JPH1019894A - 血漿中物質の高感度酵素免疫測定法 - Google Patents
血漿中物質の高感度酵素免疫測定法Info
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- JPH1019894A JPH1019894A JP16956796A JP16956796A JPH1019894A JP H1019894 A JPH1019894 A JP H1019894A JP 16956796 A JP16956796 A JP 16956796A JP 16956796 A JP16956796 A JP 16956796A JP H1019894 A JPH1019894 A JP H1019894A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 血漿中物質、特に血漿中薬物を数ｐｇ／ｍｌ
オーダーまで正確に測定でき、測定値がばらつかない高
感度酵素免疫測定法を提供する。 【解決手段】 血漿を溶媒抽出し、該溶媒抽出物を濃縮
した後、加熱処理し、次いで、血漿中の測定目的物質
（例、インドメタシン）より分子量排除が大きい限外濾
過膜（例、疎水性の限外濾過膜）を用いて濾過して濾液
を得、該濾液中の測定目的物質を、酵素免疫測定法で測
定することを特徴とする。
オーダーまで正確に測定でき、測定値がばらつかない高
感度酵素免疫測定法を提供する。 【解決手段】 血漿を溶媒抽出し、該溶媒抽出物を濃縮
した後、加熱処理し、次いで、血漿中の測定目的物質
（例、インドメタシン）より分子量排除が大きい限外濾
過膜（例、疎水性の限外濾過膜）を用いて濾過して濾液
を得、該濾液中の測定目的物質を、酵素免疫測定法で測
定することを特徴とする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は血漿中物質の高感度
酵素免疫測定法、特に血漿中の薬物の高感度酵素免疫測
定法に関する。
酵素免疫測定法、特に血漿中の薬物の高感度酵素免疫測
定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】血漿中物質の測定方法は、従来から液体
クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィーなどのク
ロマトグラフィーによる分析が知られているが、これら
の測定法では、ｎｇ／ｍｌまでの測定が限度であり、血
漿中物質が薬物である場合、感度が低すぎるといった問
題があった。この問題を解決するために、特開昭５７−
１８４９７０号公報、及び「酵素免疫測定法」，第３
版，（株）医学書院発行（１９８７）には、薬物を酵素
免疫測定法により測定する方法が提案されているが、こ
の方法は、薬物と、該薬物に酵素が結合したコンジュゲ
ートとを、第一抗体へ競合結合させ、該薬物結合第１抗
体及びコンジュゲート結合第１抗体を第二抗体結合担体
に結合させて、第二抗体結合担体に結合したコンジュゲ
ートを酵素反応により測定して、薬物の量を測定する方
法であり、この測定方法では、数１００ｐｇ／ｍｌオー
ダーまで測定可能である。
クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィーなどのク
ロマトグラフィーによる分析が知られているが、これら
の測定法では、ｎｇ／ｍｌまでの測定が限度であり、血
漿中物質が薬物である場合、感度が低すぎるといった問
題があった。この問題を解決するために、特開昭５７−
１８４９７０号公報、及び「酵素免疫測定法」，第３
版，（株）医学書院発行（１９８７）には、薬物を酵素
免疫測定法により測定する方法が提案されているが、こ
の方法は、薬物と、該薬物に酵素が結合したコンジュゲ
ートとを、第一抗体へ競合結合させ、該薬物結合第１抗
体及びコンジュゲート結合第１抗体を第二抗体結合担体
に結合させて、第二抗体結合担体に結合したコンジュゲ
ートを酵素反応により測定して、薬物の量を測定する方
法であり、この測定方法では、数１００ｐｇ／ｍｌオー
ダーまで測定可能である。
【０００３】しかし、薬物を軟膏剤、ローション剤、貼
付剤などの剤型で使用した場合、薬物の血中濃度は、数
ｐｇ／ｍｌオーダー以下まで要求されるので、上記酵素
免疫測定法では、測定が困難であるという問題点があっ
た。
付剤などの剤型で使用した場合、薬物の血中濃度は、数
ｐｇ／ｍｌオーダー以下まで要求されるので、上記酵素
免疫測定法では、測定が困難であるという問題点があっ
た。
【０００４】上記問題を解決する方法として血漿中物質
を溶媒抽出した濃縮物を酵素免疫測定法で測定する方法
があるが、測定目的物質以外の血漿中成分の濃縮物の混
入、特に濃縮された脂質の混入により抗原抗体反応及び
酵素反応が阻害される、測定値がばらつくといった問題
があった。
を溶媒抽出した濃縮物を酵素免疫測定法で測定する方法
があるが、測定目的物質以外の血漿中成分の濃縮物の混
入、特に濃縮された脂質の混入により抗原抗体反応及び
酵素反応が阻害される、測定値がばらつくといった問題
があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題点
に着眼してなされたものであり、血漿中物質、特に血漿
中薬物を数ｐｇ／ｍｌオーダーまで正確に測定でき、測
定値がばらつかない高感度酵素免疫測定法を提供するこ
とを目的とする。
に着眼してなされたものであり、血漿中物質、特に血漿
中薬物を数ｐｇ／ｍｌオーダーまで正確に測定でき、測
定値がばらつかない高感度酵素免疫測定法を提供するこ
とを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】請求項１記載の高感度酵
素免疫測定法（請求項１記載の発明を本発明１という）
は、血漿を溶媒抽出し、該溶媒抽出物を濃縮した後、加
熱処理し、次いで、血漿中の測定目的物質より分子量排
除が大きい限外濾過膜を用いて濾過して濾液を得、該濾
