JPH08338839A - 網状赤血球測定用試薬及び測定方法 - Google Patents

網状赤血球測定用試薬及び測定方法

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JPH08338839A JP15347295A JP15347295A JPH08338839A JP H08338839 A JPH08338839 A JP H08338839A JP 15347295 A JP15347295 A JP 15347295A JP 15347295 A JP15347295 A JP 15347295A JP H08338839 A JPH08338839 A JP H08338839A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 安価な励起光源を用いたフローサイトメータ
を用いて、網状赤血球を正確かつ迅速に測定するための
試薬ならびに測定方法を提供する。 【構成】 以下の構造式： 【化１】 Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7は炭素数１〜６の
アルキル、アルケニルまたはハロゲン化アルキルであ
る］からなる群から選ばれる少なくとも１つの色素を含
有することを特徴とする網状赤血球測定用試薬、ならび
に該試薬を用いて網状赤血球を測定する方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査分野におい
て、血液中の網状赤血球を測定する試薬および測定する
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】網状赤血球とは、骨髄中で造血幹細胞か
ら分化成熟した赤芽球系細胞が脱核し、骨髄から末梢血
液中に放出された直後の若い赤血球であり、１〜２日後
に成熟赤血球となる。網状赤血球は、細胞成熟の名残と
して、成熟赤血球には含まれていない少量のＲＮＡある
いはリボソーム、ミトコンドリアなどの細胞内小器官を
有している。
【０００３】臨床検査分野において、網状赤血球を分類
・計数することは、患者の骨髄内での造血状態を把握す
る上で極めて重要な検査である。正常人においては、網
状赤血球は、全赤血球中の０．５〜２．０％を占めてお
り、骨髄造血が抑制された状態では減少し、骨髄造血が
亢進した状態では増加する。例えば、再生不良性貧血、
悪性腫瘍の化学療法時では減少し、溶血性貧血等では増
加する。
【０００４】さて、網状赤血球を測定するためには、従
来より血液とニューメチレンブルー（ＮＭＢ）、ブリリ
アントクレシルブルー（ＢＣＢ）などの塩基性色素を含
有する染色液とを混合する（超生体染色）ことによっ
て、網状赤血球中に含まれる上記残存物質を網状に析出
させ、塗抹標本を作製し、１個１個の細胞を顕微鏡で観
察することにより、成熟赤血球と網状赤血球とを弁別し
計数する方法（用手法）が行われている。
【０００５】しかしながら、用手法は操作が煩雑であ
り、検査技師間で細胞判別の個人差や細胞計数数の少な
さに由来する統計学的誤差が大きいことが知られてい
る。
【０００６】これらの問題を解決するために、前述の塩
基性色素のかわりに、蛍光性の塩基性色素で網状赤血球
を蛍光染色し、フローサイトメータで細胞の前方散乱光
強度、蛍光強度を測定し、主に蛍光強度の差で成熟赤血
球と網状赤血球を弁別し、網状赤血球を計数する方法が
行われている。さらに、網状赤血球の蛍光強度によっ
て、網状赤血球を成熟度別に分類計数すること（成熟指
数の計算）も可能である。例えば、蛍光強度の強い網状
赤血球の比率、すなわち最も若い網状赤血球の比率は、
骨髄造血能の回復の指標として有用であることが知られ
ている。
【０００７】この方法に用いられる色素としては、オー
ラミンＯが良く知られている。オーラミンＯは、実質的
に３０秒以内で網状赤血球を染色でき、迅速かつ精度よ
く網状赤血球を分析することができる。オーラミンＯ以
外にもアクリジンオレンジ、チアゾールオレンジなども
