JPH0838192A

JPH0838192A - モノクローナル抗体産生細胞、その製造法、モノクローナル抗体及びその製造法

Info

Publication number: JPH0838192A
Application number: JP6182241A
Authority: JP
Inventors: Kenzo Baba; 憲三馬場; Mitsuo Yamaki; 光男山木; Yasuyuki Kuroiwa; 保幸黒岩; Kiyotaka Kawagoe; 清隆川越; Akishi Iguchi; 晃史井口; Shunei Morikawa; 俊英守川; Yoshiki Nakao; 義喜中尾
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd
Current assignee: Resonac Corp
Priority date: 1994-08-03
Filing date: 1994-08-03
Publication date: 1996-02-13

Abstract

(57)【要約】【構成】タンパク質に対して特異的な反応性を有する
モノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の製造法に
おいて、未変性タンパク質又は変性タンパク質のいずれ
か一方で免疫を惹起し、次いで他方のタンパク質により
追加免疫した動物から取得した抗体産生細胞と、骨髄腫
細胞とを融合させることを特徴とするモノクローナル抗
体産生細胞の製造法、この製造法により得られたモノク
ローナル抗体産生細胞、このモノクローナル抗体産生細
胞を培養することを特徴とするモノクローナル抗体の製
造法及びこの製造法により作製されたモノクローナル抗
体。【効果】タンパク質のなかで従来法ではモノクローナ
ル抗体の製造が困難であったものを効率的に製造するこ
とができる。得られたモノクローナル抗体は目的とする
タンパク質を特異的に検出するための各種診断法、各種
試薬に有用であり、また医薬品としても有用である。ま
た、得られた抗体産生細胞は上記抗体を産生することの
他に抗体遺伝子のソースとしても有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、従来取得が困難である
タンパク質に特異的なモノクローナル抗体の産生能を有
するモノクローナル抗体産生細胞、その効率的な製造
法、モノクローナル抗体及びその製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】モノクローナル抗体及びその産生細胞の
作製は、1975年にKohlerとMilsteinにより報告されて以
来、数多くの報告がなされている。しかしながら、一般
的に抗原性の高いタンパク質に対するモノクローナル抗
体の作製は容易であるが、抗原性の低いタンパク質に対
するモノクローナル抗体の作製は難しい。さらに、抗原
性の高いタンパク質であっても、抗原部位によりその抗
原性は大きく異なっており、抗原性の低い抗原部位に対
するモノクローナル抗体の作製は、困難を極めている。
例えば、クラミジア・ニューモニエの外膜に存在する分
子量39.5Kダルトンのタンパク質である、外膜主要タン
パク質（Major Outer Memblane Protein、以下、ＭＯＭ
Ｐと略す）は、種特異的な抗原部位と属特異的な抗原部
位を有し、かつ量的にも多く含まれているため、検出す
る抗原として好ましい。また、属特異的な抗原部位に対
するモノクローナル抗体は、すでに取得されていること
から、本抗原部位は、抗原性が高いと推測されるが、ク
ラミジア・ニューモニエに対するモノクローナル抗体の
作製が試みられているにもかかわらず、種特異的なモノ
クローナル抗体の報告はないことより、本抗原部位は、
抗原性が低いと考えられる。クラミジア・ニューモニエ
基本小体（ＥＢ）やＭＯＭＰ等を用いた通常の免疫方法
では、ＭＯＭＰの抗原性の低い抗原部位に特異的に反応
するモノクローナル抗体を産生する細胞を得ることは困
難であり、現在までＭＯＭＰの抗原性の低い部位に特異
反応的なモノクローナル抗体及びその抗体産生細胞は得
られていない。

