JPH0838183A

JPH0838183A - カルデスモン転写調節領域

Info

Publication number: JPH0838183A
Application number: JP6197202A
Authority: JP
Inventors: Kenji Sofue; 憲治祖父江
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-07-29
Filing date: 1994-07-29
Publication date: 1996-02-13

Abstract

(57)【要約】【構成】カルデスモンをコードしている遺伝子の５’
上流領域にある転写調節領域。【効果】本発明によりカルデスモンをコードしている
遺伝子の上流にあるプロモーター部分が解明され、これ
により、カルデスモンの発現を調節することが可能とな
り、ガンの治療薬、抗動脈硬化剤および消化管運動促進
剤として有用なカルデスモンを多量に発現させること、
遺伝子治療に用いること、およびカルデスモン発現の調
節物質をスクリーニングすることが可能となった。ま
た、動脈硬化症の診断に利用することもできる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な転写調節領域
（プロモーター）に関する。更に詳細には、本発明は、
脊椎動物、特にヒトを含む平滑筋および非筋肉組織にお
ける、カルデスモンと呼ばれるタンパク質をコードする
遺伝子配列のプロモーターに関する。本発明のプロモー
ターは、適当なベクターに挿入され、宿主細胞内でカル
デスモンの発現調節に使用される。

【０００２】

【従来の技術】カルデスモンは、骨格筋、心筋を除く組
織において、カルモデュリン−アクチン−トロポミオシ
ン結合能を有するタンパク質であり、平滑筋および非筋
細胞のアクチン−ミオシン系の調節機構に関与してい
る。カルシウム濃度の低いときには、カルデスモンはア
クチンフィラメントトロポミオシン系に結合し、アクチ
ン−ミオシン間相互作用を抑制する。一方カルシウム濃
度の増加により、活発型のカルモデュリン・カルデスモ
ン複合体が形成され、この複合体はアクチンフィラメン
ト・トロポミン系から遊離する。この結果、カルデスモ
ンによるアクチン−ミオシン間の抑制作用が解除され、
アクチン−ミオシン間相互作用が起こる。

【０００３】カルデスモン（以下、ＣａＤと略記するこ
とがある。）には、高分子量型のカルデスモン（ｈ−Ｃ
ａＤ）と低分子量型のカルデスモン（ｌ−ＣａＤ）があ
り、平滑筋組織には主にｈ−ＣａＤが分布し、筋肉以外
の組織中には主にｌ−ＣａＤが分布している。カルデス
モン自体のアミノ酸配列については、ニワトリについ
て、本発明者らによりすでに明らかにされている。ｈ−
ＣａＤは、Biochem. Biophys. Res. Commun. 164, 503
(1989)に記載されており、また、ｌ−ＣａＤは、特開平
3-240798号明細書に記載されている。同様に、ヒトのカ
ルデスモンについても、本発明者らにより、ｈ−ＣａＤ
およびｌ−ＣａＤがＨｅＬａＳ３細胞からクローニン
グにより得られ、ゲノム構造が明らかにされている（Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 12122 (1992)）。

【０００４】一方で、細胞形態の維持とアクチン構造と
は、密接に関連しており、ガン化による細胞形態変化と
アクチンケーブルの形態変化および消失とは、よく一致
していることが知られている（Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 72, 994 (1975)）。また、ガン遺伝子を持つウイ
ルスを用いて培養細胞をガン化させるとカルデスモン量
が低下することが知られている（Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 81, 3133(1984) ）。

【０００５】これらの知見から、カルデスモンと細胞の
ガン化による細胞の形態変化には密接な関係にあること
が示唆されており、このため、カルデスモンはガンの治
療薬または診断薬としての可能性を有している。また、
ｈ−ＣａＤとｌ−ＣａＤの発現変換は平滑筋細胞の形質
転換を最も顕著に反映している（Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 85, 9049 (1997) ）。このため、動脈硬化症診
断の有力な手段になるものと期待される。さらに、カル
デスモンは、アクチン−ミオシン系の調節機構に関与し
ているため、血管拡張または消化管運動促進剤として利
用可能である。

【０００６】

【発明の構成】今回、本発明者は、カルデスモンをコー
ドしている遺伝子の上流にあるプロモーター部分を解明
した。これにより、カルデスモンの発現を調節すること
が可能となった。このため、カルデスモンを医薬として
多量に発現させること、遺伝子治療に用いること、およ
びカルデスモン発現の調節物質をスクリーニングするこ
とが可能となった。カルデスモンは、ガンの治療薬、抗
動脈硬化剤また消化管運動促進剤として使用できること
は、本発明者らによってすでに提案されており、この目
的の達成のために、本発明のプロモーターを用いること
ができる。本発明のプロモーターには、鳥類のみなら
ず、ヒトを含む脊椎動物、特にヒトのカルデスモンプロ
モーターも含まれる。