液中の測定目的物質を、酵素免疫測定法で測定すること
を特徴とする。
素免疫測定法（請求項１記載の発明を本発明１という）
は、血漿を溶媒抽出し、該溶媒抽出物を濃縮した後、加
熱処理し、次いで、血漿中の測定目的物質より分子量排
除が大きい限外濾過膜を用いて濾過して濾液を得、該濾
液中の測定目的物質を、酵素免疫測定法で測定すること
を特徴とする。
【０００７】請求項２記載の高感度酵素免疫測定法（請
求項２記載の発明を本発明２という）は、血漿を溶媒抽
出し、該溶媒抽出物を濃縮した後、加熱処理し、次い
で、血漿中の低分子物質である測定目的物質より分子量
排除が大きい限外濾過膜を用いて濾過して濾液を得、該
濾液中の測定目的物質及び上記測定目的物質と酵素との
コンジュゲートを、該測定目的物質に対する第１抗体へ
競合結合させ、次いで、該測定目的物質結合第１抗体及
び該コンジュゲート結合第１抗体を第２抗体結合担体に
結合させ、次いで、第２抗体結合担体に結合されたコン
ジュゲートの酵素活性を測定することにより、該測定目
的物質の量を測定することを特徴とする。
求項２記載の発明を本発明２という）は、血漿を溶媒抽
出し、該溶媒抽出物を濃縮した後、加熱処理し、次い
で、血漿中の低分子物質である測定目的物質より分子量
排除が大きい限外濾過膜を用いて濾過して濾液を得、該
濾液中の測定目的物質及び上記測定目的物質と酵素との
コンジュゲートを、該測定目的物質に対する第１抗体へ
競合結合させ、次いで、該測定目的物質結合第１抗体及
び該コンジュゲート結合第１抗体を第２抗体結合担体に
結合させ、次いで、第２抗体結合担体に結合されたコン
ジュゲートの酵素活性を測定することにより、該測定目
的物質の量を測定することを特徴とする。
【０００８】請求項３記載の高感度酵素免疫測定法（請
求項３記載の発明を本発明３という）は、測定目的物質
より分子量排除が大きい限外濾過膜が、疎水性の限外濾
過膜である本発明１又は本発明２である。
求項３記載の発明を本発明３という）は、測定目的物質
より分子量排除が大きい限外濾過膜が、疎水性の限外濾
過膜である本発明１又は本発明２である。
【０００９】本発明１で使用される血漿としては、ヒト
血漿に限らずあらゆる動物の血漿が挙げられる。
血漿に限らずあらゆる動物の血漿が挙げられる。
【００１０】本発明１でいう溶媒抽出は、上記血漿の溶
媒抽出であり、使用する溶媒としては、血漿中の物質を
抽出できる溶媒であれば特に限定されないが、抽出操作
の簡便さから抽出後に血漿層と溶媒層との２層に分離す
る溶媒が好ましい。この様な溶媒としては、例えば、ア
セトン、酢酸エチル、塩化メチレン、クロロホルム、ヘ
キサン、シクロヘキサン、ベンゼン等の溶媒；及びこれ
らの溶媒と他の溶媒との混合溶媒などが挙げられる。
媒抽出であり、使用する溶媒としては、血漿中の物質を
抽出できる溶媒であれば特に限定されないが、抽出操作
の簡便さから抽出後に血漿層と溶媒層との２層に分離す
る溶媒が好ましい。この様な溶媒としては、例えば、ア
セトン、酢酸エチル、塩化メチレン、クロロホルム、ヘ
キサン、シクロヘキサン、ベンゼン等の溶媒；及びこれ
らの溶媒と他の溶媒との混合溶媒などが挙げられる。
【００１１】上記抽出とは、血漿をそのまま、又は緩衝
液、水などで希釈したものに、上記溶媒を加えて、通常
の抽出操作を行うことである。
液、水などで希釈したものに、上記溶媒を加えて、通常
の抽出操作を行うことである。
【００１２】本発明１でいう濃縮とは、上記溶媒抽出物
の溶媒を蒸発させて、抽出物の濃度を高めた濃縮液を得
ることである。濃縮法としては、溶媒を濃縮操作で蒸発
乾固して、その乾固物をもとの血漿の容量より少ない容
量の緩衝液又は水などに溶解するか又は懸濁するのが好
ましい。
の溶媒を蒸発させて、抽出物の濃度を高めた濃縮液を得
ることである。濃縮法としては、溶媒を濃縮操作で蒸発
乾固して、その乾固物をもとの血漿の容量より少ない容
量の緩衝液又は水などに溶解するか又は懸濁するのが好
ましい。
【００１３】本発明１でいう加熱処理は、上記濃縮液中
のタンパク質及び脂質を変性させるために行う処理であ
り、条件としては、通常、この目的に用いられる温度と
時間が用いられ、好ましくは９０℃以上で５〜１０分間
である。上記加熱処理後、変性タンパク質及び脂質を取
り除くために遠心分離し、変性タンパク質及び脂質と濃
縮液とを分離することが好ましい。
のタンパク質及び脂質を変性させるために行う処理であ
り、条件としては、通常、この目的に用いられる温度と
時間が用いられ、好ましくは９０℃以上で５〜１０分間
である。上記加熱処理後、変性タンパク質及び脂質を取
り除くために遠心分離し、変性タンパク質及び脂質と濃
縮液とを分離することが好ましい。
【００１４】本発明１で使用される限外濾過膜として
は、分子量排除が測定目的物質より大きい親水性又は疎
水性の限外濾過膜であり、好ましくは、疎水性の限外濾
過膜である。上記限外濾過膜は、測定目的物質自体を分
離する場合は、好ましくは、分子量排除が測定目的物質
の分子量より大きく１００万以下のものが用いられる。
例えば、測定目的物質の分子量が１０００未満の場合
は、分子量排除が１０００〜１００万のものが用いられ
る。
は、分子量排除が測定目的物質より大きい親水性又は疎
水性の限外濾過膜であり、好ましくは、疎水性の限外濾
過膜である。上記限外濾過膜は、測定目的物質自体を分
離する場合は、好ましくは、分子量排除が測定目的物質
の分子量より大きく１００万以下のものが用いられる。
例えば、測定目的物質の分子量が１０００未満の場合
は、分子量排除が１０００〜１００万のものが用いられ
る。
【００１５】本発明１でいう血漿中の測定目的物質とし
ては、血漿中に存在し、加熱変性しない物質であり、血
漿中の低分子物質及び薬物などが挙げられ、好ましくは
分子量が１０００以下の低分子薬物が挙げられる。
ては、血漿中に存在し、加熱変性しない物質であり、血
漿中の低分子物質及び薬物などが挙げられ、好ましくは