【０００３】クラミジア・ニューモニエに対するモノク
ローナル抗体として、Iijima等は、種々のものを報告し
ているが(J. Clinical Microbiology, 32(3), 583-588
(1994))、この中にＭＯＭＰに特異的に反応するモノク
ローナル抗体の報告はない。Cho-chou Kuo等は、クラミ
ジア・ニューモニエに特異的な反応性を有するモノクロ
ーナル抗体(RR402)を報告しているが(J. Clinical Micr
obiology, 24(6), 1034-1037(1986)、特表昭64-500083
号公報)、このモノクローナル抗体(RR402)が認識する抗
原は、明らかにされていない(Y. Iijima, J. Clinical
Microbiology, 32(3), 583-588(1994))。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、クラミ
ジア・ニューモニエ由来ＭＯＭＰを具体例として検討
し、ＭＯＭＰの立体的な構造（３次構造）は抗原性が高
く、平面的な抗原構造やアミノ酸配列そのものは抗原性
が低いと推定し、鋭意検討した結果、従来取得が困難で
あったＭＯＭＰの低抗原性部位に対するモノクローナル
抗体を産生する細胞を製造することができ、本発明を完
成するに至った。

【０００５】

【課題を解決するための手段】即ち本発明は、タンパク
質に対して特異的な反応性を有するモノクローナル抗体
を産生する抗体産生細胞の製造法において、未変性タン
パク質又は変性タンパク質のいずれか一方で免疫を惹起
し、次いで他方のタンパク質により追加免疫した動物か
ら取得した抗体産生細胞と、骨髄腫細胞とを融合させる
ことを特徴とするモノクローナル抗体産生細胞の製造
法、該製造法により得られるモノクローナル抗体産生細
胞、前記モノクローナル抗体産生細胞を培養することを
特徴とするモノクローナル抗体の製造法、及び、該製造
法により得られるモノクローナル抗体に関する。本発明
のモノクローナル抗体産生細胞の製造法は、免疫する動
物に対する免疫法に特徴を有するが、それ以外は一般の
方法、即ち、動物の免疫、細胞融合、融合細胞の選択、
特異抗体産生細胞の選択、クローニング等の工程を経て
調製することができる。本発明の製造法を適用できるタ
ンパク質としては、クラミジア属、特にクラミジア・ニ
ューモニエのＭＯＭＰ、細菌、ウイルス、ヒト及び動植
物由来の各種タンパク質が挙げられる。

【０００６】未変性タンパク質とは、その本来形成して
いる立体構造が破壊されていないタンパク質であり、ク
ラミジア、細菌、ウイルス等の生物体自身、例えばクラ
ミジアの場合はその基本小体（ＥＢ）そのものであって
もよいし、タンパク質の部分精製物又はタンパク質の完
全な精製物であっても良い。クラミジア・ニューモニエ
の場合、未変性なタンパク質抗原としては、例えば、Ｙ
Ｋ−４１株、ＴＷＡＲ株のＥＢ等が挙げられる。変性タ
ンパク質とは、各種処理により生理的溶液中で本来形成
しているその立体構造が破壊された状態のタンパク質を
いい、好ましくは、そのジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結
合）も切断された、アミノ酸配列自体を抗原部位として
認識できる状態のタンパク質である。この免疫により、
未変性タンパク質の免疫のみでは前記タンパク質に対す
るモノクローナル抗体産生細胞を得ることが困難な場合
でも、そのタンパク質の低抗原性部位に対する抗体産生
細胞が充分に増幅されるため、容易に前記抗体産生細胞
を得ることができる。なお、いずれか一方のタンパク質
のみを免疫用抗原として用いた場合は、該タンパク質中
の高い抗原部位に対する抗体産生のみが誘導され、目的
とする低抗原部位に対する抗体を効率的に誘導すること
が困難である。タンパク質の変性法は特に制限されない
が、還元剤又は界面活性剤で処理する方法、熱処理によ
る方法、有機溶媒処理による方法等があるが、還元剤又
は界面活性剤で処理する方法が好ましい。還元剤として
は、特に制限はないが、2-メルカプトールエタノールが
好ましい。界面活性剤としては、特に制限はないが、Ｓ
ＤＳ（ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム）が好ま
しい。免疫される哺乳動物としては、マウス、ラット、
ウサギ、ヒツジ、ニワトリ等が挙げられるが、マウスが
特に好ましい。