使用できるが、５〜３０分の染色時間を要する。
【０００８】一方、網状赤血球を特徴づける物質の１つ
であるＲＮＡを特異的に染色する色素が特公昭６３−６
１６２２号、米国特許第４，９５７，８７０号に開示さ
れている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】オーラミンＯ、アクリ
ジンオレンジやチアゾールオレンジを用いた網状赤血球
の分析方法では、極めて有用な方法であるにもかかわら
ず、蛍光色素を励起するための光源として非常に高価な
アルゴンレーザを必要とするため、装置が非常に高価な
ものになってしまう。また、上記公報には、励起光源と
してアルゴンレーザ以外の光源を用いた網状赤血球を測
定する技術は開示されていない。
【００１０】さらには色素の細胞膜透過性の問題が存在
する。上記公報に開示されているＲＮＡを特異的に染色
する色素は、ＲＮＡと溶液中で混合することによって、
飛躍的に蛍光強度が増大する。従って、原理的には網状
赤血球の検出のための優れた色素となるはずである。し
かしながら、実際に網状赤血球を検出しようとした場
合、ＲＮＡ水溶液と混合する場合とは異なり、まず色素
は細胞膜を透過しなければならない。しかし、色素の細
胞膜透過性は色素によって異なり、全ての色素が速やか
に細胞膜を透過し、ＲＮＡと結合するわけではない。そ
のため、全ての色素が網状赤血球の検出に使用できるわ
けではない。
【００１１】アルゴンレーザの波長４８８ｎｍで励起で
きる色素は、分子の大きさが比較的小さく、比較的容易
に細胞膜を透過するため、細胞中のＲＮＡと容易に結合
できる。そのため、染色のために特別な工夫をしなくて
も、例えば、通常良く用いられるＰＢＳ緩衝液に色素を
溶解しただけの染色液で網状赤血球の測定が可能であ
る。
【００１２】青領域よりも長波長の励起光を発するレー
ザはアルゴンレーザよりも安価であるが、そのような励
起光源を使用して網状赤血球の測定を行うためには、青
領域よりも長波長で励起可能な色素を使用しなければな
らない。しかし、そのような色素は、青領域（例えば４
８８ｎｍ）で励起できる色素に比べて、分子内各部の炭
化水素鎖長が長い、あるいは大きな芳香環を有する等の
ために、大半の物質は極性が低い。このような色素で赤
血球を染色した場合、多くの色素は細胞膜の脂質二重層
あるいはヘモグロビンに結合し、非特異蛍光を発しやす
い。あるいは、細胞膜に対して透過性が悪い。例えば、
本明細書の参考例に記載するように、上述の色素の１種
を用いて血液試料を染色し、赤半導体レーザを光源とす
るフローサイトメータで測定した場合、図１に示すよう
に赤血球の非特異蛍光が強く、網状赤血球を正確に測定
することはできない。さらに、細胞膜透過性が悪く、染
色のために少なくとも３０分以上の時間が必要である。
【００１３】なお、非特異蛍光の問題は、何も青領域よ
りも長波長で励起可能な色素に特有の問題ではなく、青
領域で励起可能な色素についても起こりうる。
【００１４】一般に疎水性分子は、親水性分子より速や
かに赤血球細胞膜を透過し、小さな分子は大きな分子よ
りも速やかに膜を透過するとされているが、どのような
色素が網状赤血球を迅速にかつ特異的に染色することが
できるかを予測するのは困難である（特開平６−１８０
３１５号、４頁、カラム６、３８行目〜５頁、カラム
７、６行目参照）。
【００１５】本発明は、Ｈｅ／Ｎｅレーザや赤半導体レ
ーザなどの安価な励起光源を用いたフローサイトメータ
を用いて、網状赤血球を正確かつ迅速に測定するための
試薬ならびに測定方法を提供することを目的とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上述した目
的を達成するために鋭意研究した結果、本発明の色素が
網状赤血球を正確かつ迅速に染色し、安価な励起光源を
用いるフローサイトメータによっても網状赤血球を精度
よく測定しうることを発見して本発明を完成した。
【００１７】すなわち、本発明は、以下の構造式：
