JPH08338842A - 梅毒抗原の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 梅毒トレポネーマ菌を懸濁させた液に界面活
性剤等の菌可溶化剤を加えて可溶化処理を行った後、不
溶成分を除去し、次いで可溶化溶液から分子量が１５
０，０００以上の画分を梅毒抗原として分画することを
特徴とする梅毒抗原の製造方法。 【効果】 上記の製造方法により得られた梅毒抗原を不
溶性担体に担持することにより、特異性が高く、且つ高
感度特に初期感染を検出可能な梅毒検査用試薬を製造で
きる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は梅毒検査用試薬に用いら
れる抗原の製造方法に関する。さらに詳しくは特異性が
高く且つ高純度な梅毒検査用試薬の抗原の簡便な製造方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】梅毒は梅毒トレポネーマ菌を病因菌とす
る感染症である。梅毒検査用試薬にはワッセルマン法反
応試薬、マイクロタイター試薬、ラテックス凝集試薬、
蛍光抗体法試薬などがある。抗原抗体反応を利用して患
者血清、血漿中の抗体を検出する方法が主流を占めてい
る。代表的なものには、富沢らが開発したＴＰＨＡテス
トは梅毒トレポネーマ菌より調製した抗原として用い、
患者血清中の梅毒トレポネーマ菌抗体（以下、ＴＰ抗体
とも略記する）を検出する検査用試薬である。

【０００３】梅毒検査用試薬に用いる従来の抗原は、超
音波処理、ホモジナイザー処理などにより梅毒トレポネ
ーマ菌を破砕し、直接あるいはこれをさらに界面活性剤
等で可溶化して用いている。

【０００４】従来の方法により製造された抗原は、梅毒
トレポネーマ菌由来の抗原以外に多種の夾雑物質を含有
している。このように夾雑物質を含有している抗原を用
いて梅毒検査用試薬を調製した場合、夾雑物質は抗原抗
体反応以外の非特異的な反応を起こし、梅毒検査用試薬
を用いた誤診断の原因となる。さらに夾雑物質が比較的
弱い抗原抗体反応に基づく、抗原−初期抗体（ＩｇＭ）
の反応を阻害し、初期抗体を検出できず、適切な初期感
染の検出ができないという問題点が指摘されてきた。従
って、梅毒検査用試薬に用いる抗原は夾雑物質を含まず
高純度であることが、高い診断精度を得るため、及び初
期感染を高い効率で検出するために必要不可欠である。
特に、抗生物質等による適切な治療方法が確立された梅
毒では感染の早期発見は重要な意味を持つ。

【０００５】梅毒トレポネーマ菌より得られる抗原性を
含むタンパクは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法、ウエスタンブロット法による解析で主要な抗原
性を有する分子量１５，５００、１７，０００、４４，
５００、４７，０００の４サブユニット、及び比較的弱
い抗原性を持つ分子量３０，０００、３３，０００〜３
５，０００、３８，０００〜４０，０００の３サブユニ
ットが存在することが知られている。このうち、分子量
１５，５００、１７，０００、４４，５００、４７，０
００の主要な抗原性を持つ４サブユニットのうち３サブ
ユニットを抗原として用いることで９３．８％の診断精
度を持つことが知られている（Ｒｏｂｅｒｔ Ｅ．ｅｔ
ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３０，ｖｏｌ．３０，ｐ１１
５（１９９２））。さらに１００％に近い診断精度を得
るには抗原性を有するサブユニットをすべて含むこと、
及び夾雑物質を含まないことが梅毒診断用試薬の抗原に
は重要である。しかしながら、これらすべてのサブユニ
ットを含み、且つ夾雑物質を含まない梅毒検査用試薬に
用いる高純度抗原の製造方法は未だ確立されていないの
が現状である。

【０００６】これまでに本発明に類する技術として特開
昭５８−７１４５７公報に梅毒トレポネーマ菌より比重
１．０１以下の画分を除去した抗原含有物を用いる例が
記載されている。比重分画は簡便な抗原の製造方法では
あるが、比重分画だけで夾雑物質を含まない高純度な抗
原を製造することは困難である。

【０００７】さらに別の類する技術としては特開平２−
２３４０６３公報及び特開平３−２６７７６０公報に梅
毒トレポネーマ菌の培養物から陽イオン交換体によって
夾雑物質を除去する方法、及び梅毒トレポネーマ菌の培
養物からハイドロキシアパタイトによって夾雑物質を除
去する方法がある。陽イオン交換体及びハイドロキシア
パタイトによる抗原の製造方法は煩雑であり、且つ陽イ
オン交換体、及びハイドロキシアパタイト等での分画を
行うと抗原性を有するタンパクを部分的に排除してしま
う可能性がある。