【０００７】免疫方法は、いずれか一方のタンパク質で
免疫を惹起し、最終免疫用抗原として、他方のタンパク
質を用いるが、未変性タンパク質で免疫を惹起し、最終
免疫用抗原として、変性タンパク質を用いる方が好まし
い。例えばクラミジア・ニューモニエの場合は、ＥＢ
(基本小体)又はその未変性なＭＯＭＰで免疫を惹起し、
最終免疫用抗原として、変性タンパク質、例えばクラミ
ジア・ニューモニエの場合は還元剤及び界面活性剤処理
を施すことにより変性させたＭＯＭＰを用いることが推
奨される。また、免疫の際にアジュバントを用いるのが
好ましく、例えば、フロイントの完全アジュバント（以
下、ＦＣＡと略す）、フロイントの不完全アジュバント
（以下、ＦＩＡと略す）等が好ましいものとして挙げら
れる。免疫の惹起は、通常１回〜５回程度の免疫操作で
行えるが、免疫する抗原により６回以上の免疫操作によ
り惹起を行うこともできる。免疫で使用する抗原量は、
動物あたり通常１ng〜１０mg程度の量が使用できるが、
抗原によってより多い抗原量やより少ない抗原量も使用
できる。最終免疫も、通常１回〜５回程度の免疫操作で
行えるが、免疫する抗原により６回以上の免疫操作によ
り惹起を行うこともできる。免疫で使用する抗原量は、
動物あたり通常１ng〜１０mg程度の量が使用できるが、
抗原によってより多い抗原量やより少ない抗原量も使用
できる。また、通常惹起に用いた抗原量の１／１００〜
１０倍量程度用いられる。上記方法による充分な免疫
後、免疫した哺乳動物から、脾細胞、リンパ球Ｂ細胞等
を抗体産生能を有する親株として摘出する。

【０００８】ハイブリドーマ作製のもう一方の親株とし
ては、一般に骨髄腫（ミエローマ）細胞が用いられる。
例えば、マウス由来のＰ３Ｕ１、ＮＳ−１、６５３、Ｓ
Ｐ２、Ｘ６３、ＭＰＣ−１１等、ラット由来のＡＧ１、
ＡＧ２、ＡＧ３、ＲＣＹ３、２１０等、ヒト由来のＳＫ
Ｏ−００７等が使用できるが、マウス由来の細胞が好ま
しく、特にＰ３Ｕ１、６５３等が好ましい。細胞融合は
ポリエチレングリコールを用いる方法、センダイウイル
スを用いる方法、電気融合法等が使用できるが、ポリエ
チレングリコールを用いる方法が好ましい。ハイブリド
ーマの選択は、ハイブリドーマのみが生育できる選択培
地中で培養することにより行うことができる。例えばＨ
ＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）培
地、ＨＡｚ（ヒポキサンチン−アザセリン）培地等が好
ましいものとして挙げられる。

【０００９】特異抗体産生細胞の選択は、上記培養によ
りハイブリドーマの増殖が認められたウエルの上清を採
取し、目的とするタンパク質等（例えばクラミジアニュ
ーモニエの場合、ＥＢ、ＭＯＭＰ）を用い酵素抗体法、
免疫ブロッティング法等により抗体産生の有無を調べる
ことにより行うことができる。クローニングとは、上記
特異抗体産生細胞を１つのクローンに由来する均一な細
胞集団とすることであり、例えば、限界希釈法、ソフト
アガー上のコロニーを拾い上げる方法、シングルセルマ
ニュピュレーション法、ＦＡＣＳ法等が挙げられるが、
限界希釈法が簡便で好ましい。以上の方法により、モノ
クローナル抗体産生細胞を得ることができる。本発明の
方法により得られたモノクローナル抗体産生細胞の一例
である、クラミジア・ニューモニエ由来ＭＯＭＰに特異
的な反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマＣＰ−６を、工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託し、１９９４年７月２０日に寄託番号生命
研菌寄第１４４３６号（ＦＥＲＭＰ−１４４３６）と
して受託された。

