JPH10319010A

JPH10319010A - 白血球分類計数用試薬および分類計数方法

Info

Publication number: JPH10319010A
Application number: JP9128472A
Authority: JP
Inventors: Toshihiro Mizukami; 利洋水上; Munetaka Ishiyama; 宗孝石山; Takashi Sakata; 孝坂田
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1997-05-19
Filing date: 1997-05-19
Publication date: 1998-12-04
Anticipated expiration: 2017-05-19
Also published as: US6004816A; JP3783808B2; DE69829606D1; EP0882983B1; EP0882983A3; DE69829606T2; EP0882983A2; SA01220457A

Abstract

(57)【要約】【課題】簡便に高精度で幼若白血球や異常白血球等の
異常細胞を分類計数すると同時に、正常白血球の分類計
数ならびに、白血球計数を行うことができる試薬及び方
法を提供する。【解決手段】以下の構造式で表されるＲＮＡに特異的
に結合し蛍光強度の増加する色素を少なくとも１つ含む
ことを特徴とする白血球分類計数用試薬：【化１】（式中、Ｒ₁は水素原子又はアルキル基；Ｒ₂及びＲ₃は
水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基；Ｒ₄
は水素原子、アシル基、又はアルキル基；Ｚは硫黄、酸
素、あるいは低級アルキル基を有する炭素であり；ｎは
０,1又は２であり；Ｘ^-はアニオンである）、ならびに
該試薬を用いる白血球分類計数方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はフローサイトメトリ
ーによる白血球の分類計数用試薬及び計数方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】臨床検査の分野においては、白血球の分
類計数を行うことにより、疾患の診断を行う上で極めて
有用な情報を得ることができる。例えば、通常、正常な
末梢血液中の白血球には、リンパ球、単球、好中球、好
酸球、好塩基球の５つの正常白血球が一定の比率で存在
する。疾患の存在により、これらの白血球の比率は変動
することがあり、これらの正常白血球を分類計数する事
により各白血球の比率を測定することは疾患の存在につ
いての情報を得るうえで有用である。

【０００３】また、一方、疾患によっては、これらの正
常白血球以外に、骨髄芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄
球などの幼若顆粒球、赤芽球、などの通常骨髄内に存在
し末梢血には存在しない幼若白血球や幼若赤血球が末梢
血中に出現することがある。さらに、リンパ芽球、異形
リンパ球、異常リンパ球等の異常白血球が出現すること
もある。これらの細胞の出現を検出、さらに、分類計数
する事も疾患の診断において極めて有用である。

【０００４】従来、白血球分類を行うには、血液の塗抹
標本を作製し、適当な染色を施した後に顕微鏡で観察し
ながら分類計数するのが一般的であった。一方、近年、
フローサイトメータの原理を応用した種々の全自動白血
球分類計数装置が提供されている。しかしながら、これ
らの装置は、正常な白血球を高精度に分類することはで
きるが、上述の幼若白血球などの異常細胞の分類計数
を、正常白血球を分類計数するのと同時に行う事はでき
なかった。

【０００５】例えば、ＲＦ／ＤＣ測定原理を用いて幼若
白血球の出現を高精度に検出する試薬および方法が提供
されている（特開平６−２７３４１３号）。前記公報の
方法は、特定の条件下では正常白血球よりも幼若白血球
の方が破壊されにくいという性質を利用して電気的に測
定を行うものである。また、散乱光情報によって測定で
きることも示唆されている。しかし、この方法は幼若白
血球の検出のみを目的としており、幼若白血球の検出に
おいては優れた性能を有するが、幼若白血球の測定と同
時に正常白血球を分類計数することはできない。正常な
白血球を分類計数するには別途、他の方法で行う必要が
ある。

【０００６】また、これとは別に蛍光測定原理を用いて
白血球を４分類すると同時に種々の幼若白血球を分類計
数する方法が提供されている（特開平６−２０７９４２
号）。この方法は、正常白血球を同時に４分類しかでき
ず、好塩基球を測定するためには別途、他の方法で行う
必要がある。また、複数の蛍光信号を測定する必要があ
り装置が複雑で高価になるという問題もある。

【０００７】さらに、白血球を５分類すると同時に種々
の幼若白血球を分類計数する方法が提供されている（特
開平５−３４２５１号）。この方法では、白血球の５分
類を行うために複雑な検出器が必要であり、また、２つ
の蛍光情報が必要であり、装置が大型で高価になるとい
う問題がある。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、簡便に高精
度で幼若白血球や異常白血球等の異常細胞を分類計数す
ると同時に、正常白血球の分類計数ならびに、白血球計
数を行うことができる試薬及び方法を提供することを目
的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は、ある色素を
使用することによって、簡便に白血球を少なくとも５分
類できることを見出した。すなわち本発明は、以下の構
造式を有するＲＮＡに特異的に結合し蛍光強度の増加す
る色素を少なくとも１つ含むことを特徴とする。