【０００８】さらに別の類する技術には特開平４−１８
８０６７公報にハイドロキシアパタイトにより精製した
抗原を免疫して得た抗体を用いて固定化抗体を作成し、
アフィニティーカラムクロマトグラフィーにより製造す
る方法がある。この製造方法は特異性の高い抗原が回収
できる可能性のある方法である。しかし、この方法の欠
点は、アフィニティーカラムクロマトグラフィーに用い
る固定化抗体の特異性により製造される抗原の純度が大
きく左右されることにある。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、梅毒検査用
試薬に用いる抗原の製造方法において、特異性が高く、
且つ高純度の抗原の簡便な製造方法を提供することを目
的としている。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記問題を
解決すべく鋭意研究を行ってきた。その結果、梅毒トレ
ポネーマ菌を懸濁させた液に、菌可溶化剤を加えて可溶
化処理を行い、不溶化成分を除去した後、得られた可溶
溶液から分子量１５０，０００以上の画分を梅毒抗原と
して用いることにより上記目的が達成されることを見い
出し、本発明を完成するに至った。

【００１１】即ち、本発明は、梅毒トレポネーマ菌を懸
濁させた液に菌可溶化剤を加えて可溶化処理を行った
後、不溶化成分を除去し、次いで可溶溶液から分子量が
１５０，０００以上の画分を梅毒抗原として分画するこ
とを特徴とする梅毒抗原の製造方法である。

【００１２】以下、発明を詳細に説明する。

【００１３】本発明でいう梅毒トレポネーマ菌（以下、
ＴＰ菌とも略記する）とは梅毒の病因菌でスピロヘータ
の一種である病原性トレポネーマ パリダム菌（病原性
Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ菌）のことを指
す。ＴＰ菌を大量に得るための培養方法は、栄養素を人
為的に添加した液体、即ち、培地を用い、培養する生体
外培養法があるが、ＴＰ菌においては生体外培養法は未
だ確立されていない。従って、家兎の睾丸にＴＰ菌を感
染させて培養する生体内培養法が採られている。具体的
にはＴＰ菌は以下のような方法、即ち、ミラーらの方法
（Ｍｉｌｌｅｒｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．９６，ｐ４５０，（１
９６６））に従って培養すればよい。詳細には家兎睾丸
にＴＰ菌を接種し、１１〜１４日間、増殖させた後、家
兎睾丸をハサミで切断して０．１５Ｍ塩化ナトリウム水
溶液（以下、生理食塩水とも略記する）で懸濁してＴＰ
菌の抽出液とする。この抽出液を２００×ｇで１５分間
遠心して睾丸組織の大きな破片を沈殿除去する。続いて
１９，０００×ｇで９０分間遠心分離して生理食塩水等
に沈澱物を懸濁し、ＴＰ菌の懸濁液を得る。この時点
で、ＴＰ菌の懸濁液には通常、家兎睾丸成分等を夾雑物
質として多く含有している。一般的に抗原性を有する成
分（タンパク、脂質、糖類、糖タンパク、リポタンパク
等）の大部分は、細胞表層に水性溶媒に不溶性の状態で
存在していると予想される。従って、家兎睾丸内で培養
された夾雑物質を含むＴＰ菌は続く可溶化処理に供し、
抗原性を有する成分を可溶化することが必要である。

【００１４】本発明でいう可溶化処理とは、ＴＰ菌の細
胞表層に不溶性成分として存在する抗原性を有する成分
を水性溶媒に溶解可能な状態にする操作（以下、本操作
を可溶化とも略記する）をいう。ＴＰ菌においても抗原
性を有する成分は、大部分が水性溶媒に不溶性の状態で
細胞表層に存在している。従って、抗原性を有する成分
を得るには、先ずＴＰ菌の細胞表層より抗原性を有する
成分を水性溶媒に可溶化して溶出する可溶化処理が必須
である。該可溶化処理はＴＰ菌に菌可溶化剤を加えるこ
とにより実施する。

【００１５】可溶化処理は、菌可溶化剤を含む溶液にＴ
Ｐ菌を直接懸濁して可溶化するか、あるいは菌可溶化剤
を含まない溶媒にＴＰ菌を一旦懸濁した後に菌可溶化剤
を添加して可溶化するかの何れかの方法で実施される。
ＴＰ菌を均一に可溶化処理に供するためには菌可溶化剤
を含まない溶媒に十分に懸濁し、その後、菌可溶化剤を
添加して十分に懸濁し、可溶化処理することが望まし
い。

【００１６】菌可溶化剤を添加した懸濁液は十分に攪拌
することにより得られる抗原性を有する成分の抽出効率
は向上する。攪拌の方法は十分に菌可溶化剤とＴＰ菌が
混和される条件であれば、特に制限なく用いられる。例
えば、ＴＰ菌の水性溶媒懸濁液をビーカー等に入れ、マ
グネチックスタラー等で攪拌しながら、菌可溶化剤を含
む溶液を添加していく。あるいはＴＰ菌を菌可溶化剤を
含む溶液に直接懸濁して、その後、マグネチックスター
ラー等で十分に攪拌してもよい。できるだけ瞬時に攪拌
を実施することで抗原性を有する成分は高い抽出効率で
得られる。

【００１７】可溶化処理時にＴＰ菌を懸濁させる液の種
類は、用いる菌可溶化剤に適したものを用いるが、一般
的にはｐＨ５．０〜９．０程度の水性溶媒が望ましい。
例えば、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、リン酸緩衝液
（ｐＨ７．２）含有生理食塩水（以下、ＰＢＳとも略記
する）、生理食塩水等が挙げられる。ＴＰ菌の懸濁菌数
濃度は任意でよいが、菌可溶化剤での可溶化処理での効
率を考慮すると、１０⁹細胞／ｍｌオーダー程度が望ま
しい。