分子量が１０００以下の低分子薬物が挙げられる。
【００１６】本発明１でいう酵素免疫測定法は、酵素活
性を標識として抗原抗体反応を追跡し、これから抗原又
は抗体の量を定量する、公知の酵素免疫測定法のいずれ
も可能であり、その代表的な測定法としては競合型測定
法、非競合型測定法、均質法（Ｂ／Ｆ分離が不必要な測
定法）などが挙げられるが、この内、低分子薬物の分析
に用いられ、血漿成分の妨害が起こり易い非競合型測定
法に本発明１は特に適している。
性を標識として抗原抗体反応を追跡し、これから抗原又
は抗体の量を定量する、公知の酵素免疫測定法のいずれ
も可能であり、その代表的な測定法としては競合型測定
法、非競合型測定法、均質法（Ｂ／Ｆ分離が不必要な測
定法）などが挙げられるが、この内、低分子薬物の分析
に用いられ、血漿成分の妨害が起こり易い非競合型測定
法に本発明１は特に適している。
【００１７】上記酵素免疫測定法に用いられる標識用の
酵素としては、測定目的物質や抗体などを標識可能なも
のであれば、特に限定されないが、例えば、ペルオキシ
ダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼなどが挙げられる。
酵素としては、測定目的物質や抗体などを標識可能なも
のであれば、特に限定されないが、例えば、ペルオキシ
ダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼなどが挙げられる。
【００１８】本発明１の酵素免疫測定法は、初めに血漿
を溶媒抽出し、該溶媒抽出物を濃縮装置で濃縮し濃縮物
を得る。次に、その濃縮物に緩衝液又は水を添加して溶
液又は懸濁液にし、その溶液又は懸濁液を加熱処理して
タンパク質、脂質などを変性させ、次いで、測定目的物
質より分子量排除が大きい限外濾過膜に通し、タンパク
質、脂質を取り除く。タンパク質、脂質が取り除かれた
濾液を被検試料として、酵素免疫測定法で測定すること
により血漿中の測定目的物質の量を求める。
を溶媒抽出し、該溶媒抽出物を濃縮装置で濃縮し濃縮物
を得る。次に、その濃縮物に緩衝液又は水を添加して溶
液又は懸濁液にし、その溶液又は懸濁液を加熱処理して
タンパク質、脂質などを変性させ、次いで、測定目的物
質より分子量排除が大きい限外濾過膜に通し、タンパク
質、脂質を取り除く。タンパク質、脂質が取り除かれた
濾液を被検試料として、酵素免疫測定法で測定すること
により血漿中の測定目的物質の量を求める。
【００１９】本発明２で使用される血漿及び限外濾過膜
は、本発明１で使用されるものと同じである。本発明２
でいう溶媒抽出及び加熱処理は、本発明１と同じ操作で
ある。
は、本発明１で使用されるものと同じである。本発明２
でいう溶媒抽出及び加熱処理は、本発明１と同じ操作で
ある。
【００２０】本発明２でいう血漿中の測定目的物質とし
ては、血漿中に存在し、加熱変性しない物質であり、血
漿中の低分子物質に限定され、例えば、分子量が１００
０以下の低分子薬物が挙げられる。低分子薬物として
は、例えば、治療のために投与されたインドメタシンが
挙げられる。
ては、血漿中に存在し、加熱変性しない物質であり、血
漿中の低分子物質に限定され、例えば、分子量が１００
０以下の低分子薬物が挙げられる。低分子薬物として
は、例えば、治療のために投与されたインドメタシンが
挙げられる。
【００２１】本発明２で使用されるコンジュゲートは、
測定目的物質に標識用酵素が結合したものであり、上記
測定目的物質と標識用酵素との結合としては、測定目的
物質と標識用酵素の直接結合、架橋試薬を介しての結合
などが挙げられるが、好ましくは架橋試薬を介しての結
合である。なお、標識用酵素としては、本発明１で用い
られる酵素と同様である。
測定目的物質に標識用酵素が結合したものであり、上記
測定目的物質と標識用酵素との結合としては、測定目的
物質と標識用酵素の直接結合、架橋試薬を介しての結合
などが挙げられるが、好ましくは架橋試薬を介しての結
合である。なお、標識用酵素としては、本発明１で用い
られる酵素と同様である。
【００２２】上記測定目的物質と標識用酵素の直接結合
は、好ましくは、測定目的物質のカルボキシル基もしく
は、アミノ基と標識用酵素のアミノ基もしくは、カルボ
キシル基の反応によって生じるペプチド結合である。
は、好ましくは、測定目的物質のカルボキシル基もしく
は、アミノ基と標識用酵素のアミノ基もしくは、カルボ
キシル基の反応によって生じるペプチド結合である。
【００２３】上記架橋試薬としては、タンパク質の架橋
試薬として使用されるものが使用され、例えば、グルタ
ルアルデヒド、過ヨウ素酸、マレイミド基を有する化合
物、ピリジル・ジスルフィド基を有する化合物が挙げら
れる。
試薬として使用されるものが使用され、例えば、グルタ
ルアルデヒド、過ヨウ素酸、マレイミド基を有する化合
物、ピリジル・ジスルフィド基を有する化合物が挙げら
れる。
【００２４】本発明２で使用される第１抗体は、測定目
的物質又は測定目的物質に牛血清アルブミンなどの高分
子化合物を結合したものを、ウサギなどの動物に免疫し
て得られた抗体である。
的物質又は測定目的物質に牛血清アルブミンなどの高分
子化合物を結合したものを、ウサギなどの動物に免疫し
て得られた抗体である。
【００２５】本発明２で使用される第２抗体は、第１抗
体作製の際に使用したウサギなどの動物の免疫グロブリ
ンであるＩｇＧを異種の動物、例えばヤギなどの動物に
免疫して得られた抗体である。
体作製の際に使用したウサギなどの動物の免疫グロブリ
ンであるＩｇＧを異種の動物、例えばヤギなどの動物に
免疫して得られた抗体である。
【００２６】本発明２で使用される第２抗体結合担体に
おいて、担体としては、酵素免疫測定法に使用されてい
る公知の担体のいずれも使用可能であり、例えば、プラ
スチックビーズやプレートが挙げられる。第２抗体と担
体との結合方法は、酵素免疫測定法に使用されている公
知の方法のいずれも用いられ得る。
おいて、担体としては、酵素免疫測定法に使用されてい