【００１０】

【化４】（式中、Ｒ₁は水素原子又はアルキル基；Ｒ₂及びＲ₃は
水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基；Ｒ₄
は水素原子、アシル基、又はアルキル基；Ｚは硫黄、酸
素、あるいは低級アルキル基を有する炭素であり；ｎは
０,1又は２であり；Ｘ^-はアニオンである）

【００１１】また、本発明の白血球分類方法は、以下の
工程からなる：１)血液試料を、血液試料中の赤血球を測定の障害とな
らない程度に溶解し、正常または異常細胞を染色に好適
な状態にする溶血剤と混合する工程、２)前記１）で調製した試料と、以下の構造式で表され
る細胞中のＲＮＡに特異的に結合し蛍光強度の増加する
色素と混合することにより血液試料中の有核細胞を蛍光
染色する工程：

【化５】（式中、Ｒ₁は水素原子又はアルキル基；Ｒ₂及びＲ₃は
水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基；Ｒ₄
は水素原子、アシル基、又はアルキル基；Ｚは硫黄、酸
素、あるいは低級アルキル基を有する炭素であり；ｎは
０,1又は２であり；Ｘ^-はアニオンである）、３)前記２）で調製した測定用試料をフローサイトメー
タで測定し、少なくとも１つの散乱光と、少なくとも１
つの蛍光を測定する工程、および４）前記３）で測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて
正常な白血球を少なくとも５つに分類計数する工程。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明でいう血液試料とは、末梢
血液、骨髄液、尿、アフェレーシスで採取した血液試料
など、白血球を含む体液試料をいう。

【００１３】異常細胞とは、通常骨髄中に存在し、末梢
血液には存在しない幼若細胞、例えば、骨髄芽球（Ｂｌ
ａｓｔ）、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球などの幼若顆粒
球（IG）等の幼若白血球、さらには異形リンパ球(Ａ−
Ｌｙｍｐｈ)、リンパ芽球（Ｌ−Ｂｌａｓｔ）、異常好
中球（Ａｂ−Ｎｅｕｔ）等の異常白血球、および赤芽球
（ＮＲＢＣ）等の通常末梢血に存在しない細胞をいう。

【００１４】本発明でいう、血液試料中の赤血球を測定
の障害とならない程度に溶解し、正常または異常細胞を
染色に好適な状態にする溶血剤と混合する工程とは、血
液試料を適当な溶血剤と混合する工程である。

【００１５】本工程の目的は、測定対象とする白血球細
胞の細胞膜に少なくとも色素分子が透過するのに十分な
細孔をあけるだけである。この目的に使用する溶血剤
は、少なくとも一つのカチオン性界面活性剤、少なくと
も一つのノニオン性界面活性剤、ｐＨを一定に保つため
の緩衝剤を含むｐＨ4.5 - 11.0、好ましくはｐＨ5.0 -1
0.0の水溶液である。

【００１６】カチオン性界面活性剤としては、４級アン
モニウム塩型界面活性剤又はピリジニウム塩型界面活性
剤が好ましい。４級アンモニウム塩型およびピリジニウ
ム塩型界面活性剤は、

【化６】〔Ｒ₁は炭素数６〜１８のアルキル又はアルケニル基、
Ｒ₂およびＲ₃は炭素数１〜４のアルキル又はアルケニル
基、Ｒ₄は炭素数１〜４のアルキルおよびアルケニル基
又はベンジル基、Ｘはハロゲン原子である。〕で表され
る全炭素数９〜３０の界面活性剤が挙げられる。Ｒ₁の
炭素数６〜１８のアルキル又はアルケニル基としてはへ
キシル、オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル等
を挙げることができるが、とりわけオクチル、デシル、
ドデシル等の直鎖のアルキル基が好ましい。また、Ｒ₂
およびＲ₃の炭素数１〜４のアルキル、アルケニル基と
しては、メチル、エチル、プロピル、ブチル等を挙げる
ことができるが、とりわけ、メチル、エチル、プロピル
等の炭素数１〜３のアルキル基が好ましい。さらに、Ｒ
₄の炭素数１〜４のアルキルおよびアルケニル基として
は、メチル、エチル、プロピル、ブチル等を挙げること
ができるが、とりわけ、メチル、エチル、プロピル等の
炭素数１〜３のアルキル基が好ましい。

【００１７】ノニオン性界面活性剤としては以下の式の
ポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤が好ましい：Ｒ₁−Ｒ₂−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n−Ｈ〔式中、Ｒ₁は炭素数８〜２５のアルキル、アルケニル
又はアルキニル基；Ｒ₂はＯ、