【０００７】本発明は、配列番号１で示されるニワトリ
のカルデスモン遺伝子のエクソン１ａ−１のＤＮＡ配列
のうち−３１５から−２１８までの転写調節領域（プロ
モーター）に関する。更に、本発明には、上記のプロモ
ーターの一部分が、置換、欠損または追加された塩基配
列（ホモログと称する）、上記プロモーターのフラグメ
ントおよびフラグメントのホモログが含まれる。

【０００８】配列番号１で示される塩基配列を有するＤ
ＮＡのホモログとは、少なくとも１０個、好ましくは少
なくとも２０個、例えば３０、４０または６０個の連続
した塩基配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少
なくとも８０または９０％、より好ましくは、９５％以
上相同性のあるものであり、そのようなＤＮＡは、本発
明に含まれる。

【０００９】本発明の転写調節領域を用いたカルデスモ
ン転写調節物質のスクリーニング方法は、例えば以下の
ようにして行なうことができる。すなわち、本発明の転
写調節領域を含む塩基配列を用いて、レポーター遺伝子
プラスミドを構築し、このプラスミドで形質転換した細
胞を用いて、スクリーニングすべき化合物と共存させ培
養を行なう。必要な培養量を得た後に、細胞から分離し
たレポーター活性を測定することにより、その物質が転
写に与える影響を知ることができる。また、レポーター
遺伝子を用いないで、本発明の転写調節領域を含む塩基
配列を用いてプラスミドを構築し、同様に形質転換を行
ない、スクリーニングすべき化合物と形質転換した細胞
を共存させ、培養した後、細胞から分離したＣａＤの発
現量によって、その物質の転写に与える影響を知ること
ができる。レポーター遺伝子としては、クロラムフェニ
コール、ルシフェラーゼ等を用いることができる。プラ
スミドとしては、ｐＵＣ−ＣＡＴ、ｐＳＶ０ＣＡＴ等が
挙げられる。用いる細胞としては、E.coli等の大腸菌、
枯草菌、酵母、種々の動物細胞（ニワトリ、マウス、ラ
ット、ヒトなど）が挙げられる。

【００１０】配列番号１で示されるプロモーターの作製
は、以下の方法により行なわれる。すなわち、(i) ゲノ
ムライブラリーのスクリーニングおよびシーケンシング
を行ない、(ii)プライマーエクステンションによりアニ
ーリングを行ない、(iii)クロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子プラ
スミドを構築し、(iv)このプラスミドで細胞を形質転換
した後、培養し、(v) デリーション解析により、ＣＡＴ
活性を測定し、(vi)ノザンブロット解析を行ない、(vii
i)イムノブロット解析を行なう。

【００１１】より詳細に説明すると、(i) ゲノムライブ
ラリーのスクリーニングは、公知の方法により行なわれ
る（Biochem. Biophys. Res. Commun., 197, 145(199
3)）。シーケンシングは、マキサム・ギルバート法やジ
デオキシ・ターミネーター法により行なわれる。 (ii)プライマーエクステンションは、対象となる細胞か
ら例えばグアニジン／セシウムクロライド法などによ
り、分離したＲＮＡを標識したアンチセンスでアニーリ
ングした後、レトロウイルス由来の逆転写酵素を用いて
伸長することにより行なわれる。 (iii) ＣＡＴレポーター遺伝子の構築は、上で得られた
ＲＮＡ断片をｐＵＣ０ＣＡＴ、ｐＳＶＣＡＴ等のプラス
ミドにクローニングすることにより行なわれる。 (iv)このプラスミドで対象細胞を形質転換するには、常
法で行なわれるが、例えば、リン酸カルシウム共沈法、
ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−デキストラン法、
電気穿孔法などが用いられる。培養は、常法により行な
われるが、血清は添加しても、しなくてもよい。 (v) デリーション解析は、形質転換後、培養された細胞
を溶解し、この抽出物のデアセチラーゼを不活化した
後、アセチルコエンザイムと［¹⁴Ｃ］クロラムフェニコ
ールでインキュベートし、薄層クロマトグラフィーで分
析することにより行なわれる。 (vi)ノザンブロット解析は、常法により行なわれる。 (vii) イムノブロット解析は、公知であるが、例えば、
対象細胞のホモジネートを電気泳動で分離し、ＣａＤの
特異的抗体とパーオキシダーゼ結合蛋白を用いて行なわ
れる。