る公知の担体のいずれも使用可能であり、例えば、プラ
スチックビーズやプレートが挙げられる。第２抗体と担
体との結合方法は、酵素免疫測定法に使用されている公
知の方法のいずれも用いられ得る。
【００２７】本発明２の酵素免疫測定法は、初めに血漿
を溶媒抽出し、該溶媒抽出物を濃縮装置で濃縮し濃縮物
を得る。次に、その濃縮物に緩衝液又は水を添加して溶
液又は懸濁液にし、その溶液又は懸濁液を加熱処理して
タンパク質、脂質などを変性させ、次いで、測定目的物
質より分子量排除が大きい限外濾過膜に通し、タンパク
質、脂質を取り除く。タンパク質、脂質が取り除かれた
濾液を被検試料とし、該被検試料に上記コンジュゲート
を添加し、更に、上記第１抗体を添加し、測定目的物質
と上記コンジュゲートとを第１抗体へ競合結合させて、
該測定目的物質結合第１抗体及び該コンジュゲート結合
第１抗体を生成させる。これに、第二抗体結合担体を添
加することにより、該測定目的物質結合第１抗体及び該
コンジュゲート結合第１抗体を第２抗体結合担体に結合
させる。次に、常法により、第２抗体結合担体に結合さ
れたコンジュゲートの酵素活性を測定することにより、
該測定目的物質の量を測定する。
を溶媒抽出し、該溶媒抽出物を濃縮装置で濃縮し濃縮物
を得る。次に、その濃縮物に緩衝液又は水を添加して溶
液又は懸濁液にし、その溶液又は懸濁液を加熱処理して
タンパク質、脂質などを変性させ、次いで、測定目的物
質より分子量排除が大きい限外濾過膜に通し、タンパク
質、脂質を取り除く。タンパク質、脂質が取り除かれた
濾液を被検試料とし、該被検試料に上記コンジュゲート
を添加し、更に、上記第１抗体を添加し、測定目的物質
と上記コンジュゲートとを第１抗体へ競合結合させて、
該測定目的物質結合第１抗体及び該コンジュゲート結合
第１抗体を生成させる。これに、第二抗体結合担体を添
加することにより、該測定目的物質結合第１抗体及び該
コンジュゲート結合第１抗体を第２抗体結合担体に結合
させる。次に、常法により、第２抗体結合担体に結合さ
れたコンジュゲートの酵素活性を測定することにより、
該測定目的物質の量を測定する。
【００２８】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施例を説明す
る。以下の実施例において、測定目的物質は血漿中のイ
ンドメタシンである。 〔材料の調製〕実施例１、２及び比較例１、２に使用し
た材料の調製は以下のように行った。
る。以下の実施例において、測定目的物質は血漿中のイ
ンドメタシンである。 〔材料の調製〕実施例１、２及び比較例１、２に使用し
た材料の調製は以下のように行った。
【００２９】インドメタシン結合β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ（コンジュゲート）の作製 インドメタシン（和光純薬工業社製）５．４ｍｇ（１
５．１μｍｏｌ）を２００μｌの無水ジメチルホルムア
ミド（和光純薬工業社製）に溶解し、Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミド（和光純薬工業社製）を２．０ｍｇ含む５
０μｌの無水ジメチルホルムアミド溶液及び１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミ
ド（和光純薬工業社製）を３．２ｍｇ含む１００μｌの
無水ジメチルホルムアミド溶液を加え、遮光して、室温
にて７０分間撹拌することにより、活性化インドメタシ
ンを得た。
ーゼ（コンジュゲート）の作製 インドメタシン（和光純薬工業社製）５．４ｍｇ（１
５．１μｍｏｌ）を２００μｌの無水ジメチルホルムア
ミド（和光純薬工業社製）に溶解し、Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミド（和光純薬工業社製）を２．０ｍｇ含む５
０μｌの無水ジメチルホルムアミド溶液及び１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミ
ド（和光純薬工業社製）を３．２ｍｇ含む１００μｌの
無水ジメチルホルムアミド溶液を加え、遮光して、室温
にて７０分間撹拌することにより、活性化インドメタシ
ンを得た。
【００３０】この活性化インドメタシンを、β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ（和光純薬工業社製）を２００μｇ含有
する１ｍｌの０．１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液に滴下し、
遮光して、室温にて２時間反応した後、１０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７．８、ＮａＣｌを０．１Ｍ、ＭｇＣｌ2
を１ｍＭ含有）にて４℃下で２日間透析した。透析によ
って得られたインドメタシンとβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼのコンジュゲート溶液に、等量のグリセロールを添加
し、グリセロールの５０％（ｖ／ｖ）溶液として−２０
℃で保存した。
ラクトシダーゼ（和光純薬工業社製）を２００μｇ含有
する１ｍｌの０．１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液に滴下し、
遮光して、室温にて２時間反応した後、１０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７．８、ＮａＣｌを０．１Ｍ、ＭｇＣｌ2
を１ｍＭ含有）にて４℃下で２日間透析した。透析によ
って得られたインドメタシンとβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼのコンジュゲート溶液に、等量のグリセロールを添加
し、グリセロールの５０％（ｖ／ｖ）溶液として−２０
℃で保存した。