【化７】またはＣＯＯ；ｎは１０〜５０の整数を表す。〕

【００１８】溶血剤の組成は特に限定されるものではな
いが、例えば、特開平６−２０７９４２号、特開平７−
１８１１７７号に記載の溶血剤等が好適に使用できる。

【００１９】さらに、溶血剤中に少なくとも１つの、分
子内に少なくとも１つの芳香環を有する有機酸もしくは
その塩を含有することは、白血球の散乱光強度分布を、
分類により好適なように調整するために好適である。

【００２０】例えば、安息香酸、フタル酸、馬尿酸、サ
リチル酸、p-アミノベンゼンスルホン酸、ベンゼンスル
ホン酸もしくはその塩などが好適に使用できる。これら
の有機酸を含有することにより、特に好酸球の散乱光強
度が増加し、結果として、好中球と好酸球の分離が改善
される。例えば、実質的に側方散乱光のみを用いて白血
球の４分画が可能となる。

【００２１】溶血剤のｐＨは4.5 - 11.0、好ましくは5.
0 - 10.0であり、ｐＨを一定に保つために例えば、クエ
ン酸塩、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩などの緩衝剤を含む。な
お、前述の酸が緩衝剤として作用する場合には、緩衝剤
は必ずしも必要な成分ではない。ｐＨが低すぎる場合、
好酸球、好塩基球の分離が悪くなり、正常白血球を５分
画することが困難になる。しかしながら、正常白血球を
３分画（リンパ球、単球、顆粒球）並びに幼若白血球、
異常白血球を分類計数する事は可能である。

【００２２】ｐＨが高すぎる場合は白血球が損傷を受け
やすくなり、好ましくない。

【００２３】細胞中のＲＮＡに特異的に結合し蛍光強度
の増加する色素としては、ＲＮＡの存在しない環境では
蛍光強度が低く、ＲＮＡと結合することによって蛍光強
度の増加する色素が使用できる。

【００２４】大部分の幼若白血球や異常白血球等の異常
細胞は、正常な白血球に比べ、ＲＮＡを豊富に含有す
る。これは、例えば幼若白血球では、成熟途中の細胞で
あるために、細胞成熟に伴う種々の生産活動（タンパク
質合成等）をおこなっており、そのためにＲＮＡが豊富
に存在すると考えられる。

【００２５】本発明の白血球分類計数用試薬および白血
球分類計数法に使用するには以下の色素が好ましい：

【化８】（式中、Ｒ₁は水素原子又はアルキル基；Ｒ₂及びＲ₃は
水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基；Ｒ₄
は水素原子、アシル基、又はアルキル基；Ｚは硫黄、酸
素、あるいは低級アルキル基を有する炭素であり；ｎは
０，1又は２であり；Ｘ^-はアニオンである）。

【００２６】上記色素は、ＲＮＡと結合することによ
り、著しく蛍光強度の増加する性質を有する。

【００２７】さらに予期せぬことに、これらの色素を使
用することにより、好塩基球を同時に分類することが可
能となった。

【００２８】上述したように、これらの色素はＲＮＡに
結合した場合に蛍光強度が増加する（特異性がある）
が、通常はＤＮＡと結合した場合にも蛍光強度が増加す
る場合が多い。

【００２９】ＤＮＡに対して特異性を有する場合でも本
発明で使用可能であるが、ＲＮＡからの蛍光信号に、Ｄ
ＮＡからの蛍光信号が重畳され、正常白血球と幼若白血
球、異常白血球との間の蛍光強度差が小さくなる傾向が
ある。従って本発明の目的には、ＤＮＡとの親和性（特
異性）の低いものがより好ましい。

【００３０】このため、さらに我々はＤＮＡとの結合の
影響を少なくし、ＲＮＡに対する特異性を高めるため
に、上記の色素のうち、少なくともＲ₁あるいはＲ₄のい
ずれかが長鎖の（炭素数６〜１８の）アルキル基である
色素を合成し、正常および異常白血球の分類計数に使用
した。

【００３１】その結果、上記の色素は、作用機序は明確
ではないが、長鎖アルキル基を分子構造内に有するため
に細胞核膜を透過できない、あるいは、立体障害のため
にＤＮＡ分子への結合が阻害されるため、ＤＮＡに起因
する蛍光増加が少なく、よりＲＮＡ主体の蛍光を測定で
きるという利点があることが判明した。これによって、
幼若白血球や異常白血球等の異常細胞と正常白血球の分
離が著しく改善される。

【００３２】長鎖アルキル基の鎖長（炭素数）は長いほ
どＤＮＡに起因する蛍光強度増加が抑制され、ＲＮＡ特
異性が高まるが、一方、分子が疎水性になる傾向があ
り、水に難溶となって、使用不可能ではないが、取り扱
いが難しくなる。これらの点を勘案すると、Ｒ₁もしく
はＲ₄のアルキル基の炭素数が６、８、１０の色素が特
に好適である。

【００３３】Ｒ₂およびＲ₃における低級アルキル基又は
低級アルコキシ基とは、炭素数１〜８の直鎖又はアルキ
ル基又はアルコキシ基をいい、好ましくはメチル基、メ
トキシ基、エチル基、エトキシ基である。