【００１０】上記方法により得られたモノクローナル抗
体産生細胞を好適な培地で培養することにより、モノク
ローナル抗体を製造することができる。培地としては例
えば、牛胎児血清を添加した変性イーグル培地（ＭＥＭ
培地）、ダルベッコの変性イーグル培地（ＤＭＥＭ培
地）、ＲＰＭＩ１６４０培地等が好ましいものとして挙
げられる。モノクローナル抗体の回収は、培養上清を集
め、プロティンＡカラム、プロティンＧカラム等を用い
たアフィニティークロマトグラフィー法、イオン交換ク
ロマトグラフィー法、ポリエチレングリコール分画法、
エタノール分画法、硫酸アンモニウム分画法等により行
うことができるが、アフィニティークロマトグラフィー
法が好ましい。得られたモノクローナル抗体は、目的と
するタンパク質に対して特異的な反応性を有するか否か
評価することができる。例えば、生物を適当な処理液で
処理し、電気泳動し、これを用いたウエスタンブロット
法により、前記タンパク質のバンドと特異的に反応する
ものを選択することができる。

【００１１】本発明のモノクローナル抗体の製造法によ
れば、その種類は現在知られているどのようなタイプ
（グロブリンクラス）のものも製造できる。また、さら
にモノクローナル抗体の部分分解物又はモノクローナル
抗体の部分構造を有するものとして使用することもでき
る本発明の製造法により得られるモノクローナル抗体
は、従来取得が困難であったタンパク質の低抗原性部位
を抗原決定部位として認識するものである。具体的に
は、そのタンパク質の平面構造やアミノ酸配列自体を抗
原決定部位として認識するものである。

【００１２】本発明により得られるモノクローナル抗体
は、必要に応じて他のモノクローナル抗体又はポリクロ
ーナル抗体と組み合わせて目的とするタンパク質の検出
法に用いることができる。具体的にはラジオイムノアッ
セイ、エンザイムイムノアッセイなどの免疫反応を利用
した検出法に使用できる。また、その為の診断薬又は研
究用試薬の一成分として使用できる。さらに直接又はキ
メラ抗体やドラフト化抗体として医薬品にも使用でき
る。また、本発明のモノクローナル抗体をポリメラーゼ
チェーンリアクションなどと組み合わせた診断キットに
使用することもできる。本発明の抗体産生細胞は、抗体
遺伝子のソースとしても使用できる。さらにこの抗体遺
伝子は、各種の細胞で発現させることもできる。

【００１３】

【実施例】本実施例では従来法では取得できなったクラ
ミジア・ニューモニエ由来ＭＯＭＰに特異的に反応する
モノクローナル抗体を得ることを目的とした。１．クラミジア・ニューモニエＥＢの調製クラミジア・ニューモニエＥＢの調製にはＹＫ−４１株
を用いた。ＹＫ−４１株のヒト肺由来細胞（ＨＬ細胞と
略す）への感染は、岸本らの方法（検査と技術,18
（7）,959-964（1990））に従った。24ウエル又は６ウ
エルシャーレで培養した感染細胞を細胞剥離し、培地ご
と回収した後、6,000rpm、30分間遠心した。上清を除去
し沈澱物をシュークロース-リン酸-グルタミン溶液（7.
5％(w/v)シュークロース、3.8mM KH₂PO₄、7mM K₂HPO₄、
5mM グルタミン酸（pH7.4）、ＳＰＧと略す）に懸濁し
た。懸濁液をホモジナイザーで破砕した後、2,500rpmで
10分間遠心した。上清を除去し沈澱物をＳＰＧに懸濁し
た。この操作を５回繰り返した後、上清を回収した。回
収液を23％（v/v）ウログラフィン（日本シェーリング
社）、50％シュークロースと２容：２容：１容の比で混
合し遠心分離（8,000rpm,１時間）した。上清除去後、
下層（50%(w/v) シュークロース層）を回収しＳＰＧに
懸濁、洗浄し、遠心分離（10,000rpm、30分間）後、上
清を吸引除去し、沈澱物をＳＰＧに懸濁後、26.6〜38％
(v/v)ウログラフィンDensity Gradientと１容：４容の
比で混合し遠心分離（8,000rpm,１時間）し、中間層を
回収、ＳＰＧに懸濁した。遠心分離（10,000rpm、30分
間）後、上清を吸引除去し、沈澱物を適当量のＳＰＧに
懸濁しＥＢ溶液とした。保存は分注後、4℃又は-70℃で
行った。