【００３１】第１抗体（抗血清）の調製 上記コンジュゲートの作製の項と同様にして得られた活
性化インドメタシンを、窒素ガス下で乾固し、次いで、
再度１００μｌの無水ジメチルホルムアミドに溶解した
後、この溶液を２０ｍｇの牛血清アルブミン（シグマ社
製）を含む１ｍｌの０．１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液に滴
下し、遮光して、室温にて７０分間攪拌することによ
り、インドメタシン−牛血清アルブミンの複合体を得
た。この複合体の溶液を、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．８、ＮａＣｌを０．１Ｍ、ＭｇＣｌ2 を１ｍＭ含
有）にて４℃下で２日間透析した。透析によって得られ
たインドメタシン−牛血清アルブミンの複合体の溶液
０．５ｍｌとフロイントコンプリートアジュバント（Ｄ
ＩＦＣＯ社製）０．５ｍｌとを混合し、得られた混合物
を雄のウサギに注射し、さらに４週間後同じものを注射
し、その１週間後に、ウサギより採血し、血清を分離
し、その血清を５６℃で３０分間加熱した後、−２０℃
で保存した。
性化インドメタシンを、窒素ガス下で乾固し、次いで、
再度１００μｌの無水ジメチルホルムアミドに溶解した
後、この溶液を２０ｍｇの牛血清アルブミン（シグマ社
製）を含む１ｍｌの０．１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液に滴
下し、遮光して、室温にて７０分間攪拌することによ
り、インドメタシン−牛血清アルブミンの複合体を得
た。この複合体の溶液を、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．８、ＮａＣｌを０．１Ｍ、ＭｇＣｌ2 を１ｍＭ含
有）にて４℃下で２日間透析した。透析によって得られ
たインドメタシン−牛血清アルブミンの複合体の溶液
０．５ｍｌとフロイントコンプリートアジュバント（Ｄ
ＩＦＣＯ社製）０．５ｍｌとを混合し、得られた混合物
を雄のウサギに注射し、さらに４週間後同じものを注射
し、その１週間後に、ウサギより採血し、血清を分離
し、その血清を５６℃で３０分間加熱した後、−２０℃
で保存した。
【００３２】第２抗体結合担体の調製 ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（カッペル社製）１５ｍｇを１
００ｍｌの０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、Ｎａ
Ｃｌを０．１Ｍ、ＭｇＣｌ2 を１ｍＭ、ＮａＮ 3 を０．
１％含有）に溶かした溶液に、ポリスチレンビーズ（粒
径６．３５ｍｍ、イムノケミカル社製）を４８時間浸漬
して、ポリスチレンビーズにヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を
吸着させた後、０．１％（ｗ／ｖ）の濃度で牛血清アル
ブミンを含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、
ＮａＣｌを０．１Ｍ、ＭｇＣｌ2を１ｍＭ含有）に１８
時間浸漬してブロッキングし第２抗体結合担体を調製し
た。
００ｍｌの０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、Ｎａ
Ｃｌを０．１Ｍ、ＭｇＣｌ2 を１ｍＭ、ＮａＮ 3 を０．
１％含有）に溶かした溶液に、ポリスチレンビーズ（粒
径６．３５ｍｍ、イムノケミカル社製）を４８時間浸漬
して、ポリスチレンビーズにヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を
吸着させた後、０．１％（ｗ／ｖ）の濃度で牛血清アル
ブミンを含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、
ＮａＣｌを０．１Ｍ、ＭｇＣｌ2を１ｍＭ含有）に１８
時間浸漬してブロッキングし第２抗体結合担体を調製し
た。
【００３３】（実施例１）表１に示す濃度のインドメタ
シン含有ヒト血漿１ｍｌに酢酸エチル４ｍｌを加え、１
０分間撹拌し、遠心分離した後、上層を採取した。残り
の下層に再び酢酸エチル４ｍｌを加え、１０分間撹拌
し、遠心分離した後、上層を採取した。採取した上層を
まとめたものを窒素ガスの吹き付けにより４０℃で乾固
後、０．１％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン含有０．０１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、０．１Ｍ ＮａＣｌ、1
ｍＭ ＭｇＣｌ2 含有）５００μｌを加えた後、懸濁
し、ブロックヒータ（井内盛栄堂社製）で１００℃で５
分間加熱後、室温に戻し、１００００Ｇで３０分遠心分
離した後、上層を分子量排除１００００の疎水性限外濾
過膜（日本ミリポア社製）で限外濾過して得られた濾液
を被検試料とした。
シン含有ヒト血漿１ｍｌに酢酸エチル４ｍｌを加え、１
０分間撹拌し、遠心分離した後、上層を採取した。残り
の下層に再び酢酸エチル４ｍｌを加え、１０分間撹拌
し、遠心分離した後、上層を採取した。採取した上層を
まとめたものを窒素ガスの吹き付けにより４０℃で乾固
後、０．１％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン含有０．０１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、０．１Ｍ ＮａＣｌ、1
ｍＭ ＭｇＣｌ2 含有）５００μｌを加えた後、懸濁
し、ブロックヒータ（井内盛栄堂社製）で１００℃で５
分間加熱後、室温に戻し、１００００Ｇで３０分遠心分
離した後、上層を分子量排除１００００の疎水性限外濾
過膜（日本ミリポア社製）で限外濾過して得られた濾液
を被検試料とした。