【化２】 Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7は炭素数１〜６の
アルキル、アルケニルまたはハロゲン化アルキルであ
る］からなる群から選ばれる少なくとも１つの色素を含
有することを特徴とする網状赤血球測定用試薬を提供す
る。
【００１８】本発明において使用可能な色素の例として
は、以下のものが挙げられる。
【００１９】（１）１，１’，３，３，３’，３’−ヘ
キサメチルインドジカルボシアニンアイオダイド（ＨＩ
ＤＣＩ、ＬＡＭＢＤＡ ＰＨＹＳＩＫ社） （１，１’，３，３，３’，３’−ｈｅｘａｍｅｔｈｙ
ｌｉｎｄｏｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ ｉｏｄｉｄ
ｅ）
【化３】 （２）１，１’−ジエチル−２，４’−キノカルボシア
ニン アイオダイド（ＮＫ−１３８、日本感光色素研究
所） （１，１’−ｄｉｅｔｈｙｌ−２，４’−ｑｕｉｎｏｃ
ａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅｉｏｄｉｄｅ）
【化４】 （３）ピナシアノール クロライド （Ｐｉｎａｃｙａｎｏｌｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
【化５】 （４）１，３’−ジエチル−２，２’−キノチアカルボ
シアニン アイオダイド （１，３’−ｄｉｅｔｈｙｌ−２，２’−ｑｕｉｎｏｔ
ｈｉａｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ ｉｏｄｉｄｅ）
【化６】 網状赤血球を染色するのに十分な色素の量は、色素によ
って異なるが、０．３〜１００ｍｇ／ｌ 程度の量が好
適な濃度である。
【００２０】色素濃度がこの範囲を越えた場合、色素に
もよるが、一般的には、赤血球の非特異蛍光が増加し、
成熟赤血球と網状赤血球との弁別が困難になる。
【００２１】色素濃度がこの範囲以下の場合、使用不可
能ではないが、使用の容器壁面への吸着、分解等により
色素濃度の減少が発生しやすくなる。
【００２２】本発明の試薬中には、赤血球の非特異蛍光
を抑制するための多価アニオンを含有することができ
る。一般に、赤血球系細胞を超生体染色する場合、溶血
を防ぐために、染色液の浸透圧は、生理的浸透圧付近
（２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ程度）に調整される。この目的
には、塩化ナトリウムを主成分（通常１００ｍＭ以上）
とするＰＢＳが汎用されている。
【００２３】ところが染色液中に塩化ナトリウム、とく
に塩化物イオンが多量に存在する場合、赤血球の非特異
蛍光が強く、成熟赤血球と網状赤血球の弁別が困難にな
る。しかし、塩化物イオンを多価アニオンで置換した場
合、赤血球の非特異蛍光が著しく抑制され、成熟赤血球
と網状赤血球の弁別が容易になることを本発明者らは見
いだした。使用できる多価アニオンとしては、クエン
酸、シュウ酸、フタル酸、琥珀酸等の多価カルボン酸イ
オン、燐酸イオン、硫酸イオン、炭酸イオン等が好適で
ある。濃度は、試薬中の全アニオン成分に占める割合が
モル比で５０％以上が使用可能であり、好ましくは７０
％以上が好適である。
【００２４】ハロゲン等の単価アニオンは速やかに細胞
膜を通過して、ヘモグロビン分子と結合してヘモグロビ
ンの立体構造を変化させ、色素に対する親和性を増加さ
せ、結果として、赤血球の非特異蛍光が増加すると考え
られる。単価アニオンの大部分を多価アニオンに置換す
ることにより赤血球の非特異蛍光は抑制される。
【００２５】なお、多価アニオンの対イオンはアルカリ
金属イオンが好適である。
【００２６】さらに本発明において、多価アニオンを組
み合わせて用いるとさらに好適である。例えば、燐酸イ
オンを主成分とし（８０〜２００ｍＭ）、多価カルボン
酸を組み合わせる（５〜８０ｍＭ）。燐酸とシュウ酸と
の組合せは特に好適であり、赤血球の非特異蛍光を抑制
するだけでなく網状赤血球の蛍光強度を増加させる効果
がある。