【００１４】２．クラミジア・ニューモニエＭＯＭＰの
調製上記方法により得られたＥＢ溶液をディスクプレパラテ
ィブ電気泳動により分離精製し、ＭＯＭＰを調製した。
すなわち、得られたＥＢ溶液（タンパク（ＥＢ）濃度72
7μg/ml） 0.5mlと0.5mlの２倍濃度のサンプルバッフ
ァー（0.31Mトリス−塩酸（pH6.8）、1.6％(w/v)ドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳと略す）、１mM ジチオスレ
イトール、16％(v/v)グリセリン、0.005％(w/v)ブロモ
フェノールブルー）を混合し、煮沸（100℃、３分間）
によりタンパクを可溶化後、全量をディスクゲル（濃縮
ゲル４％、分離ゲル10％）に付加、電気泳動（装置：デ
ィスクプレパラティブ電気泳動装置ＮＡ−1800型、日本
エイドー社、泳動条件100Ｖ（定電圧））し、一定量ず
つ（0.26ml/フラクション）回収した。フラクションご
とのＳＤＳスラブ電気泳動を行い（装置：DNA-PAGE用電
気泳動装置ＮＢ−5000型、日本エイドー社、泳動条件10
0Ｖ（定電圧））分子量39.5KのＭＯＭＰをフラクション
33〜45番に回収したことを確認した（タンパク濃度0.21
mg/ml）。

【００１５】３．ハイブリドーマ及びモノクローナル抗
体の製造上記方法により得られたＥＢの生理食塩液溶解液0.5ml
をＦＣＡ（ディフコ社）0.6mlと混和、超音波破砕機
（ブランソン社）を用いて油中水型のエマルジョンを作
製し免疫用抗原とし、生後８週令のBALB/c雌性マウス５
匹に、200μlずつ腹腔内注射した（１回あたりＥＢ免疫
量10μg/マウス）。６日後及び12日後にＦＩＡ（ディフ
コ社）を用いて免疫を行った。その６日後、部分採血し
各々の血清について抗体価をDot Immuno Binding Assay
法(以下DIBA法と略す）で測定し、抗体価の一番高いも
のについて、測定日から３日間最終免疫として上記方法
により得られた精製ＭＯＭＰ200μl（１回あたりＭＯＭ
Ｐ免疫量１μg/マウス）を尾静脈より投与した。最終免
疫３日目の翌日にマウスの頚椎脱臼後脾臓を摘出し単細
胞分散を行い細胞融合用の脾細胞とした。細胞融合用の
パートナー細胞には10％(v/v)牛胎児血清加ダルベッコ
ＭＥＭ培地（10Ｆ培地と略す）であらかじめ培養した
（ナプコ製ＣＯ₂インキュベーター、37℃、５％炭酸ガ
ス、飽和湿度下）、Ｐ３Ｕ１マウスミエローマ細胞を用
いた。