【００３４】上記被検試料１００μｌに、前記のインド
メタシン結合β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（コンジュゲー
ト）を１．０％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン含有０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、０．１Ｍ ＮａＣｌ、1
ｍＭ ＭｇＣｌ2 含有）で１万倍に希釈した溶液５０μ
ｌ、及び前記の第１抗体（抗血清）を上記のコンジュゲ
ート希釈緩衝液と同様の緩衝液で８万倍に希釈した溶液
５０μｌを４℃下で加え、撹拌の後、４℃で１８時間静
置した。
メタシン結合β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（コンジュゲー
ト）を１．０％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン含有０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、０．１Ｍ ＮａＣｌ、1
ｍＭ ＭｇＣｌ2 含有）で１万倍に希釈した溶液５０μ
ｌ、及び前記の第１抗体（抗血清）を上記のコンジュゲ
ート希釈緩衝液と同様の緩衝液で８万倍に希釈した溶液
５０μｌを４℃下で加え、撹拌の後、４℃で１８時間静
置した。
【００３５】次いで、この溶液に０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０、ＮａＣｌを０．１Ｍ、ＭｇＣｌ2 を１ｍ
Ｍ含有）を２００μｌ加え、撹拌後、前記の第２抗体結
合ポリスチレンビーズを加え、１５℃で４時間反応を行
った。反応後のポリスチレンビーズを、０．１％（ｗ／
ｖ）の濃度で牛血清アルブミンを含有する１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０、ＮａＣｌを０．１Ｍ、ＭｇＣｌ
2 を１ｍＭ含有）（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ｍという）
で３回洗浄することにより、ポリスチレンビーズに結合
していないインドメタシン結合β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ（コンジュゲート）を除去した（Ｂ／Ｆ分離）。
（ｐＨ７．０、ＮａＣｌを０．１Ｍ、ＭｇＣｌ2 を１ｍ
Ｍ含有）を２００μｌ加え、撹拌後、前記の第２抗体結
合ポリスチレンビーズを加え、１５℃で４時間反応を行
った。反応後のポリスチレンビーズを、０．１％（ｗ／
ｖ）の濃度で牛血清アルブミンを含有する１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０、ＮａＣｌを０．１Ｍ、ＭｇＣｌ
2 を１ｍＭ含有）（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ｍという）
で３回洗浄することにより、ポリスチレンビーズに結合
していないインドメタシン結合β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ（コンジュゲート）を除去した（Ｂ／Ｆ分離）。
【００３６】上記Ｂ／Ｆ分離した、インドメタシン結合
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（コンジュゲート）が結合さ
れたポリスチレンビーズを、ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ｍ ２０
０μｌに加えた後、０．３ｍＭ ４−methyl−umbellif
eryl−β−Ｄ−garactoside（以下４−ＭＵＧという）
（シグマ社製）を２００μｌ加え、３７℃で２時間酵素
反応を行った。０．１Ｍ Ｎａ2 ＣＯ3 水溶液を２ｍｌ
加えて反応を停止させた後、酵素反応により、４−ＭＵ
Ｇから生成した４−methyl−umbelliferylの蛍光強度
（励起３６０ｎｍ、蛍光４５０ｎｍ）を測定し、結果を
表１に示した。
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（コンジュゲート）が結合さ
れたポリスチレンビーズを、ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ｍ ２０
０μｌに加えた後、０．３ｍＭ ４−methyl−umbellif
eryl−β−Ｄ−garactoside（以下４−ＭＵＧという）
（シグマ社製）を２００μｌ加え、３７℃で２時間酵素
反応を行った。０．１Ｍ Ｎａ2 ＣＯ3 水溶液を２ｍｌ
加えて反応を停止させた後、酵素反応により、４−ＭＵ
Ｇから生成した４−methyl−umbelliferylの蛍光強度
（励起３６０ｎｍ、蛍光４５０ｎｍ）を測定し、結果を
表１に示した。
【００３７】
【表１】
【００３８】なお、この測定は、同一の被検試料につい
て３回行った。表１（及び後述の表２〜４）には、この
３回の測定値と、その平均値と変動係数〔変動係数をＣ
Ｖと記した。変動係数（％）＝（標準偏差／平均値）×
１００〕とを示した。また、表１（及び後述の表２〜
４）における、抗血清（−）欄の値は、被検試料を得る
ための操作において、ヒト血漿としてインドメタシンを
含まないヒト血漿を用いたこと、及び上記の測定操作に
おいて、第１抗体（抗血清）の代わりに、１．０％（ｗ
／ｖ）牛血清アルブミン含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０、０．１Ｍ ＮａＣｌ、1 ｍＭ ＭｇＣｌ2 含
有）を用いたことの他は、上記測定操作と同様に操作し
て測定して得られた蛍光強度の値である。
て３回行った。表１（及び後述の表２〜４）には、この
３回の測定値と、その平均値と変動係数〔変動係数をＣ