【００１８】可溶化処理の条件としては、可溶化温度は
１℃〜１００℃、さらに好適には２０℃〜６０℃が有効
である。可溶化処理の時間は３０分以上で効果を発揮
し、好ましくは３０分以上２４時間以下で作用させれば
効果的である。

【００１９】可溶化処理を実施する前に、凍結融解破
砕、超音波破砕、ホモジナイザー破砕、グラスビーズ破
砕等によって予めＴＰ菌を物理的破砕することは、ＴＰ
菌の細胞表層を部分的に破砕して可溶化処理の効率的を
向上させ、最終的製造される梅毒抗原の収率を向上させ
るので好ましく、必要に応じて実施される。

【００２０】さらに、抗原性を有する成分はＴＰ菌の細
胞表層に局在化しているので、ミラーらの方法により得
たＴＰ菌の懸濁液の可溶性成分は抗原性を含まない成分
であり抗原としては不要である。従って、本発明の可溶
化処理を実施する前に家兎睾丸由来の夾雑物質である不
要な可溶性成分を除去するため、ＴＰ菌を水性溶媒で洗
浄してもよい。洗浄に用いる水性溶媒は、例えば、ｐＨ
５．０〜９．０程度の水性溶媒が望ましい。例えば、リ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、ＰＢＳ、生理食塩水等が挙
げられる。該水性溶媒による洗浄は、通常、遠心洗浄に
より行われる。遠心洗浄とはＴＰ菌を水性溶媒に懸濁し
た後、ＴＰ菌の懸濁液を遠心用ローターに入れ、ロータ
ーを回転することにより遠心力場をつくり、これにより
該懸濁液中の可溶性成分を除去してＴＰ菌を含む不溶性
成分のみを回収することである。前記可溶化処理前に本
洗浄操作を実施することにより、可溶性成分に含まれて
いる夾雑物質を除去することができる。従って、洗浄操
作により、最終的に得られる梅毒抗原の純度を一層向上
させることができる。

【００２１】本発明で可溶化処理に用いる菌可溶化剤と
は、ＴＰ菌の細胞表層に存在する不溶性の抗原性を有す
る成分を水性溶媒に可溶化するための処理剤である。代
表的には、下記界面活性剤、及び尿素や塩酸グアニジン
等の変性剤等が挙げられる。

【００２２】界面活性剤としては非イオン性界面活性剤
又はイオン性界面活性剤を用いることができる。イオン
性界面活性剤には陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界
面活性剤、両性界面活性剤がある。本発明の可溶化処理
にいずれも好適に採用できる。

【００２３】非イオン性界面活性剤としては、具体的に
オクチルグルコシド、デシルグルコシド、ヘプチルチオ
グルコシド、オクチルチオグルコシド、ノニルチオグル
コシド、オクチルマルトシド、ドデシルマルトシド、デ
カノイル−Ｎ−メチルグルカミド、トリトンＸ４５、ト
リトンＸ１１４、ノニデットＰ４０、トリトンＸ１０
０、トリトンＸ１０２、トリトンＸ１６５、トリトンＸ
３０５、ブリッジ７６、ブリッジ９６、ブリッジ５６、
ブリッジ５８、トリトンＮ１０１、スクロースモノヘキ
サン酸エステル、スクロースモノラウリル酸エステル、
モノステアリン酸ソルビトール、モノラウリン酸ソルビ
トール等を用いることができる。

【００２４】陰イオン性界面活性剤としては、具体的に
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、テトラデシル硫酸
ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、テトラデ
シルスルホン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオ
キシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、
タウロデオキシコール酸ナトリウム等を用いることがで
きる。

【００２５】陽イオン性界面活性剤としては、具体的に
セチルトリメチルアンモニウムブロミド、テトラジシル
トリメチルアンモニウムクロリド、ドデシルピリジニウ
ムブロミド、セチルピリジニウムクロリド等を用いるこ
とができる。

【００２６】両性界面活性剤としては３−［（３−コラ
ミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンス
ルホン酸、３−［（コラミドプロピル）ジメチルアンモ
ニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸等を
用いることができる。

【００２７】これら界面活性剤のうち、特に非イオン性
界面活性剤の親水基部分に糖をもつオクチルグルコシ
ド、デシルグルコシド、ヘプチルチオグルコシド、オク
チルチオグルコシド、ノニルチオグルコシド、オクチル
マルトシド、ドデシルマルトシド、デカノイル−Ｎ−メ
チルグルカミドを好適に使用できる。

【００２８】可溶化処理に用いる界面活性剤の濃度は該
界面活性剤を生理食塩水、ＰＢＳ等の水性溶媒に溶解し
たときにミセルを形成する濃度、すなわち、臨界ミセル
濃度（以下、ＣＭＣとも略記する）以上であれば有効で
ある。さらにＣＭＣ以上またはＣＭＣの１０倍までの濃
度で好適に用いられ、さらにＣＭＣからＣＭＣの５倍ま
での濃度で可溶化を実施すると好適に作用する。界面活
性剤には親水基と疎水基の大小と強弱のバランスを示す
値としてＨＬＢ（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ−ｌｉｐｏｐｈ
ｉｌｅ ｂａｒａｎｃｅ）がある。本発明で使用する界
面活性剤はＨＬＢ１０〜１７を好適に用いることができ
る。

