JPH0841099A - クラミジア・ニューモニエに対するモノクローナル抗体、その製造方法、その抗体産生細胞及びクラミジア・ニューモニエの検出方法 - Google Patents
クラミジア・ニューモニエに対するモノクローナル抗体、その製造方法、その抗体産生細胞及びクラミジア・ニューモニエの検出方法Info
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- JPH0841099A JPH0841099A JP6182240A JP18224094A JPH0841099A JP H0841099 A JPH0841099 A JP H0841099A JP 6182240 A JP6182240 A JP 6182240A JP 18224094 A JP18224094 A JP 18224094A JP H0841099 A JPH0841099 A JP H0841099A
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- antibody
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 クラミジア・ニューモニエ由来外膜主要タン
パク質に対して特異的な反応性を有するモノクローナル
抗体、このモノクローナル抗体の産生能を有するモノク
ローナル抗体産生細胞、この抗体産生細胞を培養するこ
とを特徴とするモノクローナル抗体の製造方法及び前記
モノクローナル抗体を用いることを特徴とするクラミジ
ア・ニューモニエの検出方法。 【効果】 モノクローナル抗体は、量的に多く含まれる
そのＭＯＭＰに特異的に反応するため、クラミジア・ニ
ューモニエ又はそのＭＯＭＰを特異的に検出するための
各種診断法、各種試薬に有用であり、また医薬品として
も有用である。また、抗体産生細胞は上記抗体を産生す
ることの他に抗体遺伝子のソースとしても有用である。
パク質に対して特異的な反応性を有するモノクローナル
抗体、このモノクローナル抗体の産生能を有するモノク
ローナル抗体産生細胞、この抗体産生細胞を培養するこ
とを特徴とするモノクローナル抗体の製造方法及び前記
モノクローナル抗体を用いることを特徴とするクラミジ
ア・ニューモニエの検出方法。 【効果】 モノクローナル抗体は、量的に多く含まれる
そのＭＯＭＰに特異的に反応するため、クラミジア・ニ
ューモニエ又はそのＭＯＭＰを特異的に検出するための
各種診断法、各種試薬に有用であり、また医薬品として
も有用である。また、抗体産生細胞は上記抗体を産生す
ることの他に抗体遺伝子のソースとしても有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、従来特異的な検出が困
難であったクラミジア・ニューモニエを特異的に検出で
きるモノクローナル抗体、その製造方法、その抗体産生
細胞及びクラミジア・ニューモニエの検出方法に関す
る。
難であったクラミジア・ニューモニエを特異的に検出で
きるモノクローナル抗体、その製造方法、その抗体産生
細胞及びクラミジア・ニューモニエの検出方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】クラミジア属には、クラミジア・トラコ
マティス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・シ
ッタシ及びクラミジア・ペコラムの４種類のものが知ら
れている。クラミジア・ニューモニエは、臨床上、肺炎
などの起因菌と考えられており、Cho-chou Kuoらにより
1986年に初めて報告された(J. Clinical Microbiology,
24(6), 1034-1037(1986))。現在、本微生物の検出は、
研究室レベルにおいて蛍光抗体法により行われている
が、大量の検体の処理には向いていない。クラミジア・
ニューモニエの抗原としては、リポ多糖（ＬＰＳ）及び
タンパク質が知られている。リポ多糖は、クラミジア属
に共通な抗原性を有している。また、タンパク質として
は、分子量39.5Kダルトン、60Kダルトン、75Kダルト
ン、98Kダルトンのものなどが知られているが、特に分
子量39.5Kダルトンのタンパク質は、外膜主要タンパク
質（Major Outer Memblane Protein、以下、ＭＯＭＰと
略す）と呼ばれている。
マティス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・シ
ッタシ及びクラミジア・ペコラムの４種類のものが知ら
れている。クラミジア・ニューモニエは、臨床上、肺炎
などの起因菌と考えられており、Cho-chou Kuoらにより
1986年に初めて報告された(J. Clinical Microbiology,
24(6), 1034-1037(1986))。現在、本微生物の検出は、
研究室レベルにおいて蛍光抗体法により行われている
が、大量の検体の処理には向いていない。クラミジア・
ニューモニエの抗原としては、リポ多糖（ＬＰＳ）及び
タンパク質が知られている。リポ多糖は、クラミジア属
に共通な抗原性を有している。また、タンパク質として
は、分子量39.5Kダルトン、60Kダルトン、75Kダルト
ン、98Kダルトンのものなどが知られているが、特に分
子量39.5Kダルトンのタンパク質は、外膜主要タンパク
質（Major Outer Memblane Protein、以下、ＭＯＭＰと
略す）と呼ばれている。
【０００３】モノクローナル抗体の作製は、1975年にKo
hlerとMilsteinにより報告されて以来、数多くの報告が
なされている。クラミジア属に特異的抗原としてはGLXA
(a genus-specific glycolipid antigen)、リポ多糖、
ＭＯＭＰが知られている。GLXAに対するモノクローナル
抗体をElizabeth S. Stuart等が(Current Microbiolog
y, 28, 85-90(1994))、リポ多糖に対するモノクローナ
ル抗体をHarland D. Caldwell AND Penny J. Hitchcock
が(Infection and Immunity, 44(2), 306-314(1984))、
ＭＯＭＰに対するモノクローナル抗体をEllena M. Pete
rson等が(Infection and Immunity, 59(11), 4147-4153
(1991))、Byron E. Batteiger等が(Infection and Immu
nity, 53(3), 530-533(1986)）報告している。
hlerとMilsteinにより報告されて以来、数多くの報告が
なされている。クラミジア属に特異的抗原としてはGLXA
(a genus-specific glycolipid antigen)、リポ多糖、
ＭＯＭＰが知られている。GLXAに対するモノクローナル
抗体をElizabeth S. Stuart等が(Current Microbiolog
y, 28, 85-90(1994))、リポ多糖に対するモノクローナ
ル抗体をHarland D. Caldwell AND Penny J. Hitchcock
が(Infection and Immunity, 44(2), 306-314(1984))、
ＭＯＭＰに対するモノクローナル抗体をEllena M. Pete