Ｖと記した。変動係数（％）＝（標準偏差／平均値）×
１００〕とを示した。また、表１（及び後述の表２〜
４）における、抗血清（−）欄の値は、被検試料を得る
ための操作において、ヒト血漿としてインドメタシンを
含まないヒト血漿を用いたこと、及び上記の測定操作に
おいて、第１抗体（抗血清）の代わりに、１．０％（ｗ
／ｖ）牛血清アルブミン含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０、０．１Ｍ ＮａＣｌ、1 ｍＭ ＭｇＣｌ2 含
有）を用いたことの他は、上記測定操作と同様に操作し
て測定して得られた蛍光強度の値である。
【００３９】表１より、本発明の測定方法によると、血
漿中のインドメタシンを数ｐｇ／ｍｌオーダーまで正確
に測定でき、且つ測定値のばらつきが特に小さいことが
分かる。
漿中のインドメタシンを数ｐｇ／ｍｌオーダーまで正確
に測定でき、且つ測定値のばらつきが特に小さいことが
分かる。
【００４０】（実施例２）実施例１における、被検試料
の作製に用いた分子量排除１００００の疎水性限外濾過
膜（日本ミリポア社製）の代わりに、分子量排除１００
００の親水性限外濾過膜（日本ミリポア社製）を用いて
限外濾過して被検試料を作製したことの他は、実施例１
と同様に操作した。得られた酵素免疫測定法の結果（蛍
光強度）を表２に示した。
の作製に用いた分子量排除１００００の疎水性限外濾過
膜（日本ミリポア社製）の代わりに、分子量排除１００
００の親水性限外濾過膜（日本ミリポア社製）を用いて
限外濾過して被検試料を作製したことの他は、実施例１
と同様に操作した。得られた酵素免疫測定法の結果（蛍
光強度）を表２に示した。
【００４１】
【表２】
【００４２】表２より、本発明の測定方法によると、血
漿中のインドメタシンを数ｐｇ／ｍｌオーダーまで正確
に測定できることが分かる。ただ、測定値のばらつき
は、疎水性限外濾過膜を使用した実施例１のものよりは
大きかった。
漿中のインドメタシンを数ｐｇ／ｍｌオーダーまで正確
に測定できることが分かる。ただ、測定値のばらつき
は、疎水性限外濾過膜を使用した実施例１のものよりは
大きかった。
【００４３】（比較例１）表３に示す濃度のインドメタ
シン含有ヒト血漿１００μｌに、０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０、ＮａＣｌを０．１Ｍ、ＭｇＣｌ2 を１ｍ
Ｍ含有）を９００μｌ添加し、撹拌後、除タンパクのた
めに、ブロックヒータ（井内盛栄堂社製）で１００℃で
５分間加熱した後、室温に戻し、１００００Ｇで３０分
遠心分離して得られた上層を被検試料としたことの他
は、実施例１と同様に操作して酵素免疫測定を行った。
得られた結果（蛍光強度）を表３に示した。
シン含有ヒト血漿１００μｌに、０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０、ＮａＣｌを０．１Ｍ、ＭｇＣｌ2 を１ｍ
Ｍ含有）を９００μｌ添加し、撹拌後、除タンパクのた
めに、ブロックヒータ（井内盛栄堂社製）で１００℃で
５分間加熱した後、室温に戻し、１００００Ｇで３０分
遠心分離して得られた上層を被検試料としたことの他
は、実施例１と同様に操作して酵素免疫測定を行った。
得られた結果（蛍光強度）を表３に示した。
【００４４】
【表３】
【００４５】表３より、血漿の溶剤抽出をしなければ、
測定下限が高くなることが分かる。
測定下限が高くなることが分かる。
【００４６】（比較例２）表４に示す濃度のインドメタ
シン含有ヒト血漿１ｍｌに酢酸エチル４ｍｌを加え、１
０分間撹拌し、遠心分離した後、上層を採取した。残り
の下層に再び酢酸エチル４ｍｌを加え、１０分間撹拌
し、遠心分離した後、上層を採取した。採取した上層を
まとめたものを窒素ガスの吹き付けにより４０℃で乾固
後、０．１％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン含有０．０１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、０．１Ｍ ＮａＣｌ、1
ｍＭ ＭｇＣｌ2 含有）５００μｌを加えて得られた懸
濁液を被検試料としたことの他は、実施例１と同様に操
作して酵素免疫測定を行った。得られた結果（蛍光強
度）を表４に示した。
シン含有ヒト血漿１ｍｌに酢酸エチル４ｍｌを加え、１
０分間撹拌し、遠心分離した後、上層を採取した。残り
の下層に再び酢酸エチル４ｍｌを加え、１０分間撹拌
し、遠心分離した後、上層を採取した。採取した上層を
まとめたものを窒素ガスの吹き付けにより４０℃で乾固
後、０．１％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン含有０．０１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、０．１Ｍ ＮａＣｌ、1
ｍＭ ＭｇＣｌ2 含有）５００μｌを加えて得られた懸
濁液を被検試料としたことの他は、実施例１と同様に操
作して酵素免疫測定を行った。得られた結果（蛍光強
度）を表４に示した。
【００４７】
【表４】
【００４８】表４より、血漿を溶剤抽出しても限外濾過
をしなければ、ばらつきが大きくなり、正確な測定がで
きないことが分かる。
をしなければ、ばらつきが大きくなり、正確な測定がで
きないことが分かる。
【００４９】
【発明の効果】本発明１の血漿中物質の高感度酵素免疫
測定法は、血漿を溶媒抽出し、該溶媒抽出物を濃縮した
後、加熱処理し、次いで、血漿中の測定目的物質より分
子量排除が大きい限外濾過膜を用いて濾過して濾液を
得、該濾液中の測定目的物質を、酵素免疫測定法で測定
するので、血漿中物質、特に血漿中薬物を数ｐｇ／ｍｌ
オーダーまで正確に測定でき、測定値がばらつかない高
感度酵素免疫測定法を提供する。
測定法は、血漿を溶媒抽出し、該溶媒抽出物を濃縮した
後、加熱処理し、次いで、血漿中の測定目的物質より分