【００２７】本発明においては、浸透圧補償剤を添加す
ることもできる。浸透圧補償剤は赤血球の低張溶血を防
ぐために添加するものであり、通常１５０ｍＯｓｍ／ｋ
ｇ以上の浸透圧があればよい。浸透圧が高すぎることの
弊害は特に認めないが、通常６００ｍＯｓｍ／ｋｇ程度
までで使用される。上述の多価アニオンで十分な浸透圧
が得られる場合は必須の成分ではない。浸透圧補償剤と
して特に制限されるものはない。例えば、プロピオン酸
などのアルカリ金属塩、グルコース、マンノースなどの
糖類が好適に使用される。なお、全アニオン成分に占め
る割合が５０％未満であれば、ハロゲン化物も使用でき
る。
【００２８】さらに本発明においては、緩衝剤を含有さ
せることもできる。緩衝剤は、安定した染色結果を得ら
れるように、ｐＨを一定に保つために加えられるもので
ある。通常使用される緩衝剤、例えば、カルボン酸類、
燐酸、グッド緩衝剤等が使用でき、数ｍＭ〜１００ｍＭ
程度の濃度で使用される。ｐＨは染色に好適なｐＨが選
ばれる。好適なｐＨは、色素によって異なるが、４．０
〜１１．０の範囲から選ばれる。ｐＨがこの範囲よりも
低すぎる場合、あるいは高すぎる場合、赤血球が溶血し
やすくなり、正確な測定ができなくなる。さらに、ｐＨ
が高すぎる場合、赤血球膜上の酸性官能基が解離してマ
イナスチャージを持ち、カチオン性である色素と結合す
ることにより、赤血球の非特異蛍光が増加して、成熟赤
血球と網状赤血球の弁別が困難になる傾向がある。
【００２９】さらに好適には４．５〜９．０のｐＨ範
囲、より好適には４．５〜７．０の範囲が選ばれる。な
お、前述の多価アニオンの塩類によって、ｐＨを染色に
適した値に安定に保つことができるのであれば必須の成
分ではない。
【００３０】また、本発明の試薬には、赤血球球状化剤
として界面活性剤を赤血球が溶血しない濃度でかつ網状
赤血球の染色を阻害しない濃度で含有させることもでき
る。
【００３１】さらに、色素が水溶液中で不安定な場合、
色素を適当な水溶性の非水溶媒、例えば、エタノール、
ジメチルスルホキシド、エチレングリコール等に溶解し
て保存し、使用時に希釈液と混合して使用することがで
きる。希釈液の成分としては、前述の多価アニオンの塩
類、浸透圧補償剤、緩衝剤あるいは赤血球球状化剤を含
有させることができる。
【００３２】本発明の試薬を用い、フローサイトメータ
で網状赤血球を測定するには、（ａ）網状赤血球測定用
試薬と血液学的試料とを混合して測定用試料を作製し、
（ｂ）測定用試料をフローサイトメータに流し、（ｃ）
細胞からの蛍光と、大きさ情報を反映するパラメータを
測定し、（ｄ）大きさ情報あるいは、大きさ情報と蛍光
強度で赤血球系細胞と血小板を弁別し、（ｅ）蛍光強度
で赤血球と網状赤血球と白血球を弁別し、網状赤血球
数、網状赤血球比率を測定する。
【００３３】測定用試料の作製にあたっては、網状赤血
球測定用試薬と血液学的試料との混合比は、１００：１
〜１０００：１、反応時間は１０〜１２０秒、反応温度
は２５〜５０℃の範囲で作製することができる。
【００３４】大きさ情報を反映するパラメータとして
は、前方散乱光強度、電気抵抗信号が挙げられる。ま
た、蛍光は、前方蛍光または側方蛍光のいずれを測定し
てもよい。
【００３５】本発明の方法で使用するフローサイトメー
タの光源は、色素によって異なるが、Ｈｅ／Ｎｅレー
ザ、赤半導体レーザ等安価なものが好適である。
【００３６】
【実施例】
参考例 次の構造式を有する色素（米国特許第４，９５７，８７
０号に開示された範囲に含まれる）：
【化７】 １ｍｇ／ｍｌジメチルスルホキシドの溶液を調製し、そ
の色素溶液１２５μｌをＰＢＳ（ＮａＨ2ＰＯ4 １０ｍ
Ｍ、ＮａＣｌ １４０ｍＭ、ＮａＯＨでｐＨ７．０に調
整）１ｌ に加え染色液とした。
【００３７】上記の染色液２ｍｌに抗凝固処理血液１０
μｌを加え、室温で３０分間インキュベートした後、赤
半導体レーザ（波長６３３ｎｍ）を光源とするフローサ
イトメータで、前方散乱光および６６０ｎｍ以上の側方
蛍光を測定した。
【００３８】図１に示したように、赤血球の非特異蛍光