【００１２】また、配列番号１で示される塩基配列が一
旦確定されると、その後は化学合成によって、またはＰ
ＣＲ法によって、あるいは該塩基の断片または全長をプ
ローブとしてハイブリダイズさせることにより本発明の
塩基配列を得ることができる。さらに本塩基配列を含有
するベクターＤＮＡを適当な宿主に導入し、これを増殖
させることによって、目的とする本発明の塩基配列を、
必要量得ることができる。

【００１３】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものでは
ない。

【００１４】実施例１：ゲノムライブラリーのスクリー
ニングおよびシーケンシングゲノムライブラリーのスクリーニングは、Haruna, M ら
の方法により行なった(Biochem. Biophys. Res. Commu
n., 197, 145 (1993)) 。λＧ１０２およびλＢ１１
は、ニワトリ砂嚢のｈ−ＣａＤ、ｌ−ＣａＤおよび脳ｌ
−ＣａＤの５’上流領域をそれぞれ持っている。砂嚢タ
イプのＣａＤの詳細な制限酵素地図を図１に示す。λＧ
１０２のＨｉｎｄIII フラグメント、Ｈ３−Ｄ、Ｈ３−
ＥをｐＵＣ１８に、Ｈ３−ＦをｐＵＣ１９にそれぞれサ
ブクローニングした。λＢ１１由来のＥｃｏＲＩフラグ
メントおよびＨｉｎｄIII フラグメントをｐＴＶ１１８
ＮおよびＭＷ２１９にそれぞれサブクローニングした。
ＤＮＡのシーケンシングは、ジデオキシチェーンターミ
ネーション法で決定した。

【００１５】実施例２：プライマーエクステンション細胞内の総ＲＮＡをニワトリ胎児の砂嚢および脳からグ
アニジン／セシウムクロライド法により、単離した。そ
れぞれのＲＮＡ（２０μｇ）を砂嚢ｈ−ＣａＤまたは脳
ｌ−ＣａＤのｃＤＮＡの５’ノンコーディング領域に相
当する（ｈ−ＣａＤのｃＤＮＡの５１−７４のヌクレオ
チドまたは、ｌ−ＣａＤのｃＤＮＡ−１４０から−１１
７のヌクレオチド）［γ³²Ｐ］ＡＴＰ（Amersham社）で
標識されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて
アニーリングした。続いて、４２℃で１時間、Ｒｏｕｓ
関連ウイルスリバーストランスクリプターゼ（宝酒造）
を用いてエクステンドした。これを６％ポリアクリルア
ミド尿素ゲルによる電気泳動で分離した。

【００１６】実施例３：ＣＡＴレポーター遺伝子プラス
ミドの構築ｐＵＣ０ＣＡＴを用いて、ＣａＤ遺伝子の５’上流領域
にバクテリアのクロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子を導入したプラ
スミドを構築した(Takenaka, Mら，J. Bio. Chem., 26
4, 2363 (1989))。ＫｐｎＩ／ＳｐｅＩ（Klenow処理を
行なった）フラグメント（0.65ｋｂ）をｐＵＣ１８Ｇ１
０２Ｈ３−Ｄから単離し、ｐＵＣ０ＣＡＴのＨｉｎｄII
I （Klenow処理を行なった）およびＫｐｎＩサイトにク
ローニングした。このプラスミドをＧＰ１ＣＡＴと名付
けた。

【００１７】ｐＵＣ１９Ｇ１０２Ｈ３−Ｆから切りだし
たＨｉｎｄIII フラグメント（ 0.3ｋｂ）をＧＰ１ＣＡ
ＴのＨｉｎｄIII サイトにクローニングし、ＧＰ２ＣＡ
Ｔを得た。

【００１８】ＧＰ３ＣＡＴは、以下のようにして構築し
た。ｐＵＣ１８Ｇ１０２Ｈ３−Ｅから切りだしたＨｉｎ
ｄIII ／ＸｂａＩフラグメント（2.1 ｋｂ）をＨｉｎｄ
III （部分消化した）／ＸｂａＩ−ＧＰ２ＣＡＴとライ
ゲーションした。