【００２９】可溶化処理に用いる変性剤とはタンパク変
性を起こす物質であり、タンパク変性とは、生理条件で
とっている固有の１次構造は変化せずに高次構造のみが
破壊されることをいう。従って、変性剤は生理食塩水、
ＰＢＳ等の水性溶媒に不溶性成分を可溶化する作用があ
る。変性剤の具体的な例示をすれば、４Ｍ以上の尿素、
２Ｍ以上の塩酸グアニジンが用いられる。好適にはタン
パクが完全変性する８Ｍ以上の尿素、６Ｍ以上の塩酸グ
アニジンが用いられる。

【００３０】菌可溶化剤は単独で用いても、いくつかの
菌可溶化剤を共存させても好適にＴＰ菌表層より不溶性
の抗原性を有する成分を効率よく可溶化できる。例え
ば、界面活性剤と変性剤を併用することも出来る。

【００３１】可溶化処理を実施することで抗原性を有す
る成分は、水性溶媒に可溶化して可溶性成分として存在
し、不溶性成分である残渣には抗原性はほとんど存在し
ない。従って、可溶化処理が終了した段階での懸濁液
は、抗原性を有する成分を有する可溶性成分と抗原性を
ほとんど示さない不溶性成分である残渣とからなる。

【００３２】本発明では当該懸濁液より不溶性成分を除
去することで抗原性を有する可溶溶液を得る。この不溶
性成分を除去する工程により、本発明で最終的に得られ
る梅毒抗原の純度、特異性を向上させることができる。
もし、この不溶性成分を除去しなければ、得られる梅毒
抗原の純度は著しく低下するので、この不溶性成分を除
去する操作は本製造方法で必須である。

【００３３】不溶性成分を除去するための方法として
は、特に限定はない。例えば、遠心分離等の方法を用い
られ、前記懸濁液を遠心用ローターに入れ、ローターを
回転することにより遠心力場をつくり、該懸濁液中に含
まれる不溶性成分を除去して可溶性成分のみを可溶溶液
として回収する。上記不溶性成分の除去操作での遠心分
離に採用する遠心力は不溶性成分を沈殿除去できる程度
であれば良い。通常、不溶性成分を除去するには１０，
０００×ｇ、３０分間で十分である。

【００３４】不溶性成分を除去することで抗原性を有す
る成分は菌可溶化剤を含有する溶液に溶解して溶液状態
となっている。しかしながら、不溶性成分を除去して得
られたこの可溶溶液には依然、抗原成分以外の夾雑物質
が混入している。可溶溶液に含まれる代表的な夾雑物質
は家兎睾丸成分等である。

【００３５】本発明では、上記抗原性を有する可溶溶液
より分子量１５０，０００以上の画分を更に分画するこ
とにより、梅毒検査用試薬に用いる特異性が高く且つ高
純度の梅毒抗原が製造できる。すなわち、本発明では、
分子量１５０，０００以上の画分を梅毒抗原とする。

【００３６】ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
で検定した結果、分子量１５０，０００以上の画分に
は、分子量１５，５００、１７，０００、４４，５０
０、４７，０００の抗原性が強い４サブユニット、３
０，０００、３３，０００〜３５，０００、３８，００
０〜４０，０００の抗原性が比較的弱い３サブユニット
のうちの少なくとも１サブユニットを有し、夾雑物質の
含有量が低いことを確認した。従って、可溶溶液より分
子量１５０，０００以上の画分を分画することで抗原性
が強い４サブユニット、および抗原性が比較的弱い３サ
ブユニットのうち少なくとも１サブユニットを回収して
いるものと考えられる。即ち、抗原性を有するサブユニ
ットはネイティブな状態では多量体を成し架橋体を形成
していると予想され、全体として分子量１５０，０００
以上の画分の分画操作を実行することにより、これらの
主要な抗原サブユニットを高純度に分画精製しているも
のと推測している。

【００３７】本発明における分子量とはネイティブな状
態の分子量である。本発明の分子量の決定は限定的でな
いが、ゲル濾過法が好適に用いられる。例えば、ゲル濾
過法による分子量検定では抗原の立体構造によっても分
子量は多少変化するので、分子量の検定では以下のよう
に実施することとする。固定相は排除限界分子量８００
０，０００のセファクリルＳ−４００（ファルマシア社
製）を用い、溶媒はＴＰ菌液の可溶化時に用いた菌可溶
化剤と同一組成を用いる。分子量マーカーで溶出時間を
検定した後、本発明に従って製造した梅毒抗原の分子量
を検定する。分子量マーカーの分子量と溶出時間より検
量線を作成し、梅毒抗原の分子量を算出する。

【００３８】本製造法で製造した梅毒抗原は特異性が高
く、且つ高純度の梅毒検査用試薬に用いることのできる
抗原である。本発明の製造方法に基づいて製造された梅
毒抗原は梅毒感染症患者の体液中に存在する特異抗体と
抗原抗体反応で反応する抗原性有する成分を指す。該梅
毒抗原は上記梅毒トレポネーマ菌の感染に起因する梅毒
の診断用検査試薬の抗原として用いる。