rson等が(Infection and Immunity, 59(11), 4147-4153
(1991))、Byron E. Batteiger等が(Infection and Immu
nity, 53(3), 530-533(1986)）報告している。
【０００４】クラミジア・トラコマティスに対するモノ
クローナル抗体は、Richard S. Stephens等の報告(J. I
mmunology, 128(3), 1083-1089(1982))後、多くの報告
がなされている。クラミジア・シッタシに対するモノク
ローナル抗体は、H. Puy等が(Immunology Letters, 23,
217-222(1989/1990))、クラミジア・ペコラムに対する
モノクローナル抗体は、Kuroda等が(Am J Vet Res, 54
(5), 709-712(1993))報告している。クラミジア・ニュ
ーモニエに対するモノクローナル抗体として、Iijima等
は種々のものを報告しているが（Ｊ． Ｃｌｉｎｉｃａ
ｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ３２（３）， ５８
３−５８８（１９９４））、この中にＭＯＭＰに特異的
に反応するモノクローナル抗体の報告はない。Ｃｈｏ−
ｃｈｏｕ Ｋｕｏ等は、クラミジア・ニューモニエに特
異的な反応性を有するモノクローナル抗体(RR402)を報
告しているが(J. Clinical Microbiology, 24(6), 1034
-1037(1986)、特表昭64-500083号公報)、このモノクロ
ーナル抗体(RR402)が認識する抗原は、明らかにされて
いない(Y. Iijima, J. Clinical Microbiology, 32(3),
583-588(1994))。
クローナル抗体は、Richard S. Stephens等の報告(J. I
mmunology, 128(3), 1083-1089(1982))後、多くの報告
がなされている。クラミジア・シッタシに対するモノク
ローナル抗体は、H. Puy等が(Immunology Letters, 23,
217-222(1989/1990))、クラミジア・ペコラムに対する
モノクローナル抗体は、Kuroda等が(Am J Vet Res, 54
(5), 709-712(1993))報告している。クラミジア・ニュ
ーモニエに対するモノクローナル抗体として、Iijima等
は種々のものを報告しているが（Ｊ． Ｃｌｉｎｉｃａ
ｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ３２（３）， ５８
３−５８８（１９９４））、この中にＭＯＭＰに特異的
に反応するモノクローナル抗体の報告はない。Ｃｈｏ−
ｃｈｏｕ Ｋｕｏ等は、クラミジア・ニューモニエに特
異的な反応性を有するモノクローナル抗体(RR402)を報
告しているが(J. Clinical Microbiology, 24(6), 1034
-1037(1986)、特表昭64-500083号公報)、このモノクロ
ーナル抗体(RR402)が認識する抗原は、明らかにされて
いない(Y. Iijima, J. Clinical Microbiology, 32(3),
583-588(1994))。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】クラミジア・ニューモ
ニエを特異的に検出するためには、量的に多く含まれ、
尚且つ、クラミジア・ニューモニエに特異的な抗原を検
出することが望ましい。この条件を満たす抗原としてＭ
ＯＭＰが考えられる。しかしながら、クラミジア・ニュ
ーモニエ由来ＭＯＭＰに対するモノクローナル抗体の製
造は慣用手段を用いるだけでは困難であり、現在までに
クラミジア・ニューモニエ由来ＭＯＭＰを特異的に認識
するモノクローナル抗体はない。そこで、我々は、クラ
ミジア・ニューモニエ由来ＭＯＭＰに対して特異的に反
応するモノクローナル抗体を作製することを鋭意検討
し、本発明を完成するに至った。
ニエを特異的に検出するためには、量的に多く含まれ、
尚且つ、クラミジア・ニューモニエに特異的な抗原を検
出することが望ましい。この条件を満たす抗原としてＭ
ＯＭＰが考えられる。しかしながら、クラミジア・ニュ
ーモニエ由来ＭＯＭＰに対するモノクローナル抗体の製
造は慣用手段を用いるだけでは困難であり、現在までに
クラミジア・ニューモニエ由来ＭＯＭＰを特異的に認識
するモノクローナル抗体はない。そこで、我々は、クラ
ミジア・ニューモニエ由来ＭＯＭＰに対して特異的に反
応するモノクローナル抗体を作製することを鋭意検討
し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
【課題を解決するための手段】即ち本発明は、クラミジ
ア・ニューモニエ由来外膜主要タンパク質（ＭＯＭＰ）
に対して特異的な反応性を有するモノクローナル抗体、
その製造方法、その抗体の産生能を有するモノクローナ
ル抗体産生細胞及びその抗体を用いることを特徴とする
クラミジア・ニューモニエの検出方法に関する。本発明
のモノクローナル抗体産生細胞は、クラミジア・ニュー
モニエ由来ＭＯＭＰに対して特異的な反応性を有するモ
ノクローナル抗体を産生できるものであれば特に制限は
ないが、一般に、動物の免疫、細胞融合、融合細胞の選
択、特異抗体産生細胞の選択、クローニング等の工程を
経て調製される融合細胞（ハイブリドーマ）であり、ク
ラミジア・ニューモニエ由来外膜主要タンパク質に対し
て特異的な反応性を有するモノクローナル抗体を産生す
るものである。
ア・ニューモニエ由来外膜主要タンパク質（ＭＯＭＰ）
に対して特異的な反応性を有するモノクローナル抗体、
その製造方法、その抗体の産生能を有するモノクローナ
ル抗体産生細胞及びその抗体を用いることを特徴とする
クラミジア・ニューモニエの検出方法に関する。本発明
のモノクローナル抗体産生細胞は、クラミジア・ニュー
モニエ由来ＭＯＭＰに対して特異的な反応性を有するモ
ノクローナル抗体を産生できるものであれば特に制限は
ないが、一般に、動物の免疫、細胞融合、融合細胞の選
択、特異抗体産生細胞の選択、クローニング等の工程を
経て調製される融合細胞（ハイブリドーマ）であり、ク
ラミジア・ニューモニエ由来外膜主要タンパク質に対し
て特異的な反応性を有するモノクローナル抗体を産生す
るものである。
【０００７】免疫用抗原として使用するクラミジア・ニ
ューモニエは、適当なストレインを使用できる。例え
ば、ＹＫ−４１株、ＴＷＡＲ株等が挙げられる。免疫さ
れる哺乳動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヒツ
ジ、ニワトリ等が挙げられるが、特にマウスが好まし
い。免疫方法は、適宜、周知の適当な方法を組み合わせ
て実施できる。本発明のモノクローナル抗体産生細胞を
効率的に作製するためには、例えば、まず、クラミジア
・ニューモニエの基本小体(以下、ＥＢと略す)又はその
未変性のＭＯＭＰで免疫を惹起し、最終免疫用抗原とし
て還元剤及び界面活性剤処理を施すことにより変性させ
たＭＯＭＰを用いる方法が好ましい。還元剤としては、
特に制限はないが、2-メルカプトールエタノールが好ま
しい。界面活性剤としては、特に制限はないが、ＳＤＳ
（ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム）が好まし
い。また、免疫の際にアジュバントを用いるのが好まし
く、例えば、フロイントの完全アジュバント（以下、Ｆ
ＣＡと略す）、フロイントの不完全アジュバント（以
下、ＦＩＡと略す）等が好ましいものとして挙げられ
る。上記方法による充分な免疫後、免疫した哺乳動物か
ら、脾細胞、リンパ球Ｂ細胞等を抗体産生能を有する親
株として摘出する。
ューモニエは、適当なストレインを使用できる。例え
ば、ＹＫ−４１株、ＴＷＡＲ株等が挙げられる。免疫さ
れる哺乳動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヒツ
ジ、ニワトリ等が挙げられるが、特にマウスが好まし
い。免疫方法は、適宜、周知の適当な方法を組み合わせ
て実施できる。本発明のモノクローナル抗体産生細胞を
効率的に作製するためには、例えば、まず、クラミジア
・ニューモニエの基本小体(以下、ＥＢと略す)又はその
未変性のＭＯＭＰで免疫を惹起し、最終免疫用抗原とし
て還元剤及び界面活性剤処理を施すことにより変性させ
たＭＯＭＰを用いる方法が好ましい。還元剤としては、
特に制限はないが、2-メルカプトールエタノールが好ま
しい。界面活性剤としては、特に制限はないが、ＳＤＳ
（ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム）が好まし
い。また、免疫の際にアジュバントを用いるのが好まし
く、例えば、フロイントの完全アジュバント（以下、Ｆ
ＣＡと略す）、フロイントの不完全アジュバント（以
下、ＦＩＡと略す）等が好ましいものとして挙げられ
る。上記方法による充分な免疫後、免疫した哺乳動物か
ら、脾細胞、リンパ球Ｂ細胞等を抗体産生能を有する親
株として摘出する。
【０００８】ハイブリドーマ作製のもう一方の親株とし
ては、一般に骨髄腫（ミエローマ）細胞が用いられる。
例えば、マウス由来のＰ３Ｕ１、ＮＳ−１、６５３、Ｓ
Ｐ２、Ｘ６３、ＭＰＣ−１１等、ラット由来のＡＧ１、
ＡＧ２、ＡＧ３、ＲＣＹ３、２１０等、ヒト由来のＳＫ
Ｏ−００７等が使用できるが、マウス由来のものが好ま
しく、特にＰ３Ｕ１、６５３等が好ましい。細胞融合は
ポリエチレングリコールを用いる方法、センダイウイル
スを用いる方法、電気融合法等が使用できるが、ポリエ
チレングリコールを用いる方法が好ましい。ハイブリド
ーマの選択は、ハイブリドーマのみが生育できる選択培
地中で培養することにより行うことができる。例えばＨ
ＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）培
地、ＨＡｚ（ヒポキサンチン−アザセリン）培地等が好
ましいものとして挙げられる。
ては、一般に骨髄腫（ミエローマ）細胞が用いられる。
例えば、マウス由来のＰ３Ｕ１、ＮＳ−１、６５３、Ｓ
Ｐ２、Ｘ６３、ＭＰＣ−１１等、ラット由来のＡＧ１、
ＡＧ２、ＡＧ３、ＲＣＹ３、２１０等、ヒト由来のＳＫ
Ｏ−００７等が使用できるが、マウス由来のものが好ま
しく、特にＰ３Ｕ１、６５３等が好ましい。細胞融合は
ポリエチレングリコールを用いる方法、センダイウイル
スを用いる方法、電気融合法等が使用できるが、ポリエ
チレングリコールを用いる方法が好ましい。ハイブリド
ーマの選択は、ハイブリドーマのみが生育できる選択培
地中で培養することにより行うことができる。例えばＨ
ＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）培
地、ＨＡｚ（ヒポキサンチン−アザセリン）培地等が好
ましいものとして挙げられる。
【０００９】特異抗体産生細胞の選択は、上記培養によ
りハイブリドーマの増殖が認められたウエルの上清を採
取し、クラミジアニューモニエのＥＢ、ＭＯＭＰ等を用
いた免疫ブロッティング法等により抗体産生の有無を調
べることにより行うことができる。クローニングとは、
上記特異抗体産生細胞を１つのクローンに由来する均一
な細胞集団とすることであり、例えば、限界希釈法、ソ
フトアガー上のコロニーを拾い上げる方法、シングルセ
ルマニュピュレーション法、ＦＡＣＳ法等が挙げられる
が、限界希釈法が簡便で好ましい。以上の方法により、
本発明のモノクローナル抗体産生細胞を得ることができ
る。本発明のモノクローナル抗体産生細胞の一例である
ハイブリドーマＣＰ−６を、工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託し、１９９４年７月２０日に寄託番号
生命研菌寄第１４４３６号（ＦＥＲＭ Ｐ−１４４３
６）として受託された。
りハイブリドーマの増殖が認められたウエルの上清を採
取し、クラミジアニューモニエのＥＢ、ＭＯＭＰ等を用
いた免疫ブロッティング法等により抗体産生の有無を調
べることにより行うことができる。クローニングとは、
上記特異抗体産生細胞を１つのクローンに由来する均一
な細胞集団とすることであり、例えば、限界希釈法、ソ
フトアガー上のコロニーを拾い上げる方法、シングルセ
ルマニュピュレーション法、ＦＡＣＳ法等が挙げられる
が、限界希釈法が簡便で好ましい。以上の方法により、
本発明のモノクローナル抗体産生細胞を得ることができ
る。本発明のモノクローナル抗体産生細胞の一例である
ハイブリドーマＣＰ−６を、工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託し、１９９４年７月２０日に寄託番号
生命研菌寄第１４４３６号（ＦＥＲＭ Ｐ−１４４３
６）として受託された。
【００１０】上記方法により得られたモノクローナル抗
体産生細胞を好適な培地で培養することにより、モノク
ローナル抗体を製造することができる。培地としては例
えば、牛胎児血清を添加したダルベッコの変性イーグル
培地（ＭＥＭ培地）が好ましいものとして挙げられる。
モノクローナル抗体の回収は、培養上清を集め、プロテ
ィンＡカラム、プロティンＧカラム等を用いたアフィニ
ティークロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラ
フィー法、ポリエチレングリコール分画法、エタノール
分画法、硫酸アンモニウム分画法等により行うことがで
きる。これらの中でアフィニティークロマトグラフィー
法が好ましく、特にプロティンＡカラムを用いる方法が
好ましい。 得られたモノクローナル抗体は、クラミジ
ア・ニューモニエ由来ＭＯＭＰに対して特異的な反応性
を有するか否か評価することができる。例えば、クラミ
ジア・ニューモニエＥＢを適当な処理液で処理し、電気
泳動し、これを用いたウエスタンブロット法により、分
子量が約39.5KダルトンのＭＯＭＰのバンドと特異的に
反応するものを選択することができる。こうして選択さ
れるモノクローナル抗体は、クラミジアニューモニエ由
来ＭＯＭＰの１次構造（即ちアミノ酸配列）を抗原決定
基として特異的に認識するものと判断できる。
体産生細胞を好適な培地で培養することにより、モノク
ローナル抗体を製造することができる。培地としては例
えば、牛胎児血清を添加したダルベッコの変性イーグル
培地（ＭＥＭ培地）が好ましいものとして挙げられる。
モノクローナル抗体の回収は、培養上清を集め、プロテ
ィンＡカラム、プロティンＧカラム等を用いたアフィニ
ティークロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラ
フィー法、ポリエチレングリコール分画法、エタノール
分画法、硫酸アンモニウム分画法等により行うことがで
きる。これらの中でアフィニティークロマトグラフィー
法が好ましく、特にプロティンＡカラムを用いる方法が
好ましい。 得られたモノクローナル抗体は、クラミジ
ア・ニューモニエ由来ＭＯＭＰに対して特異的な反応性
を有するか否か評価することができる。例えば、クラミ
ジア・ニューモニエＥＢを適当な処理液で処理し、電気
泳動し、これを用いたウエスタンブロット法により、分
子量が約39.5KダルトンのＭＯＭＰのバンドと特異的に
反応するものを選択することができる。こうして選択さ
れるモノクローナル抗体は、クラミジアニューモニエ由
来ＭＯＭＰの１次構造（即ちアミノ酸配列）を抗原決定
基として特異的に認識するものと判断できる。
【００１１】こうして得られる本発明のモノクローナル
抗体は、クラミジア属のその他の種であるクラミジア・
トラコマティス外膜主要タンパク質と実質的に反応性を
有しないものが好ましく、特にクラミジア・ニューモニ
エ種以外の全てのクラミジア外膜主要タンパク質と実質
的に反応性を有しないものが、クラミジア・ニューモニ
エ外膜主要タンパク質の種特異的な診断等に有用である
ので好ましい。本発明のモノクローナル抗体の種類には
現在知られているどのようなタイプ（グロブリンクラ
ス）のものも含まれる。また、モノクローナル抗体から
の部分分解物又はモノクローナル抗体の部分構造を有す
るものも含まれる。
抗体は、クラミジア属のその他の種であるクラミジア・
トラコマティス外膜主要タンパク質と実質的に反応性を
有しないものが好ましく、特にクラミジア・ニューモニ
エ種以外の全てのクラミジア外膜主要タンパク質と実質
的に反応性を有しないものが、クラミジア・ニューモニ
エ外膜主要タンパク質の種特異的な診断等に有用である
ので好ましい。本発明のモノクローナル抗体の種類には
現在知られているどのようなタイプ（グロブリンクラ
ス）のものも含まれる。また、モノクローナル抗体から
の部分分解物又はモノクローナル抗体の部分構造を有す
るものも含まれる。
【００１２】本発明のモノクローナル抗体は、必要に応
じて他のモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体と
組み合わせてクラミジア・ニューモニエの検出法に用い
ることができる。具体的にはラジオイムノアッセイ、エ
ンザイムイムノアッセイなどの免疫反応を利用した検出
法に使用できる。また、その為の診断薬又は研究用試薬
の一成分として使用できる。さらに直接又はキメラ抗体
やドラフト化抗体として医薬品にも使用できる。また、
本発明のモノクローナル抗体をポリメラーゼチェーンリ
アクションなどと組み合わせた診断キットに使用するこ
ともできる。本発明の抗体産生細胞は、抗体遺伝子のソ
ースとしても使用できる。さらにこの抗体遺伝子は、各
種の細胞で発現させることもできる。
じて他のモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体と
組み合わせてクラミジア・ニューモニエの検出法に用い
ることができる。具体的にはラジオイムノアッセイ、エ
ンザイムイムノアッセイなどの免疫反応を利用した検出
法に使用できる。また、その為の診断薬又は研究用試薬
の一成分として使用できる。さらに直接又はキメラ抗体
やドラフト化抗体として医薬品にも使用できる。また、
本発明のモノクローナル抗体をポリメラーゼチェーンリ
アクションなどと組み合わせた診断キットに使用するこ
ともできる。本発明の抗体産生細胞は、抗体遺伝子のソ
ースとしても使用できる。さらにこの抗体遺伝子は、各
種の細胞で発現させることもできる。
【００１３】
１．クラミジア・ニューモニエＥＢの調製 クラミジア・ニューモニエＥＢの調製にはＹＫ−４１株
を用いた。ＹＫ−４１株のヒト肺由来細胞（ＨＬ細胞と
略す）への感染は、岸本らの方法（検査と技術,18
（7）,959-964（1990））に従った。24ウエル又は６ウ
エルシャーレで培養した感染細胞を細胞剥離し、培地ご
と回収した後、6,000rpm、30分間遠心した。上清を除去
し沈澱物をシュークロース-リン酸-グルタミン溶液（7.
5％(w/v)シュークロース、3.8mM KH2PO4、7mM K2HPO4、
5mM グルタミン酸（pH7.4）、ＳＰＧと略す）に懸濁し
た。懸濁液をホモジナイザーで破砕した後、2,500rpmで
10分間遠心した。上清を除去し沈澱物をＳＰＧに懸濁し
た。この操作を５回繰り返した後、上清を回収した。回
収液を23％(v/v)ウログラフィン（日本シェーリング
社）、50％(w/v)シュークロースと２容：２容：１容の
比で混合し遠心分離（8,000rpm,１時間）した。上清除
去後、下層（50%(w/v) シュークロース層）を回収しＳ
ＰＧに懸濁、洗浄し、遠心分離（10,000rpm、30分間）
後、上清を吸引除去し、沈澱物をＳＰＧに懸濁後、26.6
〜38％(v/v)ウログラフィンDensity Gradientと１容：
４容の比で混合し遠心分離（8,000rpm,１時間）し、中
間層を回収、ＳＰＧに懸濁した。遠心分離（10,000rp
m、30分間）後、上清を吸引除去し、沈澱物を適当量の
ＳＰＧに懸濁しＥＢ溶液とした。保存は分注後、4℃又
は-70℃で行った。
を用いた。ＹＫ−４１株のヒト肺由来細胞（ＨＬ細胞と
略す）への感染は、岸本らの方法（検査と技術,18
（7）,959-964（1990））に従った。24ウエル又は６ウ
エルシャーレで培養した感染細胞を細胞剥離し、培地ご
と回収した後、6,000rpm、30分間遠心した。上清を除去
し沈澱物をシュークロース-リン酸-グルタミン溶液（7.
5％(w/v)シュークロース、3.8mM KH2PO4、7mM K2HPO4、
5mM グルタミン酸（pH7.4）、ＳＰＧと略す）に懸濁し
た。懸濁液をホモジナイザーで破砕した後、2,500rpmで
10分間遠心した。上清を除去し沈澱物をＳＰＧに懸濁し
た。この操作を５回繰り返した後、上清を回収した。回
収液を23％(v/v)ウログラフィン（日本シェーリング
社）、50％(w/v)シュークロースと２容：２容：１容の
比で混合し遠心分離（8,000rpm,１時間）した。上清除
去後、下層（50%(w/v) シュークロース層）を回収しＳ
ＰＧに懸濁、洗浄し、遠心分離（10,000rpm、30分間）
後、上清を吸引除去し、沈澱物をＳＰＧに懸濁後、26.6
〜38％(v/v)ウログラフィンDensity Gradientと１容：
４容の比で混合し遠心分離（8,000rpm,１時間）し、中
間層を回収、ＳＰＧに懸濁した。遠心分離（10,000rp
m、30分間）後、上清を吸引除去し、沈澱物を適当量の
ＳＰＧに懸濁しＥＢ溶液とした。保存は分注後、4℃又
は-70℃で行った。
【００１４】２．クラミジア・ニューモニエＭＯＭＰの
調製 上記により得られたＥＢ溶液をディスクプレパラティブ
電気泳動により分離精製し、ＭＯＭＰを調製した。即
ち、得られたＥＢ溶液（タンパク（ＥＢ）濃度727μg/m
l） 0.5mlと0.5mlの ２倍濃度のサンプルバッファー
（0.31Mトリス−塩酸（pH6.8）、1.6％(w/v)ドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳと略す）、１mM ジチオスレイト
ール、16％(v/v)グリセリン、0.005％(w/v)ブロモフェ
