1/5) 元素分析値 Ｃ₃₅Ｈ₄₇Ｎ₅Ｏ₁₀ 理論値 Ｃ:60.25% Ｈ:6.79% Ｎ:10.04% 測定値 Ｃ:59.94% Ｈ:6.85% Ｎ:10.37% 〔実施例６〕方法２によるグルカゴンの固相合成 実施例１−１において得られた中間体 Ｈ−Ｔrp−Ｌeu
−Ｍet−Ａsn−Ｔhr（Ｂzl）−ＰＡＭ樹脂 1.48gに、グ
ルカゴンのアミノ酸配列の17〜24位のアミノ酸残基に相
当する下記式： Ｂoc−Ａrg（Ｔｏｓ）−Ａrg（Ｔｏｓ）−Ａla−Ｇln−
Ａsp（ＯＢzl）−Ｐhe−Ｖal−Ｇln−ＯＨ で表されるオクタペプチド 15mmol 、ＨＯＢｔ 15mmol
、ＤＣＭ 100ml及びＤＭＦ 20mlを加えて攪拌し、さら
にＤＣＣ（１Ｍ−ＤＣＭ溶液）15mlを加えて２時間反応
させた。反応後、反応混合液を濾過し、ＭｅＯＨ 200ml
（２回）、ＤＣＭ200ml（２回）の順に攪拌下で処理し
た。尚各処理毎に濾過を行った。このようにして、Ｂoc
−Ａrg（Ｔｏｓ）−Ａrg（Ｔｏｓ）−Ａla−Ｇln−Ａsp
（ＯcＨｅx）−Ｐhe−Ｖal-Ｇln−Ｔrp−Ｌeu−Ｍet−
Ａsn−Ｔhr（Ｂzl）−ＰＡＭ樹脂を得た。

【００９０】上記樹脂に、実施例１−１の方法と同様に
して16位から１位までアミノ酸残基を順次１個ずつ結合
して延長し、Ｈ−Ｈis(Ｂom）−Ｓer(Ｂzl）−Ｇln−Ｇ
ly−Ｔhr（Ｂzl）−Ｐhe−Ｔhr（Ｂzl）−Ｓer（Ｂzl）
−Ａsp（ＯcＨｅx）−Ｔyr（Ｂr-Ｚ）−Ｓer(Ｂzl）−
Ｌys(Ｃl-Ｚ）−Ｔyr(Ｂr-Ｚ）−Ｌeu−Ａsp（ＯcＨｅ
x）−Ｓer（Ｂzl）−Ａrg（Ｔos）−Ａrg（Ｔos）−Ａl
a−Ｇln−Ａsp（ＯＢzl）−Ｐhe−Ｖal-Ｇln−Ｔrp−Ｌ
eu−Ｍet−Ａsn−Ｔhr（Ｂzl）−ＰＡＭ樹脂50gを得
た。

【００９１】得られた保護ペプチド−ＰＡＭ樹脂から、
実施例１−１と同様の方法でペプチドの抽出及び精製を
行って、精製グルカゴン0.89gを得た。尚、上記で用い
たBoc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-
Gln-OHは下記(1) 及び(2) の操作によって製造した。 (1) Boc-Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-OH
の合成 実施例５の(5) で得られたBoc-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-
Val-Gln-OH 5.13g(5.72mmol) を0℃でTFA 10mlに溶解
し、室温で30分間撹拌した後、エーテルを加えて、生じ
た沈殿物を濾取、真空乾燥して粉末状のH-Ala-Gln-Asp
(OBzl)-Phe-Val-Gln-OH・TFAを得た。得られた粉末をDM
F 100mlに溶解し、0℃でＮ−メチルモルフォリンを加え
て中和した。

【００９２】Boc-Arg(Tos)-OH 3.75g(8.84mmol) をDMF4
0mlに溶解し、ドライアイス−エタノ−ルで-20℃に冷却
し、Ｎ−メチルモルフォリン 0.98ml(8.84mmol)を滴下
した後クロロギ酸イソブチル 1.17ml(8.84mmol)を滴下
して、-20℃で1分間撹拌して混合酸無水物の溶液を調製
した。この溶液を前記の溶液に加えて、0℃で5分間、室
温で30分間撹拌した後、減圧濃縮した。残渣に1N-HClを
加えて、生じた沈殿物を濾取して、水で洗浄した。得ら
れた粉末を、DMF−酢酸エチル、さらにDMF−エーテルで
再沈殿させた後、真空乾燥を行って、Boc-Arg(Tos)-Ala
-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-OH 4.89g(収率 69%)を得
た。

【００９３】得られたBoc-Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(OBzl)
-Phe-Val-Gln-OH の融点、旋光度、ＴＬＣのRf及び元素
分析値を下記に示す。 m.p. ：229.9 〜233.2 ℃(分解) [α] _D ：+6.3232°(c=1.0, DMF) Rf ：0.70 (BuOH/AcOH/H₂O=4/1/5) 元素分析値 Ｃ₅₆Ｈ₇₈Ｎ₁₂Ｏ₁₆Ｓ 理論値 Ｃ:55.71% Ｈ:6.51% Ｎ:13.92% 測定値 Ｃ:56.01% Ｈ:6.56% Ｎ:13.22% (2) Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Va
l-Gln-OH の合成 上記(1) で得られたBoc-Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(OBzl)-P
he-Val-Gln-OH 4.89g(4.05mmol)を0℃でTFA 10mlに溶解
し、室温で30分間撹拌した後エーテルを加えて、生じた
沈殿物を濾取、真空乾燥して粉末状のH-Arg(Tos)-Ala-G
ln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-OH・TFAを得た。得られた粉
末をDMF 200mlに溶解し、0℃で、Ｎ−メチルモルフォリ
ンを加えて中和した。

【００９４】Boc-Arg(Tos)-OH 2.61g(6.08mmol) をDMF4
0mlに溶解し、ドライアイス−エタノ−ルで-20℃に冷却
し、Ｎ−メチルモルフォリン 0.67ml(6.08mmol)を滴下
した後クロロギ酸イソブチル 0.802ml(6.08mmol)を滴下
し、-20℃で1分間撹拌して混合酸無水物の溶液を調製し
た。この溶液を前記の溶液に加え、0℃で5分間、室温で
30分間撹拌した後、減圧濃縮した。残渣に1N-HClを加え
て、生じた沈殿物を濾取して、水で洗浄した。得られた
粉末をDMF−エーテルで再沈殿させ沈殿物を濾取して水
で洗浄する操作を3回繰り返した。その後、真空乾燥を
行って、Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Ph
e-Val-Gln-OH 3.60g(収率 59%)を得た。

【００９５】得られたBoc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-Gln-
Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-OH の融点、旋光度、ＴＬＣのR
f及び元素分析値を下記に示す。 m.p. ：242.0 〜245.0 ℃(分解) [α] _D ：-14.551°(c=1.0, DMF) Rf ：0.68 (BuOH/AcOH/H₂O=4/1/5) 元素分析値 Ｃ₆₉Ｈ₉₆Ｎ₁₆Ｏ₁₉Ｓ₂ 理論値 Ｃ:54.60% Ｈ:6.38% Ｎ:14.77% 測定値 Ｃ:54.72% Ｈ:6.48% Ｎ:14.61% 〔実施例７〕方法３によるグルカゴンの合成 (1) グルカゴンのアミノ酸配列の１位から12位のアミノ
酸残基に相当する下記式：Ｆｍｏｃ−Ｈis−Ｓer−Ｇln
−Ｇly−Ｔhr−Ｐhe−Ｔhr−Ｓer−Ａsp−Ｔyr−Ｓer−
Ｌys−ＯＨで表されるペプチドの製造 Ｂｏｃ−Ｌys（Ｃｌ−Ｚ）−ＰＡＭ樹脂（渡辺化学社
製、アミノ基含有量： 0.5mmol/g）1.2ｇに、実施例１
−１の方法と同様にして上記ペプチドのアミノ酸配列に
したがって順次アミノ酸残基をカップリングし、Ｆｍｏ
ｃ−Ｈis（Ｔｏｓ）−Ｓer（Ｂzl）−Ｇln−Ｇly−Ｔhr
（Ｂzl）−Ｐhe−Ｔhr（Ｂzl）−Ｓer−Ａsp（ＯｃＨｅ
ｘ）−Ｔyr（Ｂｒ-Ｚ）−Ｓer（Ｂzl）−Ｌys（Ｃｌ-
Ｚ）−ＰＡＭ樹脂 2.4gを得た。