が強く、網状赤血球と成熟赤血球の弁別が困難である。
【００３９】本参考例の試薬で処理した検体の網状赤血
球比率は、０．７８％であった。一方、同じ検体を対照
としてアルゴンレーザを光源とするＲ−２０００システ
ム（東亜医用電子株式会社製、染色液はオーラミンＯを
使用）で測定した場合、１．５％であり、本参考例の試
薬では、網状赤血球を正確に測定できないことが判明し
た。
【００４０】実施例１ ＨＩＤＣＩ １ｍｇをＰＢＳ（ＮａＨ2ＰＯ4 １０ｍ
Ｍ、ＮａＣｌ １４０ｍＭ、ＮａＯＨでｐＨ７．０に調
整）１ｌ に溶解し染色液とした。
【００４１】上記の染色液２ｍｌに抗凝固処理血液１０
μｌを加え、３５℃で２０秒間インキュベートした後、
赤半導体レーザ（波長６３３ｎｍ）を光源とするフロー
サイトメータで、前方散乱光および６６０ｎｍ以上の側
方蛍光を測定した。
【００４２】図２に示したように、網状赤血球と成熟赤
血球との間に十分な蛍光強度の差があり、網状赤血球を
測定できる。
【００４３】本実施例の試薬で処理した検体の網状赤血
球比率は、１．７６％であった。一方、同じ検体を参考
例と同様にＲ−２０００システムで測定した場合、１．
６５％であり、本実施例の試薬を用いると、網状赤血球
を正確に測定できることが判明した。
【００４４】実施例２ ＨＩＤＣＩ １ｍｇを１５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4水溶液
（ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整）１ｌ に溶解し、 染色
液とした。測定は実施例１と同様に行った。
【００４５】図３に示したように、成熟赤血球の非特異
蛍光が抑制され、さらに良好に網状赤血球を測定でき
る。
【００４６】本実施例の試薬で処理した検体の網状赤血
球比率は、１．３０％であった。一方、同じ検体を参考
例と同様にＲ−２０００システムで測定した場合、１．
３３％であり、本実施例の試薬を用いても、網状赤血球
を正確に測定できることが判明した。
【００４７】実施例３ シュウ酸 ３０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4 １２０ｍＭ ＮａＯＨでｐＨ５．０に調整 上記の水溶液に色素を溶解し、染色液を調製した。
【００４８】色素として、ＨＩＤＣＩ １ｍｇ／ｌ用い
た場合を図４に、１，１’−ジエチル−２，４’−キノ
カルボシアニン アイオダイド３ｍｇ／ｌを用いた場合
を図５に、ピナシアノール クロライド１ｍｇ／ｌを用
いた場合を図６に示す。いずれの場合でも、網状赤血球
と成熟赤血球との間に十分な蛍光強度の差があり、網状
赤血球を測定できる。
【００４９】本実施例で用いた検体を参考例と同様にＲ
−２０００システムで測定したとき、その網状赤血球比
率は、２，０１％であった。同じ検体を本実施例の色素
で染色し、赤半導体レーザを光源とするフローサイトメ
ータを用いて測定したとき、 色素ＨＩＤＣＩ：１．９８％ 色素１，１’−ジエチル−２，４’−キノカルボシアニ
ン アイオダイド：２．０５％ 色素ピナシアノール クロライド：１．８９％ であり、本実施例のいずれの色素で染色して赤半導体レ
ーザで測定する場合にもアルゴンレーザと同様に網状赤
血球を正確に測定できることが判明した。
【００５０】実施例４ 実施例３でＨＩＤＣＩ １ｍｇ／ｌを用いた場合と、対
照法としてＲ−２０００システム（東亜医用電子株式会
社製、染色液はオーラミンＯを使用）を用いた場合との
相関図を図７に示す。
【００５１】直線回帰式Ｙ＝０．９３＋０．１８、相関
係数ｒ＝０．９１５１（ｎ＝３７）であり、Ｒ−２００
０システムと比較して、良好な相関が得られた。
【００５２】
【発明の効果】本発明によれば、安価な光源を用いたフ
ローサイトメータで、網状赤血球を測定することができ
る。また、色素と多価アニオンを組み合わせることによ
って、さらに精度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】参考例に記載の染色液で染色した血液を、赤半