ノールブルー）を混合し、煮沸（100℃、３分間）によ
りタンパクを可溶化後、全量をディスクゲル（濃縮ゲル
４％、分離ゲル10％）に付加、電気泳動（装置：ディス
クプレパラティブ電気泳動装置ＮＡ−1800型、日本エイ
ドー社、泳動条件100Ｖ（定電圧））し、一定量ずつ
（0.26ml/フラクション）回収した。フラクションごと
のＳＤＳスラブ電気泳動を行い（装置：DNA-PAGE用電気
泳動装置ＮＢ−5000型、日本エイドー社、泳動条件100
Ｖ（定電圧））分子量39.5KのＭＯＭＰをフラクション3
3〜45番に回収したことを確認した（タンパク濃度0.21m
g/ml）。
調製 上記により得られたＥＢ溶液をディスクプレパラティブ
電気泳動により分離精製し、ＭＯＭＰを調製した。即
ち、得られたＥＢ溶液（タンパク（ＥＢ）濃度727μg/m
l） 0.5mlと0.5mlの ２倍濃度のサンプルバッファー
（0.31Mトリス−塩酸（pH6.8）、1.6％(w/v)ドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳと略す）、１mM ジチオスレイト
ール、16％(v/v)グリセリン、0.005％(w/v)ブロモフェ
ノールブルー）を混合し、煮沸（100℃、３分間）によ
りタンパクを可溶化後、全量をディスクゲル（濃縮ゲル
４％、分離ゲル10％）に付加、電気泳動（装置：ディス
クプレパラティブ電気泳動装置ＮＡ−1800型、日本エイ
ドー社、泳動条件100Ｖ（定電圧））し、一定量ずつ
（0.26ml/フラクション）回収した。フラクションごと
のＳＤＳスラブ電気泳動を行い（装置：DNA-PAGE用電気
泳動装置ＮＢ−5000型、日本エイドー社、泳動条件100
Ｖ（定電圧））分子量39.5KのＭＯＭＰをフラクション3
3〜45番に回収したことを確認した（タンパク濃度0.21m
g/ml）。
【００１５】３．ハイブリドーマ及びモノクローナル抗
体の製造 上記方法により得られたＥＢの生理食塩液溶解液0.5ml
をＦＣＡ（ディフコ社）0.6mlと混和、超音波破砕機
（ブランソン社）を用いて油中水型のエマルジョンを作
製し免疫用抗原とし、生後８週令のBALB/c雌性マウス５
匹に、200μlずつ腹腔内注射した（１回あたりＥＢ免疫
量10μg/マウス）。６日後及び12日後にＦＩＡ（ディフ
コ社）を用いて免疫を行った。その６日後、部分採血し
各々の血清について抗体価をDot Immuno Binding Assay
法(以下DIBA法と略す）で測定し、抗体価の一番高いも
のについて、測定日から３日間最終免疫として上記方法
により得られた精製ＭＯＭＰ200μl（１回あたりＭＯＭ
Ｐ免疫量１μg/マウス）を尾静脈より投与した。最終免
疫３日目の翌日にマウスの頚椎脱臼後脾臓を摘出し単細
胞分散を行い細胞融合用の脾細胞とした。細胞融合用の
パートナー細胞には10％(v/v)牛胎児血清加ダルベッコ
ＭＥＭ培地（10Ｆ培地と略す）であらかじめ培養した
（ナプコ製ＣＯ2インキュベーター、37℃、５％炭酸ガ
ス、飽和湿度下）、Ｐ３Ｕ１マウスミエローマ細胞を用
いた。
体の製造 上記方法により得られたＥＢの生理食塩液溶解液0.5ml
をＦＣＡ（ディフコ社）0.6mlと混和、超音波破砕機
（ブランソン社）を用いて油中水型のエマルジョンを作
製し免疫用抗原とし、生後８週令のBALB/c雌性マウス５
匹に、200μlずつ腹腔内注射した（１回あたりＥＢ免疫
量10μg/マウス）。６日後及び12日後にＦＩＡ（ディフ
コ社）を用いて免疫を行った。その６日後、部分採血し
各々の血清について抗体価をDot Immuno Binding Assay
法(以下DIBA法と略す）で測定し、抗体価の一番高いも
のについて、測定日から３日間最終免疫として上記方法
により得られた精製ＭＯＭＰ200μl（１回あたりＭＯＭ
Ｐ免疫量１μg/マウス）を尾静脈より投与した。最終免
疫３日目の翌日にマウスの頚椎脱臼後脾臓を摘出し単細
胞分散を行い細胞融合用の脾細胞とした。細胞融合用の
パートナー細胞には10％(v/v)牛胎児血清加ダルベッコ
ＭＥＭ培地（10Ｆ培地と略す）であらかじめ培養した
（ナプコ製ＣＯ2インキュベーター、37℃、５％炭酸ガ
ス、飽和湿度下）、Ｐ３Ｕ１マウスミエローマ細胞を用
いた。
【００１６】上記の脾細胞1.1×108個とＰ３Ｕ１マウス
ミエローマ細胞2.1×107個とを混合し、遠心分離（1,00
0rpm、10分）後、上清を吸引除去し、軽く振動を与えて
細胞ペレットをほぐした後、細胞融合剤（50％(v/v)ポ
リエチレングリコール；ＭＷ＝4000メルク社）を0.2ml
加えた。１分45秒後、培養液10mlを１分間かけて加え、
さらに培養液20mlを加え懸濁後、段階的に遠心し分離し
た（300rpm ３分、500rpm ３分、700rpm ３分）。上清
を吸引除去し、細胞ペレットに５％ブライクローン（大
日本製薬）を含有する10Ｆ培地（10Ｆ＋Bri培地と略
す）を加え、細胞浮遊液を調製した。細胞浮遊液を96ウ
エルのプラスチック平底マルチプレート（コーニング
社）にミエローマ細胞換算で4×104個/ウエル/0.1mlに
なるよう分注し、37℃、５％炭酸ガス、飽和湿度下で培
養した。翌日ＨＡＴを含有する10Ｆ培地（1×10-4Ｍヒ
ポキサンチン、4×10-7Ｍアミノプテリン、1.6×10-5Ｍ
チミジン及び10％(v/v)牛胎児血清を添加したダルベッ
コＭＥＭ培地、ＨＡＴ培地と略す）を0.1ml/ウエル加
え、更に３、４日間隔で培養上清の半量をＨＡＴ培地に
おきかえ、いわゆるＨＡＴセレクションを約２週間にわ
たって行い、ハイブリドーマの増殖が認められたウエル
の上清を採取して DotImmuno Binding Assay法（以下、
DIBA法と略す）によりＥＢに対する抗体産生の有無をス
クリーニングした。
ミエローマ細胞2.1×107個とを混合し、遠心分離（1,00
0rpm、10分）後、上清を吸引除去し、軽く振動を与えて
細胞ペレットをほぐした後、細胞融合剤（50％(v/v)ポ
リエチレングリコール；ＭＷ＝4000メルク社）を0.2ml
加えた。１分45秒後、培養液10mlを１分間かけて加え、
さらに培養液20mlを加え懸濁後、段階的に遠心し分離し
た（300rpm ３分、500rpm ３分、700rpm ３分）。上清
を吸引除去し、細胞ペレットに５％ブライクローン（大
日本製薬）を含有する10Ｆ培地（10Ｆ＋Bri培地と略
す）を加え、細胞浮遊液を調製した。細胞浮遊液を96ウ
エルのプラスチック平底マルチプレート（コーニング
社）にミエローマ細胞換算で4×104個/ウエル/0.1mlに
なるよう分注し、37℃、５％炭酸ガス、飽和湿度下で培
養した。翌日ＨＡＴを含有する10Ｆ培地（1×10-4Ｍヒ
ポキサンチン、4×10-7Ｍアミノプテリン、1.6×10-5Ｍ
チミジン及び10％(v/v)牛胎児血清を添加したダルベッ
コＭＥＭ培地、ＨＡＴ培地と略す）を0.1ml/ウエル加
え、更に３、４日間隔で培養上清の半量をＨＡＴ培地に
おきかえ、いわゆるＨＡＴセレクションを約２週間にわ
たって行い、ハイブリドーマの増殖が認められたウエル
の上清を採取して DotImmuno Binding Assay法（以下、
DIBA法と略す）によりＥＢに対する抗体産生の有無をス
クリーニングした。
【００１７】DIBA法は96ウエルのＵ底マルチプレート
（コーニング社）を用い、あらかじめ、１ドット当り0.