【００１６】上記の脾細胞1.1×10⁸個とマウスミエロー
マＰ３Ｕ１細胞2.1×10⁷個とを混合し、遠心分離（1,00
0rpm、10分）後、上清を吸引除去し、軽く振動を与えて
細胞ペレットをほぐした後、細胞融合剤（50％(v/v)ポ
リエチレングリコール；Ｍ．Ｗ．＝4000メルク社）を0.
2ml加えた。１分45秒後、培養液10mlを１分間かけて加
え、さらに培養液20mlを加え懸濁後、段階的に遠心し分
離した（300rpm ３分、500rpm ３分、700rpm ３分）。
上清を吸引除去し、細胞ペレットに５％ブライクローン
（大日本製薬）を含有する10Ｆ培地（10Ｆ＋Bri培地と
略す）を加え、細胞浮遊液を調製した。細胞浮遊液を96
ウエルのプラスチック平底マルチプレート（コーニング
社）にミエローマ細胞換算で4×10⁴個/ウエル/0.1mlに
なるよう分注し、37℃、５％炭酸ガス、飽和湿度下で培
養した。翌日ＨＡＴを含有する10Ｆ培地（1×10^-4Ｍヒ
ポキサンチン、4×10^-7Ｍアミノプテリン、1.6×10^-5Ｍ
チミジン及び10％牛胎児血清を添加したダルベッコＭＥ
Ｍ培地、ＨＡＴ培地と略す）を0.1ml/ウエル加え、更に
３、４日間隔で培養上清の半量をＨＡＴ培地におきか
え、いわゆるＨＡＴセレクションを約２週間にわたって
行い、ハイブリドーマの増殖が認められたウエルの上清
を採取して Dot Immuno Binding Assay法（以下、DIBA
法と略す）によりＥＢに対する抗体産生の有無をスクリ
ーニングした。

【００１７】DIBA法は96ウエルのＵ底マルチプレート
（コーニング社）を用い、あらかじめ、１ドット当り0.
02μgのＥＢを抗原として固定した３mm角のメンブラン
フィルター（アドバンテック47mm径格子入フィルターA0
45b047A）に10％(v/v)ＦＣＳ(Fetal Calf Serum)を加え
室温に15分、ついで上清除去後、ハイブリドーマの培養
上清100μlを加え室温に１時間、ついで上清除去後パー
オキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体
（カッペル社）の500倍希釈液100μlを加えて同様に１
時間それぞれ反応させて最後に基質として４−クロル１
ナフトールを加えて発色させた。抗原を固定したメンブ
ランフィルター上に肉眼的に発色を認めたものを抗体産
生陽性と判定した。このスクリーニングの結果、抗体産
生陽性のウエルのハイブリドーマをさらに限界希釈法に
よりクローニングを行なった。すなわち、該抗体産生陽
性のハイブリドーマのＨＡＴ含有培地による浮遊液を調
製し細胞濃度を測定して新しいマイクロプレートにハイ
ブリドーマが２〜100個/100μl/ウエルになるよう希釈
液を分注して培養した。この時希釈液にはＨＴ＋５％ブ
ライクローン培地を用いた。

【００１８】高希釈のウエルでハイブリドーマの増殖が
認められた場合は抗体産生能の測定と顕微鏡観察を行い
モノクローンであることを確認した上さらに再度同じ操
作を繰り返し、抗体持続産生能の高い抗ＥＢモノクロー
ナル抗体産生クローンを得た。得られた各クローンは培
養スケールを徐々に上げ最終的に50mlの10Ｆ培地で培養
し、その培養上清につき抗体の性質を調べた。以上の実
験操作を前後２回にわたって行い、最終的に表１に示す
モノクローナル抗体産生クローンを10株得た。10株のハ
イブリドーマクローンの産生するモノクローナル抗体の
グロブリンクラスはISOTYPE Ab-STAT-Iキット（Sang St
at Medical社）により測定した（表１参照）。表１に示
すようにモノクローナル抗体ＣＰ−１、ＣＰ−２、ＣＰ
−４、ＣＰ−５、ＣＰ−６、ＣＰ−７、ＣＰ−８はクラ
ミジア・トラコマティスへの反応性を示さず、クラミジ
ア・ニューモニエへの反応性を示した。