【００９６】得られた保護ペプチド−ＰＡＭ樹脂 2.4g
にアニソ−ル 3mlを加え、さらに無水フッ化水素25mlを
加え、０℃で１時間撹拌した。反応後、無水フッ化水素
を減圧下留去後、残渣をエ−テルで洗浄し、これに 10%
酢酸 200mlを加えてペプチドを抽出した。抽出液はＯＤ
Ｓ−１０２０ＴＴ（富士デビソン社製）を用いた逆相カ
ラムクロマトグラフィーにより精製し、目的とするペプ
チド 89.7mgを得た。このペプチドについて高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の保持時間の測定、旋光
度の測定及びアミノ酸分析を行った。その結果を下記に
示す。 ・ＨＰＬＣ 分析条件 カラム：TSK GEL ODS-120T（4.6×250mm） 溶 媒：30%アセトニトリル−0.1%ＴＦＡ 流 速：1ml/min 検出波長：２２０ｎｍ ＨＰＬＣの保持時間：９．６分 ・ [α] _D ：−７．５° ・アミノ酸分析 Asp(1) 1.10, Thr(2) 2.04, Ser(3) 2.29, Glu(1) 1.1
3, Gly(1) 1.20,Tyr(1) 0.94, Phe(1) 1.04, Lys(1) 1.
12, His(1) 1.14 (2) グルカゴンのアミノ酸配列の13位から29位のアミノ
酸残基に相当する下記式：Ｈ−Ｔyr−Ｌeu−Ａsp−Ｓer
−Ａrg−Ａrg−Ａla−Ｇln−Ａsp−Ｐhe−Ｖal−Ｇln−
Ｔrp−Ｌeu−Ｍet−Ａsn−Ｔhr−ＯＨで表されるペプチ
ドの製造 実施例１−１において得られる中間体 Ｈ−Ｔyr（Ｂｒ
Ｚ）−Ｌeu−Ａsp(ＯｃＨｅｘ）−Ｓer（Ｂzl）−Ａrg
（Ｔｏｓ）−Ａrg（Ｔｏｓ）−Ａla−Ｇln−Ａsp（Ｏｃ
Ｈｅｘ）−Ｐhe−Ｖal−Ｇln−Ｔrp−Ｌeu−Ｍet−Ａsn
−Ｔhr（Ｂzl）−ＰＡＭ樹脂 1.2gに、アニソ−ル 1ml
及びエタンジチオール 1mlを加え、さらに無水フッ化水
素 10mlを加え、０℃で１時間撹拌した。反応後、無水
フッ化水素を減圧下留去後、残渣をエ−テルで洗浄し、
これに10%酢酸 70mlを加えてペプチドを抽出した。抽出
液を凍結乾燥して 396mgの白色粉末を得た。次に得られ
た粉末を40%酢酸に溶解した後、ＯＤＳ−１０２０ＴＴ
（富士デビソン社製）を用いた逆相カラムクロマトグラ
フィーにより精製し、目的とするペプチド 149mgを得
た。このペプチドについて高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）の保持時間の測定、旋光度の測定及びアミ
ノ酸分析を行った。その結果を下記に示す。 ・ＨＰＬＣ 分析条件 カラム：TSK GEL ODS-120T（4.6×250mm） 溶 媒：36%アセトニトリル−0.1%ＴＦＡ 流 速：1ml/min 検出波長：２２０ｎｍ ＨＰＬＣの保持時間：９．７分 ・ [α] _D ：−２１．２° ・アミノ酸分析 Asp(3) 3.23, Thr(1) 0.85, Ser(1) 0.48, Glu(2) 2.2
2, Ala(1) 1.07,Val(1) 1.07, Met(1) 0.69, Leu(2) 2.
32, Tyr(1) 0.92, Phe(1) 1.11,Arg(2) 2.03 (3) 下記式：Ｆｍｏｃ−Ｈis−Ｓer−Ｇln−Ｇly−Ｔhr
−Ｐhe−Ｔhr−Ｓer−Ａsp−Ｔyr−Ｓer−Ｌys−Ｔyr−
Ｌeu−Ａsp−Ｓer−Ａrg−Ａrg−Ａla−Ｇln−Ａsp−Ｐ
he−Ｖal−Ｇln−Ｔrp−Ｌeu−Ｍet−Ａsn−Ｔhr−ＯＨ
で表される末端アミノ基保護ペプチドの製造 上記(1) で得られたペプチド 89.7mg(56.8μmol)、上記
(2) で得られたペプチド 149mg(69.5μmol)及び 50%Ｄ
ＭＳＯを含む0.2Mトリス緩衝液（ｐＨ 6.5）50mlに、ト
リプシン 50mgを加えて、37℃で 24時間振盪した。氷酢
酸 2mlを加えた後、生成物を濾取して水で洗浄した。次
いで五酸化リン存在下、デシケーター中で減圧乾燥し
た。得られた粉末に 10%酢酸 200mlを加えてペプチドを
抽出した。

【００９７】抽出液をＯＤＳ−１０２０ＴＴ（30×420m
m）カラムを用いた逆相カラムクロマトグラフィーによ
り精製し、目的とするペプチド 12mg（収率 4%）を得
た。このペプチドについて高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）の保持時間の測定、旋光度の測定及びアミ
ノ酸分析を行った。その結果を下記に示す。 ・ＨＰＬＣ 分析条件 カラム：TSK GEL ODS-120T（4.6×250mm） 溶 媒：40%アセトニトリル−0.1%ＴＦＡ 流 速：1ml/min 検出波長：２２０ｎｍ ＨＰＬＣの保持時間：１０．２分 ・ [α] _D ：−３４．２° ・アミノ酸分析 Asp(4) 3.93, Thr(3) 2.63, Ser(4) 2.89, Glu(3) 3.0
0, Gly(1) 1.07,Ala(1) 1.01, Val(1) 1.00, Met(1) 0.
95, Leu(2) 2.06, Tyr(2) 1.92,Phe(2) 1.92, His(1)
1.05, Lys(1) 0.88, Arg(2) 1.94 (4) グルカゴンの製造 上記(3) で得られた末端アミノ基保護ペプチド 12mg
に、氷冷下 10%ジエチルアミン／ＤＭＦ 50mlを加えて
溶解させ、室温で 1.5時間攪拌した。反応液を減圧濃縮
した後、エーテルを加えて固化し、実施例１−１と同様
の操作により精製し、精製グルカゴン 5.2mg（収率 2
%）を得た。この精製グルカゴンについて高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）の保持時間の測定、旋光度
の測定及びアミノ酸分析を行った。その結果を下記に示
す。 ・ＨＰＬＣ 分析条件 カラム：TSK GEL ODS-120T（4.6×250mm） 溶 媒：35%アセトニトリル−0.1%ＴＦＡ 流 速：1ml/min 検出波長：２２０ｎｍ ＨＰＬＣの保持時間：１０．４分 ・ [α] _D ：−３４．４° ・アミノ酸分析 Asp(4) 3.91, Thr(3) 2.63, Ser(4) 2.89, Glu(3) 2.9
8, Gly(1) 1.07,Ala(1) 1.00, Val(1) 1.00, Met(1) 0.
97, Leu(2) 2.06, Tyr(2) 1.92,Phe(2) 1.92, His(1)
1.05, Lys(1) 0.99, Arg(2) 1.94 〔実施例８〕方法４によるグルカゴンの製造 (1) グルカゴンのアミノ酸配列の１位から18位のアミノ
酸残基に相当する下記式：Ｆｍｏｃ−Ｈis−Ｓer−Ｇln
−Ｇly−Ｔhr−Ｐhe−Ｔhr−Ｓer−Ａsp−Ｔyr−Ｓer−
Ｌys−Ｔyr−Ｌeu−Ａsp−Ｓer−Ａrg−Ａrg−ＯＨで表
されるペプチドの製造 Ｂｏｃ−Ａrg（Ｔｏｓ）−ＰＡＭ樹脂（渡辺化学社製、
アミノ基 0.44mmol/g）5.43ｇに、実施例１−１の方法
と同様にして上記ペプチドのアミノ酸配列にしたがって
順次アミノ酸残基をカップリングし、Ｆｍｏｃ−Ｈis
（Ｔｏｓ）−Ｓer（Ｂzl）−Ｇln−Ｇly−Ｔhr（Ｂzl）
−Ｐhe−Ｔhr（Ｂzl）−Ｓer−Ａsp(ＯｃＨｅｘ）−Ｔy
r（Ｂｒ-Ｚ）−Ｓer（Ｂzl）−Ｌys（Ｃｌ-Ｚ）−Ｔyr
（ＢｒＺ）−Ｌeu−Ａsp（ＯｃＨｅｘ）−Ｓer（Ｂzl）
−Ａrg（Ｔｏｓ）−Ａrg（Ｔｏｓ）−ＰＡＭ樹脂 12.6g
を得た。

【００９８】得られた保護ペプチド−ＰＡＭ樹脂 5.0g
にアニソ−ル 8mlを加え、さらに無水フッ化水素25mlを
加えて、０℃で１時間撹拌した。反応後、無水フッ化水
素を減圧下留去後、残渣をエ−テルで洗浄し、これに 1
0%酢酸 200mlを加えてペプチドを抽出した。抽出液はＯ
ＤＳ−１０２０ＴＴ（富士デビソン社製）を用いた逆相
カラムクロマトグラフィーにより精製し、目的とするペ
プチド 456mgを得た。このペプチドについて高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の保持時間の測定、旋光
度の測定及びアミノ酸分析を行った。その結果を下記に
示す。 ・ＨＰＬＣ 分析条件 カラム：TSK GEL ODS-120T（4.6×250mm） 溶 媒：32%アセトニトリル−0.1%ＴＦＡ 流 速：1ml/min 検出波長：２２０ｎｍ ＨＰＬＣの保持時間：８．８分 ・ [α] _D ：−５．２° ・アミノ酸分析 Asp(2) 2.08, Thr(2) 2.02, Ser(4) 3.27, Glu(1) 1.1
3, Gly(1) 1.22,Leu(1) 1.08, Tyr(2) 1.87, Phe(1) 1.
00, Lys(1) 1.10, His(1) 1.18,Arg(2) 2.05 (2) グルカゴンのアミノ酸配列の19〜29位のアミノ酸残
基に相当する下記式：Ｈ−Ａla−Ｇln−Ａsp−Ｐhe−Ｖ
al−Ｇln−Ｔrp−Ｌeu−Ｍet−Ａsn−Ｔhr−ＯＨで表さ
れるペプチドの製造 実施例１−１において得られた中間体 Ｈ−Ａla−Ｇln
−Ａsp（ＯｃＨｅｘ）−Ｐhe−Ｖal−Ｇln−Ｔrp−Ｌeu
− Ｍet−Ａsn−Ｔhr（Ｂzl）−ＰＡＭ樹脂 1.48gに、
アニソ−ル 1ml及びエタンジチオール 1mlを加え、さら
に無水フッ化水素 7mlを加えて、０℃で１時間撹拌し
た。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残渣をエ
−テルで洗浄し、これに 50%酢酸 70mlを加えてペプチ
ドを抽出した。抽出液を凍結乾燥して 430mgの白色粉末
を得た。次に得られた粉末を0.1%酢酸に溶解した後、Ｏ
ＤＳ−１０２０ＴＴ（富士デビソン社製）を用いた逆相
カラムクロマトグラフィーにより精製し、目的とするペ
プチド 101mgを得た。このペプチドについて高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の保持時間の測定、旋光
度の測定及びアミノ酸分析を行った。その結果を下記に
示す。 ・ＨＰＬＣ 分析条件 カラム：TSK GEL ODS-120T（4.6×250mm） 溶 媒：36%アセトニトリル−0.1%ＴＦＡ 流 速：1ml/min 検出波長：２２０ｎｍ ＨＰＬＣの保持時間：１０．４分 ・ [α] _D ：−２３．３° ・アミノ酸分析 Asp(2) 2.10, Thr(1) 0.80, Glu(2) 2.05, Ala(1) 1.0
2, Val(1) 1.00,Met(1) 0.77, Leu(1) 1.23, Phe(1) 1.
04 (3) 下記式：Ｆｍｏｃ−Ｈis−Ｓer−Ｇln−Ｇly−Ｔhr
−Ｐhe−Ｔhr−Ｓer−Ａsp−Ｔyr−Ｓer−Ｌys−Ｔyr−
Ｌeu−Ａsp−Ｓer−Ａrg−Ａrg−Ａla−Ｇln−Ａsp−Ｐ
he−Ｖal−Ｇln−Ｔrp−Ｌeu− Ｍet−Ａsn−Ｔhr−Ｏ
Ｈで表される末端アミノ基保護ペプチドの製造 上記(1) で製造したペプチド 200mg(80μmol)、上記(2)
で製造したペプチド50mg(40μmol)及び 50%ＤＭＳＯを
含む0.2Mトリス緩衝液（ｐＨ 6.5）50mlに、トリプシン
30mgを加え、37℃で 24時間振盪した。次いで氷酢酸 2
mlを加えた後、生成物を濾取し、水で洗浄した後、五酸
化リン存在下、デシケーター中で減圧乾燥した。得られ
た粉末に10%酢酸 200mlを加えてペプチドを抽出した。