02μgのＥＢを抗原として固定した３mm角のメンブラン
フィルター（アドバンテック47mm径格子入フィルターA0
45b047A）に10％(v/v)ＦＣＳ（Fetal Calf Serum）を加
え室温に15分、ついで上清除去後、ハイブリドーマの培
養上清100μlを加え室温に１時間、ついで上清除去後パ
ーオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン抗
体（カッペル社）の500倍希釈液100μlを加えて同様に
１時間それぞれ反応させて最後に基質として４−クロル
１ナフトールを加えて発色させた。抗原を固定したメン
ブランフィルター上に肉眼的に発色を認めたものを抗体
産生陽性と判定した。このスクリーニングの結果、抗体
産生陽性のウエルのハイブリドーマをさらに限界希釈法
によりクローニングを行なった。すなわち、該抗体産生
陽性のハイブリドーマのＨＡＴ含有培地による浮遊液を
調製し細胞濃度を測定して新しいマイクロプレートにハ
イブリドーマが２〜100個/100μl/ウエルになるよう希
釈液を分注して培養した。この時希釈液にはＨＴ＋５％
ブライクローン培地を用いた。
（コーニング社）を用い、あらかじめ、１ドット当り0.
02μgのＥＢを抗原として固定した３mm角のメンブラン
フィルター（アドバンテック47mm径格子入フィルターA0
45b047A）に10％(v/v)ＦＣＳ（Fetal Calf Serum）を加
え室温に15分、ついで上清除去後、ハイブリドーマの培
養上清100μlを加え室温に１時間、ついで上清除去後パ
ーオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン抗
体（カッペル社）の500倍希釈液100μlを加えて同様に
１時間それぞれ反応させて最後に基質として４−クロル
１ナフトールを加えて発色させた。抗原を固定したメン
ブランフィルター上に肉眼的に発色を認めたものを抗体
産生陽性と判定した。このスクリーニングの結果、抗体
産生陽性のウエルのハイブリドーマをさらに限界希釈法
によりクローニングを行なった。すなわち、該抗体産生
陽性のハイブリドーマのＨＡＴ含有培地による浮遊液を
調製し細胞濃度を測定して新しいマイクロプレートにハ
イブリドーマが２〜100個/100μl/ウエルになるよう希
釈液を分注して培養した。この時希釈液にはＨＴ＋５％
ブライクローン培地を用いた。
【００１８】高希釈のウエルでハイブリドーマの増殖が
認められた場合は抗体産生能の測定と顕微鏡観察を行い
モノクローンであることを確認した上さらに再度同じ操
作を繰り返し、抗体持続産生能の高い抗ＥＢモノクロー
ナル抗体産生クローンを得た。得られた各クローンは培
養スケールを徐々に上げ最終的に50mlの10Ｆ培地で培養
その培養上清につき抗体の性質を調べた。以上の実験操
作を前後２回にわたって行い、最終的に表１に示すモノ
クローナル抗体産生クローンを10株得た。10株のハイブ
リドーマクローンの産生するモノクローナル抗体のグロ
ブリンクラスはISOTYPE Ab-STAT-Iキット（Sang Stat M
edical社）により測定した（表１参照）。表１に示すよ
うにモノクローナル抗体ＣＰ−１、ＣＰ−２、ＣＰ−
４、ＣＰ−５、ＣＰ−６、ＣＰ−７、ＣＰ−８はクラミ
ジア・トラコマティスへの反応性を示さず、クラミジア
・ニューモニエへの反応性を示した。
認められた場合は抗体産生能の測定と顕微鏡観察を行い
モノクローンであることを確認した上さらに再度同じ操
作を繰り返し、抗体持続産生能の高い抗ＥＢモノクロー
ナル抗体産生クローンを得た。得られた各クローンは培
養スケールを徐々に上げ最終的に50mlの10Ｆ培地で培養
その培養上清につき抗体の性質を調べた。以上の実験操
作を前後２回にわたって行い、最終的に表１に示すモノ
クローナル抗体産生クローンを10株得た。10株のハイブ
リドーマクローンの産生するモノクローナル抗体のグロ
ブリンクラスはISOTYPE Ab-STAT-Iキット（Sang Stat M
edical社）により測定した（表１参照）。表１に示すよ
うにモノクローナル抗体ＣＰ−１、ＣＰ−２、ＣＰ−
４、ＣＰ−５、ＣＰ−６、ＣＰ−７、ＣＰ−８はクラミ
ジア・トラコマティスへの反応性を示さず、クラミジア
・ニューモニエへの反応性を示した。
【００１９】
【表１】
【００２０】さらに、表１のモノクローナル抗体すべて
をそれぞれ産生するハイブリドーマクローンにつき10Ｆ
培地で培養して増殖した細胞をプリスタン（和光純薬）
0.5ml/マウスを投与し前処理したBALB/cマウスの腹腔内
に1×107個づつ接種して２〜３週間後に得られた腹水か
ら本発明のモノクローナル抗体を精製した。ハイブリド
ーマクローンＮｏ．６の腹水は下記の如くプロテインＡ
を固定化したアフィニティカラムによる方法で精製し
た。すなわち、マウス腹水と同量の1.5Ｍグリシン＋３
ＭNaCl（pH8.9）を加え0.45μmのナイロンフィルター
（コーニング社）を通過させたのちプロテインＡ−ポロ
ス（日本ガイシ）のアフィニティカラムに付し1.5Ｍグ
リシン＋３Ｍ NaCl（pH8.9）で洗浄した。ついで150mM
NaClを含むリン酸−クエン酸緩衝液（pH6.0）で溶出さ
せた。溶出液は1M Tris-HCl緩衝液（pH9.0）で中和後冷
却し、ＰＢＳで一晩透析後、回収液の280nmの吸光度を
測定（U-2000、日立製作所）し、0.2μmのセルロースア
セテートフィルター（コーニング社）を通過させ-80℃
で保存し精製抗体の保存液とした。
をそれぞれ産生するハイブリドーマクローンにつき10Ｆ
培地で培養して増殖した細胞をプリスタン（和光純薬）
0.5ml/マウスを投与し前処理したBALB/cマウスの腹腔内
に1×107個づつ接種して２〜３週間後に得られた腹水か
ら本発明のモノクローナル抗体を精製した。ハイブリド
ーマクローンＮｏ．６の腹水は下記の如くプロテインＡ
を固定化したアフィニティカラムによる方法で精製し
た。すなわち、マウス腹水と同量の1.5Ｍグリシン＋３
ＭNaCl（pH8.9）を加え0.45μmのナイロンフィルター
（コーニング社）を通過させたのちプロテインＡ−ポロ
ス（日本ガイシ）のアフィニティカラムに付し1.5Ｍグ
リシン＋３Ｍ NaCl（pH8.9）で洗浄した。ついで150mM
NaClを含むリン酸−クエン酸緩衝液（pH6.0）で溶出さ
せた。溶出液は1M Tris-HCl緩衝液（pH9.0）で中和後冷
却し、ＰＢＳで一晩透析後、回収液の280nmの吸光度を
測定（U-2000、日立製作所）し、0.2μmのセルロースア
セテートフィルター（コーニング社）を通過させ-80℃
で保存し精製抗体の保存液とした。
【００２１】４．モノクローナル抗体の特異性解析 モノクローナル抗体の特異性解析をウエスタンブロット
法で行った。クラミジア・ニューモニエとの反応性は上
記１．に記載した方法により得られたＥＢ溶液(ＥＢ濃
度727μg/ml)を使用した。具体的には、ＥＢ50μgを含
む前記ＥＢ溶液とサンプル処理液（0.063M Tris、５％
(v/v)２−メルカプトエタノール、10％(v/v)グリセリ
ン、2.3％(w/v) SDS、0.001％(w/v)BPB(Bromphenol Blu