子量排除が大きい限外濾過膜を用いて濾過して濾液を
得、該濾液中の測定目的物質を、酵素免疫測定法で測定
するので、血漿中物質、特に血漿中薬物を数ｐｇ／ｍｌ
オーダーまで正確に測定でき、測定値がばらつかない高
感度酵素免疫測定法を提供する。
【００５０】本発明２の血漿中物質の高感度酵素免疫測
定法は、血漿を溶媒抽出し、該溶媒抽出物を濃縮した
後、加熱処理し、次いで、血漿中の低分子物質である測
定目的物質より分子量排除が大きい限外濾過膜を用いて
濾過して濾液を得、該濾液中の測定目的物質及び上記測
定目的物質と酵素とのコンジュゲートを、該測定目的物
質に対する第１抗体へ競合結合させ、次いで、該測定目
的物質結合第１抗体及び該コンジュゲート結合第１抗体
を第２抗体結合担体に結合させ、次いで、第２抗体結合
担体に結合されたコンジュゲートの酵素活性を測定する
ことにより、該測定目的物質の量を測定するので、血漿
中物質の低分子物質、特に血漿中薬物を数ｐｇ／ｍｌオ
ーダーまで正確に測定でき、測定値がばらつかない高感
度酵素免疫測定法を提供する。
定法は、血漿を溶媒抽出し、該溶媒抽出物を濃縮した
後、加熱処理し、次いで、血漿中の低分子物質である測
定目的物質より分子量排除が大きい限外濾過膜を用いて
濾過して濾液を得、該濾液中の測定目的物質及び上記測
定目的物質と酵素とのコンジュゲートを、該測定目的物
質に対する第１抗体へ競合結合させ、次いで、該測定目
的物質結合第１抗体及び該コンジュゲート結合第１抗体
を第２抗体結合担体に結合させ、次いで、第２抗体結合
担体に結合されたコンジュゲートの酵素活性を測定する
ことにより、該測定目的物質の量を測定するので、血漿
中物質の低分子物質、特に血漿中薬物を数ｐｇ／ｍｌオ
ーダーまで正確に測定でき、測定値がばらつかない高感
度酵素免疫測定法を提供する。
【００５１】本発明３の血漿中物質の高感度酵素免疫測
定法は、測定目的物質より分子量排除が大きい限外濾過
膜が、疎水性の限外濾過膜である本発明１又は２記載の
血漿中物質の高感度酵素免疫測定法なので、血漿中物
質、特に血漿中薬物を数ｐｇ／ｍｌオーダーまでより正
確に測定でき、測定値がばらつかない高感度酵素免疫測
定法を提供する。
定法は、測定目的物質より分子量排除が大きい限外濾過
膜が、疎水性の限外濾過膜である本発明１又は２記載の
血漿中物質の高感度酵素免疫測定法なので、血漿中物
質、特に血漿中薬物を数ｐｇ／ｍｌオーダーまでより正
確に測定でき、測定値がばらつかない高感度酵素免疫測
定法を提供する。
Claims (3)
- 【請求項１】 血漿を溶媒抽出し、該溶媒抽出物を濃縮
した後、加熱処理し、次いで、血漿中の測定目的物質よ
り分子量排除が大きい限外濾過膜を用いて濾過して濾液
を得、 該濾液中の測定目的物質を、酵素免疫測定法で測定する
ことを特徴とする血漿中物質の高感度酵素免疫測定法。 - 【請求項２】 血漿を溶媒抽出し、該溶媒抽出物を濃縮
した後、加熱処理し、次いで、血漿中の低分子物質であ
る測定目的物質より分子量排除が大きい限外濾過膜を用
いて濾過して濾液を得、 該濾液中の測定目的物質及び上記測定目的物質と酵素と
のコンジュゲートを、該測定目的物質に対する第１抗体
へ競合結合させ、 次いで、該測定目的物質結合第１抗体及び該コンジュゲ
ート結合第１抗体を第２抗体結合担体に結合させ、 次いで、第２抗体結合担体に結合されたコンジュゲート
の酵素活性を測定することにより、 該測定目的物質の量を測定することを特徴とする血漿中
物質の高感度酵素免疫測定法。 - 【請求項３】 測定目的物質より分子量排除が大きい限
外濾過膜が、疎水性の限外濾過膜である請求項１又は２
記載の血漿中物質の高感度酵素免疫測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16956796A JPH1019894A (ja) | 1996-06-28 | 1996-06-28 | 血漿中物質の高感度酵素免疫測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16956796A JPH1019894A (ja) | 1996-06-28 | 1996-06-28 | 血漿中物質の高感度酵素免疫測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1019894A true JPH1019894A (ja) | 1998-01-23 |
Family
ID=15888870
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16956796A Pending JPH1019894A (ja) | 1996-06-28 | 1996-06-28 | 血漿中物質の高感度酵素免疫測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1019894A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021148610A (ja) * | 2020-03-19 | 2021-09-27 | 東レ株式会社 | 体液検体中のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の検出方法 |
-
1996
- 1996-06-28 JP JP16956796A patent/JPH1019894A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021148610A (ja) * | 2020-03-19 | 2021-09-27 | 東レ株式会社 | 体液検体中のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の検出方法 |
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