【００９９】抽出液をＯＤＳ−１０２０ＴＴ（30×420m
m）カラムを用いた逆相カラムクロマトグラフィーによ
り精製し、目的とするペプチド 8mg（収率 5%）を得
た。このペプチドについて高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）の保持時間の測定、旋光度の測定及びアミ
ノ酸分析を行った。その結果を下記に示す。 ・ＨＰＬＣ 分析条件 カラム：TSK GEL ODS-120T（4.6×250mm） 溶 媒：40%アセトニトリル−0.1%ＴＦＡ 流 速：1ml/min 検出波長：２２０ｎｍ ＨＰＬＣの保持時間：１０．２分 ・ [α] _D ：−３４．１° ・アミノ酸分析 Asp(4) 3.88, Thr(3) 2.75, Ser(4) 2.89, Glu(3) 2.8
2, Gly(1) 1.15,Ala(1) 1.01, Val(1) 1.06, Met(1) 0.
89, Leu(2) 2.14, Tyr(2) 2.13,Phe(2) 2.07, His(1)
1.11, Lys(1) 1.01, Arg(2) 2.09 (4) グルカゴンの製造 上記(3) で得られた末端アミノ基保護ペプチド 8mgに、
氷冷下 10%ジエチルアミン／ＤＭＦ 50mlを加えて溶解
し、室温で 1.5時間攪拌した。反応液を減圧濃縮した
後、エーテルを加えて固化し、実施例１−１と同様の操
作により精製し、精製グルカゴン 5mg（収率 3%）を得
た。この精製グルカゴンについて高速液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）の保持時間の測定、旋光度の測定及
びアミノ酸分析を行った。その結果を下記に示す。 ・ＨＰＬＣ 分析条件 カラム：TSK GEL ODS-120T（4.6×250mm） 溶 媒：35%アセトニトリル−0.1%ＴＦＡ 流 速：1ml/min 検出波長：２２０ｎｍ ＨＰＬＣの保持時間：１０．４分 ・ [α] _D ：−３５．４° ・アミノ酸分析 Asp(4) 3.84, Thr(3) 2.73, Ser(4) 2.86, Glu(3) 2.7
9, Gly(1) 1.13,Ala(1) 1.00, Val(1) 1.05, Met(1) 0.
88, Leu(2) 2.11, Tyr(2) 2.11,Phe(2) 2.05, His(1)
1.10, Lys(1) 1.00, Arg(2) 2.07 〔実施例９〕方法５によるグルカゴンの合成 (1) グルカゴンのアミノ酸配列の１位から18位のアミノ
酸残基に相当する下記式：Ｆｍｏｃ−Ｈis−Ｓer−Ｇln
−Ｇly−Ｔhr−Ｐhe−Ｔhr−Ｓer−Ａsp−Ｔyr−Ｓer−
Ｌys（Ｆｍｏｃ）−Ｔyr−Ｌeu−Ａsp−Ｓer−Ａrg−Ａ
rg−ＯＨで表されるペプチドの製造 Ｂｏｃ−Ａrg（Ｔｏｓ）−ＰＡＭ樹脂（渡辺化学社製、
アミノ基 0.44mmol/g）1.0ｇに、実施例１−１の方法と
同様にして上記ペプチドのアミノ酸配列にしたがって順
次アミノ酸残基をカップリングし、Ｆｍｏｃ−Ｈis（Ｔ
ｏｓ）−Ｓer（Ｂzl）−Ｇln−Ｇly−Ｔhr（Ｂzl）−Ｐ
he−Ｔhr（Ｂzl）−Ｓer−Ａsp(ＯｃＨｅｘ）−Ｔyr
（Ｂｒ-Ｚ）−Ｓer（Ｂzl）−Ｌys（Ｆｍｏｃ）−Ｔyr
（ＢｒＺ）−Ｌeu−Ａsp（ＯｃＨｅｘ）−Ｓer（Ｂzl）
−Ａrg（Ｔｏｓ）−Ａrg（Ｔｏｓ）−ＰＡＭ樹脂 2.4g
を得た。

【０１００】得られた保護ペプチド−ＰＡＭ樹脂 2.4g
に、アニソ−ル 1mlを加え、さらに無水フッ化水素25ml
を加え、０℃で１時間撹拌した。反応後、無水フッ化水
素を減圧下留去後、残査をエ−テルで洗浄し、これに 3
0%酢酸 200mlを加えてペプチドを抽出した。抽出液はＯ
ＤＳ−１０２０ＴＴ（富士デビソン社製）を用いた逆相
カラムクロマトグラフィーにより精製し、目的とするペ
プチド 216mgを得た。このペプチドについて高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の保持時間の測定、旋光
度の測定及びアミノ酸分析を行った。その結果を下記に
示す。 ・ＨＰＬＣ 分析条件 カラム：TSK GEL ODS-120T（4.6×250mm） 溶 媒：40%アセトニトリル−0.1%ＴＦＡ 流 速：1ml/min 検出波長：２２０ｎｍ ＨＰＬＣの保持時間：１０．２分 ・ [α] _D ：−５．１° ・アミノ酸分析 Asp(2) 2.16, Thr(2) 1.87, Ser(4) 3.20, Glu(1) 1.2
5, Gly(1) 1.20,Leu(1) 1.33, Tyr(2) 1.84, Phe(1) 1.
25, Lys(1) 0.97, His(1) 1.01,Arg(2) 1.82 (2) 下記式：Ｆｍｏｃ−Ｈis−Ｓer−Ｇln−Ｇly−Ｔhr
−Ｐhe−Ｔhr−Ｓer−Ａsp−Ｔyr−Ｓer−Ｌys（Ｆｍｏ
ｃ）−Ｔyr−Ｌeu−Ａsp−Ｓer−Ａrg−Ａrg−Ａla−Ｇ
ln−Ａsp−Ｐhe−Ｖal−Ｇln−Ｔrp−Ｌeu−Ｍet−Ａsn
−Ｔhr−ＯＨで表される末端アミノ基保護ペプチドの製
造 上記(1) で得られたペプチド 216mg(80μmol)、上記実
施例８の(2) で得られたペプチド 50mg(40μmol)を用い
て、実施例８の(3) の方法と同様にして目的とするペプ
チド 5mg（収率 3%）を得た。このペプチドについて高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の保持時間の測
定、旋光度の測定及びアミノ酸分析を行った。その結果
を下記に示す。 ・ＨＰＬＣ 分析条件 カラム：TSK GEL ODS-120T（4.6×250mm） 溶 媒：40%アセトニトリル−0.1%ＴＦＡ 流 速：1ml/min 検出波長：２２０ｎｍ ＨＰＬＣの保持時間：１０．５分 ・ [α] _D ：−３４．１° ・アミノ酸分析 Asp(4) 3.92, Thr(3) 2.63, Ser(4) 2.89, Glu(3) 3.0
0, Gly(1) 1.07,Ala(1) 1.01, Val(1) 1.01, Met(1) 0.
95, Leu(2) 2.05, Tyr(2) 1.91,Phe(2) 1.91, His(1)
0.99, Lys(1) 1.04, Arg(2) 1.92 (3) グルカゴンの製造 上記(2) で得られた末端アミノ基保護ペプチド 5mgに、
氷冷下 10%ジエチルアミン／ＤＭＦ 50mlを加えて溶解
し、室温で 1.5時間攪拌した。反応液を減圧濃縮した
後、エーテルを加えて固化し、実施例１−１と同様の操
作により精製し、精製グルカゴン 3mg（収率 1%）を得
た。このペプチドについて高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）の保持時間の測定、旋光度の測定及びアミ
ノ酸分析を行った。その結果を下記に示す。 ・ＨＰＬＣ 分析条件 カラム：TSK GEL ODS-120T（4.6×250mm） 溶 媒：35%アセトニトリル−0.1%ＴＦＡ 流 速：1ml/min 検出波長：２２０ｎｍ ＨＰＬＣの保持時間：１０．４分 ・ [α] _D ：−３５．４° ・アミノ酸分析Ａｓｐ（４） ３．９２， Ｔｈｒ
（３） ３．１３， Ｓｅｒ（４） ３．００， Ｇｌ
ｕ（３） ２．９２， Ｇｌｙ（１） １．１０，Ａｌ
ａ（１） １．０２， Ｖａｌ（１） ０．９８， Ｍ
ｅｔ（１） ０．９０， Ｌｅｕ（２） ２．０５，
Ｔｙｒ（２） １．９８，Ｐｈｅ（２） １．９２，
Ｈｉｓ（１） １．０５， Ｌｙｓ（１） ０．９６，
Ａｒｇ（２） ２．０３ 〔実施例10〕方法６によるグルカゴンの液相合成 (1) Boc-Asn-Thr(Bzl)-OBzl の合成 Boc-Asn-OH 34.8ｇ、H-Thr(Bzl)-OBzl 41.65ｇ及びHO
BT 19.25 ｇを、DMF200mlとTHF 450mlとの混合溶媒に
溶解した。得られた溶液に、０℃に冷却しながらWSC 2
3.25 mlを添加して２時間攪拌した後、室温で一夜攪拌
した。次いで、０℃に冷却しながらN-メチルモルフォリ
ンを用いてpH７に調節した後、さらにWSC 23.25mlを添
加して攪拌した。