【００３９】本発明における分子量分画の方法は分子量
１５０，０００以上の分画が可能な方法ならば、特に限
定されない。例えば、ゲル濾過法、限外濾過法等が挙げ
られる。特に繰り返し使用できるゲル濾過法が好適に用
いられる。ゲル濾過に用いられる固定層は分子量１５
０，０００以上の画分を分画できるものであれば、何ら
制限を受けない。排除限界分子量が１５０，０００付近
である固定層を用いて、排除限界分子量以上（ボイド画
分）において抗原性を有する成分を回収できれば、操作
が簡易で有用である。例えば、固定相として排除限界分
子量１５０，０００のセファクリルＳ−３００ＨＲ（フ
ァルマシア社製）、及び溶媒として２％オクチルグルコ
シド含有ＰＢＳを用いた場合、分子量１５０，０００以
上のタンパクはボイド画分に回収される。

【００４０】さらに限外濾過法による分画では、分画分
子量１５０，０００のものを用いれば、分画操作が簡便
である。例えば、分画分子量１５０，０００の限外濾過
膜で上記可溶溶液を濾過し、その未濾過画分に梅毒抗原
が回収される。

【００４１】上記可溶溶液に含まれる抗原性を有する成
分はＴＰ菌内では不溶性であり、分画操作の溶媒はＴＰ
菌の可溶化処理に用いたものと同一組成の菌可溶化剤を
含有するもので実施するのことが好適である。なお、ゲ
ル濾過法におけるの固定相、及び限外濾過法におけるフ
ィルターへの梅毒抗原の吸着を防止するために、０．１
５Ｍ以上のイオン強度を持つ溶媒での分画操作が好適で
ある。

【００４２】梅毒検査用試薬とは抗原抗体反応を応用し
た梅毒の免疫学的診断薬であり、例えば、マイクロタイ
ター試薬、ラテックス凝集試薬、免疫比濁試薬、酵素免
疫試薬等が含まれる。本発明ではマイクロタイター試
薬、ラテックス凝集試薬など抗原抗体反応を凝集反応で
捉える試薬であるで有効である。

【００４３】通常、この溶液状態のまま梅毒抗原として
用い、必要に応じて生理食塩水、ＰＢＳ等で希釈、ある
いは濃縮して後述の不溶性担体の感作操作に供する。該
抗原溶液には可溶化に用いた菌可溶化剤を含んでいても
よいが、必要ならば透析等で除去すればよい。

【００４４】本発明の製造方法によって得られる梅毒抗
原は不溶性担体に担持して梅毒検査用試薬を製造するこ
とができる。該不溶性担体粒子としては公知の免疫学的
凝集法の診断試薬に用いることができる担体が制限なく
使用できる。例えば、核部となる無機質化合物に染料を
被覆させた高比重複合粒子（特開昭６２ー１１５３６６
参照、以下、ＨＤＰとも略記する）、羊赤血球、ポリス
チレン粒子、ゼラチン粒子、ポリアミノ酸粒子等が挙げ
られる。中でもＨＤＰ及び赤血球は梅毒抗原の吸着量が
多く好適に用いられる。

【００４５】また、不溶性担体の粒子径も免疫学的凝集
法診断試薬として用いうる公知の範囲のものならば特に
制限されないが、通常、粒子径０．０１μｍから３μｍ
までのものが好適に用いられる。不溶性担体の比重は
１．０以上であればよいが、特に沈降反応を利用したマ
イクロタイター試薬用担体粒子は比重が大きい程、沈降
速度が速く判定時間が短縮化できるので１．５以上のも
のが好適に用いられる。

【００４６】本発明での製造した梅毒抗原の不溶性担体
への担持とは、不溶性担体に感作物質としての抗原剤等
を吸着させることである。

【００４７】具体的な担持方法としては、感作物質を溶
解した緩衝溶液中に不溶性担体を分散、混合して感作物
質を不溶性担体上に担持した後余剰の感作物質を遠心洗
浄で除去し次いでブロッキング剤を同様にして担持する
方法が用いられる。

【００４８】不溶性担体に感作物質を担持する方法とし
ては疎水吸着法等の物理的吸着法、塩化クロム法等の化
学的吸着法等の公知の方法が採用されが、感作物質は不
溶性担体上に担持されたのち被検体中の測定目的物質と
抗原抗体反応により結合をするため感作物質はできるだ
け穏やかな条件で担持することが必要であり、そのため
疎水的吸着法が特に好適に用いられる。

【００４９】上記疎水的吸着法による担持は、緩衝作用
のある緩衝液中に不溶性担体と吸着物質を分散させた状
態で行う。該緩衝液は燐酸緩衝液、グリシン緩衝液、ト
リス緩衝液、酢酸緩衝液等など緩衝作用のあるものなら
ば制限なく用いることができる。緩衝液のｐＨについて
は担持させる吸着物質によりそれぞれ最適な範囲を選択
して採用するが、一般に中性領域ｐＨ６．０〜ｐＨ８．
０が望ましい。不溶性担体に吸着物質を担持させる時間
は吸着物質が均一的に不溶性担体表面に担持されるのに
十分な時間であればよいが、例えば梅毒抗原をＨＤＰの
疎水吸着法で行う場合は３０分間以上で十分である。さ
らに温度に関しても担持する吸着物質が熱変性を受けな
い範囲即ち１℃以上８０℃以下が採用される。