e)（pH6.8））を１容：１容で混合し、10分間煮沸した
後100μl付加し、電気泳動した（電気泳動装置：AE-656
0（アトー社）、ゲル：アトーパジェル1020DL、泳動用
バッファー：0.025M Tris、0.192M グリシン、0.1％(w/
v) SDS（pH8.3）、泳動条件：20mA定電流、80分間泳
動）。転写装置は、NA-1510（日本エイドー社）を使用
した。あらかじめ氷中に浸しておいた転写用バッファー
（0.025M Tris、0.192M グリシン、20％(v/v) メタノー
ル（pH8.3））に泳動後のゲル、３mm厚ろ紙（ワットマ
ン社）２枚及びニトロセルロース膜（バイオラッド社）
を転写用バッファーに１５分間浸した。パット上にろ
紙、ゲル、ニトロセルロース膜、ろ紙の順に乗せ、更に
パットではさみ装置にセットした。装置を氷中に置き、
５０Ｖ定電圧、２時間通電し、ニトロセルロース膜にタ
ンパク質を移動させた。ニトロセルロース膜をＰＢＳ
（日水製薬）で洗浄（２分間、２回、振とう）後、10％
ＦＣＳ／ＰＢＳでブロッキング（30分間、室温、振と
う）した。ニトロセルロース膜をＰＢＳ（日水製薬）で
洗浄（２分間、３回、振とう）後、表１に示す全てのハ
イブリドーマの培養上清とそれぞれ反応（１時間、室
温、振とう）させた。ＰＢＳで洗浄（２分間、３回、振
とう）後、500倍希釈したパーオキシダーゼ標識ウサギ
抗マウスイムノグロブリン抗体（カッペル社）と反応
（１時間、室温、振とう）させた。ＰＢＳで洗浄（２分
間、３回、振とう）後、発色液（３mg/ml ４−クロロ−
１−ナフトール １ml、ＰＢＳ ５ml 過酸化水素水 ２μ
l）を添加しタンパク質のバンドが出現するまで反応さ
せた後、蒸留水で膜を数回洗浄し反応を停止した。クラ
ミジア・トラコマティスとの反応性の解析には精製クラ
ミジア・トラコマティスＥＢ（Ｌ２株）を使用し、上記
条件と同様にウエスタンブロットした。その結果、本発
明のモノクローナル抗体ＣＰ−６とＣＰ−７はクラミジ
ア・トラコマティスのＭＯＭＰとの反応性を示さず、ク
ラミジア・ニューモニエのＭＯＭＰとの反応性のみを示
した。
法で行った。クラミジア・ニューモニエとの反応性は上
記１．に記載した方法により得られたＥＢ溶液(ＥＢ濃
度727μg/ml)を使用した。具体的には、ＥＢ50μgを含
む前記ＥＢ溶液とサンプル処理液（0.063M Tris、５％
(v/v)２−メルカプトエタノール、10％(v/v)グリセリ
ン、2.3％(w/v) SDS、0.001％(w/v)BPB(Bromphenol Blu
e)（pH6.8））を１容：１容で混合し、10分間煮沸した
後100μl付加し、電気泳動した（電気泳動装置：AE-656
0（アトー社）、ゲル：アトーパジェル1020DL、泳動用
バッファー：0.025M Tris、0.192M グリシン、0.1％(w/
v) SDS（pH8.3）、泳動条件：20mA定電流、80分間泳
動）。転写装置は、NA-1510（日本エイドー社）を使用
した。あらかじめ氷中に浸しておいた転写用バッファー
（0.025M Tris、0.192M グリシン、20％(v/v) メタノー
ル（pH8.3））に泳動後のゲル、３mm厚ろ紙（ワットマ
ン社）２枚及びニトロセルロース膜（バイオラッド社）
を転写用バッファーに１５分間浸した。パット上にろ
紙、ゲル、ニトロセルロース膜、ろ紙の順に乗せ、更に
パットではさみ装置にセットした。装置を氷中に置き、
５０Ｖ定電圧、２時間通電し、ニトロセルロース膜にタ
ンパク質を移動させた。ニトロセルロース膜をＰＢＳ
（日水製薬）で洗浄（２分間、２回、振とう）後、10％
ＦＣＳ／ＰＢＳでブロッキング（30分間、室温、振と
う）した。ニトロセルロース膜をＰＢＳ（日水製薬）で
洗浄（２分間、３回、振とう）後、表１に示す全てのハ
イブリドーマの培養上清とそれぞれ反応（１時間、室
温、振とう）させた。ＰＢＳで洗浄（２分間、３回、振
とう）後、500倍希釈したパーオキシダーゼ標識ウサギ
抗マウスイムノグロブリン抗体（カッペル社）と反応
（１時間、室温、振とう）させた。ＰＢＳで洗浄（２分
間、３回、振とう）後、発色液（３mg/ml ４−クロロ−
１−ナフトール １ml、ＰＢＳ ５ml 過酸化水素水 ２μ
l）を添加しタンパク質のバンドが出現するまで反応さ
せた後、蒸留水で膜を数回洗浄し反応を停止した。クラ
ミジア・トラコマティスとの反応性の解析には精製クラ
ミジア・トラコマティスＥＢ（Ｌ２株）を使用し、上記
条件と同様にウエスタンブロットした。その結果、本発
明のモノクローナル抗体ＣＰ−６とＣＰ−７はクラミジ
ア・トラコマティスのＭＯＭＰとの反応性を示さず、ク
ラミジア・ニューモニエのＭＯＭＰとの反応性のみを示
した。
【００２２】５．蛍光抗体法による抗体の解析（トラコ
マティス、シッタシ、ペコラムとの反応性） クラミジア・トラコマティス、シッタシ、ペコラム各々
の分離株を１μl点置したスライドグラスに、表１に示
す全てのハイブリドーマの培養上清８μlを載せ、湿箱
に入れ37℃に３時間反応させ、ＰＢＳと蒸留水で洗浄
し、風乾した。風乾後、10倍希釈ＦＩＴＣ標識抗マウス
免疫グロブリン・ヤギ血清（KPL社）８μlを点置部位が
全て覆われるように載せ、湿箱に入れ37℃で30分間反応
後、洗浄、風乾し封入液（50％グリセリン−ＰＢＳ）10
0μｌで封入し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、本
発明のモノクローナル抗体ＣＰ−６とＣＰ−７はクラミ
ジア・ニューモニエのＥＢとのみ点々と輝いて見え、抗
体がクラミジア・ニューモニエのＥＢとのみ反応してい
ることがわかった。このモノクローナル抗体ＣＰ−６を
産生するハイブリドーマをＣＰ−６として生命工学工業
技術研究所へ寄託した（寄託番号：生命研菌寄第１４４
３６号（ＦＥＲＭ Ｐ−１４４３６））。
マティス、シッタシ、ペコラムとの反応性） クラミジア・トラコマティス、シッタシ、ペコラム各々
の分離株を１μl点置したスライドグラスに、表１に示
す全てのハイブリドーマの培養上清８μlを載せ、湿箱
に入れ37℃に３時間反応させ、ＰＢＳと蒸留水で洗浄
し、風乾した。風乾後、10倍希釈ＦＩＴＣ標識抗マウス
免疫グロブリン・ヤギ血清（KPL社）８μlを点置部位が
全て覆われるように載せ、湿箱に入れ37℃で30分間反応
後、洗浄、風乾し封入液（50％グリセリン−ＰＢＳ）10
0μｌで封入し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、本
発明のモノクローナル抗体ＣＰ−６とＣＰ−７はクラミ
ジア・ニューモニエのＥＢとのみ点々と輝いて見え、抗
体がクラミジア・ニューモニエのＥＢとのみ反応してい
ることがわかった。このモノクローナル抗体ＣＰ−６を
産生するハイブリドーマをＣＰ−６として生命工学工業
技術研究所へ寄託した（寄託番号：生命研菌寄第１４４
３６号（ＦＥＲＭ Ｐ−１４４３６））。
【００２３】
【発明の効果】本発明のクラミジア・ニューモニエに対
するモノクローナル抗体は、量的に多く含まれるそのＭ
ＯＭＰに特異的に反応するため、クラミジア・ニューモ
ニエ又はそのＭＯＭＰを特異的に検出するための各種診