【０１０１】得られた反応混合液を減圧濃縮した後、残
渣に酢酸エチル 500mlを添加して、１Ｎ塩酸 200mlで２
回、飽和重曹水 200mlで２回、飽和食塩水で２回の順で
洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、
減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル−ヘキサンに溶解して
再結晶化させた。この再結晶化の操作は３回繰り返し
た。得られた結晶を、できるだけ少量のクロロホルムに
溶解し、クロロホルム−メタノール−酢酸（５：１：
５）を用いたシリカゲルクロマトグラフィーにより精製
した。このようにして、Boc-Asn-Thr(Bzl)-OBzl 60.1ｇ
（収率78.6％）を得た。

【０１０２】得られたBoc-Asn-Thr(Bzl)-OBzl の融点、
旋光度、ＴＬＣのRf及び元素分析値を下記に示す。 m.p. ：54〜56℃ [α] _D ：−17.5°(c=1, DMF) Rf ：0.51(CHCl₃/EtOH/酢酸エチル＝5/2/5) 元素分析値 Ｃ₂₇Ｈ₃₅Ｎ₃Ｏ₇ 理論値 Ｃ:63.14% Ｈ:6.87% Ｎ:8.18% 測定値 Ｃ:63.05% Ｈ:6.90% Ｎ:7.98% (2) Boc-Met-Asn-Thr(Bzl)-OBzl の合成 上記(1) で得られたBoc-Asn-Thr(Bzl)-OBzl 56.1ｇに、
氷冷しながらTFA 100ml を添加して室温で30分間攪拌し
た後、減圧濃縮してTFA を留去した。残渣にエーテルを
添加して、生じた沈殿物を濾取した後、乾燥してH-Asn-
Thr(Bzl)-OBzl・TFA を得た。

【０１０３】一方、Boc-Met-OH（ペプチド研究所製）2
7.4ｇをTHF 50mlに溶解し、ドライアイス−エタノール
で-20℃に冷却し、Ｎ−メチルモルフォリン 12.1ml を
滴下した後、クロロギ酸イソブチル14.52ml(0.1mol)を
滴下して、-20℃で1分間攪拌して混合酸無水物の溶液を
調製した。得られた溶液を、Ｎ−メチルモルフォリンで
中和した上記H-Asn-Thr(Bzl)-OBzl ・TFA のTHF 溶液 2
00mlと混合し、０℃で５分間、室温で30分間攪拌した
後、減圧濃縮した。残渣に酢酸エチル 500mlを加え、1N
塩酸 200mlで２回、飽和重曹水 200mlで２回、飽和食塩
水で２回の順で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム
で乾燥した後、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル−ヘキ
サンに溶解して、再結晶化させた。この再結晶化の操作
は４回繰り返した。このようにして、Boc-Met-Asn-Thr
(Bzl)-OBzl 56.18 ｇ（収率79.8％）を得た。

【０１０４】得られたBoc-Met-Asn-Thr(Bzl)-OBzl の融
点、旋光度、ＴＬＣのRf及び元素分析値を下記に示す。 m.p. ：89〜91℃ [α] _D ：−15.0°(c=1, DMF) Rf ：0.61(CHCl₃/EtOH/酢酸エチル＝5/2/5) 元素分析値 Ｃ₃₂Ｈ₄₄Ｎ₄Ｏ₈Ｓ 理論値 Ｃ:59.61% Ｈ:6.88% Ｎ:8.69% 測定値 Ｃ:59.48% Ｈ:6.35% Ｎ:8.60% (3) Boc-Leu-Met-Asn-Thr(Bzl)-OBzl の合成 上記(2) で得られたBoc-Met-Asn-Thr(Bzl)-OBzl 54.4ｇ
に、氷冷しながらTFA60ml及びエタンジチオール２mlを
添加して室温で30分間攪拌した後、減圧濃縮してTFA を
留去した。残渣にエーテルを添加して、生じた沈殿物を
濾取した後、乾燥してH-Met-Asn-Thr(Bzl)-OBzl ・TFA
を得た。

【０１０５】上記で得られたH-Met-Asn-Thr(Bzl)-OBzl
・TFA に、HOBT 13.77ｇ及びBoc-Leu-OH・H₂O 25.5 ｇ
を添加した。次いで、０℃に冷却しながらWSC 18.5mlを
添加して室温で一夜攪拌した。得られた反応混合液を減
圧濃縮した後残渣に氷水を添加した。生じた沈殿物を濾
取し、酢酸エチルに加熱溶解した。これにベンゼンを添
加して共沸により水を除去した。この操作を３回繰り返
した後、エタノール−−エーテルを用いて再結晶化させ
た。このようにして、Boc-Leu-Met-Asn-Thr(Bzl)-OBzl
52.46 ｇ（収率82.3％）を得た。

【０１０６】得られたBoc-Leu-Met-Asn-Thr(Bzl)-OBzl
の融点、旋光度、ＴＬＣのRf及び元素分析値を下記に示
す。 m.p. ：172 〜173 ℃ [α] _D ：−20.0°(c=1, DMF) Rf ：0.72(CHCl₃/EtOH/酢酸エチル＝5/2/5) 元素分析値 Ｃ₃₈Ｈ₅₅Ｎ₅Ｏ₉Ｓ 理論値 Ｃ:60.22% Ｈ:7.31% Ｎ:9.24% 測定値 Ｃ:60.10% Ｈ:7.35% Ｎ:9.16% (4) Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Va
l-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(Bzl)-OBzl の合成 上記(3) で得られたBoc-Leu-Met-Asn-Thr(Bzl)-OBzl 4
8.75 ｇに、氷冷しながらTFA 50ml及びエタンジチオー
ル 1.2mlを添加して室温で30分間攪拌した後、減圧濃縮
してTFA を留去した。残渣にエーテルを添加して、生じ
た沈殿物を濾取した後、乾燥してH-Leu-Met-Asn-Thr(Bz
l)-OBzl ・TFA を得た。

【０１０７】上記のH-Leu-Met-Asn-Thr(Bzl)-OBzl ・TF
A をDMF に溶解して、得られた溶液に、HOBT 10.53ｇ、
実施例４の(2) で得られたBoc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-
Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-OH 151.58g 、及びWS
C 4.2ml を添加して、N-メチルモルフォリンを用いてpH
７に調節し、室温で一夜攪拌した。得られた反応混合液
を減圧濃縮し、残渣に氷水を添加した。生じた沈殿物を
濾取し、水洗し、乾燥した後、エタノール−ジエチルエ
ーテルを用いて再結晶化させた。再結晶化の操作は２回
繰り返した。このようにして、Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-
Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr
(Bzl)-OBzl 192.6 ｇ（収率95.6％）を得た。

【０１０８】得られたペプチドのアミノ酸分析値を下記
に示す。 Asp(2) 2.10, Thr(1) 0.96, Ala(1) 1.06, Glu(2) 2.0
3, Val(1) 0.98,Met(1) 0.96, Leu(1) 1.09, Phe(1) 1.
01, Arg(2) 2.11 (5) Boc-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(OBz
l)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(Bzl)-OBzl の合
成 上記(4) で得られたBoc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-Gln-As
p(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(Bzl)-OBzl
186.3 ｇに、氷冷しながらTFA 200ml 及びエタンジチオ
ール10mlを添加して室温で30分間攪拌した後、減圧濃縮
してTFA を留去した。残渣にエーテルを添加して、生じ
た沈殿物を濾取した後、乾燥してH-Arg(Tos)-Arg(Tos)-
Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr
(Bzl)-OBzl ・TFA を得た。

【０１０９】一方、Boc-Ser(Bzl)-OH （ペプチド研究所
製）10.04 ｇをTHF 100ml に溶解し、ドライアイス−エ
タノールで-20℃に冷却し、Ｎ−メチルモルフォリン 6.
6mlを滴下した後、クロロギ酸イソブチル7.92mlを滴下
して、-20℃で1分間攪拌して混合酸無水物の溶液を調製
した。得られた溶液を、Ｎ−メチルモルフォリンで中和
した上記H-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-
Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(Bzl)-OBzl ・TFA のTHF
溶液 200mlと混合し、０℃で５分間、室温で30分間攪拌
した後、減圧濃縮した。残渣に氷水を添加した。生じた
沈殿物を濾取し、水洗し、メタノール−エーテルを用い
て再結晶化させた。再結晶化の操作は２回繰り返した。
このようにして、Boc-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala
-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(Bz
l)-OBzl 173.83ｇ（収率88.6％）を得た。

【０１１０】得られたペプチドのアミノ酸分析値を下記
に示す。 Asp(2) 2.10, Thr(1) 0.96, Ser(1) 0.92, Ala(1) 1.0
6, Glu(2) 2.04,Val(1) 0.98, Met(1) 0.96, Leu(1) 1.
08, Phe(1) 1.00, Arg(2) 2.10 (6) Boc-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-G
ln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(Bzl)-
OBzl の合成 上記(5) で得られたBoc-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-A
la-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(B
zl)-OBzl 163.5ｇに、氷冷しながらTFA 200ml及びエタ
ンジチオール４mlを添加して室温で30分間攪拌した後、
減圧濃縮してTFA を留去した。残渣にエーテルを添加し
て、生じた沈殿物を濾取した後、乾燥してH-Ser(Bzl)-A
rg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp
-Leu-Met-Asn-Thr(Bzl)-OBzl・TFA を得た。

【０１１１】一方、Boc-Asp(OBzl)-OH（ペプチド研究所
製）16.9ｇをTHF 100ml に溶解し、ドライアイス−エタ
ノールで-20℃に冷却し、Ｎ−メチルモルフォリン 5.5m
lを滴下した後、クロロギ酸イソブチル6.6ml を滴下し
て、-20℃で1分間攪拌して混合酸無水物の溶液を調製し
た。得られた溶液を、Ｎ−メチルモルフォリンで中和し
た上記H-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(OBz
l)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(Bzl)-OBzl・TFA
のTHF 溶液 200mlと混合し、０℃で５分間、室温で30分
間攪拌した後、減圧濃縮した。残渣に氷水を添加した。
生じた沈殿物を濾取し、水洗し、メタノール−エーテル
を用いて再結晶化させた。再結晶化の操作は２回繰り返
した。このようにして、Boc-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Arg(T
os)-Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp- Le
u-Met-Asn-Thr(Bzl)-OBzl 160.7ｇ（収率92.1％）を得
た。