【００５０】さらに不溶性担体へのブロッキング剤の担
持も上述の感作物質の担持と同様の方法を採用すること
ができる。

【００５１】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。ただし、これらの実施例により本発明の技術的範囲
が限定されるものではない。

【００５２】参考例１ タンパク濃度の定量法 タンパク濃度の定量方法はローリー法（Ｌｏｗｒｙ ｅ
ｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１９３，
ｐ２６５（１９５１））で行った。すなわち、タンパク
量５〜１００μｇを含む溶液０．２ｍｌを試験管にと
り、炭酸ナトリウム−アルカリ性銅試薬１ｍｌを加えて
混合した。室温で１０分間放置後、水で２倍に希釈した
フェノール試薬を０．１ｍｌを加えて直ちに混和し、３
０分間放置後、７５０ｎｍでの吸光度を測定した。標準
曲線は牛血清アルブミンを用いて作成した。

【００５３】参考例２ 抗原価の測定方法 抗原性の評価はドットブロット法で行った。測定手順は
以下の通り。

【００５４】（１） 被検体である抗原液をＰＢＳで
１，２，５，１０，２０，５０，１００，２００，５０
０倍に希釈してニトロセルロースフィルター（ミリポア
社製、HAHY00010）上に２μｌずつスポットした（２枚
用意する）。

【００５５】（２） フィルターを風乾したのち、１０
％スキムミルクを０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有０．１
Ｍトリス緩衝液，ｐＨ７．５（以下、ＴＢＳと略記す
る）に溶解したブロッキング溶液に浸し、３７℃、１時
間ブロッキングを行った。

【００５６】（３） １次抗体として健常者血清、及び
患者血清をＴＢＳでそれぞれ２５倍希釈して血清希釈液
を作製し、これにブロッキングをしたニトロセルロース
を１枚ずつ浸し、３７℃、１時間反応させた。

【００５７】（４） （３）のニトロセルロースフィル
ターを０．１％トゥイーン８０（ｔｗｅｅｎ８０）含有
ＴＢＳで３回洗浄した。

【００５８】（５） ２次抗体としてアビジン標識抗ヒ
トＩｇＧ（フナコシ社製）とアビジン標識抗ヒトＩｇＭ
（フナコシ社製）をそれぞれＴＢＳで４００倍希釈して
２次抗体液を調製し（４）の洗浄済みニトロセルロース
フィルターを浸して３７℃、１時間反応させた。

【００５９】（６） （４）と同様に洗浄操作を行っ
た。

【００６０】（７） 酵素標識としてビオチン化パーオ
キシダーゼをＴＢＳで２００倍希釈して（６）の洗浄済
みニトロセルロースフィルターを浸して３７℃、３０分
間反応させた。

【００６１】（８） （４）と同様に洗浄を行った。

【００６２】（９） ０．１％ジアミノベンチジン水溶
液に３０％過酸化水素液を１／２０添加しニトロセルロ
ースフィルターに作用させ発色させた。１次抗体に患者
血清を用いたニトロセルロースフィルターにおいて発色
の確認できた抗原液の最高希釈倍率を抗原価とし、抗原
性の強さの指標とした。なお、１次抗体で健常者血清を
用いたニトロセルロースフィルターにおいて発色した最
高希釈倍率を対照値とし、夾雑物による非特異反応の程
度を表す指標とした。

【００６３】実施例１ （１）ＴＰ菌の培養 ＴＰ菌の培養は以下のようなミラーらの方法（Ｍｉｌｌ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．９６，ｐ４５０（１９６６））
に従って、培養集菌を行った。すなわち、家兎睾丸にＴ
Ｐ菌を１１〜１４日間、接種し増殖させ、家兎睾丸をハ
サミで切断して生理食塩水で懸濁してＴＰ菌を抽出し
た。抽出液を２００×ｇで１５分間遠心して睾丸組織の
大きな破片を沈澱除去した。続いて、１９，０００×ｇ
で９０分間遠心してＴＰ菌を沈澱させ、このＴＰ菌を生
理食塩水の懸濁したものをＴＰ菌の菌懸濁液とした。

【００６４】（２）凍結融解によるＴＰ菌の破砕 上記ＴＰ菌の菌数を細菌計数盤（Ｃ．Ａ．Ｈａｕｓｓｅ
ｒ＆Ｓｏｎ社製細菌計数器）、暗視野顕微鏡にて測定し
たところ、３×１０⁹細胞／ｍｌであった。ＴＰ菌液１
ｍｌをスピッツ管（栄研機材）に入れた。続いて、上記
スピッツ管を液体窒素に３０秒間接触させて凍結したの
ち、３７℃恒温水槽に３分間入れて融解した。この操作
を３回繰り返して凍結融解によりＴＰ菌を破砕し、破砕
物懸濁液を得た。

【００６５】（３）遠心分離によるＴＰ菌の分画 上記破砕物懸濁液に１０，０００×ｇ、３０分間の遠心
分離を施し、夾雑物質を含む可溶性成分と分画してＴＰ
菌を含む不溶性成分を得た。