【００１９】ＧＰ１ＣＡＴ由来のデリーションは、制限
サイト（ＳａｃＩ、ＳｐｈＩおよびＰｓｔＩ）またはエ
クソヌクレアーゼIII とmung bean ヌクレアーゼを用い
て構築した。ＰＢ２ＣＡＴは、ｐＵＣ２ＣＡＴのＨｉｎ
ｄIII （Klenow処理を行なった）／ＸｂａＩサイトに、
ｐＴＶ１１８ＮＢ１１ＥＲＩ由来のＨｉｎｃII／Ｘｂａ
Ｉフラグメント（1.2 ｋｂ）を挿入することにより構築
した。ｐＭＷ２１９Ｂ１１Ｈ３由来のＨｉｎｃIIフラグ
メント（0.9 ｋｂ）をｐＵＣ０ＣＡＴのＨｉｎｄIII
（Klenow処理を行なった）／ＸｂａＩにクローニングし
た。

【００２０】ＢＰａ（Ｓｐｈ１）ＣＡＴＢＰ１ＣＡＴ由
来のデリーションプラスミドは、ＳｐｈＩにより消化さ
れたＢＰ１ＣＡＴの自動環化により構築した。キメラＣ
ＡＴプラスミド、ＢＰ１（ＳｐｈＩ）／ＧＥ２００ＣＡ
ＴおよびＢＰ１（ＳｐｈＩ）／ＧＥ１００ＣＡＴは、以
下のようにして構築した。ＳａｃＩ／ＳｐｈＩフラグメ
ント（２００ｂ）とＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩフラグメント
（１００ｂｐ）を、ＧＰ１（ＳａｃＩ）ＣＡＴおよびＧ
Ｐ１Ｄｂ−２１ＣＡＴ（ＧＰ１ＣＡＴのデリーション部
分）からそれぞれ単離した。競合プラスミドであるｐＵ
ＣＧ１００は、ｐＵＣ１８にＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩフラ
グメントを挿入することにより構築した。

【００２１】実施例４：細胞の培養、形質転換およびＣ
ＡＴのアッセイニワトリ胎児繊維芽細胞を１０日令の胎児から調製し、
１０％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ・モディファ
イ・イーグル（Dulbecco modify Eagle ）液で培養し
た。マウスの骨格筋細胞のクローンセルラインであるＣ
２Ｃ１２をBlauらの方法に従って培養した（Cell 32, 1
171 (1983)）。単核筋原細胞を頻繁に継代培養すること
により、低密度で培養した。この間、分化を低血清培養
液（２％ウマ血清添加のＤＭＥＭ）とのスウィチィング
・コンフルーエンツ（switching confluents）培養によ
り誘発しながら行なった。転写とＣＡＴのアッセイは、
ゴーマン（Gormon, C.M.）らの方法により行なった（Mo
l. Cell. Bio., 2, 1044 (1982) ）。

【００２２】細胞を、直径６０ｍｍのシャーレに１×１
０⁵個の濃度で蒔き、２４時間培養した。プロモーター
領域のデリーション解析のために、培養した細胞に、１
０μｇのＣＡＴコンストラクトと１μｇのコントロール
プラスミド（ニワトリβアクチンの下流にルシフェラー
ゼコーディング領域またはサルウイルス４０のアーリー
プラスミドを含んだ）を含んだカルシウムフォスフェー
ト−ＤＮＡの沈澱物を加えた。

【００２３】５時間の形質転換の後、ニワトリ胎児繊維
芽細胞を３０秒間、グリセリンショックにさらし、４８
時間培養した。筋原細胞への形質転換は、グリセリンシ
ョックを行なわず、カルシウム沈澱と１５〜２０時間放
置した以外は、同様の操作により行なった。初期筋芽細
胞への形質転換は、シャーレに２×１０⁵個の密度で細
胞を蒔き、１日間培養した後、筋原細胞の時と同様に行
なった。ただし、形質転換後、１５〜２０時間で低血清
培養液に換え、細胞を７２時間培養した。

【００２４】細胞を、0.25Ｍトリス−塩酸バッファー
（１２０μｌ、ｐＨ 7.5）に懸濁し、３回の凍結、融解
で溶解した。ルシフェラーゼ活性の検量は、細胞抽出物
２０μｌを用いて、ドゥ・ウェット（de Wet, J. R. ）
らの方法により行なった（Mol.Cell. Biol., 7, 725 (1
987) ）。