【００３４】Ｘ^-として好適なアニオンにはＦ^-、Ｃ
ｌ^-、Ｂｒ^-、Ｉ^-等のハロゲンイオン、およびＣＦ₃ＳＯ
₃ ^-、ＢＦ₄ ^-などを含む。

【００３５】Ｚとしては、硫黄原子、酸素原子、あるい
はメチル、エチル、イソプロピル基などの低級アルキル
基で置換されている炭素原子が好ましい。

【００３６】色素の濃度は使用する色素により異なる
が、一般に0.001 - 1000 ppm、好ましくは0.01 - 100 p
pm、さらに好ましくは0.1 - 10 ppmである。なお、この
濃度は白血球分類計数試薬中の濃度であり、染色液と溶
血剤を別々にする場合には、染色液と溶血剤とを混合し
た状態での濃度である。

【００３７】本発明の白血球分類計数試薬は上記色素を
エチレングリコール、メタノール、ＤＭＳＯなどの水溶
性有機溶媒に溶解して染色液として保存し、血液試料と
溶血剤とを混合して調製した試料に使用時に加えること
ができる。あるいは、溶血剤中に混合して１液構成の試
薬とすることも可能である。

【００３８】このようにして調製した測定用試料をフロ
ーサイトメータで測定し、少なくとも１つの散乱光と、
少なくとも１つの蛍光を測定する。

【００３９】本発明でいう散乱光とは、一般に市販され
るフローサイトメータで測定できる散乱光であり、側方
散乱光、前方低角散乱光（受光角度０〜５度付近）、前
方高角散乱光（５〜２０度付近）等をいい、白血球の大
きさもしくは内部構造情報を反映する散乱角度が選ばれ
る。このうち側方散乱光がもっとも好適である。

【００４０】また、散乱光を１つ以上使用することによ
り、より分類精度をあげることができる。

【００４１】特に、前方低角散乱光を使用すると、細胞
の大きさに関する情報が得られるため、例えば、Hairy
Cell Leukemia等の大きさのみが変わって、ＲＮＡ量の
増加しない異常球の検出にも本発明を用いることがで
き、有用である。

【００４２】なお、前方高角散乱光を使用した場合、前
方低角散乱光と側方散乱光の中間の情報が得られる。つ
まり、細胞の大きさ情報と細胞の内部構造情報の両方を
含む情報が得られる。

【００４３】蛍光は、ＲＮＡ，ＤＮＡ等の細胞成分と結
合した色素から発せられるもので、使用する色素によっ
て好適な受光波長が選択される。

【００４４】フローサイトメータの光源は、特に限定さ
れず、色素の励起に好適な波長の光源が選ばれる。例え
ば、アルゴンイオンレーザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザ、赤色半
導体レーザ、水銀アークランプなどが使用される。特に
半導体レーザは気体レーザに比べ非常に安価かつ小型で
あり、装置コストを大幅に下げることができ、さらに小
型化できるため、好適である。

【００４５】「測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて
正常な白血球を少なくとも５つに分類計数する工程」と
は、（１）例えばＸ軸に側方散乱光、Ｙ軸に赤蛍光をと
ったスキャッタグラム（２次元分布図）を描いた場合、
例えば、図１に示すように、各白血球細胞は各細胞毎に
集団を形成する；そして（２）この集団を、適当な解析
ソフトで解析することにより、各白血球細胞の数と割合
を算出する、工程をいう。例えば、各細胞集団を囲むウ
インドウを設け、その中の細胞数を算出することによ
り、各白血球細胞の数と割合を算出することができる。

【００４６】本発明の試薬及び方法を用いると、正常な
白血球を少なくとも５つに分類計数できるのみでなく、
異常細胞の分類計数を同時に行うことができる。本発明
の試薬及び方法で分類計数するのに適した異常細胞は、
正常細胞よりもRNA量の増加した細胞であり、例えば幼
若顆粒球、骨髄芽球、赤芽球及び異形リンパ球から選択
される１つ以上である。

【００４７】本発明はさらに、以下の試薬を含む白血球
分類計数試薬キットを提供する：１)血液試料を、血液試料中の赤血球を測定の障害とな
らない程度に溶解し、正常または異常細胞を染色に好適
な状態にする溶血剤、及び２）以下の構造式で表されるＲＮＡに特異的に結合し蛍
光強度の増加する色素を少なくとも１つ含むことを特徴
とする染色液：

【化９】（式中、Ｒ₁は水素原子又はアルキル基；Ｒ₂及びＲ₃は
水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基；Ｒ₄
は水素原子、アシル基、又はアルキル基；Ｚは硫黄、酸
素、あるいは低級アルキル基を有する炭素であり；ｎは
０,1又は２であり；Ｘ^-はアニオンである）。