【０１１２】得られたペプチドのアミノ酸分析値を下記
に示す。 Asp(3) 3.12, Thr(1) 0.95, Ser(1) 0.91, Ala(1) 1.0
5, Glu(2) 2.04,Val(1) 0.98, Met(1) 0.95, Leu(1) 1.
08, Phe(1) 1.01, Arg(2) 2.05 (7) Boc-Tyr-Leu-OMe の合成 Boc-Tyr-OH 42.2ｇ、H-Leu-OMe 21.6ｇ及びHOBT 19.25
ｇを乾燥DMF 200 mlと乾燥THF 450 mlの混合溶媒に溶解
した。得られた溶液に、０℃に冷却しながらWSC23.25ml
を添加して２時間攪拌した後室温で一夜攪拌した。得ら
れた反応混合液を減圧濃縮した後残渣を酢酸エチル 600
mlに溶解した。次いで、１Ｎ塩酸 200mlで２回、飽和重
曹水 200mlで２回、飽和食塩水 200mlで２回の順で洗浄
した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧
濃縮した。残渣を酢酸エチル−エーテルを用いて再結晶
化させた。この再結晶の操作は２回繰り返した。このよ
うにして、Boc-Tyr-Leu-OMe 52.0ｇ（収率85.3％）を得
た。

【０１１３】得られたBoc-Tyr-Leu-OMe の融点、旋光
度、ＴＬＣのRf及び元素分析値を下記に示す。 m.p. ：106 〜108 ℃ [α] _D ：−14.7°(c=1, DMF) Rf ：0.73(CHCl₃/MeOH/AcOH＝9/1/0.5) 元素分析値 Ｃ₂₁Ｈ₃₂Ｎ₂Ｏ₆ 理論値 Ｃ:61.74% Ｈ:7.90% Ｎ:6.86% 測定値 Ｃ:61.86% Ｈ:7.73% Ｎ:6.84% (8) Boc-Lys(Z)-Tyr-Leu-OMeの合成 上記(7) で得られたBoc-Tyr-Leu-OMe 50.0ｇに、TFA 50
mlを添加して30分間攪拌した後、減圧濃縮してTFA を留
去した。残渣にエーテルを添加して、生じた沈殿物を濾
取した後、乾燥THF 250ml に溶解した。

【０１１４】得られた溶液に、HOBT 19.44ｇ及びBoc-Ly
s(Z)-OH 45.6 ｇを添加した。次いで、０℃に冷却しな
がらWSC 26.2mlを添加して室温で一夜攪拌した。得られ
た反応混合液を減圧濃縮した後残渣を酢酸エチル 800ml
に溶解した。次いで、１Ｎ塩酸 200mlで２回、飽和重曹
水 200mlで２回、飽和食塩水 200mlで２回の順で洗浄し
た。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧乾
固した。残渣を酢酸エチル−エーテルを用いて再結晶化
させた。この再結晶の操作は２回繰り返した。このよう
にして、Boc-Lys(Z)-Tyr-Leu-OMe 72.36ｇ（収率90.0
％）を得た。

【０１１５】得られたBoc-Lys(Z)-Tyr-Leu-OMe の融
点、旋光度、ＴＬＣのRf及び元素分析値を下記に示す。 m.p. ：110 〜111 ℃ [α] _D ：−23.1°(c=1, DMF) Rf ：0.53(CHCl₃/MeOH/AcOH＝9/1/0.5) 元素分析値 Ｃ₃₅Ｈ₅₀Ｎ₄Ｏ₉ 理論値 Ｃ:62.67% Ｈ:7.51% Ｎ:8.35% 測定値 Ｃ:62.39% Ｈ:7.77% Ｎ:8.09% (9) Boc-Ser-Lys(Z)-Tyr-Leu-OMeの合成 上記(8) で得られたBoc-Lys(Z)-Tyr-Leu-OMe 70.3 ｇ
に、TFA 100ml を添加して30分間攪拌した後、減圧濃縮
してTFA を留去した。残渣にエーテルを添加して、生じ
た沈殿物を濾取した後、乾燥し、THF 250ml に溶解し
た。

【０１１６】得られた溶液に、HOBT 17.01ｇ及びBoc-Se
r-OH 21.5ｇを添加した。次いで、０℃に冷却しながら
WSC 22.93ml を添加して室温で一夜攪拌した。得られた
反応混合液を減圧濃縮した後残渣に氷水を添加した。生
じた沈殿物を濾取し、水洗し、メタノール−エーテルを
用いて再結晶化させた。この再結晶の操作は２回繰り返
した。このようにして、Boc-Ser-Lys(Z)-Tyr-Leu-OMe 6
9.53ｇ（収率87.6％）を得た。

【０１１７】得られたBoc-Ser-Lys(Z)-Tyr-Leu-OMeの融
点、旋光度、ＴＬＣのRf及び元素分析値を下記に示す。 m.p. ：109 〜111 ℃ [α] _D ：−24.2°(c=1, DMF) Rf ：0.59(CHCl₃/MeOH/AcOH＝9/1/0.5) 元素分析値 Ｃ₃₈Ｈ₅₅Ｎ₅Ｏ₁₁ 理論値 Ｃ:58.82% Ｈ:7.41% Ｎ:9.03% 測定値 Ｃ:59.02% Ｈ:7.08% Ｎ:9.15% (10)Boc-Ser-Lys(Z)-Tyr-Leu-NHNH₂の合成 上記(9) で得られたBoc-Ser-Lys(Z)-Tyr-Leu-OMe 50.0
ｇをメタノール 250mlに溶解し、抱水ヒドラジン20.8ml
を添加して、室温で20時間攪拌した。得られた反応混合
液に水を添加し、沈殿物を濾取し、乾燥してメタノール
で洗浄した。このようにして、Boc-Ser-Lys(Z)-Tyr-Leu
-NHNH₂ 41.72ｇ（収率92.1％）を得た。

【０１１８】得られたBoc-Ser-Lys(Z)-Tyr-Leu-NHNH₂の
融点、旋光度、ＴＬＣのRf及び元素分析値を下記に示
す。 m.p. ：130 〜135 ℃ [α] _D ：−26.2°(c=1, DMF) Rf ：0.60(CHCl₃/MeOH/AcOH＝9/1/0.5) 元素分析値 Ｃ₃₇Ｈ₅₅Ｎ₇Ｏ₁₀ 理論値 Ｃ:58.64% Ｈ:7.31% Ｎ:12.94% 測定値 Ｃ:58.70% Ｈ:7.25% Ｎ:12.94% (11) Boc-Ser-Lys(Z)-Tyr-Leu-Asp(OBzl)-Ser-Arg(Tos)
-Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Me
t-Asn-Thr(Bzl)-0Bzlの合成 上記(6) で得られたBoc-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-
Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met
-Asn-Thr(Bzl)-0Bzl 104.5g に、氷冷しながらTFA 150m
l 及びエタンジチオール４mlを添加して、室温で30分間
攪拌した後、減圧濃縮下してTFAを留去した。残渣にエ
ーテルを添加して、生じた沈殿物を濾取した後、乾燥し
てH-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-Gln-A
sp(0Bzl)-Phe-Val-Gln-Leu-Met-Asn-Thr(Bzl)-OBzl・TFA
を得た。

【０１１９】一方、上記(10)で得られたBoc-Ser-Lys(Z)
-Tyr-Leu-NHNH₂ 22.68ｇをDMFに溶解し、ドライアイス
−エタノールで−20℃に冷却し、６N HCl-ジオキサン1
8.07ml 及び亜硝酸イソアミル3.９mlを添加してアジド
化合物とした。これに、更にトリエチルアミン15.15ml
を添加した後中和した混液を、上記H-Asp(OBzl)-Ser(Bz
l)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(0Bzl)-Phe-Val-Gln
-Leu-Met-Asn-Thr(Bzl)-OBzl・TFAのDMF溶液に移し、−2
0℃で２時間、４℃で20時間放置した。得られた反応混
合液を減圧濃縮し、残渣に氷水を加えた。生じた沈殿物
を濾取し、水洗した後、メタノール−エーテルを用いて
再結晶化させた。再結晶化の操作は２回繰り返した。こ
のようにして、Boc-Ser-Lys(Z)-Tyr-Leu-Asp(OBzl)-Ser
-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-T
rp-Leu-Met-Asn-Thr(Bzl)-0Bzl 101.9g （収率82.5％)
を得た。

【０１２０】得られたペプチドのアミノ酸分析値を下記
に示す。 Asp(3) 3.15, Thr(1) 0.94, Ser(2) 1.80, Ala(1) 1.0
5, Glu(2) 2.03,Val(1) 0.98, Met(1) 0.95, Leu(2) 1.
08, Tyr(1) 0.96, Phe(1) 1.01,Lys(1) 1.01, Arg(2)
2.13 (12) Boc-Asp(OBzl)-Tyr-OH の合成 Boc-Asp(OBzl)-OH（ペプチド研究所製）9.69g をTHF 10
0ml に溶解し、ドライアイス−エタノールで−20℃に冷
却し、Ｎ−メチルモルフォリン3.３mlを滴下した後、ク
ロロギ酸イソブチル3.96mlを滴下して、−20℃で１分間
攪拌して混合酸無水物を調整した。得られた溶液を、NH
SのTHF 200ml 溶液と混合し、０℃で５分間、室温で30
分間攪拌した。これを、H-Tyr-OH 5.43gを２N NaOHに溶
解した溶液に加えて室温で一夜攪拌した。得られた反応
混合液を減圧濃縮し、残渣を酢酸エチル800ml に溶解し
た。１Ｎ塩酸200ml で２回、飽和食塩水200ml で２回の
順で洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した
後、減圧乾固した。残渣を酢酸エチル−ヘキサンに溶解
して再結晶化させた。この再結晶化の操作は３回繰り返
した。得られた結晶をできるだけ少量のクロロホルムに
溶かし、クロロホルム−メタノール−酢酸（20：１：0.
5)を用いたシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し
た。このようにしてBoc-Asp(OBzl)-Tyr-OH 13.41g (収
率 92.0％) を得た。