【００２５】８６μｌの細胞抽出物を６５℃で５分間加
熱し、内因性のデアセチラーゼを不活性化した。そし
て、適量を１ｍＭアセチルコエンザイムＡおよび
［¹⁴Ｃ］クロラムフェニコール（Amersham社）を３７℃
でインキュベートした。生成物を酢酸エチルで抽出し、
薄層クロマトグラフィーで分析した。ｐＵＣ０ＣＡＴお
よびｐＵＣ２ＣＡＴ（Takenaka, M. et al, J. Biol. C
hem., 264, 2363 (1989)）をそれぞれネガティブおよび
ポジティブコントロールとして用いた。形質転換実験の
大部分の培養の複数のセットによって、２ないし３の異
なるプラスミドが繰り返し得られた。比ＣＡＴ活性は、
Ｘ線フィルムを用いたデンシオメトリー解析により測定
した。

【００２６】実施例５：In vivo 競合アッセイとＣａＤ
プロモーター活性の血清の効果ＧＰ１Ｄｂ−２１ＣＡＴとその競合するプラスミドであ
るｐＵＣＧＥ１００およびコントロールプラスミドとし
てｐＵＣ１８をニワトリ胎児繊維芽細胞に共形質転換
し、デリーション解析によりＣＡＴ活性をアッセイし
た。血清の効果は以下のようにして測定した。必要なＣ
ＡＴ構築をニワトリ胎児繊維芽細胞に形質転換し、その
細胞をおのおの貧血清培養液（0.5 ％胎ウシ胎児血清添
加のＤＭＥＭ）中で５０時間培養するか、同様に４２時
間培養したのち、成長培養液で８時間刺激を加えた。

【００２７】実施例６：ノザンブロット解析ニワトリ胎児繊維芽細胞から得られた細胞総ＲＮＡを１
％ホルムアルデヒドアガロースゲルに分離し、ナイロン
メンブラン（Hybond-N+, Amersham 社）に移した。合成
ＤＮＡをプローブとして２種のＣａＤのｍＲＮＡを検出
した。おのおののプローブは、砂嚢または脳ＣａＤのｃ
ＤＮＡに対応するアンチセンスＤＮＡである。すなわ
ち、ｈ−ＣａＤのｃＤＮＡヌクレオチド１〜２５部分、
Ｔｍ＝７４℃（Hayashi, K. et al, Biochem. Biophys.
Res. Commun., 164, 503 (1989)）またはｌ−ＣａＤの
ｃＤＮＡヌクレオチド−１４０〜−１１７部分、Ｔｍ＝
７４℃（Hayashi, K. et al, J. Biol. Chem., 266, 35
5 (1991)）である。メンブランは、ホルムアミドを添加
せず、５５℃で［γ³²Ｐ］で標識されたそれぞれのプロ
ーブとハイブリダイズした。メンブランは、２×ＳＳ
Ｃ、0.1 ％ＳＤＳで室温下、１５分間、さらに６×ＳＳ
Ｃ、0.1 ％ＳＤＳで５５℃で３０分間洗浄したのち、８
０℃でライティング・プラス・インテンシファイイング
・スクリーンズ（Lighting-Plus intensifying screen
s, Du Pont 社）に曝した。ノザンブロット解析は、同
じプローブを用いたメンブランの複数セットに対して、
また同じメンブランに対して、製造社が推奨する方法に
従ってプローブを除去した後、違うプローブでハイブリ
ダイズしたものに対して行なわれた。

【００２８】実施例７：ＣａＤ発現のイムノブロット解
析ニワトリ胎児繊維芽細胞およびＣ２Ｃ１２細胞のホモジ
ネートを９％ナトリウムドデシルスルフェート−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動で分離し、ＣａＤ（３５ｋＤ
ａ）のカルボン酸ドメイン特異的抗体と西洋ワサビパー
オキシダーゼ結合蛋白Ａを用いて、イムノブロットし
た。ブロットは、ＥＣＬ（enhanced chemiluminescenc
e， Amersham 社) で現像した。

【００２９】［結果］ニワトリのカルデスモン５’上流領域部分の遺伝子：λ
Ｇ１０２およびλＢ１１のゲノムクローンからのＤＮＡ
断片を適当なクローニングベクターにサブクローニング
し、核酸配列を同定した。核酸配列を配列表２に示す。
以前に投稿されたｃＤＮＡ配列（Hayashi, K. et al, B
iochem. Biophys. Res. Commun., 164, 503 (1989)およ
びHayashi, K. et al, J. Biol. Chem., 266, 355 (199
1)）とこのシーケンスの解析から、λＧ１０２およびλ
Ｂ１１が、１番目のエクソンの５’上流領域を含むこと
が明かとなった（エクソン１ａ−１およびエクソン１ｂ
は、それぞれ砂嚢ＣａＤ、脳ＣａＤをコードしてい
る）。