【００４８】本発明を以下の実施例によってさらに詳し
く説明するが、本発明には種々の変更、修飾が可能であ
り、従って、本発明の範囲は以下の実施例によって限定
されるものではない。

【００４９】なお、添付の各図において、以下の略号は
それぞれ次の物を意味する。 Lymph：リンパ球 Eo：好酸球 Mono：単球 Baso：好塩基球 Neut：好中球 WBC：白血球 IG：用若顆粒球 Blast：骨髄芽球 NRBC：赤芽球 A-Lymph：異形白血球

【００５０】

【実施例】実施例１色素化合物Ａの合成色素化合物Ａ（Ｒ₁=メチル，Ｒ₂=Ｒ₃=Ｈ，Ｒ₄=ｎ-オク
チル，ｎ=１，Ｚ=Ｓ，X=ＣＦ₃ＳＯ₃ ^-）を以下のように
して製造した。

【００５１】３−メチル−２−メチルベンゾチアゾリウ
ムメタンサルフェート１当量と、Ｎ,Ｎ−ジフェニ
ルホルムアミジン３当量を酢酸中で、９０℃の油浴上で
１．５時間加熱撹拌した。反応液をヘキサンにあけ、赤
色油状物をさらにヘキサンで懸濁洗浄し、酢酸を除い
た。粗生成物を酢酸エチルーヘキサンで再結晶した（収
率４８％）。これに１−オクチルレピジニウムトリフ
レート１当量とピリジンを加え、９０℃の油浴上で3時
間加熱撹拌した。反応液を濃縮し、残った青色粗製物を
フラッシュクロマトグラフィーにてメタノール−クロロ
ホルムで精製した（収率６２％）。

【００５２】濃暗青色粉末の色素化合物Ａ（Ｒ₁=メチ
ル，Ｒ₂=Ｒ₃=Ｈ，Ｒ₄=ｎ-オクチル，ｎ=１，Ｚ=Ｓ，Ｘ=
ＣＦ₃ＳＯ₃ ^-）を得た。ＴＬＣ（シリカゲル、１０％メタノール-塩化メチレ
ン）：Ｒf=０．５¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） δ ｐｐｍ（ＴＭＳ）：0.
88(t,3H) 1.28(bＲ,10H)1.64(s,2H) 1.82(bＲ,2H) 3.60
(s,3H) 4.23(t,2H) 6.35(d,1H) 6.82〜7.26(m,2H) 7.39
〜7.90(m,6H) 8.10〜8.26(dd,2H) IＲ(cm^-1)：1625,1560,1540,1520,1480,1460,1410,140
0,1310,1260,1210,1150,1130,740,640 ＭＡＳＳ（ＦＡＢｐｏｓｉｔｉｖｅ）ｍ／ｚ＝４２
９ＴＬＣ９５．７％（１０％メタノール−塩化メチレ
ン）極大吸収スペクトル６２９ｎｍ（メタノール）

【００５３】実施例２色素化合物Ｂの合成色素化合物Ｂ（Ｒ₁=へキシル、Ｒ₂=Ｒ₃=Ｈ、Ｒ₄=メチ
ル、ｎ=1、Ｚ=Ｓ、Ｘ=ＣＦ₃ＳＯ₃ ^-）を以下のようにし
て製造した。

【００５４】３−へキシル−２−メチルベンゾチアゾリ
ウムトリフレート１当量と、Ｎ,Ｎ−ジフェニルホル
ムアミジン４当量を酢酸中で、９０℃の油浴上で１０
時間加熱撹拌した。反応液を濃縮し、残った粗製物をフ
ラッシュクロマトグラフィーにてヘキサン−酢酸エチル
で精製した（収率２７％）。これにヨウ化１−メチルレ
ピジニウム１．３当量とピリジンを加え、９０℃の油
浴上で３時間加熱撹拌した。反応液を濃縮し、残った青
色粗製物をフラッシュクロマトグラフィーにてメタノー
ル−クロロホルムで精製した（収率７５％）。

【００５５】濃暗青色粉末の色素化合物Ｂ（Ｒ₁=へキシ
ル，Ｒ₂=Ｒ₃=Ｈ，Ｒ₄=メチル，ｎ=1，Ｚ=Ｓ，Ｘ=ＣＦ₃
ＳＯ₃ ^-）を得た。ＴＬＣ（シリカゲル、１０％メタノール-塩化メチレ
ン）：Ｒf=０．５¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） δ ｐｐｍ（ＴＭＳ）：0.
90(t,3H) 1.17〜1.81(m,12H) 4.12(s,3H) 6.50(m,1H)
6.96〜8.26(m,10H) IＲ(cm^-1)；1620,1560,1530,1510,1480,1460,1410,138
0,1310,1250,1210,1150,1100,750,640 ＭＡＳＳ（ＦＡＢｐｏｓｉｔｉｖｅ）ｍ／ｚ＝４０
１ＴＬＣ９３．０％（１０％メタノール−塩化メチレ
ン）極大吸収スペクトル６２９ｎｍ（メタノール）