導体レーザ（波長６３３ｎｍ）を光源とするフローサイ
トメータで前方散乱光および６６０ｎｍ以上の側方蛍光
を測定した結果を示す。本図ならびに以下の図におい
て、ＲＢＣは赤血球を、Ｒｅｔは網状赤血球を、ＰＬＴ
は血小板を表す。なお、白血球は蛍光強度が非常に強
く、信号がオーバーフローしている。
【図２】実施例１に記載の染色液で染色した血液を、赤
半導体レーザ（波長６３３ｎｍ）を光源とするフローサ
イトメータで前方散乱光および６６０ｎｍ以上の側方蛍
光を測定した結果を示す。
【図３】実施例２に記載の染色液で染色した血液を、赤
半導体レーザ（波長６３３ｎｍ）を光源とするフローサ
イトメータで前方散乱光および６６０ｎｍ以上の側方蛍
光を測定した結果を示す。
【図４】色素としてＨＩＤＣＩを用いる実施例３に記載
の染色液で染色した血液を、赤半導体レーザ（波長６３
３ｎｍ）を光源とするフローサイトメータで前方散乱光
および６６０ｎｍ以上の側方蛍光を測定した結果を示
す。
【図５】色素として１，１’−ジエチル−２，４’−キ
ノカルボシアニン アイオダイドを用いる実施例３に記
載の染色液で染色した血液を、赤半導体レーザ（波長６
３３ｎｍ）を光源とするフローサイトメータで前方散乱
光および６６０ｎｍ以上の側方蛍光を測定した結果を示
す。
【図６】色素としてピナシアノール クロライドを用い
る実施例３に記載の染色液で染色した血液を、赤半導体
レーザ（波長６３３ｎｍ）を光源とするフローサイトメ
ータで前方散乱光および６６０ｎｍ以上の側方蛍光を測
定した結果を示す。
【図７】実施例３でＨＩＤＣＩを用いた場合と、Ｒ−２
０００システム（染色液はオーラミンＯ）を用いた場合
の相関図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 畑中 加代 兵庫県神戸市中央区港島中町７丁目２番１ 号 東亜医用電子株式会社内 (72)発明者 水上 利洋 兵庫県神戸市中央区港島中町７丁目２番１ 号 東亜医用電子株式会社内 (72)発明者 坂田 孝 兵庫県神戸市中央区港島中町７丁目２番１ 号 東亜医用電子株式会社内

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の構造式： 【化１】 Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7は炭素数１〜６の
    アルキル、アルケニルまたはハロゲン化アルキルであ
    る］からなる群から選ばれる少なくとも１つの色素を含
    有することを特徴とする網状赤血球測定用試薬。
  2. 【請求項２】 赤血球の非特異蛍光を抑制するための多
    価アニオンを含む請求項１記載の網状赤血球測定用試
    薬。
  3. 【請求項３】 浸透圧補償剤を含む請求項１または２記
    載の網状赤血球測定用試薬。
  4. 【請求項４】 ｐＨを一定に保つための緩衝剤を含む請
    求項１〜３のいずれかに記載の網状赤血球測定用試薬。
  5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに記載の試薬を
    用いて網状赤血球を測定する方法。
  6. 【請求項６】 フローサイトメータを用いて測定する請
    求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】 以下の工程により測定する請求項６の方
    法： （ａ）網状赤血球測定用試薬と血液学的試料とを混合し
    て測定用試料を作製し、（ｂ）測定用試料をフローサイ
    トメータに流し、（ｃ）細胞からの蛍光と、大きさ情報
    を反映するパラメータを測定し、（ｄ）大きさ情報ある
    いは、大きさ情報と蛍光強度で赤血球系細胞と血小板を
    弁別し、（ｅ）蛍光強度で赤血球と網状赤血球と白血球
    を弁別し、網状赤血球数、網状赤血球比率を測定する。
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