【００３０】砂嚢タイプのカルデスモンのｍＲＮＡの転
写開始点は、プライマーエクステンション解析により同
定された。砂嚢ＣａＤのｍＲＮＡの転写開始点は、ｍＲ
ＮＡの翻訳開始コドンであるＡＴＧより、２１８塩基上
流であった。ＴＡＴＡボックスは、５’上流領域中に、
転写開始点より−２７の位置にＴＡＴＴとして見いださ
れた。砂嚢タイプのＣａＤの５’上流領域にＳｐＩ結合
サイト様の配列（ＴＧＧＧＡＧＧＧＣ）が見られ、ＴＡ
ＴＡボックスの近い上流には、ＣＣＡＡＴボックスが位
置していた。オクタマー転写因子（ＯＴＦ１）結合サイ
ト様の配列（ＡＴＧＣＴＡＡＴ）は、かなり上流である
−８９８と−８９１の間に位置していた。加えて、タン
デムリピート配列（ＴＡＡＡＡＡＡＴＡＡ）は、−５５
１と−５２３の間に位置していた。−１１８９と−１１
７８の間の配列は、特有のパリンドローム構造を形成し
ていた。

【００３１】ＣＡＴ測定によるニワトリＣａＤプロモー
ターの特徴付け：１ａ−１および１ｂエクソンの５’上
流領域のプロモーター活性を、ニワトリ胎児繊維芽細胞
を用いたＣＡＴアッセイにより測定した。砂嚢タイプＣ
ａＤについての結果を図２に示す。ＧＰ３ＣＡＴ、ＧＰ
２ＣＡＴおよびＧＰ１ＣＡＴは高いＣＡＴ活性を示し、
一方、ＢＰ２ＣＡＴおよびＢＰ１ＣＡＴは活性は非常に
低いが、ネガティブコントロールであるｐＵＣ０ＣＡＴ
とは識別できる程度の活性を示した。この結果は、砂嚢
ＣａＤおよび脳ＣａＤのプロモーターは、おのおの５’
上流領域に独立した活性を示すことを示唆している。脳
タイプのＣａＤのプロモーターが活性が低いことは、ノ
ザンブロット解析で砂嚢タイプＣａＤがニワトリ胎児繊
維芽細胞中で主要発現型であることとよく一致してい
る。対照的に、これらのＣＡＴの構成は、複数のＥボッ
クスを持つＧＰ３ＣＡＴおよびＢＰ２ＣＡＴでさえ、成
長や分化条件での、Ｃ２Ｃ１２細胞中のプロモーター活
性を示さない。これらの結果は、筋原細胞および初期筋
芽細胞のＣ１Ｃ１２細胞において、ＣａＤの発現量が非
常に少ないというイムノブロット解析の結果とよく一致
する。

【００３２】さらにＧＰ１ＣＡＴから得た、デリーショ
ンＣＡＴ構成を用いて、組織特異的に砂嚢タイプＣａＤ
の発現率が高いシークエンスを探した。その結果、ＧＰ
１ＣＡＴからＧＰ１Ｄ８ＣＡＴまでからのデリーション
は、同等のＣＡＴ活性を示した。興味深いことに、ＧＰ
１Ｄａ−１０ＣＡＴおよびＧＰａＤｂ−２１ＣＡＴは、
先のデリーションより３倍高い活性を示したのに対し
て、ＧＰａ（ＳＰｈＩ）ＣＡＴの活性は劇的に低下し
た。

【００３３】これらの結果から、転写開始点から−２１
７までは、ＴＡＴＡボックス、Ｓｐ１結合サイト様の配
列、ＣＣＡＡＴボックスを含む根本的なプロモーター領
域であり、−３７２から上流の配列がプロモーター活性
に必須の調節領域であることが解った。

【００３４】この調節領域は、ネガティブレギュレータ
ー（−３７２から−３４６）とポジティブレギュレータ
ーの２つに分けられる。ＣＡｒＧボックスは、ポジティ
ブレギュレーターの方に属していた。これらの事実か
ら、砂嚢タイプのＣａＤの発現は、ポジティブレギュレ
ータであるエクソン１ａ−１の−３１５から−２１８に
依存すると考えられた。

【００３５】

【発明の効果】カルデスモンをコードしている遺伝子の
上流にあるプロモーター部分を解明した。これにより、
カルデスモンの発現を調節することが可能となり、カル
デスモンを医薬として多量に発現させる、遺伝子治療に
用いる、カルデスモン発現の調節物質をスクリーニング
することが可能となった。カルデスモンは、ガンの治療
薬、抗動脈硬化剤また消化管運動促進剤として使用でき
ることが知られており、この目的の達成のために、本発
明のプロモーターを用いることができる。また、動脈硬
化症の診断に用いることができると考えられる。