【０１２１】得られたBoc-Asp(OBzl)-Tyr-OHの融点、旋
光度、ＴＬＣのRf及び元素分析値を下記に示す。 m.p. ：75〜77℃ [α] _D ：−3.4°(c=1, DMF) Rf ： 0.50 (CHCl₃/MeOH/AcOH=9/1/0.5) 元素分析値 Ｃ₂₅Ｈ₃₀Ｎ₂Ｏ₈ 理論値 Ｃ：59.51％ Ｈ：6.39％ Ｎ：5.55％ 測定値 Ｃ：59.66％ Ｈ：6.13％ Ｎ：5.47％ (13) Boc-Asp(OBzl)-Tyr-Set-Lys(Z)-Tyr-Leu-Asp(OBz
l)-Ser-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val
-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(Bzl)-OBzlの合成 上記(11)で得られたBoc-Ser-Lys(Z)-Tyr-Leu-Asp(OBzl)
-Ser-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-G
ln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(Bzl)-0Bzl 100.0g に、氷冷し
ながら TFA 100ml、アニソール10ml及びエタンジチオー
ル５mlを添加して、室温で30分間攪拌した後、減圧濃縮
してTFAを留去した。残渣にエーテルを添加して、生じ
た沈殿物を濾取した後、乾燥してH-Ser-Lys(Z)-Tyr-Leu
-Asp(OBzl)-Ser-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(OBzl)
-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(Bzl)-0Bzl・TFA を
得た。

【０１２２】この生成物をDMFに溶解し、HOBT 3.24g、B
oc-Asp(OBzl)-Tyr-OH 9.42g及びWSC4.36mlを添加して、
Ｎ−メチルモルフォリンを用いてpH７に調節した後、室
温で一夜攪拌した。得られた反応混合液を減圧濃縮し、
残渣に氷水を加えた。生じた沈殿物を濾取し、水洗し、
乾燥した後、エタノール−エーテルに溶解して再結晶化
させた。この再結晶化の操作は２回繰り返した。このよ
うにして、Boc-Asp(OBzl)-Tyr-Set-Lys(Z)-Tyr-Leu-Asp
(OBzl)-Ser-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe
-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(Bzl)-OBzl 81.18g (収
率90.5％) を得た。

【０１２３】得られたペプチドのアミノ酸分析値を下記
に示す。 Asp(4) 4.20, Thr(1) 0.93, Ser(2) 1.79, Ala(1) 1.0
3, Glu(2) 2.03,Val(1) 0.99, Met(1) 0.95, Leu(2) 1.
07, Tyr(2) 1.95, Phe(1) 1.00,Lys(1) 1.01, Arg(2)
2.11 (14) Z-Thr-Ser-OMeの合成 Z-Thr-OH 42.2g、H-Ser-OMe 21.6g及びHOBT 19.25gをDM
F 200mlとTHF 450 mlの混合溶媒に溶解した。得られた
溶液に、０℃に冷却しながらWSC 23.25mlを添加して２
時間攪拌した後、室温で一夜攪拌した。得られた反応混
合液を減圧濃縮した後、残渣を酢酸エチル800ml に溶解
した。次いで１Ｎ塩酸200ml で２回、飽和重曹水200ml
で２回、飽和食塩水200ml で２回の順で洗浄した。有機
層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧乾固した。
残渣を酢酸エチル−ヘキサンに溶解して再結晶化させ
た。この再結晶化の操作は２回繰り返した。このように
して、Z-Thr-Ser-OMe 47.21g (収率 88.9％) を得た。

【０１２４】得られたZ-Thr-Ser-OMe の融点、旋光度、
ＴＬＣのRf及び元素分析値を下記に示す。 m.p. ：134〜137℃ [α] _D ：−6.9°(c=1, メタノール) Rf ：0.60 (CHCl₃/MeOH/H₂O=8/3/1) 元素分析値 Ｃ₁₆Ｈ₂₂Ｎ₇Ｏ₂ 理論値 Ｃ：54.23％ Ｈ：6.26％ Ｎ：7.91％ 測定値 Ｃ：54.26％ Ｈ：6.25％ Ｎ：7.89％ (15) Boc-Thr-Phe-NHNH₂ の合成 Boc-Thr-OH 42.2g(0.15mol)、H-Phe-OMe 21.6g(0.15mo
l)及びHOBT 19.25g(0.15mol)を、DMF 200ml とTHF 450m
l の混合溶媒に溶解した。得られた溶液に、０℃に冷却
しながらWSC 23.25ml を添加して２時間攪拌した後、室
温で一夜攪拌した。得られた反応混合液を減圧濃縮し、
残渣を酢酸エチル800ml に溶解した。次いで、１Ｎ塩酸
200ml で２回、飽和重曹水200ml で２回、飽和食塩水20
0ml で２回の順で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウ
ムで乾燥した後、減圧乾固した。残渣を酢酸エチル−ヘ
キサンに溶解し、再結晶化させた。この再結晶化の操作
は２回繰り返した。得られた結晶をメタノール250ml に
溶解し、抱水ヒドラジン48mlを添加して室温で20時間攪
拌した。得られた反応液に水を添加した後、濾取して、
乾燥し、メタノール−エーテルに溶解して再結晶化させ
た。このようにして、Boc-Thr-Phe-NHNH₂ 52.49g (収率
92.1％) を得た。

【０１２５】得られたBoc-Thr-Phe-NHNH₂の融点、旋光
度、ＴＬＣのRf及び元素分析値を下記に示す。 m.p. ：191〜195℃ [α] _D ：−12.3°(c=1, DMF) Rf ：0.64 (CHCl₃/MeOH/H₂O=8/3/1) 元素分析値 Ｃ₁₈Ｈ₂₈Ｎ₄Ｏ₅ 理論値 Ｃ：56.16％ Ｈ：7.46％ Ｎ：14.17％ 測定値 Ｃ：56.13％ Ｈ：7.57％ Ｎ：14.38％ (16) Boc-Thr-Phe-Thr-Ser-OMeの合成 上記(14)で得られたZ-Thr-Ser-OMe 46.2g をメタノール
に溶解し、１Ｎ塩酸4.76ml及びPd-C 6.5g を添加して、
窒素ガスを通して空気を置換した後、水素ガスを導入し
接触還元を行った。これを室温で６時間攪拌し、濾過
し、減圧濃縮した。残渣にエーテルを加えて、生じた沈
殿物を濾取し、真空乾燥してH-Thr-Ser-OMe・HClを得
た。

【０１２６】一方、上記(15)で得られたZ-Thr-Phe-NHNH
₂ 49.4gをDMFに溶解し、ドライアイス−エタノールで
−20℃に冷却し、６N HCl-ジオキサン78.3ml及び亜硝酸
イソアミル16.9mlを添加してアジド化合物とした。これ
に、更にトリエチルアミン65.6mlを添加して中和した混
合液を、上記H-Thr-Ser-OMe・HClのDMF溶液に移し、−2
0℃で２時間、４℃で20時間放置した。得られた反応混
合液を減圧濃縮し、残渣に氷水を加えた。生じた沈殿物
を濾取し、水洗し、メタノール−エーテルを用いて再結
晶化させた。この再結晶化の操作は２回繰り返した。こ
のようにして、Boc-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe 68.3g (収率
92.5％) を得た。

【０１２７】得られたBoc-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe の融
点、旋光度、ＴＬＣのRf及び元素分析値を下記に示す。 m.p. ：169〜172℃ [α] _D ：−3.7°(c=1, DMF) Rf ：Rf 0.64 (CHCl₃/MeOH/H₂O=8/3/1) 元素分析値 Ｃ₂₆Ｈ₄₀Ｎ₄Ｏ₁₀ 理論値 Ｃ：54.92％ Ｈ：7.09％ Ｎ：9.85％ 測定値 Ｃ：54.56％ Ｈ：7.57％ Ｎ：9.41％ (17) Boc-Thr-Phe-Thr-Ser-NHNH₂ 上記(16)で得られたBoc-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe 62.5g を
メタノール250ml に溶解し、抱水ヒドラジン35.2mlを添
加して室温で20時間攪拌した。得られた反応混合液に水
を添加して、沈殿物を濾取し、乾燥して、メタノール−
エーテルに溶解して再結晶化させた。このようにして、
Boc-Thr-Phe-Thr-Ser-NHNH₂ 57.54g (収率 92.1％) を
得た。

【０１２８】得られたBoc-Thr-Phe-Thr-Ser-NHNH₂の融
点、旋光度、ＴＬＣのRf及び元素分析値を下記に示す。 m.p. ：179〜184℃ [α] _D ：−4.4°(c=1, DMF) Rf ：0.64 (CHCl₃/MeOH/H₂O=8/3/1) 元素分析値 Ｃ₂₅Ｈ₄₀Ｎ₆Ｏ₉ 理論値 Ｃ：52.81％ Ｈ：7.09％ Ｎ：14.78％ 測定値 Ｃ：52.33％ Ｈ：7.57％ Ｎ：14.88％ (18) Boc-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp(OBzl)-Tyr-Ser-Lys(Z)-
Tyr-Leu-Asp(OBzl)-Ser-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-Gln-As
p(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(Bzl)-OBzl
の合成 上記(13)で得られたBoc-Asp(OBzl)-Tyr-Ser-Lys(Z)-Tyr
-Leu-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-Gln-
Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(Bzl)-OBz
80gに、氷冷しながらTFA 160ml 、アニソール８ml及び
エタンジチオール４mlを添加して溶解し、室温で30分間
攪拌した後、減圧濃縮してTFAを留去した。残渣にエー
テルを添加して、生じた沈殿物を濾取した後、乾燥して
H-Asp(OBzl)-Tyr-Ser-Lys(Z)-Tyr-Leu-Asp(OBzl)-Ser(B
zl)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gl
n-Leu-Met-Asn-Thr(Bzl)-OBzl ・TFAを得た。