【００５６】実施例３白血球分類計数試薬組成例以下の組成の試薬を調製した。ＨＥＰＥＳ 10 mM 市販品フタル酸２Ｎａ 20 mM 市販品ＢＣ３０ＴＸ（ポリオキシエチレン（３０）セチルエーテル） 1500 ppm 日光ケミカルズラウリルトリメチルアンモニウムクロライド 550 ppm 市販品色素化合物Ａ 0.5 ppm ＮａＯＨでｐＨを７．０に調整

【００５７】上記試薬１．０ｍｌに抗凝固剤処理した健
常人の血液３０μｌを加え、３５℃で４０秒間反応させ
たのちフローサイトメータ（ＦＣＭ）で、側方散乱
光、前方低角散乱光、蛍光を測定した。

【００５８】光源は６３３ｎｍの赤色半導体レーザを使
用した。蛍光は６６０ｎｍ以上の波長の蛍光（赤蛍光）
を測定した。

【００５９】図１にＸ軸に側方散乱光、Ｙ軸に赤蛍光を
とったスキャッタグラムを示す。

【００６０】図２にＸ軸に前方低角散乱光、Ｙ軸に赤蛍
光をとったスキャッタグラムを示す。

【００６１】白血球はリンパ球、単球、好中球、好酸
球、好塩基球の５つの集団に分かれる。

【００６２】参考までに図３に、Ｘ軸に側方散乱光、Ｙ
軸に前方低角散乱光をとったスキャッタグラムを、図４
に側方散乱光強度のヒストグラムを示す。白血球はリン
パ球、単球、好中球、好酸球の４つの集団に分かれる。

【００６３】各々の集団にウインドウを設けウィンドウ
内の細胞数の計数、細胞比率の算出を行う。

【００６４】図５〜９に従来法（東亞医用電子ＳＥ−９
０００）と本法（図１）との白血球分類の相関図を示
す。

【００６５】図１０に従来法（東亞医用電子ＳＥ−９０
００）と本法（図１）との白血球数の相関図を示す。い
ずれの項目も、従来法と良好な相関がある。

【００６６】なお、従来法の測定は以下の測定試薬を用
い、操作はＳＥ−９０００で全自動で行った：・白血球数：セルパック−３Ｄ（II）^TM（東亞医用電
子）とストマトライザ−ＥＯ（II）^TM（東亞医用電子）
の１：１混合物に血液を加えて測定、・リンパ球及び単球：セルパック−３Ｄ（II）^TM（東亞
医用電子）により溶血後、ストマトライザ−３Ｄ（II）
^TM（東亞医用電子）を添加して測定、・好酸球：ストマトライザ−ＥＯ（II）^TM（東亞医用電
子）を使用して測定、・好塩基球：ストマトライザ−ＢＡ（II）^TM（東亞医用
電子）を使用して測定、・好中球：(白血球数)−{(リンパ球数)＋(単球数)＋(好
酸球)＋(好塩基数)}により求めた。

【００６７】実施例４幼若顆粒球、異常白血球の出現
した検体の分類計数実施例３の試薬並びに方法を用いて以下の検体を測定し
た。・幼若顆粒球（後骨髄球、骨髄球）の出現した検体
（図１１）従来法（目視）で４．５％、本法で４．０％・骨髄芽球の出現した検体（図１２）従来法で８１．５％、本法で８５．１％・赤芽球の出現した検体（図１３）従来法で２５％、本法で２１．５％・異形リンパ球と幼若顆粒球の出現した検体（図１
４）異形リンパ球：従来法で２．０％、本法で１．８９％幼若顆粒球：従来法で２．０％、本法で２．１７％

【００６８】いずれの幼若顆粒球、異常白血球も正常白
血球と明確に分離され分類計数する事ができる。なお、
従来法は塗抹標本をメイーグリュンワルドーギムザ染色
法で二重染色し、白血球を顕微鏡（倍率：ｘ１０００）
で２００個分類計数した。

【００６９】実施例５試薬組成例ＨＥＰＥＳ 10 mM 市販品フタル酸２Ｎａ 20 mM 市販品ＢＣ３０ＴＸ（ポリオキシエチレン（３０）セチルエーテル） 1500 ppm 日光ケミカルズラウリルトリメチルアンモニウムクロライド 550 ppm 市販品色素任意の量ＮａＯＨでｐＨを７．０に調整以下の色素を使用した場合の実施例を示すＤＱＴＣＩ(Ｒ₁,Ｒ₄=エチル、Ｒ₂,Ｒ₃=Ｈ，Ｚ=Ｓ，Ｘ^-=Ｉ^-，ｎ=１) 0.1 ppm Lambda Physik社色素化合物Ａ 0.5 ppm 色素化合物Ｂ 0.3 ppm