【００３６】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：９８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類： cDNA to mRNA 配列 GGATAACCAA AAAAGGGCAT GTAGCAAGAC AGTTTTGGCA GCTTGCATGA ATTTTCGGAG -256 CTTTTTAGGT CTTGGTTTTC TGATGAGTGG CTTCCTGA -218

【００３７】配列番号：２配列の長さ：３０７３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類： cDNA to mRNA 起源生物名： White Leghorn 組織の種類：Gizzard 配列の特徴特徴を表わす記号： promoter 存在位置： -315..-218 特徴を決定した方法： E 配列 TCTAGACCAC AGCATTATCT TAGCTTTTGA TTGTAAATTT CAAAGGAAAA ATTGGTAAAC -2982 CGTAGAGAGC CACAGTTTCT ACAGCTTTCT GGGTATTTCT AACATGGTCC TTCAAGGGAG -2922 TTGACTGCAC ATTTGTGCTC TGAGAACACT TTGGTGGCTC GGCATGTACA AATGCATTGG -2862 TTCTTATCAC CCTTGCCCTG AGTTACCATC TCAAGAGCTG AGCAATGAAC ATTGCATGGC -2802 CCTTTCTTCC TATCATAAGA ACAATTCTAA TATTGATGTC TTGTTCTGGG GCCTGATTTC -2742 TACACTTGCT ATTTTTTTGA TGTCTTACAT CTGCAATCAT AAATCAAGAG CTGGATTCTT -2682 CAGACACAGG TTTTCAGCCT TGTGCATTTT TCAGCACATT GTGCTATGGC ACAAAGAGTT -2622 TGATCGTCAG GGTCAAAGCA GAGGGGAAAG GAAATTGTGG CTAGAGTGGC AACCTTGGCA -2562 GCGAGGGCAA GGACTACGAG GGTAGTTCCC TAATTTCCTA CTGTTGTGGA TTGAGACATA -2502 TTATAGCTGT GTATTTACAG CAGGCATCTG CAGGTTGCTC CTGGTTATAG GATGCCATGG -2442 GACATCCACT AGAAATTTAG CTCAGCATTC TCAGTAGCTC AGATTCTCAA AAATATCTCC -2382 AGGAGATCTG TGCTAGCTCA TTGGTTTGGA AGTTTCAAGT CTTGAAATCC AAAAGTTTCT -2322 CCAGGTGAAA TTCAGCTCAG CTAGAAGGAT GAAAACTTTA CTTTTCATGA TACCATTTCC -2262 CCAGGGCAAA ATCAGACTTT TTGCAGGATT TTGATGGAAA AATGACCTAC AACACTTAGT -2202 CTGGGATGCT TTGACAGGGG AGCATCAAAA CTCATGCCAA GCCTCTTTCA AAACACACAG -2142 CTGCTTTCAG CCTTAAGTAG TTTGTACCTA CTAGCTCCCT GTTGCAGTGG ACACTGAGGC -2082 TGCAGCAGTT CAGTTGATGG TTATACAAGA ACAAGAACCT CAAGTTACAT CTAACATAGA -2022 ATCATGGAAT CGTCTGAGTT GGAAGGGACC TTTAAGGGCC ATATGGTTCA ACTCTCCTGC -1962 AATGAAGATG GTCTCCCACA GGGTAGGTCA GGTTGCTCAG AGCCCTATCC AGCCTGACCT -1902 TGAGTGTCTC CAGGTGTGAG GCATCCACAT CCAGATTTCT GCTCTCCCCA TCAGCATCCC -1842 TTAAACCTTT TTACTCTTTA GCCTGGATTT TTGAATGTTT TACCTTCTAA AAATCTGGGA -1782 AGATGGTAGG ATCAAGTATG AATTTGTCAT TTCTTTCTAA GTAATGTTAT TTCCTCTTTT -1722 TATTTGGTCA TCAACACATA GGTTAATAAT TTCTGTAATT AATAGAATGA CAGAGAACAA -1662 ATACATTCTT CTCCATAGTT TAGTAAATCC TGCAAACCAA GCTATATATG TAGCTGTATA -1602 TATTATTTTT AATATTTAAA GCCATCATAT TCACATAATG GAAGACATCT GGTATTTGAG -1542 AATTTCTAAA GGGTTTTTGG AAAAAAAAAG