【０１２９】上記(17)で得られたBoc-Thr-Phe-Thr-Ser-
NHNH₂ 11.36g をDMF 50mlに溶解し、ドライアイス−エ
タノールで−20℃に冷却して、６N HCl-ジオキサン10.2
ml、及び亜硝酸イソアミル2.６mlを添加してアジド化合
物とした。これに、更にトリエチルアミン8.54mlを添加
して中和した混合液を、上記H-Asp(OBzl)-Tyr-Ser-Lys
(Z)-Tyr-Leu-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-A
la-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Leu-Met-Asn-Thr(Bzl)-
OBzl ・TFAのDMF溶液に移し、−20℃で２時間、４℃で2
0時間放置した。得られた反応混合液を減圧濃縮し、残
渣に氷水を加えた。生じた沈殿物を濾取し、水洗して、
乾燥した後、エタノール−エーテルに溶解して再結晶化
させた。この再結晶化の操作は２回繰り返した。このよ
うにして、Boc-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp(OBzl)-Tyr-Ser-Ly
s(Z)-Tyr-Leu-Asp(OBzl)-Ser-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-G
ln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(Bzl)-
OBzl89.74g (収率 96.5％) を得た。

【０１３０】得られたペプチドのアミノ酸分析値を下記
に示す。 Asp(4) 4.20, Thr(3) 2.81, Ser(3) 2.69, Ala(1) 1.0
3, Glu(2) 2.04,Val(1) 0.99, Met(1) 0.95, Leu(2) 1.
07, Tyr(2) 1.95, Phe(1) 1.00,Lys(1) 1.01, Arg(2)
2.11 (19) Z-Gln-Gly-OButの合成 H-Gly-OBut・HCl 16.7gをTHF 100ml に溶解して０℃に
冷却し、Ｎ−メチルモルフォリンを用いて中和した。得
られた溶液にZ-Gln-ONp 40.14gのTHF溶液 200mlを添加
して、０℃で１時間、室温で一晩攪拌した後、減圧濃縮
した。残渣に酢酸エチル−ブタノール（１：１) を加
え、水で２回洗浄した。有機層を減圧濃縮し、残渣にエ
ーテルを加えて、生じた沈殿物を濾取した。濾取物をメ
タノール−エーテルで再沈殿させ、真空乾燥を行って、
Z-Gln-Gly-OBut 28.37g (収率 72.1％）を得た。

【０１３１】得られたZ-Gln-Gly-OButの融点、旋光度、
ＴＬＣのRf及び元素分析値を下記に示す。 m.p. ：168.5〜170.1℃ [α] _D ：−6.9°(c=0.9, DMF) Rf ：0.63 (CHCl₃/MeOH/AcOH=9/1/0.5) 元素分析値 Ｃ₁₉Ｈ₂₇Ｎ₃Ｏ₆ 理論値 Ｃ：58.00％ Ｈ：6.92％ Ｎ：10.63％ 測定値 Ｃ：57.71％ Ｈ：6.99％ Ｎ：10.60％ (20) Z-Ser-Gln-Gly-OButの合成 上記(19)で得られたZ-Gln-Gly-OBut 27.20g(69.1mmol)
をメタノールに溶解し、Pd-C 3.5g を加え、窒素ガスを
通して空気を置換した後、水素ガスを導入して接触還元
を行った。これを室温で６時間攪拌した後、濾過し、減
圧濃縮して、残渣にエーテルを加えた。生じた沈殿物を
濾取し、真空乾燥を行ってH-Gln-Gly-OButを得た。

【０１３２】Z-Ser-OH 16.53g とHOBt 11.11gをDMFに溶
解し、上記H-Gln-Gly-OButのDMF溶液と混合し、０℃でW
SC 12.89ml を加えた後、０℃で１時間、室温で一晩攪
拌した。次いで減圧濃縮し、残渣に酢酸エチル−ブタノ
ール (１：１) を加え、水で２回洗浄した。有機層を減
圧濃縮し、残渣にエーテルを加えて生じた沈殿物を濾取
した。濾取物をメタノール−エーテルで再沈殿させ、真
空乾燥を行って、Z-Ser-Gln-Gly-OBut 24.24g(収率70.
3％）を得た。

【０１３３】得られたZ-Ser-Gln-Gly-OButの融点、旋光
度、ＴＬＣのRf及び元素分析値を下記に示す。 m.p. ：158.0〜161.1℃ [α] _D ：−0.3°(c=1.0, DMF) Rf ：0.30 (CHCl₃/MeOH/AcOH=9/1/0.5) 元素分析値 Ｃ₂₂Ｈ₃₂Ｎ₄Ｏ₈ 理論値 Ｃ：54.99％ Ｈ：6.71％ Ｎ：11.66％ 測定値 Ｃ：54.79％ Ｈ：6.92％ Ｎ：11.31％ (21) Z-His-Ser-Gln-Gly-OButの合成 上記(20)で得られたZ-Ser-Gln-Gly-OBut 22.10g(46.0mm
ol) をメタノールに溶解し、Pd-C 2.3g を加え、窒素ガ
スを通して空気を置換した後、水素ガスを導入して接触
還元を行った。これを室温で８時間攪拌した後、濾過し
て、減圧濃縮した。残渣にエーテルを加えて、生じた沈
殿物を濾取し、真空乾燥を行って、H-Ser-Gln-Gly-OBut
を得た。

【０１３４】Z-His-OH 13.31gとHOBt 7.40gをDMFに溶解
し、上記H-Ser-Gln-Gly-OButのDMF溶液と混合し、０℃
でWSC 8.79mlを加えて０℃で１時間、室温で一晩攪拌し
た。次いで減圧濃縮し、残渣に酢酸エチル−ブタノール
（１：１）を加えて、水で２回洗浄した。有機層を減圧
濃縮し、残渣にエーテルを加えて、生じた沈殿物を濾取
した。濾取物をメタノール−エーテルで再沈殿させ、真
空乾燥を行って、Z-His-Ser-Gln-Gly-OBut 26.20g(収
率 92.2％）を得た。

【０１３５】得られたZ-His-Ser-Gln-Gly-OButの融点、
旋光度、ＴＬＣのRf及び元素分析値を下記に示す。 m.p. ：118.1〜120.7℃ [α] _D ：−5.0°(c=1.0, DMF) Rf ：0.60 (CHCl₃/MeOH/AcOH=9/1/0.5) 元素分析値 Ｃ₂₈Ｈ₃₉Ｎ₇Ｏ₉ 理論値 Ｃ：54.45％ Ｈ：6.36％ Ｎ：15.87％ 測定値 Ｃ：54.44％ Ｈ：6.54％ Ｎ：16.01％ (22) Z-His-Ser-Gln-Gly-OHの合成 上記(21)で得られたZ-His-Ser-Gln-Gly-OBut 24.50g を
０℃でTFA 50mlに溶解し、室温で30分間攪拌した。次い
でエーテルを加え、生じた沈殿物を濾取し、真空乾燥し
てZ-His-Ser-Gln-Gly-OH 20.84g(収率 93.5％) を得
た。

【０１３６】得られたZ-His-Ser-Gln-Gly-OHの融点、旋
光度、ＴＬＣのRf及び元素分析値を下記に示す。 m.p. ：165.5〜169.1℃ [α] _D ：−34.8°(c=1.0, H₂O) Rf ：0.65 (CHCl₃/MeOH/AcOH=9/1/0.5) 元素分析値 Ｃ₂₄Ｈ₃₁Ｎ₇Ｏ₉ 理論値 Ｃ：51.33％ Ｈ：5.56％ Ｎ：17.46％ 測定値 Ｃ：51.32％ Ｈ：5.78％ Ｎ：17.11％ (23) Z-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp(OBzl)-T
yr-Ser-Lys(Z)-Tyr-Leu-Asp(OBzl)-Ser-Arg(Tos)-Arg(T
os)-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-
Thr(Bzl)-OBzlの合成 上記(18)で得られたBoc-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp(OBzl)-Ty
r-Ser-Lys(Z)-Tyr-Leu-Asp(OBzl)-Ser-Arg(Tos)-Arg(To
s)-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-T
hr(Bzl)-OBzl 46.2gに、氷冷しながら、TFA 50ml、アニ
ソール、及びエタンジチオール２mlを加えて溶解し、室
温で30分間攪拌した後、減圧濃縮してTFAを留去した。
残渣にエーテルを加え、生じた沈殿物を濾取した後、乾
燥して H-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp(OBzl)-Tyr-Ser-Lys(Z)-
Tyr-Leu-Asp(OBzl)-Ser-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-Gln-As
p(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(Bzl)-OBzl
・TFAを得た。

【０１３７】上記生成物をDMFに溶解し、これにHOBT 1.
8g 、上記(22)で得られたZ-His-Ser-Gln-Gly-OH6.35g
及びWSC 2.46mlを加え、Ｎ−メチルモルフォリンを用い
てpH７に調節した後、室温で一夜攪拌した。得られた反
応混合液を減圧濃縮し、残渣に氷水を加えた。生じた沈
殿物を濾取し、水洗し、乾燥した後、エタノール−エー
テルに溶解して再結晶化させた。再結晶化の操作は２回
繰り返した。このようにして、Z-His-Ser-Gln-Gly-Thr-
Phe-Thr-Ser-Asp(OBzl)-Tyr-Ser-Lys(Z)-Tyr-Leu-Asp(O
Bzl)-Ser-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-V
al-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(Bzl)-OBzl 44.9g (収率 8
2.35％) を得た。

【０１３８】得られたペプチドのアミノ酸分析値を下記
に示す。 Asp(4) 4.23, Thr(3) 0.85, Ser(4) 3.60, Glu(3) 3.0
7, Gly(1) 1.01,Ala(1) 1.07, Val(1) 1.07, Met(1) 0.
69, Leu(2) 2.32, Tyr(2) 1.92,Phe(2) 2.11, Arg(2)
2.03, His(1) 0.99, Lys(1) 1.01 (24) H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser
-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-G
ln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH の合成 上記(23)で得られたZ-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Se
r-Asp(OBzl)-Tyr-Ser-Lys(Z)-Tyr- Leu-Asp(OBzl)-Ser-
Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Tr
p-Leu-Met-Asn-Thr(Bzl)-OBzl 10g にアニソール30ml及
びエタンジオール５mlを加え、さらに無水弗化水素 250
mlを加え、０℃で１時間攪拌した。反応後、無水弗化水
素を減圧下留去し、残渣をエーテルで洗浄し、次いでこ
れに10％酢酸 350mlを加えてペプチドを抽出した。得ら
れた抽出液は実施例１−１と同様の操作で精製して精製
グルカゴン1.5gを得た。