【００６６】（４）遠心洗浄によるＴＰ菌の洗浄 この不溶性成分にＰＢＳ、２ｍｌを添加して１０，００
０×ｇ、３０分間遠心分離を行い、ＴＰ菌含有可溶性成
分を遠心洗浄した。この遠心洗浄操作を３回繰り返しの
ち、洗浄済み不溶性成分とした。 （５）界面活性剤のよるＴＰ菌の可溶化 上記洗浄済み不溶性成分にＰＢＳに溶解した１％オクチ
ルグルコシドを２ｍｌ添加して３７℃、１時間可溶化を
行った。可溶化後、１０，０００×ｇ、３０分間遠心分
離を行い、遠心上清の可溶性成分２ｍｌを梅毒抗原可溶
溶液として得た。

【００６７】（６）ゲル濾過カラムによる準備 ゲル濾過に用いた固定相の樹脂は、セファクリルＳ−３
００（ファルマシア社製、排除限界分子量１５０，００
０）である。溶媒は実施例１でＴＰ菌の菌可溶化剤とし
て用いた１％オクチルグルコシドをＰＢＳに溶解したも
のを用いた。

【００６８】セファクリルＳ−３００をφ１０ｍｍ×５
００ｍｍのガラス製カラムの充填して、溶媒で十分洗浄
した。流速は１ｍｌ／ｈｒ。

【００６９】（７）可溶溶液の分子量分画 梅毒抗原を含む可溶溶液を１０倍に濃縮し、２００μｌ
をカラムの最上部に静かに重層し、分画を開始した。ゲ
ル濾過カラムより溶出した溶出液を１ｍｌずつフラクシ
ョンコレクターで回収した。なお、溶出したタンパク濃
度を紫外吸収を測定した（表１参照）。

【００７０】（８）分画した画分の分析 （２）で分画したサンプルのタンパク濃度は参考例１、
抗原性は参考例２に従って測定した。参考例１に従って
タンパク定量を測定した結果、タンパクはフラクション
Ｎｏ．１１付近から検出されはじめ、Ｎｏ．１４付近と
フラクションＮｏ．３１付近に２分化してされていた。
参考例２に従って抗原性を検定した結果、抗原性はフラ
クションＮｏ．１４付近に集中していた。フラクション
Ｎｏ．１１からＮｏ．１５を集めて、２ｍｌに濃縮して
梅毒抗原を得た。

【００７１】（９）得られた梅毒抗原の評価 参考例１に従いタンパク定量を行ったところ、０．１７
ｍｇ／ｍｌであった。さらに、参考例２に従って抗原価
を測定したところ、抗原価は１００倍であった。非特異
反応の指標となる対照値は１倍であった。

【００７２】（１０）試薬化及び性能評価 直径１．８μｍのＨＤＰ（(株)トクヤマ製品）をＰＢＳ
で２．５（ｗ／ｗ）％になるように懸濁し、ＨＤＰ懸濁
液とした。実施例（１）から（９）で調製した梅毒抗原
を１０倍希釈して抗原溶液とした。上記ＨＤＰ懸濁液１
ｍｌと抗原溶液１ｍｌを試験管内で混合して室温で１時
間放置してＨＤＰ表面に疎水的に担持させた（以下、こ
の吸着操作を感作とも略記する）。

【００７３】その後、余剰の梅毒抗原を除去するため
に、上記混合液に２，５００ｒｐｍ、５分間遠心分離を
施し、遠心上清を除去した。その遠心沈澱物に洗浄のた
め、ＰＢＳ２ｍｌを添加、懸濁後２，５００ｒｐｍ、５
分間遠心後上清を除去した。上記梅毒検査試薬用抗原を
吸着させたＨＤＰを梅毒抗原感作粒子とした。

【００７４】梅毒抗原感作粒子（５０ｍｇ）に１％牛血
清アルブミン（以下、ＢＳＡとも略記する）、２ｍｌを
添加して３７℃で３時間ブロッキングを行った。ブロッ
キング後、上記懸濁液に２，５００ｒｐｍ、５分間遠心
分離を施し、遠心上清を除去した。上記操作でブロッキ
ング操作を完了し、梅毒検査用試薬を調製した。この梅
毒検査用試薬を３（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％正常ウサギ血清
含有ＰＢＳ（以下、Ａ液とも略記する）に０．５（ｗ／
ｖｏｌ）％になるように懸濁して梅毒検査用試薬懸濁液
として以下の測定操作に供した。

【００７５】一方、検査に用いる検体をＡ液で５倍より
順次倍数希釈した。次に、検体の希釈液を９６穴マイク
ロタイタープレートに各々２５μｌずつ１穴から１２穴
まで滴下した。ついで、上記で梅毒検査用試薬懸濁液を
各穴２５μｌを滴下した。滴下後、プレートミキサーで
振とうして３０分間静置したのち、管底凝集像を観察し
た。