TGTCTTCTAA AAACCAGCAA CATTTTTTTT -1482 TACTTTATTA AAGTTGTGAA ATTTAAAATG ACACTGTAAA ATTGGAATTG CTTGGTGTAA -1422 ATCTGCAGAG CTTTGGCTCT TTAAATATTT TTTTTTGTTG TAAAGATTAG TTTACTGTCT -1362 GTGGACTGAA TCCTTCTTGC ATTACACATG TGACTAAATC CATGGGGCCC AGTGACCAGA -1302 AATAAAGACC CAGAAAGGCA TTAAAATAGT TTAGCCTGCT CAGCTGCAAA GTCATCTTAC -1242 ACATATTTTC CCCCTAACTG GTTTTGTGTA TGTTATTGTC AAATATGAAT CTGCAGAATA -1182 TCTCCTGGTC TGGAATCCTG TCCTGTGGAG CAGTCAGCAC TTCTCTTTCA GCCTTGCTTA -1122 GCGGCTGGTA CATGTGTTAG GGTCCGTGCA CTGCAATAAT TTTCACATTT CTTTTCACAC -1062 TCTCTTAATT TATGTCGGTC ATTTGTTTCC CGCATCAGTC TGCATCTGTT CTTTCATTTT -1002 AAGCTCTCTG TGTAATTTGG AAAGTTATCA ATAATGATCA CAAAAGAAAA AAAAAAGAAA -942 AAGAAAAAAT GGGATAAAAA ATGATTCTAA GCTTCCTTTA TCCATGCTAA TGGAAGATAT -882 TGAAAAGTAT TGTGCAGAAT ATATAGACGT AGGGTCTGCC CTCGTAGTAA ATGAATCTGT -822 TTAAATGTAT ATAGAAATAG CTGTACGCCT GGAAACGAAA CCCCTTCATT CTACTACCAA -762 GGATCATTGT CATAACTCTG AATCCCATTT AAAGTTGCTT TTCAGAGCAG GGATATTCTA -702 TATGTAACTT CTGTTGCACT GTTTGAGATG GAAGCAGGCT GCGGAGCCTG CCAACTCATC -642 TTTCATGTGC CTTTCCCACT GGTGTGTCTT TGCAGAATCA AGCTTGCACA GCAGAGAGTT -582 TCTGTGTTCC CTCTTACATG TGGTGCTCGT TAAAAAATAA TAATAATAAT AAAAAATCAA -522 CAATAAAGTT TTGCTGTAGT GGAATTATTT ATTTGATTTT TAAAGACCTG GTGCAGAAAG -462 TAAATATGTT TACTGTGCTC TTTTCCTTTC AGTGTGCTTC CTTTTTTTGA GCTCCGTTTG -402 TATTCAACAA GACAGCCTCT TTCTCCAAGA TTAACATTTC TTATGATTGT TCCTGACAGA -342 GGATTTACTT TCAGAGGCCC TGCTAAGGAT AACCAAAAAA GGGCATGTAG CAAGACAGTT -282 TTGGCAGCTT GCATGAATTT TCGGAGCTTT TTAGGTCTTG GTTTTCTGAT GAGTGGCTTC -222 CTGAGCATGC CTAGGGAATG ACAGGCATCT CTGCAGGCAG GCTGAACCCA CCTTGGCTTG -162 TGCGTACGCA TTGGCTGCCT ATTAGAATAA ATTGAGGACA ATGCATACCG CTGCCTGCCA -102 ATTGTAAACA TAAGGGATAT GTATTCACTT AGCATTGACT TTTGGGAGGG GCCAAGGCAA -42 GGCTGTAGTT TTATTGAATA GGGCTGTATG TGAGGCTGCT GGTGTGCCTT TCTTGCTGCG +19 CTCCTGCCCA AGCAGCCAGT TATTCATTTC CTTCCTACTA GTTGAAAACT TTTCACCGCT +79 GAGGTAAGGG CA +91

【図面の簡単な説明】

【図１】砂嚢タイプカルデスモンの制限酵素地図であ
る。

【図２】砂嚢タイプカルデスモンプロモーターのクロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）活性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】動物のカルデスモン転写調節領域。
【請求項２】配列番号１で示されるカルデスモン転写
調節領域の塩基配列。
【請求項３】配列番号１で示されるカルデスモン転写
調節領域の塩基配列のホモログ、フラグメントまたはフ
ラグメントのホモログ。
【請求項４】配列番号１で示されるカルデスモン転写
調節領域の塩基配列を用いるカルデスモン発現調節物質
のスクリーニング方法。