【００７０】上記試薬１．０ｍｌに抗凝固剤処理した血
液３０μｌを加え、３５℃で４０秒間反応させたのちＦ
ＣＭで、側方散乱光、蛍光を測定した。測定サンプル
は、正常検体、幼若顆粒球の出現した検体を用いた。光
源は６３３ｎｍの赤色半導体レーザを使用した。蛍光は
６６０ｎｍ以上の波長の蛍光を測定した。光源、蛍光受
光波長は実施例３に同じである。

【００７１】図１５−１６にチアゾールブルーを使用し
た場合のスキャッタグラム、図１７〜１８に色素化合物
Ａを使用した場合のスキャッタグラム、図１９〜２０に
色素化合物Ｂを使用した場合のスキャッタグラムを示
す。

【００７２】Ｒ₁およびＲ₄の両方が低級アルキル基の場
合には正常好中球と幼若顆粒球の弁別は困難であるが、
長鎖アルキル基を導入した場合、正常好中球と幼若顆粒
球は明確に弁別できる。

【００７３】実施例６試薬組成例以下の組成の試薬を調製した。ＨＥＰＥＳ 10 mM 市販品ＢＣ３０ＴＸ（ポリオキシエチレン（３０）セチルエーテル） 1500 ppm 日光ケミカルズラウリルトリメチルアンモニウムクロライド 550 ppm 市販品色素化合物Ａ 0.5 ppm 酸類 20 mM 市販品ＮａＯＨでｐＨを７．０に調整酸類として、クエン酸、あるいはフタル酸を使用した。

【００７４】上記試薬１．０ｍｌに抗凝固剤処理した健
常人の血液３０μｌを加え、３５℃で４０秒間反応させ
たのちＦＣＭで、側方散乱光、蛍光を測定した。光源は
６３３ｎｍの赤色半導体レーザを使用した。蛍光は６６
０ｎｍ以上の波長の蛍光（赤蛍光）を測定した。

【００７５】図２１に酸類としてクエン酸を使用した場
合のスキャッタグラムを、図２２に酸類としてフタル酸
を使用した場合のスキャッタグラムを示す。

【００７６】酸類としてフタル酸（分子構造中に芳香環
を有する有機酸）を使用した場合、クエン酸に比べ、好
中球と好酸球の分離が改善される。

【００７７】

【発明の効果】本発明の白血球分類計数用試薬によれ
ば、血液試料を溶血剤と混合し、本発明の色素と混合す
ることにより血液試料中の有核細胞を蛍光染色し、フロ
ーサイトメータにより少なくとも１つの散乱光と少なく
とも１つの蛍光を測定するだけで簡便に高精度で幼若白
血球や異常白血球の異常細胞を分類計数すると同時に、
正常白血球の分類計数ならびに白血球計数を行うことが
できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例３の試薬で測定した健常人の血液試料の
側方散乱−赤蛍光スキャッタグラムである。