【００１９】

【表１】

【００２０】さらに、表１のモノクローナル抗体すべて
をそれぞれ産生するハイブリドーマクローンにつき10Ｆ
培地で培養して増殖した細胞をプリスタン（和光純薬）
0.5ml/マウスを投与し前処理したBALB/cマウスの腹腔内
に1×10⁷個づつ接種して２〜３週間後に得られた腹水か
ら本発明のモノクローナル抗体を精製した。ハイブリド
ーマクローンＮｏ．６の腹水は下記の如くプロテインＡ
を固定化したアフィニティカラムによる方法で精製し
た。すなわち、マウス腹水と同量の1.5Ｍグリシン＋３
ＭNaCl（pH8.9）を加え0.45μmのナイロンフィルター
（コーニング社）を通過させたのちプロテインＡ−ポロ
ス（日本ガイシ）のアフィニティカラムに付し1.5Ｍグ
リシン＋３Ｍ NaCl（pH8.9）で洗浄した。ついで150mM
NaClを含むリン酸−クエン酸緩衝液（pH6.0）で溶出さ
せた。溶出液は1M Tris-HCl緩衝液（pH9.0）で中和後冷
却し、ＰＢＳで一晩透析後、回収液の280nmの吸光度を
測定（U-2000、日立製作所）し、0.2μmのセルロースア
セテートフィルター（コーニング社）を通過させ-80℃
で保存し精製抗体の保存液とした。

【００２１】４．モノクローナル抗体の特異性解析モノクローナル抗体の特異性解析をウエスタンブロット
法で行った。クラミジア・ニューモニエとの反応性は上
記１．に記載した方法により得られたＥＢ溶液(ＥＢ濃
度727μg/ml)を使用した。具体的には、ＥＢ50μgを含
むＥＢ溶液とサンプル処理液（0.063M Tris、５％(v/v)
２−メルカプトエタノール、10％(v/v)グリセリン、2.3
％(w/v) SDS、0.001％(w/v)BPB(Bromphenol Blue)（pH
6.8））を１容：１容で混合し、10分間煮沸した後100μ
l付加し、電気泳動した（電気泳動装置：AE-6560（アト
ー社）、ゲル：アトーパジェル1020DL、泳動用バッファ
ー：0.025M Tris、0.192M グリシン、0.1％(w/v) SDS
（pH8.3）、泳動条件：20mA定電流、80分間泳動）。転
写装置は、NA-1510（日本エイドー社）を使用した。あ
らかじめ氷中に浸しておいた転写用バッファー（0.025M
Tris、0.192M グリシン、20％メタノール（pH8.3））
に泳動後のゲル、３mm厚ろ紙（ワットマン社）２枚及び
ニトロセルロース膜（バイオラッド社）を転写用バッフ
ァーに15分間浸した。パット上にろ紙、ゲル、ニトロセ
ルロース膜、ろ紙の順に乗せ、更にパットではさみ装置
にセットした。装置を氷中に置き、50Ｖ定電圧、２時間
通電し、ニトロセルロース膜にタンパク質を移動させ
た。ニトロセルロース膜をＰＢＳ（日水製薬）で洗浄
（２分間、２回、振とう）後、10％ＦＣＳ／ＰＢＳでブ
ロッキング（30分間、室温、振とう）した。ニトロセル
ロース膜をＰＢＳ（日水製薬）で洗浄（２分間、３回、
振とう）後、表１に示す全てのハイブリドーマの培養上
清とそれぞれ反応（１時間、室温、振とう）させた。Ｐ
ＢＳで洗浄（２分間、３回、振とう）後、500倍希釈し
たパーオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリ
ン抗体（カッペル社）と反応（１時間、室温、振とう）
させた。ＰＢＳで洗浄（２分間、３回、振とう）後、発
色液（３mg/ml ４−クロロ−１−ナフトール１ml、Ｐ
ＢＳ５ml 過酸化水素水２μl）を添加しタンパク質の
バンドが出現するまで反応させた後、蒸留水で膜を数回
洗浄し反応を停止した。クラミジア・トラコマティスと
の反応性の解析には精製クラミジア・トラコマティスＥ
Ｂ（Ｌ２株）を使用し、上記条件と同様にウエスタンブ
ロットした。その結果、本発明のモノクローナル抗体Ｃ
Ｐ−６とＣＰ−７はクラミジア・トラコマティスのＭＯ
ＭＰとの反応性を示さず、クラミジア・ニューモニエの
ＭＯＭＰとの反応性のみを示した。