【００７６】上記のように調製した梅毒検査試薬の性能
評価を健常者検体３検体、１、２、３、及び梅毒患者検
体３検体、Ａ、Ｂ、Ｃを用いて行った。結果を表２に示
した。健常者検体では３検体いずれも２０倍希釈でも陽
性像が検出されなかった。梅毒患者検体では陽性検体Ａ
で１６０倍希釈、陽性検体Ｂで３２０倍希釈、陽性検体
Ｃで１２８０倍希釈まで陽性像が検出できた。試薬化の
検討で、健常者検体で凝集反応を示さず、梅毒患者検体
で適切な感度が得られた。ゲル濾過による分子量分画に
より、梅毒抗原の純度が向上し、夾雑物質が除去できた
と考えられる。

【００７７】比較例１ （１）ＴＰ菌の培養、（２）凍結融解によるＴＰ菌の破
砕、（３）遠心分離によるＴＰ菌の分画、（４）遠心洗
浄によるＴＰ菌の洗浄、（５）界面活性剤によるＴＰ菌
の可溶化は実施例１に準じて実施した。但し、ゲル濾過
カラムによる分画は行わなかった。

【００７８】（６）抗原性の評価 参考例１に従いタンパク定量を行ったところ、０．７０
ｍｇ／ｍｌであった。さらに、参考例２に従って抗原価
を測定したところ、抗原価は１００倍であった。非特異
反応の指標となる対照値は２倍であった。このことより
夾雑物質が存在していることが示唆された。実施例１で
調製した梅毒抗原と比較して抗原性は変わらず、タンパ
ク濃度は約４倍となっている。梅毒抗原の分子量分画に
より梅毒抗原は純度が可溶溶液と比較して４倍となって
いるといえる。

【００７９】（７）試薬化及び性能評価 試薬は実施例１の（１０）試薬化及び性能評価に従って
実施した。

【００８０】上記のように調製した梅毒検査試薬の性能
評価を健常者検体３検体、１、２、３梅毒患者検体３検
体、Ａ、Ｂ、Ｃを用いて行った。結果を表２に示した。
健常者検体は３検体すべてが２０倍で陽性像が検出され
た。梅毒患者検体では陽性検体Ａで１６０倍希釈、陽性
検体Ｂで３２０倍希釈、陽性検体Ｃで１２８０倍希釈ま
で陽性像が検出できた。健常者検体のうち１検体では低
希釈倍率で凝集反応を示し、若干の非特異的反応が見ら
れた。これは梅毒抗原に含まれる若干の夾雑物質が含ま
れている影響と考えられる。

【００８１】分子量１５０，０００の分子量分画を実施
することで、梅毒抗原の純度は向上することが示され
た。

【００８２】比較例２ （１）ＴＰ菌の培養、（２）凍結融解によるＴＰ菌の破
砕、（３）遠心分離によるＴＰ菌の分画、（４）遠心洗
浄によるＴＰ菌の洗浄、（５）界面活性剤によるＴＰ菌
の可溶化、（６）ゲル濾過カラムによる準備（７）可溶
溶液の分子量分画は実施例１に準じて実施した。

【００８３】（８）分画した画分の分析 分画したサンプルのタンパク濃度は参考例１、抗原性は
参考例２に従って測定した。参考例１に従って、タンパ
ク定量を行ったところ、タンパクはフラクションＮｏ．
１１よりタンパクが検出されはじめ、フラクションＮ
ｏ．１４付近とフラクションＮｏ．３１付近に２分化し
ていた。参考例２に従って抗原性を検定した結果、抗原
性はフラクションＮｏ．１４付近に集中していた。

【００８４】分画分子量が１５０，０００以下の画分を
抗原とするため、フラクションＮｏ．１５からＮｏ．３
２までを集めて２ｍｌに濃縮し抗原とした。

【００８５】（４）得られた梅毒抗原の評価 参考例１に従いタンパク定量を行ったところ、０．５１
ｍｇ／ｍｌであった。さらに、参考例２に従って抗原価
を測定したところ、抗原価は２倍、非特異反応の指標と
なる対照値は２倍もあった。抗原性はほとんど存在せ
ず、可溶溶液のタンパクのうち７５％が回収された。

【００８６】以下の梅毒検査用試薬の調製方法のうち、
感作、洗浄操作、ブロッキング操作、測定操作は実施例
１の（７）から（１０）に準して行った。

【００８７】（１１）梅毒検査試薬の評価結果 上記のように調製した梅毒検査試薬の性能評価を健常者
検体３検体、１、２、３、及び梅毒患者検体３検体、
Ａ、Ｂ、Ｃを用いて行った。結果を表２に示した。健常
者検体では３検体のうち、２検体では２０倍希釈でも陽
性像が検出されなかったのに対して１検体は２０倍で弱
い凝集反応が観察された。梅毒患者検体では陽性検体
Ａ、Ｂ、Ｃいずれも１倍希釈でも陽性像は検出されなか
った。試薬化の検討で、梅毒患者検体で反応が得られな
っかたことより、分子量１５０，０００以下の画分には
抗原性は存在しない。

【００８８】

【表１】

【００８９】

【表２】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 梅毒トレポネーマ菌を懸濁させた液に菌
   可溶化剤を加えて可溶化処理を行った後、不溶性成分を
   除去し、次いで可溶溶液から分子量が１５０，０００以
   上の画分を梅毒抗原として分画することを特徴とする梅
   毒抗原の製造方法。