【図２】実施例３の試薬で測定した健常人の血液試料の
前方低角散乱−赤蛍光スキャッタグラムである。

【図３】実施例３の試薬で測定した健常人の血液試料の
側方散乱−前方低角散乱スキャッタグラムである。

【図４】実施例３の試薬で測定した健常人の血液試料の
側方散乱ヒストグラムである。

【図５】従来法（東亞医用電子ＳＥ−９０００）と実施
例３の分類計数法によるリンパ球比率の相関図である。

【図６】従来法（東亞医用電子ＳＥ−９０００）と実施
例３の分類計数法による単球比率の相関図である。

【図７】従来法（東亞医用電子ＳＥ−９０００）と実施
例３の分類計数法による好中球比率の相関図である。

【図８】従来法（東亞医用電子ＳＥ−９０００）と実施
例３の分類計数法による好酸球比率の相関図である。

【図９】従来法（東亞医用電子ＳＥ−９０００）と実施
例３の分類計数法による好塩基球比率の相関図である。

【図１０】従来法（東亞医用電子ＳＥ−９０００）と実
施例３の分類計数法による白血球数の相関図である。

【図１１】実施例３の試薬で測定した幼若顆粒球（後骨
髄球、骨髄球）の出現した検体の側方散乱−赤蛍光スキ
ャッタグラムである。

【図１２】実施例３の試薬で測定した骨髄芽球の出現し
た検体の側方散乱−赤蛍光スキャッタグラムである。

【図１３】実施例３の試薬で測定した赤芽球の出現した
検体の側方散乱−赤蛍光スキャッタグラムである。

【図１４】実施例３の試薬で測定した異形リンパ球と幼
若顆粒球の出現した検体の側方散乱−赤蛍光スキャッタ
グラムである。

【図１５】実施例５において色素としてチアゾールブル
ーを使用して正常検体を測定した場合の側方散乱−蛍光
スキャッタグラムである。

【図１６】実施例５において色素としてチアゾールブル
ーを使用して幼若顆粒球の出現した検体を測定した場合
の側方散乱−蛍光スキャッタグラムである。

【図１７】実施例５において色素として色素化合物Ａを
使用して正常検体を測定した場合の側方散乱−蛍光スキ
ャッタグラムである。

【図１８】実施例５において色素として色素化合物Ａを
使用して幼若顆粒球の出現した検体を測定した場合の側
方散乱−蛍光スキャッタグラムである。

【図１９】実施例５において色素として色素化合物Ｂを
使用して正常検体を測定した場合の側方散乱−蛍光スキ
ャッタグラムである。

【図２０】実施例５において色素として色素化合物Ｂを
使用して幼若顆粒球の出現した検体を測定した場合の側
方散乱−蛍光スキャッタグラムである。

【図２１】実施例６において酸類としてクエン酸を使用
して健常人の血液試料を測定した場合の側方散乱−赤蛍
光スキャッタグラムである。

【図２２】実施例６において酸類としてフタル酸を使用
して健常人の血液試料を測定した場合の側方散乱−赤蛍
光スキャッタグラムである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/58 Ｇ０１Ｎ 1/28 Ｊ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の構造式で表されるＲＮＡに特異的
に結合し蛍光強度の増加する色素を少なくとも１つ含む
ことを特徴とする白血球分類計数用試薬：【化１】（式中、Ｒ₁は水素原子又はアルキル基；Ｒ₂及びＲ₃は
水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基；Ｒ₄
は水素原子、アシル基、又はアルキル基；Ｚは硫黄、酸
素、あるいは低級アルキル基を有する炭素であり；ｎは
０,1又は２であり；Ｘ^-はアニオンである）。
【請求項２】少なくともＲ₁あるいはＲ₄のいずれか
が、炭素数６〜１８のアルキル基である請求項１記載の
白血球分類計数用試薬。
【請求項３】以下の工程からなる白血球分類計数方
法：１)血液試料を、血液試料中の赤血球を測定の障害とな
らない程度に溶解し、正常または異常細胞を染色に好適
な状態にする溶血剤と混合する工程、２)前記1)で調製した試料と、以下の構造式で表される
細胞中のＲＮＡに特異的に結合し蛍光強度の増加する色
素と混合することにより血液試料中の有核細胞を蛍光染
色する工程：【化２】（式中、Ｒ₁は水素原子又はアルキル基；Ｒ₂及びＲ₃は
水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基；Ｒ₄
は水素原子、アシル基、又はアルキル基；Ｚは硫黄、酸
素、あるいは低級アルキル基を有する炭素であり；ｎは
０,1又は２であり；Ｘ^-はアニオンである）、３)前記２）で調製した測定用試料をフローサイトメー
タで測定し、少なくとも１つの散乱光と、少なくとも１
つの蛍光を測定する工程、および４）前記３）で測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて
正常な白血球を少なくとも５つに分類計数する工程。
【請求項４】血液試料中の赤血球を測定の傷害となら
ない程度に溶解し、白血球を染色に好適な状態にする溶
血剤が、少なくとも1つのノニオン性界面活性剤と少な
くとも１つのカチオン性界面活性剤を含み、ｐＨが４．
５〜１１．０の間にある、請求項３に記載の白血球分類
計数方法。
【請求項５】溶血剤が、少なくとも１つの芳香環を有
する有機酸もしくはその塩をさらに含有する請求項４に
記載の白血球分類計数方法。
【請求項６】散乱光が、前方低角散乱光、前方高角散
乱光、側方散乱光から選ばれる少なくとも一つである請
求項３に記載の白血球分類計数方法
【請求項７】異常細胞の分類計数を同時に行うことが
できる請求項３記載の白血球分類計数方法。
【請求項８】異常細胞が、正常細胞よりもRNA量の増
加した細胞である請求項３〜８のいずれかに記載の白血
球分類計数方法。
【請求項９】異常細胞が幼若顆粒球、骨髄芽球、赤芽
球及び異形リンパ球から選択される１以上である請求項
８記載の白血球分類計数方法。
【請求項１０】以下の試薬を含む白血球分類計数試薬
キット：１)血液試料を、血液試料中の赤血球を測定の障害とな
らない程度に溶解し、正常または異常細胞を染色に好適
な状態にする溶血剤、及び２）以下の構造式で表されるＲＮＡに特異的に結合し蛍
光強度の増加する色素を少なくとも１つ含むことを特徴
とする染色液：【化３】（式中、Ｒ₁は水素原子又はアルキル基；Ｒ₂及びＲ₃は
水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基；Ｒ₄
は水素原子、アシル基、又はアルキル基；Ｚは硫黄、酸
素、あるいは低級アルキル基を有する炭素であり；ｎは
０,1又は２であり；Ｘ^-はアニオンである）。