【００２２】５．蛍光抗体法による抗体の解析（トラコ
マティス、シッタシ、ペコラムとの反応性）クラミジア・トラコマティス、シッタシ、ペコラム各々
の分離株を１μl点置したスライドグラスに、表１に示
す全てのハイブリドーマの培養上清８μlを載せ、湿箱
に入れ37℃に３時間反応させ、ＰＢＳと蒸留水で洗浄
し、風乾した。風乾後、10倍希釈ＦＩＴＣ標識抗マウス
免疫グロブリン・ヤギ血清（KPL社）８μlを点置部位が
全て覆われるように載せ、湿箱に入れ37℃で30分間反応
後、洗浄、風乾し封入液（50％グリセリン−ＰＢＳ）10
0μｌで封入し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、本
発明のモノクローナル抗体ＣＰ−６とＣＰ−７はクラミ
ジア・ニューモニエのＥＢとのみ点々と輝いて見え、抗
体がＥＢと反応していることがわかった。このモノクロ
ーナル抗体ＣＰ−６を産生するハイブリドーマをＣＰ−
６として生命工学工業技術研究所へ寄託した（寄託番
号：生命研菌寄第１４４３６号（ＦＥＲＭＰ−１４４
３６））。

【００２３】

【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体及びその産
生細胞の製造法によれば、タンパク質のなかで従来法で
はモノクローナル抗体の製造が困難であったものを効率
的に製造することができる。得られたモノクローナル抗
体は目的とするタンパク質を特異的に検出するための各
種診断法、各種試薬に有用であり、また医薬品としても
有用である。また、得られた抗体産生細胞は上記抗体を
産生することの他に抗体遺伝子のソースとしても有用で
ある。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【書類名】受託番号変更届

【提出日】平成７年７月２０日

【旧寄託機関の名称】工業技術院生命工学工業技術研
究所

【旧受託番号】ＦＥＲＭＰ−１４４３６

【新寄託機関の名称】工業技術院生命工学工業技術研
究所

【新受託番号】ＦＥＲＭＢＰ−５１５５

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/02 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者川越清隆茨城県日立市東町四丁目13番１号日立化成工業株式会社医薬品研究所内 (72)発明者井口晃史茨城県日立市東町四丁目13番１号日立化成工業株式会社医薬品研究所内 (72)発明者守川俊英茨城県日立市東町四丁目13番１号日立化成工業株式会社医薬品研究所内 (72)発明者中尾義喜茨城県日立市東町四丁目13番１号山崎産業株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】タンパク質に対して特異的な反応性を有
するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の製造
法において、未変性タンパク質又は変性タンパク質のい
ずれか一方で免疫を惹起し、次いで他方のタンパク質に
より追加免疫した動物から取得した抗体産生細胞と、骨
髄腫細胞とを融合させることを特徴とするモノクローナ
ル抗体産生細胞の製造法。
【請求項２】タンパク質に対して特異的な反応性を有
するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の製造
法において、未変性タンパク質で免疫を惹起し、次いで
変性したタンパク質により追加免疫した動物から取得し
た抗体産生細胞と、骨髄腫細胞とを融合させることを特
徴とするモノクローナル抗体産生細胞の製造法。
【請求項３】変性したタンパク質が、未変性タンパク
質を界面活性剤又は還元剤処理したものである請求項１
又は２記載のモノクローナル抗体産生細胞の製造法。
【請求項４】免疫し抗体産生細胞を取得する動物がマ
ウスであり、骨髄腫細胞がマウス由来である請求項１、
２又は３記載のモノクローナル抗体産生細胞の製造法。
【請求項５】タンパク質が、クラミジアの外膜主要タ
ンパク質である請求項１、２、３又は４記載のモノクロ
ーナル抗体産生細胞の製造法。
【請求項６】請求項１〜５のいずれかに記載の製造法
により作製されたモノクローナル抗体産生細胞。
【請求項７】請求項６記載のモノクローナル抗体産生
細胞を培養することを特徴とするモノクローナル抗体の
製造法。
【請求項８】請求項７記載の製造法により作製された
モノクローナル抗体。