【０１３９】得られた精製グルカゴンのアミノ酸分析値
を下記に示す。 Asp(4) 4.23, Thr(3) 0.85, Ser(4) 3.60, Glu(3) 3.0
7, Gly(1) 1.01,Ala(1) 1.07, Val(1) 1.07, Met(1) 0.
69, Leu(2) 2.32, Tyr(2) 1.92,Phe(2) 2.11, Arg(2)
2.03, His(1) 0.99, Lys(1) 1.01 〔実施例11〕グルカゴンの活性の測定 上記実施例１〜10で合成したグルカゴンの活性を下記の
方法にて測定し、天然グルカゴンの活性と比較した。

【０１４０】ウサギを用いたグルカゴンの血糖値上昇作
用測定法 体重 2.0〜3.0kgの健康なウサギを用い、その血糖値を
測定することにより、グルカゴンの活性値を求めた。ま
ず、測定試料溶液を 2用量（高用量試料溶液Ｔ _H 及び低
用量試料溶液Ｔ_L ，公比 2）、活性値既知のグルカゴン
標準溶液 2用量（高用量標準溶液Ｓ_H 及び低用量標準溶
液Ｓ_L ，公比 2）を作製した（生理食塩水に 0.1N HCl
を適量加え、pHを 3とし、これを溶媒に用いた。）。動
物は 1群当たり 6羽以上、計 4群に群分けした。グルカ
ゴン投与48時間前に 0.75%コルチゾン／0.5%カルボキシ
メチルセルロースを投与し、16時間以上絶食の前処置を
行った。投与は 2日行った。下記の表１（一例）のよう
に 1日目と 2日目の試料溶液及び標準溶液、高用量及び
低用量を違えて群毎に投与した。

【０１４１】

【表１】

【０１４２】グルカゴン投与後 20分及び 60 分に動物
の耳介周辺の静脈から採血し、比色法により血糖値を定
量した。2日間の各群の血糖値の合計値を用いて試料グ
ルカゴンの活性値を求めた。その結果を表２に示す。ま
た、天然グルカゴンの活性値は1.03u/mgであった。

【０１４３】

【表２】

【０１４４】以上の結果から、本発明の方法で合成した
グルカゴンは、いずれも天然のグルカゴンと同等の活性
を示すことが確認された。

【０１４５】

【発明の効果】本発明によれば、化学合成手法により、
グルカゴンを効率よく大量に、しかも安価に製造するこ
とができる。したがって、グルカゴンの工業的生産性が
向上する。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成７年６月１６日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１２】更に、本発明は、上記式（１）で表される
グルカゴンの製造方法であって、前記グルカゴンを少な
くとも２個のフラグメントに分けて各フラグメントを液
相中で合成し、次いで液相中で各フラグメントを反応さ
せてカップリングすることを特徴とする製造方法（方法
６）を提供する。本明細書において、アミノ酸、ペプチ
ド、保護基、溶媒その他に関して略号で表示する場合、
国際純正及び応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）、国際生化学
連合（ＩＵＢ）の規定或いは該当分野における慣用記号
に従うものとする。ただしアミノ酸等に関し光学異性体
がありうる場合は、特に明示しなければＬ体を示すもの
とする。以下、その例を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 高畠 ひかり 茨城県北相馬郡守谷町久保ヶ丘１丁目２番 伊藤ハム株式会社中央研究所内 (72)発明者 富崎 欣也 茨城県北相馬郡守谷町久保ヶ丘１丁目２番 伊藤ハム株式会社中央研究所内

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記式(1) ： H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr- Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln- (1) Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH で表されるグルカゴンの製造方法であって、カルボキシ
   ル基と結合可能な官能基を有する不溶性樹脂に、アミノ
   基保護スレオニンのカルボキシル基を結合させて前記樹
   脂に29位のスレオニン残基を導入する工程、該スレオニ
   ン残基の保護基を除去して得られた遊離のアミノ基に、
   上記式(1) のアミノ酸配列にしたがってアミノ基保護ア
   ミノ酸を順次ペプチド結合させて28位のアスパラギン残
   基から１位のヒスチジン残基まで一つずつ延長する工
   程、及び得られたペプチドを前記樹脂から脱離させる工
   程を含む製造方法。
2. 【請求項２】 下記式(1) ： H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr- Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln- (1) Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH で表されるグルカゴンの製造方法であって、前記グルカ
   ゴンを構成する１又は複数のフラグメント（ここで、フ
   ラグメントを構成するアミノ酸残基の総数は２〜28個で
   ある。）であって末端アミノ基を保護したものを合成す
   る工程、カルボキシル基と結合可能な官能基を有する不
   溶性樹脂に、アミノ基保護スレオニン又は29位のスレオ
   ニン残基を含む末端アミノ基保護フラグメントのカルボ
   キシル基を結合させる工程、前記樹脂に結合したスレオ
   ニン残基又はフラグメントの末端アミノ基の保護基を除
   去して得られた遊離のアミノ基に、上記式(1) のアミノ
   酸配列にしたがって末端アミノ基保護フラグメント及び
   ／又は末端アミノ基保護アミノ酸を順次ペプチド結合さ
   せて１位のヒスチジン残基まで延長する工程、及び得ら
   れたペプチドを前記樹脂から脱離させる工程を含む製造
   方法。
3. 【請求項３】 末端アミノ基保護フラグメントが、29位
   のアミノ酸残基を含む下記一般式(2) ： Ｒ¹-Ｘ-Asp-Thr( Ｒ³)-Ｒ² (2) （式中、Ｒ¹は末端アミノ基の保護基であり、Ｒ²は末端
   カルボキシル基の保護基であり、Ｒ³はスレオニン残基
   の側鎖の水酸基の保護基であり、Ｘは化学結合、Met、
   又はLeu-Met である。）で表されるペプチドを含み、該
   ペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖のカルボキシル基
   を不溶性樹脂に結合させることを特徴とする、請求項２
   に記載のグルカゴンの製造方法。
4. 【請求項４】 末端アミノ基保護フラグメントが、19位
   から25位のアミノ酸残基に相当する下記一般式(3) ： Ｒ¹-Ala-Gln-Asp(Ｒ⁴)-Phe-Val-Gln-Trp-OH (3) （式中、Ｒ¹は末端アミノ基の保護基であり、Ｒ⁴はアス
   パラギン酸残基の側鎖のカルボキシル基の保護基であ
   る。）で表されるヘプタペプチドを含む、請求項２又は
   ３に記載のグルカゴンの製造方法。
5. 【請求項５】 末端アミノ基保護フラグメントが、17位
   から25位のアミノ酸残基に相当する下記一般式(4) ： Ｒ¹-Arg(Ｒ⁵)-Arg(Ｒ⁵)-Ala-Gln-Asp(Ｒ⁴)-Phe-Val-Gln-Trp-OH (4) （式中、Ｒ¹は末端アミノ基の保護基であり、Ｒ⁴はアス
   パラギン酸残基の側鎖のカルボキシル基の保護基であ
   り、Ｒ⁵はアルギニン残基の側鎖のグアニジノ基の保護
   基である。）で表されるノナペプチドを含む、請求項２
   又は３に記載のグルカゴンの製造方法。
6. 【請求項６】 末端アミノ基保護フラグメントが、19位
   から24位のアミノ酸残基に相当する下記一般式(5) ： Ｒ¹-Ala-Gln-Asp(Ｒ⁴)-Phe-Val-Gln-OH (5) （式中、Ｒ¹は末端アミノ基の保護基であり、Ｒ⁴はアス
   パラギン酸残基の側鎖のカルボキシル基の保護基であ
   る。）で表されるヘキサペプチドを含む、請求項２又は
   ３に記載のグルカゴンの製造方法。
7. 【請求項７】 末端アミノ基保護フラグメントが、17位
   から24位のアミノ酸残基に相当する下記一般式(6) ： Ｒ¹-Arg(Ｒ⁵)-Arg(Ｒ⁵)-Ala-Gln-Asp( Ｒ⁴)-Phe-Val-Gln-OH (6) （式中、Ｒ¹は末端アミノ基の保護基であり、Ｒ⁴はアス
   パラギン酸残基の側鎖のカルボキシル基の保護基であ
   り、Ｒ⁵はアルギニン残基の側鎖のグアニジノ基の保護
   基である。）で表されるオクタペプチドを含む、請求項
   ２又は３に記載のグルカゴンの製造方法。
8. 【請求項８】 下記式(1) ： H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr- Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln- (1) Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH で表されるグルカゴンの製造方法であって、１位から12
   位のアミノ酸残基に相当する下記一般式(7) ： Ｒ¹-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-OH (7) （式中、Ｒ¹は末端アミノ基の保護基である。）で表さ
   れるペプチドと、13位から29位のアミノ酸残基に相当す
   る下記式(8) ： Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr- OH (8) で表されるペプチドとを、トリプシン又はトリプシン様
   酵素の存在下で反応させることを特徴とする製造方法。
9. 【請求項９】 下記式(1) ： H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr- Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln- (1) Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH で表されるグルカゴンの製造方法であって、１位から18
   位のアミノ酸残基に相当する下記一般式(9) ： Ｒ¹-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr- Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-OH (9) （式中、Ｒ¹は末端アミノ基の保護基である。）で表さ
   れるペプチドと、19位から29位のアミノ酸残基に相当す
   る下記式(10)： H-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH (10) で表されるペプチドとを、トリプシン又はトリプシン様
   酵素の存在下で反応させることを特徴とする製造方法。
10. 【請求項１０】 下記式(1) ： H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr- Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln- (1) Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH で表されるグルカゴンの製造方法であって、１位から18
    位のアミノ酸残基に相当する下記一般式(11)： Ｒ¹-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr- Ser-Lys(Ｒ⁶)-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-OH (11) （式中、Ｒ¹は末端アミノ基の保護基であり、Ｒ⁶はリジ
    ンの側鎖のアミノ基の保護基である。）で表されるペプ
    チドと、19位から29位のアミノ酸残基に相当する下記式
    (10)： H-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH (10) で表されるペプチドとを、トリプシン又はトリプシン様
    酵素の存在下で反応させることを特徴とする製造方法。
11. 【請求項１１】 下記式(1) ： H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr- Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln- (1) Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH で表されるグルカゴンの製造方法であって、前記グルカ
    ゴンを少なくとも２個のフラグメントに分けて各フラグ
    メントを液相中で合成し、次いで液相中で各フラグメン
    トを反応させてカップリングすることを特徴とする製造
    方法。