断法、各種試薬に有用であり、また医薬品としても有用
である。また、本発明の抗体産生細胞は上記抗体を産生
することの他に抗体遺伝子のソースとしても有用であ
る。
するモノクローナル抗体は、量的に多く含まれるそのＭ
ＯＭＰに特異的に反応するため、クラミジア・ニューモ
ニエ又はそのＭＯＭＰを特異的に検出するための各種診
断法、各種試薬に有用であり、また医薬品としても有用
である。また、本発明の抗体産生細胞は上記抗体を産生
することの他に抗体遺伝子のソースとしても有用であ
る。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【書類名】 受託番号変更届
【提出日】 平成７年７ 月２０日
【旧寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技術研
究所
究所
【旧受託番号】 ＦＥＲＭ Ｐ−１４４３６
【新寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技術研
究所
究所
【新受託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−５１５５
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｆ 33/577 Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/02 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 川越 清隆 茨城県日立市東町四丁目13番１号 日立化 成工業株式会社医薬品研究所内 (72)発明者 井口 晃史 茨城県日立市東町四丁目13番１号 日立化 成工業株式会社医薬品研究所内 (72)発明者 守川 俊英 茨城県日立市東町四丁目13番１号 日立化 成工業株式会社医薬品研究所内 (72)発明者 中尾 義喜 茨城県日立市東町四丁目13番１号 山崎産 業株式会社内
Claims (7)
- 【請求項１】 クラミジア・ニューモニエ由来外膜主要
タンパク質に対して特異的な反応性を有するモノクロー
ナル抗体。 - 【請求項２】 クラミジア・トラコマティス由来外膜主
要タンパク質に対して実質的に反応性を有さない請求項
１記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 請求項１又は２記載のモノクローナル抗
体の産生能を有するモノクローナル抗体産生細胞。 - 【請求項４】 マウス由来の抗体産生細胞とマウスミエ
ローマ細胞とのハイブリドーマである請求項３記載のモ
ノクローナル抗体産生細胞。 - 【請求項５】 ハイブリドーマＣＰ−６（生命研菌寄第
１４４３６号）である請求項４記載のモノクローナル抗
体産生細胞。 - 【請求項６】 請求項３、４又は５記載のモノクローナ
ル抗体産生細胞を培養することを特徴とするモノクロー
ナル抗体の製造方法。 - 【請求項７】 請求項１又は２記載のモノクローナル抗
体を用いることを特徴とするクラミジア・ニューモニエ
の検出方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6182240A JPH0841099A (ja) | 1994-08-03 | 1994-08-03 | クラミジア・ニューモニエに対するモノクローナル抗体、その製造方法、その抗体産生細胞及びクラミジア・ニューモニエの検出方法 |
| AU28313/95A AU692889B2 (en) | 1994-08-03 | 1995-08-02 | Monoclonal antibodies having a reactivity specific to Chlamydia pneumoniae, method for production of the monoclonal antibodies, such antibody producing cells, method for production of the cells, method for detection and/or measurement of Chlamydia pneumoniae, reagents for the method, method and agents for diagnosis of chlamydia pneumoniae infection |
| CN 95115823 CN1133192A (zh) | 1994-08-03 | 1995-08-03 | 对肺炎衣原体具有特异反应性的单克隆抗体及其制造方法 |
| EP95112207A EP0699688A3 (en) | 1994-08-03 | 1995-08-03 | Chlamydia pneumoniae specific monoclonal antibodies and their diagnostic use |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6182240A JPH0841099A (ja) | 1994-08-03 | 1994-08-03 | クラミジア・ニューモニエに対するモノクローナル抗体、その製造方法、その抗体産生細胞及びクラミジア・ニューモニエの検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0841099A true JPH0841099A (ja) | 1996-02-13 |
Family
ID=16114800
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6182240A Pending JPH0841099A (ja) | 1994-08-03 | 1994-08-03 | クラミジア・ニューモニエに対するモノクローナル抗体、その製造方法、その抗体産生細胞及びクラミジア・ニューモニエの検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0841099A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110129278A (zh) * | 2019-05-31 | 2019-08-16 | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 | 杂交瘤细胞株cmomp-5d7及其分泌的单克隆抗体与应用 |
-
1994
- 1994-08-03 JP JP6182240A patent/JPH0841099A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110129278A (zh) * | 2019-05-31 | 2019-08-16 | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 | 杂交瘤细胞株cmomp-5d7及其分泌的单克隆抗体与应用 |
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